INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

Departamento de Biotecnología

.

YAUTEPEC, MORELOS, ENERO DEL 2006

“ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS IN VITRO DE Ipomoea intrapilosa EN LUZ Y OSCURIDAD PARA LA PRODUCCIÓN DE SUSTANCIAS CON

ACTIVIDAD INSECTICIDA CONTRA Spodoptera frugiperda SMITH, (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE), PLAGA DE INTERÉS AGRÍCOLA”.

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA: BIOL. LAURA PATRICIA LINA GARCÍA.

DIRECTOR:

DR. ANTONIO RUPERTO JIMÉNEZ APARICIO

El trabajo: “Establecimiento de cultivos in vitro de Ipomoea intrapilosa en luz y oscuridad para la producción de sustancias con actividad insecticida contra Spodoptera frugiperda Smith, (Lepidoptera: Noctuidae), plaga de interés agrícola” fue

desarrollado en el Laboratorio de Control Biológico del Centro de

Investigación en Biotecnología (CEIB) de la Universidad Autónoma del

Estado de Morelos (UAEM) y en el Laboratorio de Cultivo de Células y

Tejidos Vegetales del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del

Instituto Politécnico Nacional (CeProBi – IPN), bajo la Dirección del Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio y la Tutoría de la Dra. Patricia Castillo España (CEIB-UAEM). Dicho Trabajo forma parte

del proyecto “Estudio de extractos vegetales con propiedades

insecticidas”. Para el desarrollo del mismo, se contó con

financiamiento de los Proyectos CONACYT 29065-B y 39562.

Asimismo, la sustentante contó con una Beca (parcial) otorgada por el

CONACYT para la realización de sus estudios.

El Comité Tutorial estuvo integrado por:

Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio

Dra Patricia Castillo España

Dr. Rene Arzuffi Barrera

Dr. Mario Rodríguez

El Comité de Revisión estuvo integrado por:

Dr. Antonio Ruperto Jiménez Aparicio

Dra. Patricia Castillo España

Dr. Rene Arzuffi Barrera

Dr. Mario Rodríguez

Dra. Martha Arenas

Dr. Eduardo Aranda Escobar

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de investigación en Biotecnología de la Universidad Autónoma

del Estado de Morelos por brindarme la oportunidad de superación.

Al Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico

Nacional por abrirme sus puertas.

Al Dr. Antonio Jiménez Aparicio por la oportunidad brindada para mi

desarrollo académico y su optimismo.

A la Dra. Patricia Castillo España por su introducción y enseñanza en las

técnicas del cultivo in vitro.

Al Dr. Rene Arzuffi Barrera por sus enseñanzas, tolerancia y mucha

paciencia para conmigo, así como por sus palabras de aliento que siempre me

dieron ánimos.

Al Dr. Mario Rodríguez Monroy por tomarse el tiempo de leer y criticar

minuciosamente el escrito y por sus cuestionamientos durante el desarrollo de

este trabajo con el fin de hacer mejores estudiantes.

A la Dra. Martha Arenas por la revisión del escrito y recibirnos siempre con

una sonrisa.

Al Dr. Eduardo Aranda Escobar por su amistad, por permitirme colaborar

con el, por que siempre me ha dado su apoyo y confianza incondicional, por sus

enseñanzas y la oportunidad de mejorar, muchas gracias.

A la Dra. Laura Ortiz igualmente por darme la oportunidad de desarrollarme

académicamente.

Al M en C. Rodolfo Figueroa por el “aventón” mañanero para llegar a

tiempo a clases.

A las secretarias Gloria, Toñita y Sarita, así como a Lety y Marce por su

constante ayuda y recordatorios en los tramites a seguir.

Al Dr. Víctor por su constante ayuda, su máquina, por permitirme colaborar

con él y por su buen humor ante la vida.

A Mayra y Adán por que los aprecio mucho y por alegrarme en todo

momento la vida con sus ocurrencias.

A Anabel y los estudiantes que han estado y están en el laboratorio de

Control Biológico, ya que hacen agradable la jornada diaria.

A todos y cada uno de los compañeros de mi generación porque he

aprendido algo de cada uno de ellos.

DEDICATORIA

A mi Renata, el más grande tesoro con el que me ha premiado la vida,

gracias por tu tolerancia a la ausencia, a mis enojos y la espera constante para

estar contigo, pero a pesar de todo siempre has estado y estas presente en mi

pensamiento y en mi corazón.

A mi amá, la Sra. Hermenegilda García Andrade, por tu constante fortaleza

y carácter para salir siempre adelante, por tus enseñanzas, tu sacrificio y tu

ejemplo de superación, porque siempre estas pendiente de nosotras y por que te

quiero mucho.

A mis queridas hermanas Gilda y Claudia por su ejemplo de fortaleza a las

adversidades, por sus ganas de superación, por su lucha diaria, porque son parte

importante en mi vida y aunque estemos lejos seguimos siendo una sola familia.

A mis sobrinas Mariana y Valeria esperando logren todos sus sueños.

A mi misma, porque a veces es difícil ser madre, ama de casa, estudiante y

trabajadora a la vez.

Esta figura parece representar al árbol que los morelenses llaman hoy

”Cazahuate”. La planta posee dos características interesantes: la primera, que es

un árbol considerado mágico, hasta nuestros días, en todo el altiplano mexicano

por el hecho de florecer con vistosas flores blancas acampanadas en la época del

año en que menos agua disponible hay en la zona, “anunciando así la llegada de

las lluvias mientras se nutre sólo del agua profunda”. La segunda es que, al ser

alucinógenas, sus flores se usan en la medicina popular aplicadas sobre el

cuerpo para tratar padecimientos “del agua y del frío” (Lozoya, 1999).

Contenido Pag.

i Índice de figuras y cuadros I

ii Símbolos y abreviaciones II

iii Resumen III

iV Abstract IV

1.0 INTRODUCCIÓN 1

2.0 ANTECEDENTES 4

2.1 Insecticidas de origen vegetal 4

2.2 El cultivo de tejidos para la obtención de metabolitos

secundarios con actividad biológica 6

2.3 Factores que afectan el cultivo de tejidos 9

2.3.1 Reguladores de crecimiento vegetal 9

2.3.2 Efecto luz-oscuridad 11

2.4 Cultivo de células in vitro del género Ipomoea 13

2.5 Características fitoquímicas del género Ipomoea 15

2.6 Aspectos generales del género Ipomoea (Convolvulaceæ) 16

2.7 Actividad biológica del género Ipomoea 17

2.8 Actividad tóxica de callos de Ipomoea 18

2.9 Ipomoea intrapilosa Rose 19

2.10 Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera:Noctuidae) 19

3.0 JUSTIFICACIÓN 21

4.0 HIPÓTESIS 23

5.0 OBJETIVO GENERAL 23

5.1 OBJETIVOS PARTICULARES 23

6.0 MATERIALES Y MÉTODOS 24

6.1 Materiales 24

6.1.1 Recolección y preparación del material vegetal 24

6.1.2 Reactivos 24

6.1.3 Medios de cultivo 24

6.1.4 Insecto 25

6.2 Iniciación del cultivo de callos 25

6.2.1 Desinfección de semillas 25

6.2.2 Germinación de semillas y obtención de plántulas 25

6.2.3 Inducción de callogénesis 25

6.2.4 Obtención de extractos 26

6.3 Bioensayos para determinar toxicidad 28

6.4 Morfología de tejidos 29

7.0 RESULTADOS 30

7.1 Inducción a formación de callo 30

7.2 Producción de biomasa 31

7.3 Rendimiento de extractos 34

7.4 Pruebas de toxicidad 36

7.5 Morfología de tejidos 38

7.6 CONCLUSIONES 43

8.0 PERSPECTIVAS 44

9.0 LITERATURA CITADA 45

10 APÉNDICES 54

I. Preparación del medio MS 54

II. Apéndice 2: Dieta de S. frugiperda 55

III. Apéndice 3: Fijación de tejidos 56

IV.Tinción 57

i. ÍNDICE DE FIGURAS Y CUADROS

Figuras Pag.

1. Comparación del peso seco de callos. 33

2. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con

los extractos de I. intrapilosa (ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM)

37

3. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con

los extractos de I. intrapilosa (ANA 18.09 µM)

37

4. Aspectos diversos de la estructura de callos de I. intrapilosa (luz) 40

5. Aspectos diversos de la estructura de callos de I. intrapilosa

(oscuridad)

42

Cuadros

1.- Estudios con diferentes especies del género Ipomoea. 2

2. Respuesta a callogénesis de I. intrapilosa. 32

3. Cuantificación de sólidos totales de extractos de I. intrapilosa. 35

I

ii. Abreviaturas y símbolos

AIA Ácido indolacético

ANA Ácido naftalénacético

2,4-D 2,4-diclorofenoxiacético

cm Centímetros

Cin Cinetina

hr Hora

mbar milibares

MIP Manejo integrado de plagas

ml Mililitros

mm Milímetros

MS Medio: Murashigue y Skoog

ºC Grados centígrados

p/v Peso a volumen

ppm Partes por millón

v/v Volumen a volumen

µl Microlitros

µM Micromolar

µmol Micromol

II

iii. RESUMEN

Durante la coexistencia entre plantas y otros organismos han aparecido los

herbívoros, quienes al intentar alimentarse de las plantas, éstas han generado

mecanismos de defensa: físicos y químicos para evitarlos o matarlos. No se sabe

con certeza en que momento el hombre empezó a utilizar estos compuestos para

contrarrestar la actividad de los insectos sobre sus cultivos. En la actualidad se ha

dado con relativo éxito, el uso de extractos vegetales y se ha impulsado la

búsqueda de nuevas moléculas de origen vegetal susceptibles de ser obtenidas

mediante procesos biotecnológicos. En el presente trabajo se reporta el efecto

insecticida de los extractos hexánicos, clorofórmicos y metanólicos obtenidos de

callos, generados a partir de explantes de hipocotilo de Ipomoea intrapilosa, sobre

larvas neonatas de Spodoptera frugiperda (plaga de interés agrícola). A partir de

plántulas asépticas provenientes de semillas se obtuvieron los callos en medio MS

adicionado con ANA 13.57 + cinetina 1.1 µM y ANA 18.09 µM, en condiciones de

luz y oscuridad constante. En condiciones de luz constante se obtuvieron callos

de consistencia compacta, mientras que los callos mantenidos en oscuridad

fueron blancos y de consistencia friable. Con relación a los extractos, para callos

obtenidos en luz y oscuridad constantes, se encontró que la concentración de los

sólidos totales fue mayor en los metanólicos; sin embargo, los hexánicos y

clorofórmicos fueron los que mostraron mayor actividad insecticida. En los callos

compactos, crecidos en luz constante, se observaron células parenquimatosas

isodiamétricas, sin espacios celulares, elementos traqueales en formación, restos

de haces vasculares del explante original y segmentos de pared secundaria. En

el caso de los callos friables crecidos en condiciones de oscuridad, se observaron

de manera similar células parenquimáticas, pero con abundantes espacios

intercelulares y con incipiente crecimiento de elementos traqueales. Se concluye

de manera general, que la actividad bioinsecticida que presenta I. intrapilosa se

mantuvo en los callos obtenidos in vitro, bajo condiciones de luz y oscuridad. No

hubo diferencias notables en la estructura general de los tejidos, la morfología

celular permitió reconocer que no hubo una rediferenciación clara de las células,

aunque con ANA 13.57 µM se observaron elementos traqueales de novo.

III

IV ABSTRACT During the co-existence between plants and other organisms, herbivores

appeared, i.e. those organisms that usually feed of plants. As a response to this

action, the plants generated different physical and chemical defense mechanisms

to prevent damage that eventually could lead to death. It is not well understood in

which moment human beings bean began to use these compounds to avoid the

activity of insects against their crops. Today, the use of plant extracts, as well as

the search and production of new molecules using biotechnological processes, has

been increased with relative success. In this work, hexanic, methanolic and

chloroformic extracts were obtained from callus of Ipomea intrapillosa, generated

from plantlet´s hypocotile. The insecticide effect of the extracts was assessed

against Spodoptera frugiperda first-instar larvae (pest of agriculture importance).

Aseptically-germinated plantlets were obtained from seeds, and the callus were

generated in MS media added with 13.57 µmol of NAA plus 1.1 µmol of Kin and

18.09 µmol of NAA under constant conditions of illumination and darkness.

Compact calluses were obtained under illumination, while the callus maintained in

darkness had a friable consistence and whitish coloration in both types of callus.

Concentration of total solids was greater in methanolic extracts for callus cultured

under both conditions already mentioned. Nevertheless, hexanic and chlororformic

extracts showed the best insecticide activity. The internal structure of compact

callus was described using an optical microscope. Parenchymatose and

isodiametric cells, without intercellular spaces, tracheal-forming elements and

vascular bundle residues of the original explants, were observed, as well as

secondary cell-wall segments. In case of the friable callus grown in darkness

conditions, parenchymatose cells with abundant intercellular spaces and incipient

tracheal-forming elements were observed. We may conclude that the

bioinsecticide activity recorded by the I. intrapilosa native plants was maintained in

the callus tissue, under either illumination or darkness conditions. There are not

important differences in the general structure of the tissues, although the cell

morphology did not allow to recognize a clear cell rediferentiation.

IV

1. INTRODUCCIÓN

Aunque las plantas representan una fuente prácticamente ilimitada de

compuestos (metabolitos) resultantes de su metabolismo primario, y sobre todo de

su metabolismo secundario, el número de plantas estudiadas es aún muy limitado.

A nivel mundial, menos del 5 % del recurso vegetal ha sido estudiado para

conocer sus actividades biológicas y sólo alrededor del 15 % se ha estudiado

desde el punto de vista fitoquímico (Nugroho y Verpoorte, 2002; Degenhardt et al.,

2003). Los metabolitos secundarios con actividad insecticida son conocidos desde

hace varios siglos en culturas tradicionales alrededor de todo el mundo,

actualmente la producción biotecnológica de estos compuestos capaces de matar

o interferir con el ciclo biológico de los insectos plaga es una estrategia

prometedora (Degenhardt et al., 2003).

En este sentido, la biotecnología vegetal, a través del cultivo in vitro tiene,

entre otros propósitos, el plantear alternativas para el abastecimiento de aquellos

recursos vegetales que permitan la obtención de compuestos con alguna actividad

biológica terapéutica o con otras actividades y compuestos de interés comercial

(Alfermann y Petersen, 1995).

La selección de las condiciones de cultivo establecidas para cada especie

vegetal, dependerá de la respuesta del cultivo a las diferentes condiciones físicas

y químicas evaluadas. Particularmente, luz, temperatura y reguladores de

crecimiento tienen un efecto directo en el desarrollo morfológico de las plantas y

su variación puede modificar los diferentes procesos de síntesis de estructuras

celulares y de otros compuestos. Del mismo modo, también las células vegetales

cultivadas in vitro se ven afectadas en su morfología y capacidad de síntesis de

compuestos según las condiciones de cultivo empleadas (Piqueras y Debergh,

1999).

Así pues, la búsqueda y producción a gran escala de insecticidas de origen

vegetal forman una parte importante dentro de las nuevas estrategias del manejo

integrado de plagas (MIP) en el control de insectos nocivos para la producción de

alimentos y en el control de enfermedades transmitidas por ellos. Entre los

1

organismos vegetales con mayor potencial para el desarrollo de productos activos

están un número importante de especies de diferentes familias como las

Meliaceae, Solanaceae, Papaveraceae, Convolvulaceae y Rutaceae entre otras

más, de igual importancia (Dev y Koul, 1997; Rodríguez, 1998).

Dentro de la familia Convolvulaceae existen especies de gran interés por su

aplicación comercial y farmacológica. Tal es el caso de las formas arbóreas del

género Ipomoea, las cuales presentan actividad agrícola (insecticida) y

farmacológica. Varios estudios muestran que plantas intactas, así como diferentes

explantes cultivados in vitro, de algunas especies de este género producen

compuestos con actividad insecticida (cuadro 1).

Cuadro 1. Estudios con diferentes especies del género Ipomoea.

Toledo, 2001 Extractos orgánicos de I. arborescens, I. cuernavacensis, I. carnea, I. intrapilosa e I murucoides mostraron actividad insecticida sobe tres especies de insectos plaga

Gómez, 2001 Estudió condiciones hormonales y tipo de explante para inducción de callo con I. intrapilosa, mejores tratamientos fueron ANA 13.57 y 18.09 µM e hipocotilo y pecíolo respectivamente, se observa efecto sobre ninfas de Trialeurodes vaporariorum con extractos

Lina et al., 2001 Actividad insecticida de extractos de callos, flores y semillas de I. intrapilosa

Pichardo, 2004 Efecto de ANA, 2,4-D y tipo de explante para la inducción a callogénesis en I. murucoides, el hipocotilo con 2,4-D fue el mejor tratamiento, al evaluar actividad insecticida, el extracto hexánico de hipocotilo-ANA 4.52 µM presentó mayor actividad

Vázquez, 2002 Se intenta la transformación genética de I. intrapilosa, actividad insecticida de callos cultivados in vitro

García, 2002 Se intenta la transformación genética de I. murucoides, actividad insecticida de callos cultivados in vitro

Gómez, 2003 Morfología y estructura interna de callos de I. murucoides con diferentes reguladores de crecimiento

Cortés, 2004 Efecto de reguladores de crecimiento sobre explantes de I. arborescens, en luz y oscuridad, 100% de callos con ANA en luz constante

Vera, 2005 Actividad insecticida de callos de I. murucoides con diferentes reguladores de crecimiento, varía de acuerdo a la especie de insecto, actividad en callos desdiferenciados y morfogénicos

2

Con el objeto de conocer más acerca de la actividad insecticida de otras

especies de Ipomoea, en esta investigación se analizó el efecto que determinadas

condiciones de cultivo (luz y oscuridad constantes, así como combinaciones

diversas de reguladores de crecimiento) pudieran tener en la formación de callos

de I. intrapilosa, y que estas condiciones mantuvieran la actividad biológica

encontrada por varios autores que se han señalado anteriormente. El análisis

estuvo enfocado también a conocer si la actividad puediese incrementarse o

deteriorarse dependiendo de las condiciones de incubación de los callos

obtenidos.

3

2. ANTECEDENTES.

2.1 Insecticidas de origen vegetal.

Dada su capacidad fotosintética, las plantas representan la mayor

proporción de biomasa en la naturaleza. En cambio, los animales obtienen sus

nutrientes a partir de las plantas y de otros organismos heterótrofos. En

consecuencia, se ha desarrollado una estrecha relación de dependencia entre

organismos vegetales y animales a lo largo del tiempo, lo que se ha traducido en

la aparición de mecanismos de defensa eficientes en las plantas. Así, los

herbívoros, al buscar alimento, tienen que contender con estructuras vegetales

tales como espinas, escamas, ganchos, tricomas, tejidos lignificados y cutículas

cerosas, entre otras (Wink y Schimmer, 1999; Alonso-Amelot, 2003).

A lo largo de este proceso, muchos invertebrados, particularmente los

insectos, aprendieron a vencer estos mecanismos físicos de defensa, por lo que

nuevos caracteres tuvieron que aparecer. A su vez, este proceso se tradujo en

nuevas presiones sobre las plantas, obligándolas así a desarrollar defensas cada

vez más sofisticadas y complejas (Alonso-Amelot, 2003).

Tales formas defensivas han evolucionado más allá de las formas

puramente morfológicas, dando lugar a la producción de una serie de sustancias

químicas capaces de contener el embate de los herbívoros a través de la aparición

de una amplia gama de compuestos fitoquímicos. Tal es el caso de los glicósidos

cianogénicos, glucosinolatos, alcaloides, flavonoides, taninos, terpenos, iridoides,

derivados indólicos y muchos otros compuestos. Estas sustancias no sólo les

sirven a las plantas para disuadir a los herbívoros, si no que también les permiten

responder a presiones ambientales como la escasez de agua y nutrientes, el

estrés térmico y de luz y aún para usarse como señales de comunicación entre

plantas y con otros organismos (Wink y Schimmer, 1999; Baldwin et al., 2002;

Sudha y Ravishankar, 2002).

Se sabe que los tejidos vulnerables y aquellos que participan en la

reproducción de la planta son mejor defendidos que los tejidos viejos o

4

senescentes. De igual manera se ha observado que los alcaloides con frecuencia

se encuentran en tejidos jóvenes o metabólicamente activos. No obstante, a pesar

de la presencia de estos compuestos, un número limitado de herbívoros han

logrado vencer las defensas químicas de las plantas y son capaces de utilizar a

las plantas como sus hospederos (Wink, 1999; Wink y Schimmer, 1999; Baldwin

et al., 2002; Alonso-Amelot, 2003; Degenhardt et al., 2003).

Las sustancias tóxicas producidas por los vegetales no solamente perturban

el metabolismo animal sino también el vegetal, dado que hay muchos procesos

bioquímicos comunes. Las plantas como productoras de tales compuestos deben

separar las toxinas para aislarlas de los demás procesos celulares propios y

exponerlas al enemigo solamente en caso necesario (Wink, 1999; Alonso-Amelot,

2003), por lo cual generalmente se almacenan en áreas especializadas (diferentes

al sitio de síntesis), como las vacuolas, organelo en el que se ubican la mayoría de

los compuestos disuasores de la alimentación.

Otra estrategia de almacenamiento de metabolitos secundarios son los

canales resiníferos que almacenan y posiblemente transportan lentamente las

sustancias hidrofóbicas. En otras ocasiones se produce el precursor del

compuesto activo, como es el caso del ácido cianhídrico (HCN). Así las plantas no

producen HCN directamente sino que sintetizan un precursor que no es tóxico per

se, como los glicósidos cianogénicos, pero que pueden descomponerse

rápidamente en HCN (Alonso-Amelot, 2003).

Los metabolitos secundarios pueden estar contenidos en semillas, flores,

hojas, tallos o raíces, pero la cantidad presente en las plantas varían según el

órgano en el que estén presentes, del estado fisiológico y la edad o estado

fenológico de los individuos (Alonso-Amelot, 2003).

En la actualidad se han aislado varias sustancias con actividad insecticida

(bioinsecticidas), cientos de disuasores de la alimentación y repelentes contra los

insectos, con usos potencialmente comerciales en el hogar y en la agricultura. Las

estructuras químicas son muy variadas, desde estructuras simples como el caso

del limoneno (monoterpeno) que se aísla de la cutícula de algunos cítricos, hasta

5

estructuras muy complejas que requieren muchos pasos de síntesis como la

clerodendrina obtenida del género Teucrium y la harrisonina obtenida de

Harrisonia abyssinica. Otro ejemplo notable es el de la azadiractina y otros

limonoides homólogos que se aíslan del aceite presente en las semillas del neem

(Azadirachta indica) (Rodríguez, 1998; Alonso-Amelot, 2003).

En el caso del crisantemo (Chrysanthemum cinerariaefolium) se han aislado

y purificado compuestos activos como las piretrinas que causan parálisis en

algunas especies de insectos. La juvabiona es un compuesto obtenido a partir de

Abies balsamica y produce un efecto análogo a la hormona juvenil de los insectos,

de tal forma que cuando esta sustancia está presente en las ultimas fases

larvarias impide la metamorfosis del organismo. Otro ejemplo es el de la nicotina,

la cual es uno de los productos más antiguos utilizado como insecticida, en el

mercado se puede encontrar como sulfato de nicotina al 40% (Primo, 1991).

En la búsqueda de productos vegetales con actividad insecticida el

conocimiento tradicional es muy importante. Al respecto, en un estudio realizado

por Boeke et al., (2004) se validó el efecto tóxico y repelente de 33 especies

vegetales usadas de forma empírica desde la antigüedad en África para el control

del escarabajo Callosobruchus maculatus, al hacer la evaluación en laboratorio se

refirió que los polvos de Nicotiana tabacum, Tephrosia vogelii y Securidaca

longepedunculata redujeron de forma significativa el número de progenie y en

cambio Clausena anisata, Dracaena arborea, T. vogelii, Momordica charantia y

Blumea aurita tuvieron actividad repelente, por lo que se concluyó que la mayoría

de las especies evaluadas usadas tradicionalmente por los pobladores

proporcionó un control efectivo contra este escarabajo.

2.2 El cultivo de tejidos para la obtención de metabolitos secundarios con actividad biológica

Debido a que los metabolitos secundarios son producidos en pequeñas

cantidades, en cantidades variables a lo largo del año, en un tipo particular de

células y que adicionalmente no siempre es fácil aislar el compuesto de interés de

la planta intacta, el cultivo de células vegetales es una alternativa para producir

6

estos compuestos de alto valor agregado de forma continua y bajo condiciones

controladas (Wink, 1999). Así mismo, permite manipular las condiciones de

producción no solo para obtener la misma calidad de compuestos (en algunos

casos exitosos ha permitido incrementar el flujo de las vías metabólicas

secundarias), sino incluso, para lograr la síntesis de compuestos novedosos

(Sudha y Ravishankar, 2002)..

En el cultivo in vitro se aprovecha la característica de totipotencialidad

celular, lo que significa que cada célula presenta la información genética necesaria

para producir un organismo con las mismas características de la planta de la cual

provino, al menos en teoría, ya que las células deben encontrarse en un estado

fisiológico competente que les permita reorientar su estado de diferenciación

(Constabel y Kurz, 1998; Verpoorte et al., 1999; von Arnold et al., 2002). Para que

una célula competente o porción de tejido sea capaz de responder al cultivo in

vitro, requiere que las células hayan pasando por una fase de desdiferenciación,

en este proceso las células pierden la función específica que tenían originalmente

y adquieren características de células meristemáticas o parenquimatosas,

formando una masa de tejido vegetal sin una organización aparente llamada callo

(Wetzstein y He, 2000).

La organización anatómica y características estructurales de un callo

dependen no solo del tipo y condición de las células usadas para iniciar el cultivo,

sino también del medio de cultivo y condiciones físicas utilizadas. La importancia

del cultivo de callos es que bajo circunstancias apropiadas las células pueden

inducirse a regenerar órganos y tejidos adventicios, para iniciar suspensiones

celulares o pueden ser usados para producir metabolitos biosintéticos (Wetzstein y

He, 2000).

El desarrollo de un callo se puede dividir en dos estados: inducción y

división, los cuales se caracterizan por cambios en el tamaño celular de la

población, así como en la estructura y condiciones metabólicas del tejido (Yeoman

y Yeoman, 1996).

7

Durante la primera fase, las células son preparadas para la división

mediante factores exógenos, pero morfológicamente éstas permanecen

prácticamente de tamaño constante (Violon et al., 1986; von Arnold et al., 2002).

En la etapa de división, se presenta un proceso de desdiferenciación en el cual el

tejido se revierte a un estado meristemático y las células se dividen mitóticamente,

por lo que se da una reducción del tamaño celular; las células resultantes poseen

pequeñas vacuolas y un arreglo de mitocondrias y plastidios que sugieren alta

actividad metabólica (Wetzstein y He, 2000).

Posteriormente se puede inducir la rediferenciación de la masa celular o

callo, proceso durante el cual las células toman un nuevo curso en su desarrollo y

se pueden obtener estructuras diferenciadas formadas por grupos celulares con

diferentes niveles de diferenciación metabólica y morfológica, estableciéndose un

tamaño celular más o menos constante (Salisbury y Ross, 1994; von Arnold et al.,

2002).

Respecto al aspecto morfológico externo de los callos, la agregación celular

parece ser importante para la productividad de algunos cultivos, la agregación da

como resultado un mayor contacto celular y por tanto una probable comunicación

física y química entre las células y el establecimiento de gradientes físicos y

químicos que pueden ser la clave entre cierta organización celular y la

acumulación de metabolitos (Ladd, 1989), por lo que el aspecto compacto o friable

de los callos puede ser determinante.

Dado que el explante usado para iniciar un cultivo de callos esta compuesto

de una mezcla heterogénea de tipos celulares, determinadas regiones dentro de la

masa de callo pueden mostrar diferencias significativas respecto a su fisiología y

citología, aunque el callo al exterior parezca una masa amorfa homogénea. Por

ejemplo, callos derivados de embriones inmaduros de maíz se pueden clasificar

de acuerdo a si están compuestos por células elongadas y vacuolas

redondeadas; células citoplásmicamente densas con vacuolas alongadas, o

células meristemáticas cubriendo un corazón de células alongadas y espaciadas

(Wetzstein y He, 2000).

8

De forma semejante a las vacuolas, las vesículas caracterizan cierto grado

de citodiferenciación y en ocasiones estas estructuras pueden ser condición

necesaria para la acumulación de metabolitos. Callos cultivados in vitro, pueden

presentar síntesis y acumulación de compuestos como flavonoides, alcaloides y

glicósidos que se almacenan principalmente en células vacuoladas. En Berberis

wilsoniae al menos dos de las ocho enzimas involucradas en la biosíntesis de

alcaloides isoquinólicos se encontraban asociadas con vesículas las cuales

además, son el único sitio de la biosíntesis de alcaloides (Constabel y Kurz, 1998).

2.3 Factores que afectan el cultivo de tejidos

Los cambios en la morfología (forma y estructura) y desarrollo de las

plantas micropropagadas, así como el crecimiento y diferenciación de células

vegetales cultivadas in vitro, depende en gran medida de diversos factores;

algunos son muy obvios, como las combinaciones de reguladores de crecimiento,

la fuente de carbono y los minerales disponibles; otros, no tan conspicuos pero

igualmente importantes, son las condiciones físicas (luz, temperatura y humedad).

Todos ellos juegan un papel importante, no sólo en el crecimiento de las células y

en su respuesta morfogénica, sino también en la gama de compuestos que las

células producen ante condiciones determinadas (Piqueras y Debergh, 1999).

2.3.1 Reguladores de crecimiento vegetal

Debido a que el desarrollo de las plantas es continuo, su vida esta

gobernada por la integración de las condiciones ambientales en las cuales esta

creciendo, su estado fisiológico y estado de desarrollo. La forma de integrar y

regular esta información, es a través de moléculas de señalización que no tienen

función metabólica (no son nutrientes), lo que permite un nivel más sutil y

sofisticado de control. Los reguladores de crecimiento son sustancias orgánicas

que participan en la regulación de los procesos fisiológicos (crecimiento,

diferenciación y desarrollo) de las plantas y los tejidos cultivados in vitro. Aunque

se producen naturalmente en las plantas, los tejidos y células cultivados in vitro

generalmente no producen suficientes cantidades, por lo que deben ser

adicionados selectivamente al medio (Ottoline, 1998; Kyte y Kleyn, 2003).

9

Como característica general, los reguladores de crecimiento son

sintetizados por la misma planta, se caracterizan por actuar a muy bajas

concentraciones (10-6M), son transportados desde el sitio de producción hasta el

sitio de acción, actúan uniéndose de forma no covalente y afectan los patrones de

crecimiento y desarrollo; así mismo, el tipo y concentración de reguladores de

crecimiento varía de acuerdo al tipo de planta y tejido propuesto (Ottoline, 1998;

Kyte y Kleyn, 2003).

La importancia del tipo y concentración de los reguladores de crecimiento

es que proporcionan información acerca del tipo celular, la salud y el estado

nutricional de las células y de las características del ambiente; su transporte puede

proporcionar información de posición, particularmente si este es direccional

(Ottoline, 1998).

Los principales reguladores de crecimiento son las auxinas, citocininas y

giberelinas, entre otros.

En plantas intactas, las auxinas son normalmente producidas por los

primordios foliares y hojas jóvenes, son transportadas activamente corriente abajo

por el tallo hacia la raíz estimulando su crecimiento primario y el de la raíz,

determinan la dominancia apical, la división celular en el cambium vascular,

promueven la formación de xilema secundario, inducen formación de raíces

adventicias, inhiben la abscisión de hojas y frutos, estimulan la síntesis de etileno

e inhiben o promueven la floración. Son comúnmente incorporados en los medios

usados para cultivo tejidos y células in vitro, promueven el alargamiento celular,

formación de raíces, dominancia apical y la división de las células, sobre todos si

se adicionaban en combinación con citocininas (Rost et al., 1997; Kyte y Kleyn,

2003).

La auxina natural conocida es el ácido indol-3-acético (AIA) que se sintetiza

a partir del triptofano principalmente, promueve el enraizamiento. Existen otras

auxinas sintéticas como el ácido 1-naftalenacético (ANA) usado en los medios

como inductor de raíz y para promover el crecimiento de callo; el ácido 2,4-

10

diclorofenoxiacético (2,4-D) es conocido principalmente por matar malas hierbas,

es utilizado ampliamente para inducir el crecimiento de callo (Kyte y Kleyn, 2003).

Las citocininas son reguladores de crecimiento que, en plantas maduras,

son producidos en raíz a partir de derivados de la adenina, aunque también se

encuentran en embriones y endospermo. Son transportadas vía xilema hacia las

partes aéreas. Promueven la división celular y coordinan el crecimiento entre la

parte aérea y la raíz y retardan la senescencia, tienen influencia en el transporte

de auxinas. En cultivo de tejidos se usan para inducir la división celular, procesos

de morfogénesis, la multiplicación de brotes, la proliferación de yemas axilares y

el rompimiento de la dominancia apical (Rost et al., 1997; Kyte y Kleyn, 2003).

Existe una amplia variedad de citocininas, pero la más comúnmente usada

en el cultivo de tejidos es la 6-benzilaminopurina (BAP) para promover el

crecimiento de yemas axilares; la 6-furfurilaminopurina (cinetina) que se adiciona

para promover la división celular en los cultivos; la 6-(4-hidroxi-3-metilbut-2-

enliamino) purina (zeatina) se usa para inducir una rápida división celular (Rost et

al., 1997; Kyte y Kleyn, 2003).

Es simplista resumir la diversidad de reguladores de crecimiento y sus

efectos ya que existe un amplio rango de interacciones entre los diferentes

reguladores de crecimiento, así como interacciones de estos con otros químicos.

Por otro lado el efecto inducido por los reguladores de crecimiento también se ve

afectado por la especie vegetal en cuestión y por factores ambientales como luz y

temperatura (Ottoline, 1998; Kyte y Kleyn, 2003).

2.3.2 Efecto luz-oscuridad

Aunque normalmente la fotosíntesis proporciona a las plantas un

suplemento suficiente de energía, la síntesis de estructuras y compuestos

celulares, en el cultivo in vitro de tejidos y células, las condiciones frecuentemente

no son suficientes como para soportar un desarrollo autótrofo, así que la

fotosíntesis generalmente no es funcional aunque el cultivo sea verde; no

11

obstante, incrementando la luz y proporcionando CO2 es posible conseguir la

autotrofía de algunos cultivos (Piqueras y Debergh, 1999; Scrags, 2000).

En el cultivo in vitro de células y tejidos, los principales parámetros físicos a

controlar son la calidad e intensidad de luz empleada y la temperatura (Piqueras y

Debergh, 1999; Scrags, 2000). Dado que en la micropropagación la luz de día es

completamente reemplazada por fuentes de luz artificial con diferente espectro,

tales cambios pueden inducir respuesta inhibitoria del crecimiento de células y

tejidos vegetales; en otros casos la luz puede incrementar el crecimiento de callos

y la investigación se ha dirigido a determinar si la presencia de luz con diferentes

longitudes de onda tiene efectos distintos; sin embargo, dado que los resultados

han sido contradictorios es necesario hacer más estudios al respecto (Piqueras y

Debergh, 1999).

Dado que la presencia-ausencia de luz es importante, Ekiz y Konzac (1997)

reportaron que en trigo (Triticum aestivum L.) la oscuridad constante durante la

inducción a callo incrementó la formación de callo así como la regeneración de

plantas a partir de éstos y por el contrario, la luz continua disminuyó

significativamente tanto la producción de callo como la regeneración de plantas.

Sin embargo, cuando aplicaron cantidades bajas de luz continua (80 µmol m-2 s-1)

o bien fotoperiodo de 8 h luz/16 oscuridad no se afectó de manera significativa la

inducción a callo respecto a la aplicación de oscuridad continua, concluyendo que

es la cantidad y no la calidad de luz el factor que más afectaba la inducción a callo

(Ekiz y Konzac, 1997).

Desde hace varios años algunos trabajos se han centrado en los efectos de

la luz en la biosíntesis y acumulación de metabolitos secundarios (Scrags, 2000).

Se conoce actualmente que la fotosíntesis es un proceso altamente dinámico que

puede redirigir el metabolismo secundario y afectar el nivel de formación de

productos. Es precisamente durante la fotosíntesis cuando las células elaboran

agentes reductores y varios cofactores enzimáticos importantes en algunas vías

metabólicas (Constabel y Kurz, 1998). Por otro lado también se ha visto que

aunque los cultivos no sean generalmente fotosintéticos, la fotoperiodicidad así

12

como la calidad e intensidad de luz pueden influir en el crecimiento de los cultivos,

aún cuando se usen bajos niveles de iluminación (Scrags, 2000; Wetzstein y He,

2000).

Para el caso del nitrógeno, que es uno de los elementos limitantes en las

plantas, la asimilación de N inorgánico hasta aminoácidos como la glutamina y la

asparagina, es fuertemente regulada por luz ya que induce la expresión de genes

involucrados en la biosíntesis de diversas enzimas. Así mismo, en presencia de

luz, cuando los esqueletos de carbono son abundantes, el amonio es asimilado en

glutamina, aminoácido que puede ser utilizado en diferentes reacciones

anabólicas, pero en oscuridad la glutamina es convertida en asparagina, un

aminoácido inerte usado para almacenar nitrógeno (Oliveira et al., 2001)

En plántulas intactas de tabaco en sus primeros estados de desarrollo, la

síntesis y acumulación de nicotina se ve abatida aún por un breve pulso de luz; sin

embargo, si las plántulas se exponen a un fotoperíodo de 10 h luz después que los

cotiledones abrieron, se incrementa un 70 % el contenido de nicotina (Weeks y

Bush, 1974). De igual modo, el patrón de alcaloides extraídos de plántulas de

Catharanthus roseus se ve afectado por la presencia de luz, en plántulas etioladas

se acumula tabersonina (último precursor de vindolina) y solo después de un

período de iluminación continua, se acumula vindolina debido a que la enzima

participante (tabersonina 16-hidroxilasa) en plántulas esta regulada por luz

(Vazquez-Flota y De Luca, 1998).

2.4 Cultivo de células in vitro del género Ipomea.

Debido a la presencia de una gama importante de sustancias bioactivas y

dado que en la actualidad muchas especies del género Ipomea se encuentran

restringidas en ecosistemas específicos, el cultivo de células y tejidos vegetales

representa una alternativa biotecnológica importante, tanto para la conservación

de las diferentes especies, como para la producción de metabolitos secundarios

(Khafagi et al., 2003).

Al respecto, se han realizado trabajos en los que se ha inducido la

formación de callo en I. murucoides e I. intrapilosa utilizando medio MS

13

(Murashigue y Skoog) adicionado con los reguladores de crecimiento ácido

naftalénacético (ANA), indolacético (AIA) y 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a partir

de explantes de hipocotilo, pecíolo, hojas cotiledonares y raíz. En estos trabajos

se observó que los mejores tratamientos para la formación de callo se obtuvieron

usando hipocótilo como explante y 2,4-D (4.52 y 13.57 µM) como regulador de

crecimiento para I. murucoides; e hipocótilo y pecíolo usando ANA (13.57 µM)

para el caso de I. intrapilosa (Gómez, 2001; García, 2002; Pichardo, 2004; Vera,

2004).

Al hacer un estudio histológico sobre la morfología y estructura interna de

callos de 8 semanas de I. murucoides crecidos en medio MS adicionado con ANA,

AIA y 2,4-D (13.57 µM), Gómez (2003) observó que el proceso de

desdiferenciación se produjo a partir de las células parenquimáticas que rodeaban

a los haces vasculares y que los callos estaban constituidos por células

meristemáticas y parenquimáticas. Adicionalmente durante el proceso de

rediferenciación celular observó rizogénesis directa e indirecta para los diferentes

tratamientos.

En cuanto a la comparación entre callos embriogénicos y no embriogénicos

de I. batatas hay diferencias morfológicas, fisiológicas, histológicas y bioquímicas;

en el caso de los callos embriogénicos fueron de aspecto compacto, desarrollaron

poco crecimiento pero con mas materia seca, proteínas y bajo contenido de

azúcar y una apariencia nodular; los callos no embriogénicos presentaron un

buen crecimiento y mayor contenido de azúcares y su aspecto fue frágil

(Mukherjee et al., 2001)

Respecto a I. intrapilosa, Gómez (2001) realizó un estudio para evaluar el

potencial de morfogénesis y citodiferenciación en callos obtenidos de explantes de

hipocotilo, pecíolo, raíz y hojas cotiledonares, utilizando para el cultivo medio MS

adicionado con diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento

ANA, AIA y 2,4-D. En este estudio se pudo observar que a los 35 días de cultivo

los callos crecidos en ANA presentaron un tamaño importante, particularmente en

14

los tratamientos con 4.52, 9.04, 13.57 y 18.09 µM, y de éstos, los crecidos en ANA

13.57 y 18.09 µM.

Cortés (2004) evaluó el efecto de diferentes reguladores de crecimiento

sobre varios explantes de I. arborescens, para la inducción a callo en condiciones

de luz y oscuridad; generando el 100% de callos con ANA 18.09 µM y cotiledón en

luz constante.

2.5 Características fitoquímicas del género Ipomoea

Existen reportados en la literatura diversos estudios sobre los

constituyentes químicos del género Ipomoea, en los que se han aislado y

determinado la estructura de varios compuestos. Steward y Keeler (1998)

identificaron varios alcaloides indólicos en 19 especies. En las raíces de I.

orizabensis se caracterizaron seis glucósidos (escammoninas I y II), así como 4

nuevos tetrasacáridos del ácido jalapinólico (Hernández et al., 1999). Las semillas

y raíces de I. tricolor e I. batatas presentaron alcaloides indólicos, la amida del

ácido lisérgico e isolisérgico, chanoclavina, una gran variedad de resinas

glicosídicas y los glucósidos kauranoicos, turbicorina y corimbosina; éstos últimos,

adicionalmente se encuentran presentes en varias especies del género e incluso

se pueden utilizar como marcadores taxonómicos (Pérez-Amador et al., 1992;

Pereda y Moustapha, 2003). En las partes aéreas de I. hederifolia , I. neei e I. x

perigrenium se han identificado 47 alcaloides pirrolizidínicos del tipo ipangulinas y

platinecina que la planta almacena como alcaloides terciarios (Jenett-Siems,

1998).

Una de las características anatómicas más notable del género Ipomea es la

presencia de células que secretan resinas glicosídicas en el tejido foliar así como

en las raíces. En un estudio realizado también con raíces de I. orizabensis se

extrajeron dos glucorresinas cuyas estructuras estaban formadas por un ácido

graso glucosilado unido a ácidos volátiles. De igual manera las glicorresinas

tricolorina A y B, mostraron actividad específica contra Staphylococcus aureus y

Mycobacterium tuberculosis y todas las tricolorinas y orizabinas tienen

características antifúngica. En I. stans (conocida como “Tumbavaqueros”) se

15

caracterizaron 3 nuevos tetrasacáridos glucosídicos que presentaron actividad

contra Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis (Reynolds et al., 1995).

Dentro de la familia de las Convolvuláceas existen numerosas especies que

presentan actividad biológica (Dev y Koul, 1997; Toledo, 2001). Por ejemplo, los

géneros Convolvulus, Exogonium, Ipomoea, Merremia y Operculina sintetizan

diversos tipos de alcaloides y glicorresinas los cuales presentan una actividad

fitoquímica importante (Pereda y Moustapha, 2003), así mismo la mayoría de las

especies del género Ipomoea presentan una gran variedad de alcaloides que

funcionan como defensa antiherbívoro (Steward y Keeler, 1988.

El análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

de las hojas de I. murucoides que reporta Tello (2005), muestra la presencia de

compuestos como terpenos, ácidos grasos y alcaloides tipo pirrolizidínico, así

como 1 metil pirrol, el cual no había sido reportado para las hojas de esta planta.

De estos compuestos los terpenos fueron los más abundantes, fundamentalmente

el α-Cariofileno y Cariofileno. Los ácidos grasos de mayor abundancia fueron el

ácido decanoico, dodecanoico y octadecanoico.

2.6 Aspectos generales del género Ipomoea (Convolvulaceæ)

Mundialmente el género Ipomoea está representado por 600-700 especies,

de las cuales 250 están localizadas en México. Estas plantas tienen usos muy

variados, se usan como cercas vivas en los campos de cultivo y como sustrato en

la producción de hongos, asimismo representan un mercado importante como

productos ornamentales, son melíferas y también tienen diversas aplicaciones en

la medicina tradicional (Rzedowski y Rzedowski, 1985; Murguía, 1995; Austin y

Huaman, 1996; Jenett-Siems et al., 1998).

Algunas especies del género Ipomoea son endémicas de México y se les

encuentra de forma restringida en algunos ecosistemas. Tal es el caso de los

“Cazahuates” (Ipomoea arborescens, I. intrapilosa, e I. murucoides) (Rzedowski y

Rzedowski, 1985; Rzedowski, 1991). Tienen importancia económica por sus usos

alimentarios (I. batatas), ornamentales (I. carnea, I. alba, I. tricolor), medicinales (I.

16

purga, I. orizabensis), actividad citotóxica (I. tricolor, I. purga) y dentro de los

rituales religiosos de algunas comunidades por su actividad psicotrópica (Turbina

corymbosa e I. tricolor) (Murguía, 1995; Pereda y Moustapha, 2003).

Recientemente se reportó que I. carnea es una especie con potencial de

fitorremediación, por ejemplo para la remoción de Cadmio (Ghosh y Singh, 2004).

.

2.7 Actividad biológica del género Ipomoea

Las glicoresinas producidas por diferentes especies del género Ipomoea

tienen actividad como aleloquímicos contra varias especies vegetales

competidoras, por lo que se han utilizado como herbicidas. Algunas especies

herbáceas son usadas para cubrir cultivos debido a su gran capacidad de

propagación y la emisión de compuestos sumamente efectivos en impedir el

establecimiento de otras semillas de malezas dentro de un cultivo (Pereda y

Moustapha, 2003).

En algunos agroecosistemas mexicanos el efecto alelopático se ha usado

para eliminar semillas no deseadas en cultivos de maíz y de caña de azúcar

(Pereda y Moustapha, 2003).

Una característica importante de algunas especies de Ipomoea es su

actividad insecticida. Por ejemplo, el extracto de hojas de plantas intactas de I.

batatas, fue tóxico para las hormigas Atta sexdens y efecto fungicida en los

hongos que estas hormigas cultivan como una fuente de proteínas (Hebling et al.,

2000); sin embargo, no se conocen los compuestos responsables de la actividad

tóxica.

Steward y Keeler (1988) analizaron los patrones de defensa de

antiherbivoría en el género Ipomoea y mencionan que de manera general las

especies agrupadas en esta categoría taxonómica presentan tres tipos de

defensa: 1) la presencia de compuestos de tipo indol alcaloides, 2) nectarios de

defensa, 3) hojas pubescentes y 4) estructura leñosa. En el caso de los alcaloides

se presentan con una considerable variación de estructuras y cantidad de

compuestos individuales,

17

Por otra parte, los extractos crudos obtenidos con hexano, cloroformo y

metanol de corteza, hojas, flores y semillas de cinco especies arbóreas del género

Ipomoea (I. murucoides, I. intrapilosa, I. cuernavacensis, I. carnea e I.

arborescens) tienen actividad insecticida contra plagas de importancia agrícola en

México. Entre éstas se encuentran el gusano cogollero del maíz (Spodoptera

frugiperda) y las especies de mosquita blanca Bemisia tabaci y Trialeurodes

vaporariorum, así como efecto antialimentario sobre Epilachna varivestis (Toledo,

2001; Gómez, 2001). Otros ejemplos son I. cairica Linn., cuyos aceites esenciales

se evaluaron entre 5 y 200 ppm sobre Culex tritaeniorhynchus, Aedes aegypti,

Anopheles stephensi y Culex quinquefaciatus, y se encontró que son altamente

tóxicos a las larvas (Thomas et al., 2004).

Al realizar estudios de citotoxicidad con los extractos obtenidos con

diclorometano y metanol de I. tricolor e I. purga contra 4 líneas celulares de cáncer

humano (nasofaríngeo, pulmón, seno y colon) se obtuvieron buenos niveles de

inhibición (Pereda y Moustapha, 2003). En el caso de la especie I. stans, los

extractos acuosos, etanólicos y clorofórmicos del rizoma son utilizados para el

tratamiento de la histeria y la epilepsia en Corea. Así mismo se ha validado su

actividad anticonvulsiva en bioensayos con ratas (Navarro-Ruiz et al., 1996); a

algunas glicoresinas se les atribuye acción purgante (Pereda y Moustapha, 2003).

2.8 Actividad tóxica de callos de Ipomoea

También se ha evaluado la actividad tóxica de extractos hexánicos,

clorofórmicos y metanólicos de callos de I. murucoides e I. intrapilosa sobre larvas

neonatas de Spodoptera frugiperda. Los callos se obtuvieron en medio MS

adicionado con ANA, AIA y 2, 4-D en diferentes concentraciones y utilizando

varios tipos de explante (hipocótilo, pecíolo, hojas cotiledonares y raíz). Los

resultados mostraron que los extractos hexánicos de callos obtenidos con ANA

18.09 µM provenientes de raiz y peciolo de I. intrapilosa así como los metanólicos

de callos generados con 2,4-D (200 ppm) provenientes de raíz de I. murucoides de

60 días de edad fueron los de mayor actividad al producir una mortalidad del 100 y

50 % respectivamente (Pichardo, 2004; Vázquez, 2002; Vera, 2005).

18

De igual manera en el caso de los extractos hexánicos y metanólicos de

callos obtenidos con los reguladores ANA, AIA y 2,4-D, se produjo una

considerable pérdida de peso en las larvas sobrevivientes después de 7 días de

tratamiento. Por otra parte, en bioensayos de toxicidad con insectos adultos de

Trialeurodes vaporariorum (Homoptera:Aleyrodidae) se encontró que el extracto

clorofórmico de callos obtenidos con AIA (13.57 µM) fue el que presentó una

mayor mortalidad (García, 2002; Pichardo, 2004; Vera, 2005).

Posteriormente Vázquez (2002) evaluó la actividad insecticida de callos

generados a partir de raíz y pecíolo de I. intrapilosa cultivados en medio MS

adicionado con el regulador ANA 18.09 µM y macerados en hexano; este autor

observó un porcentaje alto de mortalidad en larvas de primer estadio de S.

frugiperda usando 200 µg/cm2.

2.9 Ipomoea intrapilosa Rose

I. intrapilosa Rose, es una especie endémica del Altiplano Mexicano,

ampliamente distribuida en las zonas cálidas del Estado de Morelos. Se

caracteriza por ser una especie arbórea de hasta 8 metros de altura; esta planta

produce un látex blanco que contiene alcaloides ergólicos (Rzedowski y

Rzedowski, 1985; McDonald, 1991). Se utiliza en la medicina tradicional para el

tratamiento de padecimientos reumáticos (infusiones de flor, hoja, corteza y tallo);

para dolor de oídos y molares, contra la tos, para contrarrestar la picadura de

alacrán (corteza hervida) y algunos problemas gastrointestinales; asimismo se le

atribuyen efectos psicotrópicos (Chao y Der Marderosian, 1973; Argueta et al.,

1994; Osuna, 1994; Perusquia et al., 1995).

2.10 Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera:Noctuidae), plaga de interés agrícola.

Uno de los insectos plaga más importantes durante todo el ciclo de

desarrollo del maíz, elemento básico en la nutrición del mexicano, es el llamado

comúnmente “gusano cogollero del maíz” Spodoptera frugiperda Smith

(Lepidoptera:Noctuidae); aunque ataca principalmente cultivos de maíz también es

19

una plaga importante para los cultivos de alfalfa, frijol, papa, diferentes especies

de pastos, sorgo, soya, algodón, cacahuate y tomate de cáscara (Morón y Terrón,

1988).

Esta especie se encuentra distribuida a nivel mundial en las regiones

tropicales y subtropicales; bajo condiciones favorables una población puede llegar

a tener hasta 12 generaciones por año y cada hembra poner en promedio 1000

huevos, por lo que las pérdidas en un cultivo pueden ser severas (Morón y Terrón,

1988; Davidson y Lyon, 1996). Adicionalmente por el mal manejo con insecticidas

químicos al que han estado expuestas las poblaciones silvestres, este organismo

ha desarrollado resistencia a diversos insecticidas químicos sintéticos.

Aunado a la importancia agrícola de esta plaga, cabe mencionar que esta

especie de insecto ha sido seleccionada para realizar bioensayos en diversos

trabajos, debido a que se adapta adecuadamente a la cría en laboratorio y, dada

la facilidad de su manejo, representa un buen modelo de estudio para evaluar la

actividad de compuestos.

20

3. JUSTIFICACIÓN

La obtención de productos naturales de interés a partir de plantas intactas,

tiene la desventaja de requerir grandes cantidades de material vegetal, lo que

pone en riesgo la permanencia de la especie vegetal en su hábitat natural; así

como una calidad variable del producto obtenido y la falta de disponibilidad del

material vegetal en cualquier época del año.

El cultivo de tejidos, permite el resguardo del germoplasma de especies en

peligro de extinción, amén de ser una alternativa biotecnológica para la producción

de sustancias con actividad biológica o de interés económico (Wink, 1999; Sudha

y Ravishankar, 2002).

I. intrapilosa es una planta endémica restringida al altiplano mexicano y,

aunque no está en peligro de extinción, algunas de sus poblaciones se han visto

disminuidas por la constante pérdida de sus áreas naturales a causa de la

urbanización, principalmente. Asimismo, es una especie poco estudiada y los

compuestos bioactivos que contiene en diferentes estructuras, pueden ser de gran

interés farmacológico en la medicina tradicional (actividad antiespasmódica,

purgativa y antibacterial).

De igual manera, esta planta tiene una especial importancia desde el punto

de vista agrícola dado que ha mostrado tener actividad insecticida sobre varias

especies plaga de interés para la agricultura mexicana (Toledo, 2001).

La obtención y utilización de metabolitos con actividad tóxica sobre

insectos, a partir del cultivo in vitro de I. intrapilosa, puede ser una alternativa

importante del manejo integrado de plagas, tales como S. frugiperda. Además,

desde el punto de vista ecológico, productos naturales de este tipo pueden ser

más “amigables” con el ambiente por ser biodegradables y no ser tóxicos para los

usuarios de productos agrícolas y para los consumidores.

Sin embargo, es necesario ensayar diferentes condiciones de cultivo in vitro

para la obtención de los metabolitos con actividad tóxica, extraerlos de las células

21

con diversos disolventes y mediante bioensayos, evaluar la actividad insecticida

de cada extracto.

22

4. HIPÓTESIS

Condiciones particulares de cultivo (combinaciones hormonales e

iluminación [luz-oscuridad constante]), ocasionan que los cultivos callogénicos de

I. Intrapilosa desarrollen características morfológicas que afectan la actividad

biológica insecticida.

5. OBJETIVO GENERAL

Analizar el desarrollo de características morfológicas de cultivos

callogénicos de I. Intrapilosa y el efecto que manifiesten en la actividad biológica

insecticida

5.1 OBJETIVOS PARTICULARES

5.1.1- Crecer callos de I. intrapilosa usando dos condiciones hormonales y

en presencia y ausencia de luz.

5.1.2.- Evaluar la actividad insecticida de los extractos hexánicos,

clorofórmicos y metanólicos de los cultivos callogénicos de I. Intrapilosa en larvas

neonatas de S. frugiperda.

5.1.3.- Establecer si existe alguna relación entre la morfología de callos y la

actividad bioinsecticida.

23

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 Materiales

6.1.1 Recolección y preparación del material biológico vegetal.

Las semillas de Ipomea intrapilosa fueron colectadas de árboles maduros

del municipio de Xochitepec, Morelos, en una zona de selva baja caducifolia,

alrededor de marzo-abril de 2002. En el laboratorio las semillas fueron sometidas

a limpieza (para eliminar el exceso de polvo) y eliminación del abundante vilano

(“pelos” que recubren la semilla). Con objeto de eliminar insectos parásitos, las

semillas limpias se conservaron a 4º C hasta su uso. Antes de ser sembradas, las

semillas necesarias para la experimentación fueron seleccionadas, revisando que

estuviesen completas, sin parásitos y sin defectos visibles. Muestras de 200

semillas fueron escarificadas (raspadas) manualmente con lija de agua (No 220), a

fin de adelgazar la testa y favorecer la hidratación del embrión.

6.1.2 Reactivos.

Los reactivos utilizados para la elaboración del medio MS, así como los

reguladores de crecimiento vegetal fueron marca Sigma Co (St Louis, USA). Los

fijadores utilizados en el procesamiento de las muestras para histología fueron

marca Electrón Microscopy Sciences (Washington, USA) y Merck (Darmstadt,

Alemania), el medio de parafina para embeber las muestras fue marca Paraplast,

Oxford (St Louis, USA) y la resina de montaje para las preparaciones fue de Merck

(Darmstadt, Alemania).

6.1.3 Medios de cultivo.

El medio empleado para el cultivo de callos fue el medio Murashigue y

Skoog (MS) al 50 % para la germinación de semillas y al 100% adicionado con las

diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal (ANA y cinetina)

para la inducción a callogénesis; los medios fueron gelificados con Fitagel (3.8 g/l).

El proceso de esterilización se llevó a cabo en una esterilizadora marca TOMY

SS-325E a 121 ºC durante 20 minutos.

24

6.1.4 Insecto

Los insectos utilizados para la realización de los bioensayos se obtuvieron

del laboratorio de Control Biológico del Centro de Investigación en Biotecnología

de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos, donde se mantiene el cultivo

constante de la especie de insecto plaga Spodoptera frugiperda.

6.2 Iniciación del cultivo de callos

6.2.1 Desinfección de semillas.

Las semillas escarificadas se lavaron en una solución jabonosa ligera y

enjuagadas varias veces con agua corriente a fin de eliminar restos de jabón.

Inmediatamente, en condiciones de esterilidad (campana de flujo laminar,

Labconco modelo 36100 00), las semillas lavadas se desinfectaron

sumergiéndolas por tiempos definidos en soluciones desinfectantes como sigue

(soluciones porcentuales v/v): etanol 96 %, 5 min; etanol 70 %, 5 min, hipoclorito

de sodio comercial (Cloralex 6 %) 5 %, 5 min; 10 %, 10 min; 15 %, 5 min.

Finalmente las semillas desinfectadas fueron lavadas 5 veces, 5 min cada vez,

con agua destilada estéril. Desinfección y lavados fueron realizados siempre en

agitación constante (Gómez 2001; Pichardo 2004).

6.2.2 Germinación de semillas y obtención de plántulas.

Usando pinzas estériles, las semillas desinfectadas fueron colocadas en

frascos de vidrio de 6 cm de diámetro y 9.5 cm de altura (cinco semillas por

frasco) conteniendo 50 ml de medio MS al 50% (apéndice 1). Para inducir la

germinación, los frascos con las semillas se mantuvieron en el cuarto de cultivo de

luz constante (18 µmol m-2 s-1) a 25°C ± 1º C. Bajo estas condiciones, las semillas

de I. intrapilosa comenzaron a germinar después de 5 días de cultivo (Gómez,

2001; Vázquez, 2002; Gómez, 2003, Pichardo, 2004; Vera, 2005).

6.2.3 Inducción de callogénesis.

De plántulas de cinco días de edad y bajo condiciones de esterilidad, se

cortaron segmentos de hipocótilo de 1cm de longitud aproximadamente,

colocándose cinco segmentos en cada frasco con 30 ml de medio sólido MS al

25

100 % de nutrimentos, adicionado con las dos combinaciones de reguladores de

crecimiento sugeridas por Gómez (2001): ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM y ANA

18.09 µM.

Para la obtención de callos verdes se sembraron 30 frascos con ANA 13.57

µM + cinetina 1.1µM y 30 frascos con ANA 18.09 µM, los frascos se mantuvieron

bajo condiciones de luz constante (18 µmol m-2 s-1) a 25° C; de igual manera para

la obtención de callos albinos se sembraron 30 frascos con ANA 13.57 µM +

cinetina 1.1µM y 30 frascos con ANA 18.09 µM pero a diferencia de los callos

verdes, éstos se mantuvieron en condiciones de oscuridad constante a una

temperatura de 25° C. Todos los frascos con los explantes (luz y oscuridad) se

mantuvieron por espacio de 45 días antes de cosechar los callos, realizando

resiembras cada 15 días en medio fresco MS con el respectivo tratamiento de

fitoreguladores.

6.2.4 Obtención de extractos

Se siguió la metodología propuesta por Gómez (2001) para la obtención de

los extractos de cada tratamiento. Al cabo de los 45 días los callos se sacaron de

los frascos de cultivo e inmediatamente se congelaron con nitrógeno líquido a –70

°C, y se almacenaron en bolsas plásticas por separado y a continuación se

liofilizaron a 200 mbar de vacío (equipo Heto modelo maxidry Iyo) con el objeto de

extraer todo el contenido de humedad del tejido. Una vez que fueron

deshidratadas las muestras se registró el peso seco de cada una y se procedió a

moler los callos con ayuda de un mortero de porcelana; finalmente el polvo

obtenido de cada muestra se dividió en tres partes iguales, las cuales fueron

colocadas en matraces de vidrio (por triplicado) para su maceración.

Para la obtención de los extractos vegetales, al contenido de cada uno de

los tres matraces de cada tratamiento (luz, oscuridad y combinaciones de

fitorreguladores) se les adicionaron tres disolventes seleccionados con base en su

polaridad: hexano, cloroformo y metanol (en este orden) en una proporción de

1:10 (p/v). A continuación, la maceración en cada disolvente se dejó reposar por

26

espacio de 48 horas en condiciones de oscuridad y a temperatura ambiente

(Vázquez, 2002). Una vez que el disolvente extrajo la mayoría de los compuestos

solubles en él, los macerados fueron homogenizados mediante vibraciones

ultrasónicas (Fisher Scientific FS20) durante 60 min.

Para recuperar el disolvente con los solutos disueltos de cada muestra, los

macerados se filtraron a vacío en un embudo Buchner de porcelana con una base

de papel filtro (Whatman No. 5). De este procedimiento se recuperaron por

separado, el disolvente y la biomasa de callos pulverizados. La biomasa

recuperada y secada al ambiente fue retornada a un matraz limpio para adicionar

el siguiente disolvente. La operación fue repetida una vez más con un tercer

disolvente.

El disolvente recuperado para cada muestra, se concentró por evaporación

(Evaporador rotatorio Büchi modelo B-177) a presión reducida y una temperatura

de 60 °C; el agua de enfriamiento en el condensador tenía una temperatura entre

3 y 10 ºC. La presión utilizada fue de 335 mbar para el hexano, 474 mbar para el

cloroformo y 337 mbar para el metanol. Finalmente, los extractos se guardaron en

frascos color ámbar hasta su utilización en los bioensayos.

Para el cálculo del rendimiento y concentración de extracto se procedió de

la siguiente manera: se registro el peso de un cubreobjeto (manipulado con

pinzas) en el que se colocaron 15 µl de extracto; posteriormente estos

cubreobjetos se introdujeron a una estufa (80° C) durante una hora; transcurrido

ese tiempo los portaobjetos se sacaron de la estufa y se dejaron a que adquirieran

la temperatura ambiente, pesándose nuevamente. Una vez que llegaron a peso

constante se registro el peso y por diferencia de peso entre cada cubreobjetos

sólo y el cubreobjetos con extracto se calculó la cantidad de solutos totales.

Finalmente, tomando en cuenta la cantidad de biomasa (peso seco) que se dejó

macerar en cada tratamiento, los mililitros de extracto obtenidos y la cantidad de

solutos totales obtenidos por diferencia de peso, se calculó el rendimiento de

extracción para cada tratamiento (Pichardo, 2004; Vera, 2005).

27

6.3 Bioensayos para determinar toxicidad.

Para la realización de los bioensayos se utilizaron placas para ensayos de

ELISA del tipo Cells Wells de 24 pozos (2 cm2 de superficie por pozo) que

contenían una dieta merídica sólida utilizada para la cría del insecto (apéndice 2)

para evaluar cada extracto se utilizaron dos placas.

En cada pozo se aplicaron 35 µl de la solución de cada extracto preparada

con el disolvente respectivo, excepto el extracto metanólico el cual se disolvió

utilizando una solución de surfactante INEX-A (1µl de surfactante en 1889 µl de

agua destilada); posteriormente las placas se dejaron secar a temperatura

ambiente. La concentración de los extractos ensayada fue de acuerdo a los

criterios usados por Gómez (2001), Vázquez (2002), Pichardo (2004) y Vera

(2005), estableciéndose un máximo de 200 µg/cm2 de superficie como un límite no

tolerable para larvas neonatas (esta concentración representó un exceso para una

mezcla cruda de un extracto vegetal compuesto por una mezcla diversa de

componentes químicos. La sobrevivencia por arriba de esta concentración fue

indicativo de no toxicidad, mientras que en el caso contrario un producto podría

considerarse como potencial.

Una vez seco el extracto y con ayuda de un pincel fino, se colocó una larva

de primer estadio de S. frugiperda en cada uno de los pozos, cada placa se cubrió

con una película de papel plástico (kleen pack) con el fin de que las larvas no

escaparan, sobre el papel se hizo una pequeña perforación con un alfiler para

evitar que las larvas se asfixiaran, se utilizaron 48 larvas para cada tratamiento,

con 2 repeticiones. Las larvas se mantuvieron a 27ª C ± 1 ºC por 7 días,

después de los cuales se contaron las larvas muertas de cada tratamiento. El

control negativo utilizado en todos los casos fue agua con surfactante (Lina, 1996;

Gómez, 2001; Vázquez, 2002; Pichardo, 2004; Vera, 2005). A los datos de

mortalidad obtenidos de forma porcentual se les realizó una transformación

arcoseno y una prueba de anova (Zar, 1999).

28

6.4 Morfología de tejidos

Con el fin de comparar la morfología y la estructura interna de los callos se

tomaron muestras de tejidos de los diferentes tratamientos (luz, oscuridad y

concentraciones de reguladores de crecimiento) los cuales fueron fijados con

para-glutaraldehido, deshidratados e Incluidos en paraplast. Posteriormente se

hicieron los cortes en un microtomo marca Leica (modelo RM2125RT), la tinción

de los tejidos se hizo con azul de toluidina al 0.05 % (Gómez, 2003; Vera 2004;

Cortés, 2004). Finalmente se montaron con Entellan para observarse al

microscopio (marca Nikon, modelo Eclipse E 400)

29

7. RESULTADOS Y DISCUSION

7.1 Inducción a formación de callo

A partir de los explantes de hipocótilo de I. intrapilosa sembrados como se

detalla en la sección de métodos, se desarrollaron callos con diferente coloración.

En todos los casos, de forma general entre los 3 a 5 días de cultivo, se inició el

hinchamiento de los explantes y la formación de callo dio principio alrededor de la

cuarta semana, siendo a partir de los extremos del corte donde se generó callo

incipiente. Finalmente, después de 5 semanas se observó la formación total de

callo en los explantes. Este resultado es comparable con lo obtenido por Gómez

(2003), Pichardo (2004) y Vera (2005) quienes expusieron explantes de hipocotilo

de I. murucoides a diferentes auxinas a la concentración de 13.57 µM, en estos

trabajos a la séptima semana se pudo observar la desdiferenciación completa del

explante y la completa formación de callo. En términos generales, hemos podido

observar una respuesta positiva de varias especies arbóreas de Ipomoea para

responder positiva y rápidamente al cultivo in vitro.

En el caso de los tratamientos de luz en ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM y

ANA 18.09 µM, se desarrollaron callos compactos de color verde claro y pequeñas

porciones de color verde oscuro. En 3 explantes cultivados en ANA 18.09 µM y 7

de los cultivados en ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM se llegaron a desarrollar

raíces adventicias delgadas de color verde (cuadro 2).

Al comparar estos datos con lo obtenido por Gómez (2003) y Vera (2005)

utilizando explantes de hipocotilo de I. murucoides crecidos en ANA 13.57 µM bajo

las mismas condiciones de iluminación y con fotoperiodo, se presentaron

diferencias en la coloración de los callos ya que en esos trabajos, se observó la

generación de callos de color crema y albinos de consistencia friable, mientras que

a la concentración de 4.52 µM obtuvieron callos verdes compactos con raíces

adventicias. Pichardo (2004) reportó que al utilizar las mismas condiciones

igualmente con I. murucoides, obtuvo callos verdes compactos que en algunos

casos presentaron rizogénesis.

30

En el caso de los callos obtenidos con los tratamientos ANA 13.57 µM +

cinetina 1.1µM y ANA 18.09 µM crecidos en oscuridad, se desarrollaron callos de

consistencia friable y con coloración blanquecina; en 27 explantes crecidos con

ANA 13.57 µM + cinetina 1.1µM y 5 crecidos en ANA 18.09 µM también hubo

formación de raíces adventicias delgadas y largas, de color blanquecino (cuadro

2).

Dado que hubo formación de raíces adventicias en algunos de los explantes

sometidos a luz y oscuridad, se puede inferir que el proceso de rizogénesis en

células competentes no depende exclusivamente de las condiciones de luz para

esta especie. En este sentido Mukherjee et al. (2001), al estudiar las

características histológicas, morfológicas y bioquímicas de callos embriogénicos y

no embriogénicos generados por el efecto de diferentes combinaciones

hormonales (auxinas/citocininas) en I. batatas, observaron que los callos

embriogénicos y no embriogénicos eran morfológicamente diferentes y aunque no

mostraban variación en la coloración antes del evento embriogénico, la respuesta

de crecimiento de los callos varió tanto por el genotipo como por la composición

hormonal del medio.

7.2 Producción de biomasa

La producción de biomasa total en peso seco obtenida por los callos de los

diferentes tratamientos se cuantificó después de liofilizar las muestras. En todos

los casos hubo diferencias, siendo mayor la producción de biomasa (28.2 g) en el

tratamiento de luz ANA 13.57 + cinetina 1.1µM, seguido con 17.8 g en ANA 18.09

µM en oscuridad, ANA 13.57 + cinetina 1.1µM oscuridad con 13.0 g y finalmente

ANA 18.09 µM luz con 7.2 g como se muestra en la figura 1.

En este sentido, la respuesta de esta especie en presencia de citocininas

coincide con lo expuesto en la literatura, ya que al ser un regulador de crecimiento

que promueve la división celular, hay una mayor acumulación de biomasa, la cual

se ve afectada de manera diferente por la presencia o ausencia de luz (Rost et

al., 1997; Kyte y Kleyn, 2003).

31

Cuadro 2. Respuesta a callogénesis de explantes de hipocótilo de I. intrapilosa

cultivados in vitro en condiciones de luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante durante

45 días.

Calloalgunespon

ANCalloporciofriable

Caamesp

32

ANA 18.09 µM Luz constante s de color verde claro con amarillo enas regiones, de aspecto friablejoso y algunas porciones compactas

ANA 13.57 + cin 1.1 µM luz constante Callos de color verde claro conporciones color verde oscuro, de aspectocompacto aunque con pequeñasregiones friables

A 18.09 µM oscuridad constante s de color blanquecino con algunasnes color amarillo claro, de aspecto

ANA 13.57 + cin 1.1 µM oscuridad constante

llos de color blanquecino con porcionesarillo cremoso, de aspecto friableonjoso

LuzANA 18.09

A 13.57 cin1.105

1015

20

25

0

ramosg(gramos)

ANANA13.57 µM + cin. 1.1µM ANA 18.09 µM

c

Figura 1. Peso seco obtenido en reguladores de crecimiento ANA 13.5condiciones de luz (18 µmol m-2 s-1) y os

En este caso no es posible

diferente al efecto combinado de

auxina/citocinina) o a la concentrac

expuestos a la combinación auxina-c

la condición de luz y oscuridad cons

auxina, donde la concentración de

menor cantidad de biomasa práct

oscuridad constante. A este respec

de los callos estuvo influenciado t

crecimiento como por la condición de

En el estudio antes referido d

incremento en el peso seco de cal

consecuencia de la alta actividad me

estrés. En el caso del tratamiento A

una condición de estrés que favorec

tratamientos de auxina-citocinina s

suponer que la presencia de citocin

incremento en masa por aumento

33

obsOsc

3 Peso seco

150 callos por tratamiento, cultivados con los 7 µM + cinetina 1.1µM y ANA 18.09 µM en curidad constante (datos únicos).

observar si los callos responden de manera

los reguladores de crecimiento (auxina,

ión de estos, ya que en el caso de los callos

itocinina, la producción de biomasa es alta en

tante, a diferencia de los tratamientos sólo con

ANA es mayor (18.09 µM), ya que se obtuvo

icamente en las dos condiciones de luz y

to se puede decir que el efecto de crecimiento

anto por la combinación de reguladores de

luz.

e Mukherjee et al. (2001) se menciona que el

los embriogénicos estudiados puede ser una

tabólica inducida por condiciones distintas de

NA 18.09 µM, parece ser que la oscuridad es

ió el crecimiento celular. Sin embargo, en los

e observa un efecto inverso, lo que hace

ina generó un estado metabólico en el cual el

en el número de células fue menor que el

incremento en tamaño dado por una división celular más lenta pero con

incremento en volumen celular, lo que explicaría acumular una mayor cantidad de

biomasa

7.3 Rendimiento de extractos

Al cuantificar la cantidad de sólidos totales presentes en los 4 tratamientos

con los disolventes evaluados, se observó que el extracto metanólico de los callos

cultivados en ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM oscuridad y ANA 18.09 µM en luz y

oscuridad, tuvieron el mayor rendimiento respecto a los demás disolventes. Al

comparar los extractos por condición luz/oscuridad, entre ambos tratamientos

hormonales, se observa una diferencia significativa entre los extractos metanólicos

de ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM (t0.05,2=-17.15, p<0.05) y los extractos hexánicos

de ANA 18.09 µM (t0.05,2=-13.1891, p<0.05).

La comparación por regulador de crecimiento en condición de luz, muestra

diferencia significativa entre los tratamientos hexánicos (t0.05,2=6.63, p<0.05),

clorofórmicos (t0.05,2=6.11, p<0.05) y metanólicos (t0.05,2=-9.9563, p<0.05). En

condición de oscuridad, se observa diferencia significativa entre los extractos

hexánicos (t0.05,2=-6.94, p<0.05) y clorofórmicos (t0.05,2=4.87, p<0.05) de ambas

combinaciones de reguladores, pero no hay diferencia en el caso del extracto

metanólico (cuadro 3).

De lo anterior se concluye que, la oscuridad estimula un incremento de

sólidos totales presentes en los extractos metanólicos de ANA 13.57µM + cinetina

1.1µM y hexánico ANA 18.09, µM y que de manera general, los cultivos en ANA

13.57µM + cinetina 1.1µM tanto en luz como en oscuridad, tienen una mayor

acumulación de solutos.

A este respecto llama la atención que el tratamiento ANA 13.57 + cinetina

1.1 µM crecido en oscuridad, aunque tuvo una menor producción de biomasa, la

presencia de sólidos totales fue mayor que en la condición de luz del mismo

tratamiento, lo que podría sugerir que una parte importante del metabolismo, en

34

vez de dirigirse a preparar a las células a dividirse y crecer, se canalizó a la

síntesis alternativa de compuestos para compensar la ausencia de enzimas

metabólicamente importantes probablemente ausentes como respuesta a la falta

de luz, ya que la expresión genética de varias enzimas, como la charcona sintasa,

y la ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa, cuyas secuencias promotoras están

reguladas por luz (Gerats, et al., 1999).

Cuadro 3. Cuantificación de los sólidos totales (mg) de los extractos obtenidos a partir de callos de I. intrapilosa cultivados en medio MS adicionado con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM y ANA 18.09 µM bajo condiciones de luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante.

Tratamiento Disolvente Luz constante (mg) Oscuridad constante (mg) (X ± E.S.)

Hexano 10.30 ± 1.85 a A 10.13 ± 0.33 a A

Cloroformo 9.36 ± 0.91 a A 7.0 ± 1.17 a A

ANA 13.57+ cin 1.1µM

Metanol 29.86 ± 1.96 a A 537 ± 40.09 a B

Hexano 1.86 ± 0.11 b A 14.06 ± 1.41 b B

Cloroformo 3.36 ± 0.47 b A 4.23 ± 0.57 b A

ANA 18.09 µM

Metanol 333.1 ± 41.77 b A 444.43 ± 15.60 a A

*La comparación por disolvente entre regulador de crecimiento se marca con letras minúsculas iguales (no diferencia) o diferentes (diferencia significativa). *La comparación por disolvente entre luz y oscuridad se marca con letras mayúsculas iguales (no diferencia) o diferentes (diferencia significativa).

Wang y Lincoln (2004) mencionaron que de manera general aunque la

composición relativa de mezclas de compuestos está bajo un riguroso control

genético, la concentración relativa de estos es fuertemente afectada por factores

ambientales; en este trabajo los autores estudiaron la contribución del genotipo y

de los factores físicos en la producción de compuestos de defensa en hojas de

Myrica cerifera en diferentes hábitats, observando que la concentración de

compuestos en las plantas expuestas a la luz solar es mayor que en las plantas

expuestas a la sombra y que dichos compuestos probablemente funcionan como

disuasivos al ataque de herbívoros. En el sentido antes expuesto, es posible que

este efecto se deba a que las plantas crecidas bajo sombra están en desventaja

35

energética y deben decidir si la energía y nutrientes disponibles se canaliza a la

síntesis de compuestos o de biomasa.

Del mismo modo, se ha visto que en plantas intactas, la exposición a la luz

y otros factores metabólicos pueden afectar la asimilación de nitrógeno y por tanto

la síntesis de compuestos nitrogenados, como alcaloides. La asparagina y la

glutamina son los aminoácidos más abundantes en el xilema y floema y funcionan

como compuestos clave en la asimilación de nitrógeno inorgánico y transporte de

compuestos nitrogenados, la expresión de las enzimas responsables de su

biosíntesis son altamente sensibles a la luz (Oliveira et al., 2001).

7.4 Pruebas de toxicidad

Para evaluar biológicamente los extractos obtenidos por la maceración de

los callos cultivados en ANA 13.57 µM + cinetina 1.1 µM y ANA 18.09 µM en

condiciones de luz y oscuridad constante, se realizaron ensayos de mortalidad

sobre larvas de primer estadio del insecto plaga S. frugiperda.

Todos los extractos obtenidos de los tratamientos fueron tóxico; el mayor

porcentaje de mortalidad ocurrió con los extractos hexánicos y clorofórmicos de

ambos tratamientos hormonales, tanto en luz como en oscuridad (figura 2 y 3). El

menor efecto fue registrado con los extractos metanólicos. Estadísticamente, las

concentraciones hormonales usadas no fueron diferentes de manera significativa

en lo que a mortalidad se refiere (F0.05,1=0, p>0.05). Lo mismo ocurrió cuando se

analizaron los datos derivados de las condiciones de iluminación (F0.05,1=3.001,

p>0.05). Sin embargo, la diferencia entre los extractos preparados con los

diferentes disolventes si fue significativa (F0.05,2=24.608, p<0.05).

Estos datos de mortalidad sobre larvas de S. frugiperda concuerdan con

lo reportado por Vázquez (2002) quien evaluó los extractos hexánicos,

clorofórmicos y metanólicos de callos de I. intrapilosa generados a partir de

hipocotilo, raíz y pecíolo en ANA 18.09 µM en condiciones de luz constante. Este

autor reportó que con una concentración de 20 µg cm-2 de los extractos

36

clorofórmicos obtuvo el 80 % de mortalidad y con 200 µg cm-2 obtuvo el 100 % de

mortalidad para los extractos hexánicos y clorofórmicos.

Hex

ano

Clo

rofo

rmo

Met

anol

Agua

0

20

40

60

80

100

Porcentaje mortalidad

Disolvente extracto

ntrol

obs

Co

Luz

Control Luz Osc

Figura 2. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con los extractos hexánicos, clorofórmicos y metanólicos de callos de I. intrapilosa cultivados 45 días en medio MS adicionado con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM en luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante. (n=48 para cada tratamiento, p>0.05).

Hex

ano

Clo

rofo

rmo

Met

anol

Agua

02040

60

80

100

Porcentaje mortalidad

Disolvente extracto

Control

Luz

obs

Control Luz Osc

Figura 3. Porcentaje de mortalidad de larvas neonatas de S. frugiperda con los extractos hexánicos, clorofórmicos y metanólicos de callos de I. intrapilosa cultivados 45 días en medio MS adicionado con ANA 18.09 µM en luz (18 µmol m-2 s-1) y oscuridad constante (n=48 para cada tratamiento, p>0.05).

37

Por otra parte Pichardo (2004) obtuvo de manera similar una mayor

mortalidad en S. frugiperda con los extractos clorofórmicos; sin embargo, al

comparar la mortalidad obtenida utilizando ANA, AIA y 2,4-D para generar los

callos, los valores más elevados los obtuvo al utilizar 2,4-D como fuente de auxina.

Estos valores concuerdan con lo que observó Vera (2005) al evaluar la

actividad insecticida de I. murucoides. Este autor realizó ensayos en larvas de S.

frugiperda y Epilachna varivestis, utilizando los extractos metanólicos,

clorofórmicos y hexánicos provenientes de callos de 30, 60 y 90 días obtenidos a

partir de hipocotilo y cotiledón, crecidos en medio MS adicionado con dos

concentraciones de 2,4-D, AIA y ANA; bajo condiciones de fotoperiodo de 16

horas luz y 8 de oscuridad. Aunque el mayor porcentaje de mortalidad en el

trabajo de Vera (2005) se obtuvo con los extractos metanólicos y clorofórmicos

provenientes de los callos de 60 días cultivados con 2,4-D, la mortalidad sólo fue

significativa con el tipo y la concentración del extracto; observándose que el efecto

del regulador de crecimiento, las dos concentraciones ensayadas y el tipo de

explante, no tuvieron un efecto significativo en la mortalidad. De manera similar,

con los callos de 90 días la mortalidad en las larvas fue significativa en función del

tipo y concentración del extracto, así como con la concentración del regulador de

crecimiento; sin embargo no hubo un efecto importante por el tipo de regulador de

crecimiento.

En este trabajo parece no haber diferencia en la síntesis de los compuestos

responsables del efecto de la mortalidad ya que esta se observa por igual en los

tratamientos de luz y oscuridad, sin embargo, no es posible saber con estos datos

si la luz afecta la producción en presencia-ausencia o si se presenta un posible

efecto en la proporción de los compuestos tóxicos sintetizados, sin que este

cambio produzca un cambio visible en estos experimentos de mortalidad.

7.5 Morfología de tejidos

Las características estructurales de los explántes después de 45 días de

cultivo fuero como sigue: en el caso de los callos generados con ANA 18.09 µM

38

cultivados en luz constante (Figura 4A) la estructura general interna estuvo

formada por células pequeñas de tipo parenquimático, de forma irregular. En la

zona correspondiente a la parte compacta del callo no se observan espacios

intercelulares, pero en las zonas correspondientes al callo friable se aprecian

espacios celulares dentro del tejido. Así mismo se observaron restos de haces

vasculares (elementos traqueales) del explante original, así como células con

pared secundaria. Al interior de las células parenquimáticas es posible observar la

presencia de inclusiones cercanas a la membrana celular.

En los callos generados con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM en luz constante

(Figura 4B) se observó que el tejido estuvo formado por células parenquimáticas

irregulares en forma y tamaño, sin espacios intercelulares en la zona de callo

compacto; sólo se observa una delgada pared primaria.

También se presentaron regiones con células laxas en la zona de callo friable.

Así mismo se observó la presencia de elementos traqueales dispersos de novo

(no preexistentes), algunos unidos pero sin formar haces vasculares, la pared

secundaria con perfecta ornamentación anillada en algunas células y en otras

reticulada (Figura 4B).

En los callos generados con ANA 18.09 µM cultivados en oscuridad constante

(Figura 5A), aunque el tejido se observó ligeramente dañado se pudo apreciar que

estuvo formado por células parenquimáticas. En algunas células se observó

parte de la pared secundaria y también se presentaron secciones de tejido que

mostraban parte del explante original.

Finalmente, en los callos generados con ANA 13.57µM + cinetina 1.1µM en

oscuridad constante (Figura 5B) se observó que en el tejido predominaban las

células parenquimáticas alargadas en una zona, pero en otra zona fueron más

redondas con indicios de rediferenciación a través de los elementos traqueales de

novo dispersos en ciertas áreas del tejido.

39

de I

dura

40

ET = Elementos Traqueales

HV = Haz Vascular

IN = Inclusiones

PP = Pared Primaria

PS = Pared Secundaria

Fig

. in

nte

A

ura 4. Aspectos diversos de la estructura de callos generados a partir de hipoc

trapilosa cultivados in vitro en condiciones de luz constante (18 µmol m-2

45 días: (A): ANA, 18.09 µmol y (B) ANA 13.57 µmol + Cin 1.11 µmol.

A

A

B

B

ótilo

s-1)

Estas observaciones concuerdan con lo observado por Gómez (2003), ya que en

este trabajo, al hacer el estudio anatómico comparativo de explantes de I.

murucoides expuestos a diferentes auxinas (ANA, AIA y 2,4-D) a la concentración

de 13.57 µM y a luz constante, observó que los explantes mostraron cambios

estructurales a partir del séptimo día. A la segunda semana, aún se observaban

restos del explante original con grandes espacios intercelulares y células

meristemáticas y a partir de la cuarta semana, además, se observaron grupos de

células con inclusiones y revascularización de los cultivos.

Asimismo, Vera (2005) al realizar el análisis comparativo de toxicidad a S.

frugiperda y el aspecto anatómico entre diferentes explantes de I. murucoides

expuestos a diferentes reguladores de crecimiento y fotoperiodo de 16 horas luz a

los 30, 60 y 90 días de cultivo, observó que en el explante de hipocotilo cultivado

en ANA 13.57 µM durante 30 días, el tejido aún conservaba rastros del explante

original ya que al exterior se distinguía la epidermis adaxial unistratificada seguida

de parénquima en empalizada.

Al interior del tejido hubo grupos de células parenquimáticas con espacios

intercelulares en los que se observaron muy pocos cloroplastos; cabe señalar que

el extracto clorofórmico de este tratamiento, fue el que produjo la mayor reducción

de peso en larvas neonatas del insecto plaga mencionado.

En el caso de los callos de 60 días cultivados en ANA 4.52 µM, Vera (2005)

menciona que el tejido estuvo formado por células parenquimáticas con algunas

zonas meristemoides. Al evaluar la actividad insecticida de los extractos

obtenidos de los callos generados entre las diferentes condiciones de explante,

auxina y concentración, el extracto hexánico de este tratamiento, fue el que menor

actividad mostró. Respecto al establecimiento de alguna relación entre la

morfología de callo y la actividad insecticida no se observó algún patrón de

organización del tejido único, por lo que no fue posible establecer alguna relación

morfología-actividad en los tratamientos ensayados.

41

Figura 5. Aspectos diversos de la estructura de callos generados a partir de hipocótilo de I. intrapilosa cultivados in vitro en condiciones de oscuridad constante (18 µmol m-2 s-1) durante 45 días: (A): ANA, 18.09 µmol y (B) ANA 13.57 µmol + Cin 1.11 µmol.

42

8. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos muestran que I. intrapilosa, es una especie vegetal

que puede responder con la misma eficiencia a la formación de callo durante su

cultivo in vitro en condiciones de luz y oscuridad constante, cuando se utiliza

medio MS adicionado con el regulador de crecimiento vegetal ANA 18.09 y ANA

13.57+ cin 1.1 µM.

La producción de los compuestos solubles en metanol durante el cultivo in

vitro de I. intrapilosa en medio MS adicionado con ANA 13.57+ cin 1.1µM se ve

fuertemente incrementado cuando el cultivo se mantiene en condiciones de

oscuridad.

Si bien en un tratamiento es posible observar un haz vascular como

reminiscencia del explante original y en otros formación incipiente de elementos

traqueales, el aspecto general interno de los callos cultivados en condiciones de

luz y oscuridad constante con los tratamientos hormonales ANA 18.09 y ANA

13.57+ cin 1.1 µM, es el de tejido desdiferenciado formado básicamente por

células parenquimáticas.

La producción de biomasa y el aspecto morfológico externo de los callos

generados (verdes/albinos, friables/compactos) se ven afectados por el tipo de

regulador de crecimiento empleado (ANA / ANA-cinetina) y por la condición de luz

y oscuridad constante empleada durante el cultivo in vitro de I. intrapilosa.

Aunque el aspecto morfológico externo de los callos crecidos en

condiciones de luz y oscuridad constante no presenten una diferencia clara en lo

que a estructura se refiere, la actividad biológica insecticida se mantiene con una

alta probabilidad de contar con productos novedosos que puedan ser originados

bajo las diferentes condiciones de obtención e incubación de callos de I.

intrapilosa.

43

9.0 PERSPECTIVAS

En este trabajo se observó que se mantiene la capacidad de síntesis de los

compuestos con la actividad insecticida de I. intrapilosa. Sin embargo, dado que

no se conoce la naturaleza química de los compuestos, su concentración ni su

proporción con respecto a otros compuestos, es de gran interés conocer la

estructura de estos compuestos, para posteriormente determinar si existe algún

cambio en la síntesis de estos compuestos bajo diferentes condiciones de

reguladores de crecimiento vegetal y de exposición a luz.

También es deseable probar otras combinaciones hormonales, cultivo en

suspensión y elicitadores, con el fin de optimizar la producción de biomasa y de

los compuestos de interés en los cultivos.

Es de interés hacer un seguimiento histológico de los eventos morfogénicos

que se suceden durante el proceso de desdiferenciación y rediferenciación de los

explantes originales y encontrar la posible relación de estructura-capacidad

sintética del tejido.

Hacer evaluaciones de toxicidad con otras especies de insectos plaga que

permitan ampliar el espectro de acción de los compuestos, así como con otras

especies de insectos no plaga para determinar la inocuidad de los compuestos en

especies no blanco.

44

10. LITERATURA CITADA

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11. APÉNDICES.

I.- Soluciones para la preparación de medio Murashigue y Skoog (MS)

► Sol. A, aforar a 500 ml con agua destilada estéril (25 ml/ l de medio).

REACTIVO FÓRMULA QUÍMICA CANTIDAD (g) Nitrato de amonio NH4NO3 33.00 Nitrato de potasio KNO3 38.00 Sulfato de magnesio MgSO4.7H2O 7.40 Sulfato de potasio KH2PO4 3.40

► Sol B, aforar a 100 ml con agua destilada estéril (5 ml/ l de medio).

Cloruro de calcio CaCl2H2O 8.8

► Sol. C, en 50 ml de agua destilada estéril tibia disolver el sulfato ferroso, por

separado disolver en 50 ml de agua destilada estéril el EDTA, vaciar lentamente la

sol. de EDTA sobre el sulfato ferroso en agitación (2 ml/ l de medio).

Sulfato de ferroso FeSO4 1.39 Sulfato de potasio NaFe2EDTA 1.86

► Sol. D, aforar a 100 ml con agua destilada estéril (1 ml/ l de medio).

Sulfato manganoso MnSO4H2O 2.23 Sulfato de Zinc ZnSO47H2O 0.86 Ácido bórico H3.BO3 0.62 Ioduro de potasio KI 0.083

► Sol. Vitamínica, aforar a 100 ml con agua destilada estéril (1 ml/ l de medio).

Ácido nicotínico 0.1 Piridoxina-HCl 0.1 Tiamina 1 Glicina 0.2

► Mio-inositol (1.0 g) aforar a 100 ml de agua destilada estéril (10 ml/ l de medio).

► Sacarosa, 30 g/ l, ajustar pH= 5.7

► Fitagel 3.8 g/ l de medio,

54

II. Dieta para Spodoptera frugiperda

Ingredientes para preparar un litro de dieta:

Ingredientes Cantidad Harina de soya 71.1 g Germen de trigo 31.7 g Sales Wesson 10.6 g Sacarosa 13 g Metil-paraben 1.6 g Ácido sórbico 1.0 g Ácido ascórbico 4.3 g Agar 14 g Sol. Vitamínica 3.5 ml Sol. Ácido acético (25%) 12 ml Sol. Formalina (10%) 4.4 ml Sol. Cloruro de colina (15%) 7.3 ml Agua destilada 1000 ml

Ingredientes para prepara sol. vitamínica, aforar a 35 ml con agua destilada:

Ingredientes Cantidad (g) Pantotenato de calcio 0.42 Niacinamida 2.31 Riboflavina 0.105 Ácido fólico 0.0525 Tiamina 0.0525 Biotina 0.0042 Vitamina B12 (Axofor Plus) 0.875 ml

Licuar los ingredientes secos (excepto el agar, el cual se disuelve en 500 ml

de agua destilada caliente, dejar hervir por espacio de 5 minutos a temperatura

baja) en 500 ml de agua destilada, posteriormente agregar las vitaminas y las

55

demás soluciones, al final vaciar el agar caliente, una vez bien incorporados todos

los ingredientes se puede vaciar en moldes.

III. Fijación de tejidos

► Paraglutaraldehido, aforar a 250 ml con buffer de fosfatos

Sol. paraformaldehido al 1.5 % pH=7.2 37.5 ml

Sol. glutaraldehido al 3% 15.0 ml

Buffer de fosfatos 197.5 ml

Sacarosa 2.0 g

► Buffer de fosfatos, ajustar pH=7.2

Fosfato de sodio dibásico (2.37 g / 200 ml) 72.6 ml

Fosfato de sodio monobásico (1.816 g/ 200 ml) 27.4 ml

► Deshidratación e Inclusión

● Serie de alcoholes

Etanol 30 % 1 hora Etanol 50 % 1 hora Etanol 70 % 1 hora Etanol 80 % 1 hora Etanol 90 % 1 hora Etanol 100 % 1 hora Etanol 100 % 1 hora

● Serie Etanol: Xilol

4:1 24 horas 3:2 24 horas 1:3 24 horas Xilol absoluto 5 minutos

● Serie Xilol: Paraplast

3:1 48 horas en estufa a 60 ªC 2:2 48 horas en estufa a 60 ªC 1:3 48 horas en estufa a 60 ªC Paraplast 15 días en estufa a 60 ªC

● Incluir en Paraplast 100%

56

IV. Tinción con azul de toluidina

Xilol 100 % 10 min Xilol 100 % 10 min Etanol absoluto 5-10 min Etanol 96 % 10 min Etanol 70 % 10 min Etanol 50 % 10 min Etanol 30 % 10 min Etanol 10 % 10 min Teñir con azul de toluidina aprox. 30 seg Enjuagar el exceso de colorante con agua destilada Etanol 10 % meter y sacar rápido Etanol 30 % meter y sacar rápido Etanol 50 % meter y sacar rápido Etanol 70 % meter y sacar rápido Etanol 96 % meter y sacar rápido Etanol 100 % meter y sacar rápido Xilol 100% meter y sacar rápido Montar en Entellan Eng. 2(1):29-48.

57