INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA

LINEA 4BIOLOciA MOLECULAR Y BIOTECNOLOciA DE PLANTAS

4.1 Mecanismos moleculares involucrados en la adaptaci6n de las plantas al deficit de agua4.2 Las hormonas como reguladoras del balance hfdrico en plantas4.3 Caracterizaci6n estructural y funcional de osmolitos y protefnas inducidas por el estres hfdrico4.4 Estudio de la regulaci6n de la expresi6n genetica durante el estres hfdrico4.5 Caracterizaci6n de genes inducidos por acido absdsico en un cultivo de celulas

en suspensi6n de frijol (Phaseolus vulgaris)4.6 Caracterizaci6n de genes inducidos por acido absdsico y acido jasm6nico en un cultivo

de celulas en suspensi6n de frijol (Phaseolus vulgaris L.)4.7 Cultivo de tejidos vegetales4.8 Caracterizaci6n de una mutante albina de Arabidopsis thaliana obtenida por inserci6n

de un T-DNA4.9 Caracterizaci6n de mutantes fotosinteticas de Arabidopsis y mafz4.10 Regulaci6n metab6/ica de la fotosfntesis4.11 La levadura como un modelo para el aislamiento de genes involucrados en la respuesta

de la planta a estres salino y osm6tico4.12 Analisis genetico-molecular de la inducci6n de la termotolerancia en levaduras y plantas

vasculares4.13 Arquitectura de la pared celular en plantas superiores4.14 La respuesta de las rafces al medio ambiente: el papel de la cofia en rafces de Zea mays

y Arabidopsis thaliana4.15 Transporte de solutos a traves de membranas de celulas vegetales4.16 Transporte de so/utos a traves de la membrana peri bacteroidal4.17 Mecanismos de transporte con el potencial de conferir tolerancia a la salinidad en plantas

superiores

PROGRAMA 4.1Mecanismos moleculares involucrados en laadaptaci6n de las plantas al deficit de agua

Los organismos vivos responden a los cambiosen el medio ambiente de formas diversas. Lasplantas, por tener caracterfsticas especiales, co-mo pueden ser, entre otras, la falta de movimien-to y sus estrategias de crecimiento y desarrollo,presentan particularidades en sus respuestasque las hacen diferentes, de manera global, alasya descritas para otros organismos vivos. Por

otro lado, desde el nacimiento de la agricultura,el hombre ha buscado diferentes formas para laobtenci6n de variedades vegetales que puedancontender contra los cambios en el medio am-biente que provocan importantes perdidas en loscultivos.

Por 10 mencionado resulta interesante el co-nocer con mayor profundidad los mecanismosque utilizan los vegetales para adaptarse a loscambios ambientales.

Hemos dirigido nuestros esfuerzos a entenderc6mo las plantas responden al deficit de agua, ya

INFORME ANUAL 1995

que los mecanismos necesarios para lograr el ba-lance de agua adecuado deben participar en ungran numero de procesos biologicos, asf comoen la respuesta a otras condiciones de estrescomo serfan el calor, el frfo y la osmolaridad (sa-linidad).

Para el estudio de este problema biologicoelegimos dos plantas dicotiledoneas como mo-delos experimentales, Phaseolus vulgaris y Arabidopsisthaliana. La primera tiene gran importancia agrfco-la en nuestro pafs y sus cultivos se yen afectadosdrasticamente por los periodos de sequfa. La se-gunda es una planta que aunque carece de im-portancia agrfcola presenta ventajas notablescomo modelo experimental.

Estamos interesados de manera primordial enlos mecanismos moleculares involucrados en es-ta respuesta; sin embargo, trataremos de enmar-carlos dentro de algun proceso fisiologico quenos permita integrarlos alas funciones celu-lares.

EI objetivo general de este proyecto es el co-nocer los mecanismos moleculares que contro-Ian la respuesta de la planta al deficit de agua.Dado que este es un fenomeno complejo, nues-tro enfoque analiza aquel tipo de respuestas queinvolucran la sfntesis de protefnas de novo y cuyaregulacion de alguna manera depende de ciertashormonas vegetales conocidas, como 10 son elacido abscfsico (ABA) y el acido jasmonico (JA).

- Aislamiento y caracterizacion de genes especffi-cos que participan en la respuesta a deficit deagua en frijol

j. M. COLMENERO, F. CAMPOS, R. M. SOL6RZANO y A A

COVARRUBIAS

1991/l/DBMP-Cambios en la composicion de la pared celular

vegetal durante el deficit de agua: caracteriza-cion de algunas protefnas y sus genes

M. HERNANDEZ, B. GARCIA y A A COVARRUBIAS

1991/l/DBMP

PROGRAMA 4.2Las hormonas como reguladoras del balancehfdrico en plantas

Los niveles de acido abscfsico (ABA) se elevan enrespuesta al deficit de agua, 10 cual tiene comoconsecuencia el cerrado de los estomas evitandode esta manera que la planta siga perdiendo aguapor transpiracion. Multiples observaciones sugie-ren que el ABA tam bien pudiera participar en laregulacion osmotica de la celula vegetal. Es denuestro interes el entender la funcion del ABAcomo un mediador celular de ciertos mecanis-mos inducidos por el deficit de agua.

- Participacion de las protefnas de matriz extra-celular vegetal en la respuesta a estres osmotico

B. GARCIA y A A COVARRUBIAS

I992/P/DBMP-Caracterizacion de genes involucrados en la res-

puesta a ABA en frijolR. M. SOL6RZANO, ). M. COLMENERO y A A COVARRUBIAS

1991/I/DBMP- Estudios sobre el papel de acido abscfsico en la

germinacion de A. thalianaA A COVARRUBIAS y A GARCIARRUBIO

1991/P/DBMP

PROGRAMA 4.3Caracterizacion estructural y funcionalde osmolitos y protefnas inducidaspor el estres hfdrico

Entre las estrategias adaptativas de las plantas a lasequfa, las plantas de "resurreccion" representanun caso unico ya que toleran una deshidratacionsevera, al igual que los embriones de las semillas.

Se ha encontrado un grupo de protefnas indu-cidas durante la sequfa en hojas y en callos de laplanta de resurreccion africana Craterostigma planta-gineum. Las donas de cDNA que corresponden a la

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mayorfa de estas protefnas, han sido aisladaspor hibridizaci6n diferencial. La secuencia delDNA de algunos de estos genes revela que codifi-can para protefnas de posible funci6n osmopro-tectora. Recientemente algunos de estos geneshan sido transferidos a tabaco para estudiar elefecto fisiol6gico de estas protefnas al ser expre-sadas en plantas sensibles a la sequfa. Asimismo,se han localizado algunas de las protefnas indu-cidas durante la sequfa en Craterostigma, por mediodel microscopio electr6nico, en el citosol yen elestoma y los tilacoides de los cloroplastos.

Por otro lado, se sabe que en los microorga-nismos, algunos invertebrados y plantas que so-breviven a la sequfa, se acumulan solutos com-patibles con el metabolismo como respuesta a ladesecaci6n, ejerciendo un efecto osmorregula-dor. En las plantas de "resurrecci6n" los osmorre-guladores mas conocidos son sacarosa, que seacumula en C plantagineum, y trehalosa presenteen la planta nativa de Mexico, Selaginella lepidophylla.Este disacarido tiene ademas una funci6n comoprotector de estructuras subcelulares en ausen-cia de agua. En otras plantas de tolerancia mode-rada a la sequfa 0 salinidad, se acumula prolinao glicfn-betafna en respuesta al estres osm6tico.Por ultimo, se ha encontrado que en las semi-lias de algunos cereales los embriones madurosacumulan polioles como parte del mecanismomolecular para mantener viables alas semillasdurante la latencia. La sobreexpresi6n en plantastransgenicas de algunos de estos compuestospodrfa contribuir al mejoramiento para la tole-rancia a la sequfa.

-Caracterizaci6n de la senal de transporte al c10-roplasto en la protefna 3-06 de Craterostigma

A. CARTAJENA Y G. ITURRIAGA

1991/1!DBMP

-Aislamiento del gene de la Trehalosa -6-P sinta-sa de Selaginella lepidophylla

R. ZENTELLA Y G. ITURRIAGA

I 993/P/DBM P

-Obtenci6n del gene que codifica para la betafnaldehfdo deshidrogenasa de Amaranthus hypochon-driacus

J. LEGARIA Y G. ITURRIAGA

I 993/P/DBMP

-Sobreexpresi6n de la aldosa reductasa de ceba-da en plantas transgenicas

J. w. AYALA Y G. ITURRJAGA

I 993/P/DBMP

- Mutagenesis de protoplastos de tabaco con T-DNA para la selecci6n de mutantes que tolerenel est res osm6tico

J. W. AYALA, R. GAXIOLA Y G ITURRIAGA

I 993/P/DBMP

PROGRAMA 4.4Estudio de la regulaci6n de la expresi6ngenetica durante el estres hfdrico

EI mecanismo por el cual el estres hfdrico es trans-ducido en expresi6n genetica aun es desconoci-do. Se sabe que el fitorregulador acido abscfsico(ABA) esta involucrado en este proceso Los ge-nes que responden al est res sintetizando protef-nas osmoprotectoras deben ser activados porfactores de transcripci6n que coordinen la expre-si6n simultanea de los genes durante la sequfa.Como un primer paso en la disecci6n molecularde la transducci6n de la senal del estres hfdrico,se decidi6 aislar genes que codifiquen para fac-tores de transcripci6n de la planta Craterostigma.Uno de dichos genes, Cpm I 0, se regula por ABA ycodifica para un factor con alta homologfa a laoncoprotefna Myb de los vertebrados. EI papel quejuega CpmlO en la sequfa esta siendo dilucidado.En la actualidad, se estan caracterizando algu-nos de estos genes a nivel molecular.

- Estudio molecular y fisiol6gico de los genes myben Craterostigma

R. GHARAIBEH, F. HERNANDEZ Y G. ITURRIAGA

1991/1/DBMP

INFORME ANUAL '995

PROGRAMA 4.5Caracterizaci6n de genes inducidos por acidoabscfsico en un cultivo de celulas ensuspensi6n de frijol (Phaseolus vulgaris)

La colonizaci6n por las plantas de varios nichosecol6gicos ha sido posible gracias a la evoluci6nde mecanismos para contender con condicionesadversas. Estos mecanismos induyen la activa-ci6n, en su mayor parte a nivel transcripcional. degenes cuyos productos intervienen en la protec-ci6n de la planta mientras la situaci6n de estresperdura, a la vez que ayudan a su recuperaci6n alreanudarse las condiciones favorables. Distintosgrupos de genes son activados bajo diferentescondiciones de estres, sin embargo, estos con-juntos estan, al menos parcialmente, traslapa-dos. Se ha reportado que los reguladores del cre-cimiento vegetal. acido abscfsico (ABA) y acidojasm6nico (JA) median la conversi6n de variostipos de est res en cambios en expresi6n geneticaen plantas. Los tratamientos de varias especiesvegetales con ABA 0 jA dan lugar a la aparici6n devarias protefnas comunes, por 10 que se cree queambas hormonas podrfan formar parte de la mis-ma cadena de transmisi6n de la selial de estres.

En nuestro grupo se ha iniciado la caracteriza-ci6n molecular de la respuesta de un cultivo decelulas en suspensi6n de frijol. Pl1aseolus vulgaris, ala acci6n de ABA y lA, asf como de la interrelaci6nque guardan estos compuestos en la cadena deseliales desde que se produce el estres hasta quese dispara la expresi6n de los genes especfficos

Cuando se aliade a un cultivo de celulas en sus-pensi6n de friiol (Pl1aseolus vulgaris) ABA 10-4 M, seinduce daramente la acumulaci6n de cinco pro-tefnas de 14, 22, 36, 60 Y 70 KD. Estas protefnas es-tan siendo caracterizadas. Por otra parte, se hanconstruido genotecas de DNA complementario apartir de RNA mensajero de cultivos inducidospor jA 10-5 M 0 ABA 10-4 M. Mediante hibridacio-nes diferenciales se han identificado varias donasespecfficas de los tratamientos con las hormo-nas. Estas donas habran de ser caracterizadas ff-sica y funcionalmente. Posteriormente, se aisla-ran donas gen6micas correspondientes alas DNAc

con el fin de estudiar la regulaci6n de la expre-si6n genetica en el mismo sistema de celulas ensuspensi6n, asf como en plantas transgenicas.

-Caracterizaci6n y purificaci6n de las protefnasinducidas por ABA y IA en un cultivo de celulas ensuspensi6n de friiol

L. RODRiGUEZ, E. SANTARROSA, P LEON Y M. ROCHA

1991/1/DBMP

-Obtenci6n y caracterizaci6n de donas de DNAde genes inducidos por ABA y jA

M. J CARMONA, J M. COLORADO, B. GARCiA, P LEON Y M.

ROCHA

I 992/P/DBMP

PROGRAMA 4.6Caracterizaci6n de genes inducidos por acidoabscfsico y acido jasm6nico en un cultivo decelulas en suspensi6n de frijol (Phaseolusvulgaris L.)

La colonizaci6n por las plantas de varios nichosecol6gicos ha sido posible gracias a la evoluci6nde mecanismos para contender con condicionesadversas. Estos mecanismos induyen la activa-ci6n, en su mayor parte a nivel transcripcional.de genes cuyos productos intervienen en la pro-tecci6n de la planta mientras la situaci6n deestres perdura, a la vez que ayudan a su recupe-raci6n al reanudarse las condiciones favorables.Distintos grupos de genes son activados bajodiferentes condiciones de estres, sin embargo es-tos conjuntos estan, al menos parcialmente, tras-lapados Se ha reportado consistentemente quelos reguladores del crecimiento vegetal acidoabscfsico (ABA) y acido jasm6nico (IA) median laconversi6n de varios tipos de est res en cambiosen expresi6n genetica en plantas. Los tratamien-tos de varias especies vegetales con ABA 0 jA danlugar a la aparici6n de varias protefnas comunes,por 10 que se cree que ambas hormonas podrfanformar parte de la misma cadena de transmisi6nde la selial de estres

INS TIT U TOO E B lOT· E C N 0 LOG i A

En nuestro grupo se ha iniciado la caracteriza-cion molecular de la respuesta de un cultivo decelulas en suspension de frijol, Pnaseo/us vulgaris, ala accion de ABA y lA, asf como la relacion queguardan estos compuestos en la cadena de sena-les desde que se produce el estres hasta que sedispara la expresion de los genes especfficos.

Dos han sido las estrategias que hemos segui-do para lograr nuestro objetivo por una parte seha empezado a caracterizar y purificar protefnasque aparecen al anadir las hormonas al mediode cultivo; por otra, hemos construido genote-cas de DNA complementario (DNAC). Con respectoa la caracterizacion de protefnas inducidas parABA, hemos identificado un grupo de protefnasque son exportadas al medio de cultivo. Dos deellas han sido purificadas y se estan generandoanticuerpos en raton. Por otro lado, siguiendo di-versas metodologfas, estamos comenzando aidentificar, aislar y caracterizar clonas especfficasde la induccion por IA. por una parte utilizando lametodologfa llamada "differential display" se hanidentificado y cion ado varios segmentos de ge-nes inducidos par la hormona, estos se estan uti-lizando como sondas para la identificacion en lasgenotecas de DNAC de las clonas respectivas. Dosde los segmentos obtenidos de esta manera hansido secuenciados y las secuencias obtenidascomparadas de datos. Esta comparacion nos hapermitido saber que uno de ellos corresponde almensajero para la enzima acetil coenzima A. car-boxilasa y el otro a un retrotransposon. Se estanaislando clonas genomicas pertenecientes a es-tos genes con el fin de estudiar su expresion enel mismo sistema de celulas en suspension asfcomo en plantas transgenicas. Por otra parte, he-mos clonado varios segmentos generados por lareaccion en cadena de la polimerasa (PCR) corres-pondientes a la enzima lipoxigenasa, involucradaen la sfntesis de lA, y se ha analizado el patron deacumulacion del mensajero correspondiente, enrespuesta a distintos tipos de estres.

inducidas por ABA y jA en un cultivo de celulasen suspension de frijol

E. SANTARROSA, L. RODRiGUEZ Y M. ROCHA-SOSA

1991/P/DBMP

-Obtencion y caracterizacion de clonas de DNAC

de genes inducidos por jA

B. GARCiA, J. M. CARMONA Y M. ROCHA-SOSA

I 992/P/DBMP

-Caracterizacion del gene de la lipoxigenasa in-ducido por IA

H. PORTA, J. M. COLORADO Y M. ROCHA-SOSA

I 994/1/DBMP

PROGRAMA 4.7Cultivo de tejidos vegetales

Desarrollo de tecnicas de regeneracion y multi-plicacion de diversas variedades par cultivo invitro de tej idos vegeta les.

Las tecnicas de regeneracion y micropropaga-cion de plantas, estan basadas en la caracterfsti-ca de totipotencialidad de la celula vegetal. Estacaracterfstica, permite generar de un fragmentode tejido vegetal, un tejido desdiferenciado a par-tir del cual se puede inducir el desarrollo de unanueva planta. Existen diferentes vfas de regene-racion de plantas, y dependiendo de los objeti-vos finales, se emplea una u otra vfa. Entre lasmas comunes estan a) la regeneracion a partirde meristemos, cuya principal ventaja es la degenerar plantas libres de patogenos; b) regenera-cion por organogenesis a partir de callos desdi-ferenciados. Dadas la alta tasa de division celulary la consecuente variabilidad genetica que estoproduce (variacion somoclonal), esta tecnica seha empleado para la generacion de nuevas varie-dades; c) regeneracion por embriogenesis soma-tica, la cual consiste en promover el desarrollode embriones a partir de un tejido desdiferen-ciado. Esta tecnica tiene como ventajas el queno afecta el genotipo de la planta y que permitela multiplicacion masiva de la planta madre.

Actualmente en el laboratorio se esta traba-jando en los siguientes proyectos: a) regenera-cion de frijol a partir de meristemos, con el obje-

INFORME ANUAL 1995

tivo de obtener plantas libres de pat6genos y conellas producir semillas certificadas con caracte-rfsticas fitosanitarias 6ptimas; b) regeneraci6n ymultiplicaci6n de Valeriana edulis, con el objetivode tener una metodologfa que permita por unlado, rescatar un recurso en peligro de extinci6ny por otro, el desarrollar una estrategia que per-mita la producci6n de esta planta para satisfacersu demanda en la industria farmaceutica; c) rege-neraci6n y multiplicaci6n por embriogenesis so-matica de variedades criollas de cebolla. Esteproyecto tiene como objetivo el de generar plan-tas de cebolla libres de pat6genos y el de tener lametodologfa de multiplicaci6n de variedadesnacionales que permitan satisfacer la demandainterna de semilla certificada de cebolla.

eRegeneraci6n de frijol a partir de meristemosF. FLORES Y M. LARA

1991/I/DBMPeRegeneraci6n y multiplicaci6n de Valeriana edulis

P CASTILLO, F. FLORES Y M. LARA

1991/I/DBMPeRegeneraci6n y multiplicaci6n por embriogene-

sis somatica de variedades criollas de cebollaP. L6PEZ Y M. LARA

I 993/I/DBMP

PROGRAMA 4.8Caracterizaci6n de una mutante albinade Arabidopsis thaliana obtenidapor inserci6n de un T-DNA

Uno de los problemas para el analisis molecularde un gen mutante en organismos superiores essu aislamiento de una manera sencilla. Esto sepuede hacer facilmente si la mutaci6n es genera-da a traves de la inserci6n de un segmento deDNA bien caracterizado. En plantas se ha logradoesto ultimo usando elementos transponibles co-mo AdDs de mafz, 0 bien, el T-DNA del plasmidoTi de Agrobacterium tumefaciens

Mediante este ultimo enfoque se gener6 una

colecci6n de mutantes en Arabidopsis tnaliana. Unade estas mutantes fue seleccionada por nuestrogrupo para su estudio. La planta mutante pre-senta las siguientes caracterfsticas: lIeva una mu-taci6n recesiva que provoca un fenotipo albino,este fenotipo esta asociado a la presencia del T-

DNA; en estudios de microscopfa se encontr6 quela mutaci6n impide el desarrollo normal del clo-roplasto. Debido alas caracterfsticas menciona-das, pensamos que esta mutante es de gran inte-res para ayudar a comprender a nivel molecularel desarrollo del cloroplasto en plantas superio-res, de ahf que, nuestro objetivo inicial sea el decaracterizar al gen cuya mutaci6n provoca el fe-notipo albino, asf como el de tratar de identificarla funci6n de la protefna para la cual codifica.

Usando como sonda un segmento del T-DNAse ha clonado el gene mutante a partir de unagenoteca construida con DNA total de la plantamutante. Una vez caracterizada la clona que con-tenfa al gene mutante se aislaron varias clonasde DNA complementario (DNAC). Una de estas clo-nas ha sido completamente secuenciada, partede la clona mutante tambien fue secuenciada. Enla comparaci6n hecha con las secuencias alma-cenadas en un banco, se encontr6 que la secuen-cia nucleotfdica de este gene, al cual hemos de-nominado 119, tenfa un alto grado de similitudcon un gene que se encontraba en un oper6nfotosintetico en la bacteria Rnodobacter capsulatus.Datos obtenidos de experimentos de hibridaci6ncontra RNA aislado de la planta silvestre y de laplanta albina, nos han permitido demostrar queno hay RNA mensajero especffico de 119 en estaultima. Ademas, hemos encontrado que la acu-mulaci6n del mensajero especffico responde a lapresencia de luz. Utilizando diferentes sondascorrespondientes a igual numero de genes, tantofotosinteticos como no fotosinteticos, hemos de-mostrado que en la planta albina la expresi6n degenes fotosinteticos se encuentra reprimida, estoocurre tanto para genes nucleares como para clo-roplasticos.

Por otro lado, se ha obtenido una clona gen6-mica con la cual se esta tratando de complemen-tar a la planta mutante, con el fin de demostrar

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sin lugar a dudas que el fenotipo albino se debea la mutaci6n en el gene 119. Asimismo, con laayuda de esta ultima dona se lIevaran a cabo es-tudios de regulaci6n de la expresi6n geneticaTambien se trataran de obtener anticuerpos con-tra el producto de 119 que permitan localizaresta protefna a nivel subcelular Este proyecto serealiza en colaboraci6n con la Dra. AlejandraMandel, de la Universidad de California en SanDiego, y con el Dr Luis Herrera Estrella, del Cin-vestav-I rapuato

eAnalisis del patr6n de aparici6n de RNA mensa-jero del gene 119 en A tl1aliana en respuesta adistintas condiciones de crecimiento y en rela-ci6n a su expresi6n en distintos 6rganos de laplanta

G. PEDRERO, P LEON Y M. ROCHA

1991/P/DBMP

eAnalisis de la regi6n de control del gene 119 enplantas transgenicas

G. PEDRERO, P LEON Y M. ROCHA

I 992/P/DBMP

eLocalizaci6n subcelular del producto del gene 119G. PEDRERO, P LEON Y M. ROCHA

I 992/P/DBMP

eCompiementaci6n de la planta mutante con elgene 119 silvestre

P LEON, A. MANDEL, L. HERRERA-EsTRELLA Y M. ROCHA

I 992/P/DBMP

PROGRAMA 4.9Caracterizaci6n de mutantes fotosinteticasde Arabidopsis y mafz

La obtenci6n y caracterizaci6n de mutantes hapermitido el descubrimiento de un gran numerode genes importantes en diferentes procesos me-tab61icos asf como el entendimiento de la fun-ci6n de dichos genes Uno de los problemas parael analisis molecular de un gene mutante en or-ganismos superiores es su aislamiento de unama nera senci lIa. Esto se puede hacer faci 1mente

si la mutaci6n es generada a traves de la inser-ci6n de un segmento de DNA bien caracterizado.En plantas se ha logrado esto ultimo usando ele-mentos transponibles, como AdDs de mafz, 0

bien, el T-DNA del plasmido Ti de Agrovacterium tu-mefaciens.

a) Caracterizaci6n de una mutante albina de Ara-vidopsis tl1aliana obtenida por inserci6n de un T-DNA

Mediante el uso de T-DNA se gener6 una colecci6nde mutantes en Aravidopsis tl1aliana. (Feldman, K. etal 1991, Science 243 1351-1354); una de estas mu-tantes fue seleccionada por nuestro grupo parasu estudio. La planta mutante presenta las si-guientes caracterfsticas Ileva una mutaci6n rece-siva que provoca un fenotipo albino, este fenotipoesta asociado a la presencia del T-DNA; en estu-dios de microscopfa se encontr6 que la muta-ci6n impide el desarrollo normal del doroplastoDebido alas caracterfsticas mencionadas, pen-samos que esta mutante es de gran interes paraayudar a comprender a nivel molecular el desa-rrollo del doroplasto en plantas superiores, deahf que nuestro objetivo inicial sea el de caracte-rizar al gene, denominado DEFt, cuya mutaci6nprovoca el fenotipo albino, asf como el de tratarde identificar la funci6n de la protefna para lacual codifica

Inicialmente se obtuvieron donas de DNAC ygen6micas de DEFI, dichas donas fueron secuen-ciadas. La secuencia nudeotidica determinada fuecomparada con los bancos de datos. Se encontr6que esta secuencia tenfa 55.9% de identidad conun gene que se encontraba en un oper6n fotosin-tetico en la bacteria Rl1odovacter capsulatus AI com-parar las secuencias de las protefnas deducidasde la secuencias nudeotfdicas de ambos genesse encontr6 que ten fan 544% de identidad.

Como se mencion6 ya, la protefna DEFI es se-mejante a una protefna codificada en un oper6nfotosintetico de R capsulatus, por 10 tanto, pensa-mos que serfa mas sencillo caracterizar la protef-na y el gene correspondientes de la bacteria Coneste objetivo, haciendo uso de la metodologfadenominada "Reacci6n en Cadena de Polimera-

INFORMf ANUAL 1995

sa" (PCR), hemos amplificado los segmentos delos genes correspondientes de las bacterias R cap-sulatus y R sphaeroides, mediante la utilizaci6n de dosprimeros complementarios a amaas cadenas delgene de R. capsulatus A estos segmentos se les haintroducido un marcadar de resistencia a espec-tinomicina, ~-glucuronidasa para que, par recom-binaci6n hom610ga, se mute al gene bacteriano.Esta mutante se utilizara en distintas pruebasfenotfpicas que nos ayudaran a determinar lafunci6n de la protefna DEFI.

Par otra parte, se han obtenido anticuerposcontra una fusi6n proteica y la glutation reducta-sa sobreexpresada en E coli. Estos anticuerposestan siendo utilizados para localizar subcelular-mente a DEFI y para analizar el patr6n de apari-ci6n de esta protefna durante el desarrollo de laplanta yen sus diferentes 6rganos, asf como parabuscar a esta protefna en otras plantas y otrosorganismos Datos preliminares demuestran lapresencia de DEFI en mafz y coliflor.

b) Identificaci6n de mutantes fotosinteticas demafz a partir de mutantes generadas por el trans-pos6n Mu

Plantas como el mafz presentan variantes en elproceso de fotosfntesis como la denominada fo-tosfntesis tipo C4; en estas plantas existe un ni-vel mas de regulaci6n que involucra la expresi6ncelula especffica para los genes fotosinteticos.Actualmente poco se conoce de los mecanismosde regulaci6n involucrados en la diferenciaci6n yfuncionamiento de los diferentes tipos celularesen plantas C4. La generaci6n y caracterizaci6n demutantes que afecten tanto en el desarrollo comoen la diferenciaci6n de las celulas donde se reali-za la fotosfntesis permitira un mejor entendi-miento tanto del proceso de diferenciaci6n celulary subcelular como de los aspectos de regulaci6ndurante la fotosfntesis. Por otra parte, estas mu-tantes pueden ser usadas para la identificaci6n yaislamiento de genes importantes para dichoproceso EI mafz como modelo de estudio pre-senta algunas ventajas, por un Jado, es tal vez unade las plantas mas estudiadas a nivel genetico y

molecular, por el otro, en esta planta se han ais-lado y caracterizado secuencias de transposici6nque permiten la mutagenesis y al mismo tiempoel abanderamiento de los genes causantes dedicho fenotipo.

- Localizaci6n subcelular de la protefna DEFIG. PEDRERO, L. F JIMENEZ', P LEON Y M. ROCHA-SOSA

1994/P/D BM P/* FC-Caracterizaci6n del gene de Rodobacter correspon-

diente a DEFIC TREJO, 'G. DREYFUS, M. ROCHA-SOSA Y P LEON

1994/P/DBM P/* I FC

- Estudio de la regi6n de control del gene DEFIG. PEDRERO, J. M. ESTEVEZ, P LEON Y M. ROCHA-SOSA

1992/P/DBMP

-Clonaci6n de los genes correspondientes a DEFIde otras plantas

A. ARROYO, C TREJO, M. ROCHA-SOSA Y P LEON

I994/1/DBMP

-Obtenci6n y caracterizaci6n de mutantes foto-sinteticas de mafz generadas por el transpos6nmutador

M. L. GUTIERREZ, 'v. WALBOT Y P LEON

1994/1/DBMP/U. Stanford

- Expresi6n genica en la cofia de la rafz del mafz(lea mays)

X. ALVARADO, R. LUJAN Y G. CASSAB

1993/1/DBMP

-Aislamiento y caracterizaci6n de mutantes enArabidopsis thaliana en hidrotropismo y producci6nde mucflago

D. EAPAN, G. PONCE Y G. CASSAB

I993/1/DBM P

PROGRAMA 4.10Regulaci6n metab61ica de la fotosfntesis

Aunque durante mucho tiempo ha sido reconoci-do que existe un mecanismo de autorregulaci6nde la fotosfntesis por los niveles de carbono, elmecanismo a nivel molecular de esta regulaci6nes aun desconocido. EI descubrimiento reciente

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por el grupo de la Dra. Jen Sheen de que glucosay acetato desencadenan una represi6n global delos genes fotosinteticos en mafz a nivel de trans-cripci6n di6 la primera evidencia para un modelode regulaci6n metab61ica en plantas superiores.AI parecer, este mecanismo de represi6n pareceser universal yes capaz de anular la regulaci6n porluz, tejido especffico y estado de desarrollo. Po-tencialmente esta regulaci6n es la base molecu-lar de la interacci6n entre Fuente y captador(sink-source) Usando el sistema de expresi6ntransitaria con genes quimericos en los que seha fusionado la regi6n promotora de genes foto-sinteticos al gene reportero CAT se demostr6 quela expresi6n de siete diferentes genes fotosinte-ticos de mafz son reprimidos por glucosa Los ex-perimentos realizados hasta el momenta sugie-ren que la actividad de la enzima hexoquinasaes necesaria para detectar la concentraci6n deglucosa intracelular y mandar la senal para la re-presi6n metab6lica. Con el prop6sito de investi-gar este resultado mas a fondo hemos c1onadodos genes de hexoquinasa de Arabidopsis tflaliana atraves de complementaci6n de mutantes de leva-dura. Estos genes fueron secuenciados y la ex-presi6n de ambos analizada bajo diferentes con-diciones de crecimiento.

Ya que la represi6n metab61ica parece ser unfen6meno universal dentro de las plantas supe-riares, es posible la selecci6n, caracterizaci6n ycomplementaci6n de mutantes en Arabidopsis, elcual es un sistema de mas facil manejo en compa-raci6n con mafz. Usando como metodo de selec-ci6n la presencia de un analogo no metaboliza-ble de glucosa, 2-deoxiglucosa, hemos tamizadosemillas de Arabidopsis mutagenizadas ya sea poretil-metano sulfonato 0 par la inserci6n de T-DNA.

Se han seleccionado plantas que en presenciade este analogo permanecen verdes. Se han bus-cado mutantes en un total de 35 000 semillas pa-ra el caso de EMS y 5 000 para el caso de inser-ci6n por T-DNA. Aquellas plantas que parecen serresistentes a la presencia de 2-deoxiglucosa hansido aisladas para la producci6n de semillas y suposterior caracterizaci6n.

eAislamiento de mutantes en represi6n metab6licaP LE6N

I 993/P/DBM P

eEstudio de la expresi6n de genes fotosinteticosen plantas de Arabidopsis crecidas con diferentesconcentraciones de azucaresJ M. ESTEVEZ Y P LE6N

I 994/I/DBM P

La levadura como un modelo para elaislamiento de genes involucrados en larespuesta de la planta a estres salino y osm6tico

Aproximadamente una tercera parte de las tierrasagrfcolas de regadfo en el planeta tienen proble-mas de salinizaci6n, y la mayorfa de las plantascultivadas son muy sensibles a saL Este proble-ma se agudiza en regiones Midas y semiaridasdonde las plantas deben enfrentar, ademas, con-diciones de extrema sequfa. Por otra parte, la tec-nologfa para modificar el suelo 0 el agua de re-gadfo es muy costosa. De esta manera, una delas principales alternativas consiste en mejorargeneticamente la tolerancia de las plantas culti-vadas a salinidad y/o a sequfa.

La levadura Saccflaromyces cerevisiae es reconocidacomo un microorganismo eucariote ideal pararealizar estudios biol6gicos. A pesar de que la le-vadura tiene una complejidad genetica mayorque las bacterias, com parte la mayor parte de lasventajas tecnicas que han permitido un rapidoprogreso en la genetica molecular de procario-tes. Algunas de las propiedades que hacen a lalevadura apta para estudios biol6gicos incluyenun rapido crecimiento, la facilidad de realizar re-plicas y aislar mutantes, un sistema genetico biendefinido y, mas importante aun, un sistema detransformaci6n de DNA muy versatiL

Es pertinente hacer notar que la levadura com-parte con celulas vegetales algunas caracterfsti-

INFORME ANUAL 1995

cas morfol6gicas relevantes para el estudio delos mecanismos de osmorregulaci6n, tales comouna pared celular, vacuolar, y el hecho de queambas son sesiles.

Un escrutinio de los procesos celulares involu-crados en la adaptaci6n de microorganismos yplantas a salinidad sugiere que genes de haloto-lerancia podrfan corresponder a componentescatalftico/regulatorios de cualquier respuesta deprotecci6n (sfntesis de osmolitos, transporte deiones) 0 a procesos metab61icos (sfntesis de pro-tefnas, reacciones biosinteticas) mas sensibles aestres salino. Dada la complejidad de esta res-puesta y puesto que no se han identificado lospasos de protecci6n 0 metab6licos crfticos parala tolerancia a salinidad, no se puede realizar unamanipulaci6n genetica de este importante pro-blema bajo bases racionales.

Algunas caracterfsticas de la respuesta de lalevadura a un est res osm6tico mas general. quepudiera estar dado al exponer a celulas vivas adiferentes medios soluciones con alta osmolari-dad, pudieran compartirse con la respuesta al es-tres salino.

Partiendo de la hip6tesis de que alguno de losmecanismos basicos involucrados en est os tiposde respuestas es similar entre celulas vegetales yun eucariote sencillo como la levadura, conside-ramos que el enfoque funcional de complemen-taci6n de mutantes halo y osmosensibles pudie-ra ser una herramienta importante para poderaislar genes heter610gos, en particular de plantasque participen en estos procesos.

-Genes que participan en la respuesta a estresosm6tico en levaduras y plantas

A. GARAY, F. CAMPOS, G. SMITH, F. CORONA Y A. A. COVA-

RRUBIAS

I 992/P/DBMP

-Genes que participan en la halotolerancia enlevaduras y plantas

R. GAXIOLA, E. BENITEZ, O. MASCORRO Y A. A. COVA-

RRUBIAS

PROGRAMA 4.12Analisis genetico-molecular de la inducci6nde la termotolerancia en levaduras y plantasvasculares

Todos los organismos vivos se caracterizan portener temperaturas 6ptimas para su crecimientoy desarrollo. Las condiciones del medio ambien-te en relaci6n a parametros tales como: tempera-tura, humedad, luz, etc., varfan en el espacio y conel tiempo presentando valores maximos y mfni-mos muy alejados muchas veces de las condi-ciones 6ptimas para las distintas especies. Estoexplica en gran medida la distribuci6n geograficay estacional de los seres vivos. Como resultadodel proceso evolutivo, los organismos poseenmecanismos que les permiten adaptarse alascondiciones cambiantes del medio ambiente. Eneste proyecto se pretende estudiar el 0 los meca-nismos de adaptaci6n a temperaturas supra6pti-mas letales en organismos vivos como la leva-dura S. cerevisiae y en plantas como el mafz, trigo ytabaco.

La gran mayorfa de los organismos vivos tie-nen la capacidad de adaptarse a choques termi-cos severos de alta temperatura siempre y cuan-do sean previamente expuestos a temperaturasmoderadas. A este fen6meno se Ie conoce conel nombre de termotolerancia inducida por calory depende en parte a la expresi6n, tam bien indu-cible por calor, de las "protefnas del est res porcalor" (hsp, acr6nimo del ingles para "heat shockproteins"). En la levadura S cerevisiae se sabe que lainducci6n de la termotolerancia es un fen6menocomplejo que depende de la actividad de variosgenes que conforman distintas rutas transducto-ras de sefiales. Entre estos genes se encuentranlos que codifican para hsp 104 (una hsp de alto pe-so molecular), TPSI y TPSII (enzimas involucradas enla sfntesis del disacarido trehalosaJ, BCKI y MPKI

(cinasas que forman parte de una ruta transduc-tora que responde a sefiales provenientes de lamembrana y las dirige al nucleo celular).

Los objetivos especfficos de este proyecto sonel obtener mutantes de S. cerevisiae que muestrenlos siguientes fenotipos a) deficiencia en la in-

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ducci6n de la termotolerancia (tdJ; b) termotole-rancia constitutiva (tc) Dada 10 complejidad delmecanismo de inducci6n de la termotolerancia,esperamos obtener mutaciones que revelen acti-vida des diferentes alas descritas en el parrafoanterior Actualmente hemos obtenido 15 mu-tantes tc por mutagenesis qufmica Las metasdel proyecto son la donaci6n molecular de estosgenes asf como la caracterizaci6n funcional delas protefnas que codifican

Otro aspecto de la termotolerancia que se pro-pone estudiar es la caracterizaci6n del cDNA quecodifica para hsp98 del mafz. El analisis de la se-cuencia de la dona pJN31 obtenida, sugiere quehsp98 es la protefna hom610ga a pepcl04 de Scerevisiae. La obtenci6n de la dona p]N31 nos per-mitira iniciar la manipulaci6n de un gene posi-blemente involucrado en la termotolerancia enplantas vasculares. Nuestros objetivos a largoplaza son el caracterizar el papel fisiol6gico dehsp98 en mafz, durante la termotolerancia indu-cida yen estreses como la sequfa Se planea ob-tener plantas transgenicas que expresen en excesoo que no expresen del todo hsp98 Es probable,de acuerdo a los datos obtenidos en la levaduraS cerevisiae, que la sobreexpresi6n de hsp98 traigacomo resultado plantas mas termotolerantes.Par el contrario, es posible obtener una disminu-ci6n en la termotolerancia inducida mediante alreducci6n de la expresi6n de hsp98 Por ultimo,estas plantas nos permitiran estudiar si es quealguna de las actividades bioqufmicas afectadaspar el estres termico (fotosfntesis, transpiraci6n,respiraci6n, salida de iones, temperatura en lashojas, etc.) muestra una respuesta diferente alser desregulada la expresi6n de hsp98 Esto nospodrfa ayudar a discernir los blancos celularespara hsp98.

-Obtenci6n de mutantes constitutivos y deficien-tes en la inducci6n de la termotolerancia en Scerevisiae

I L. FOLCH, L. M. MARTINEZ, I S. CASAS Y J NIETO

I 994/P/D BM P

- HSP98 estructura genica, expresi6n y papel du-rante la termotolerancia en mafz, trigo y tabacoC SEGAL, K. B. KANNAN, A VEGA y I NIETO

I 994/P/DBMP

PROGRAMA 4.13Arquitectura de la pared celular en plantassupenores

En este programa se estudia la arquitectura de lapared celular La presencia de la pared celular esuna de las caracterfsticas mas sobresalientes quedistingue alas celulas animales de las celulasvegetales. A pesar de la importancia de la paredcelular en determinar la funci6n de los diferentestipos de celulas vegetales, todavfa se desconocec6mo es que sus componentes se ensamblan enun tipo de celula en particular Para poder enten-der c6mo es que se lIevan a cabo las interaccio-nes entre los diversos componentes de la paredcelular tales como protefnas estructurales (ex-tensinas). pectinas, celulosa, lignina, suberina,etc., utilizamos plantas deficientes en bora comomodelo, puesto que estas plantas son afectadasprincipalmente en la estructura y funci6n de lagran mayorfa de sus paredes celulares, esto es,se comportan como mutantes afectadas en la pa-red celular. Para realizar este proyecto estamosutilizando metodos de bioqufmica y biologfa ce-lular que nos permiten analizar los diferentescomponentes de la pared celular en plantas defi-cientes de boro y control, con la meta de enten-der las interacciones in muro de las protefnas es-tructurales con otros componentes de la pared.Ademas, estamos investigando las posibles inte-racciones entre protefnas del citoesqueleto yprotefnas de la pared celular, en particular entreprofilina yextensina.

Finalmente, tam bien estamos investigando alas protefnas estructurales de la pared celularque aparentemente inhiben la elongaci6n 0 cre-cimiento de la celula vegetaL Se hipotetiza quedicho control se Ileva a cabo par el entrecruza-miento 0 insolubilizaci6n de ciertas protefnas es-tructurales, como las extensinas 0 las protefnas

INFORME ANUAL 1995

ricas en prolina, dentro de la pared. Para ello, es-tamos utilizando como modelo de estudio a plan-tas de frijol que han sido sujetas a estn2s hfdrico,ya que en estas se inhibe completamente el cre-cimiento del hipoc6tilo en la zona de elongaci6nEn la zona de elongaci6n de plantas sujetas aest res hfdrico estamos analizando la expresi6nde extensina y protefnas ricas en prolina, su in-solubilizaci6n y su entrecruzamiento con otroscomponentes de la pared

eCaracterizaci6n de la pared celular de n6dulosde plantas de frijol (Pnaseolus vulgaris L) crecidasen ausencia de boro

c. MERGOLD, L. CASTREJ6N Y G. CASSAB

I 993/I/DBMP

elnteracci6n de profilina con las extensinas dela pared celular

L. CASTREJ6N Y G. CASSAB

1993/I/DBMP

eEl papel de la presi6n de turgor en el entrecru-zamiento de las protefnas estructurales de lapared celular vegetal

C. MERGOLD-VILLASENOR, L. CASTREJ6N Y G. CASSAB

1995/PIDBMP

PROGRAMA 4.14La respuesta de las rafces al medio ambiente:el papel de la cofia en rafces de Zea mays yArabidopsis thaliana

Las rafces de todas las plantas tienen en su apiceun grupo de celulas morfol6gica y fisiol6gicamen-te caracterfstico conocido como la cofia. Desde1914, Haberlandt describi6 tres funciones de lacofia: I) proteger al meristemo radical, 2) permi-tir el paso de la rafz a traves del suelo, 3) percibirel estfmulo gravitacional. La primera y la ultimafunci6n se observa en todas las cofias, ya sea deplantas terrestres, aereas 0 acuaticas. Con respec-to a la segunda funci6n, Haberlandt sefial6 queel mucflago producido por las celulas externasde la cofia facilitaba el crecimiento de la rafz en

el suelo al funcionar como lubricante. Ademas,Darwin en 1880 describi6 otras funciones de la co-fia como son la sensibilidad a la luz (fototropis-mol. al tacto (tigmotropismo), a ta temperatura(termotropismo), ya 10s gradientes de humedad(hidrotropismo). Es evidente que las diversas fun-ciones de la cofia ejercen un papel importanteen la respuesta de las rafces al medio ambiente,yal mismo tiempo contribuyen a la naturaleza ho-meostatica de las rafces. En nuestro laboratorioestamos interesados en seleccionar caracterfsti-cas superiores de las rafces, ya que par 10generalen la producci6n agrfcola han resultado incre-mentos significativos de programas geneticos enlos que unicamente se han seteccionado caracte-rfsticas superiores del tallo. Por 10general, al pen-sar en una planta, s610 se considera al tallo, hojasy flores, pero las rafces normal mente se olvidan.Nosotros estamos investigado caracterfsticas dela rafz que hipoteticamente estan involucradasen el exito de las plantas en la extracci6n de aguadel suelo. Utilizando metodos de genetica y bio-logfa molecular, se estudian las funciones fisiol6-gicas de la cofia con el fin de establecer c6mo esque estas funciones permiten a la rafz crecer nosolamente en varios tipos de suelo, sino tambiena responder a cambios continuos en su medioambiente, tal como la sequfa. Para alcanzar esteobjetivo, el programa se realiza en dos fases. Enla primera fase se examina la expresi6n de genesespecfficos en la cofia de Zea mays ya que en estaplanta se pueden utilizar herramientas de bioquf-mica, biologfa celular y genetica. En la segundafase, se estan aislando y caracterizando mutantesde Arabidopsis tnaliana que afectan funciones de lacofia, tal como su respuesta al hidrotropismo.Hasta la fecha, ya contamos con 11 plantas mu-tantes que no responden al hidrotropismo, yes-tan siendo caracterizadas geneticamente

eExpresi6n genica especffica en la cofia de la rafzde Zea mays.

R. LUJAN, G. PONCE, A. REYES Y G. CASSAB

I 993/P/DBMP

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA

eAislamiento y caracterizacion de mutantes sinrespuesta hidrotropica en Arabidopsis thaliana.

D. EAPAN, G. PONCE Y G. CASSAB

I 994/P/DBMP

eEfecto del gen HVA22 en la organizacion de laso§lulas de la rafz en la cofia de tabaco.

G. PONCE Y G. CASSAB

I 994/P/DBMP

PROGRAMA 4.15Transporte de solutos a traves de membranasde celulas vegetales

Las membranas biologicas funcionan como ba-rreras para el movimiento de solutos polares, queineluyen iones inorganicos y organicos solublesen agua. EI transporte de estos solutos se realizapor medio de protefnas que se encuentran em-bebidas en la matriz lipfdica de las membranasbiologicas, que realizan el movimiento especfficode solutos. EI movimiento selectivo de solutosestablece gradientes de concentracion a travesde las membranas, que pueden ser empleados co-mo una fuente de energfa potencial en forma depotencial electroqufmico. Este es utilizado paraactivar otros procesos de transporte, generar se-fiales electricas 0 para la sfntesis ATP. En el casoparticular de plantas, el transporte de solutos esimportante durante el cielo de vida de estas. Porejemplo, durante la germinacion, el movimientode protefnas, carbohidratos y Ifpidos almacena-dos en la semilla es necesario para mantener elcrecimiento de la plantula; posteriormente, du-rante el estadio vegetativo, el transporte de unagran variedad de solutos entre diferentes orga-nos y dentro de estos, es un prerrequisito para elbuen desarrollo y crecimiento de las plantas; du-rante la polinizacion, el crecimiento del tubo po-Ifnico depende estrechamente de flujos de calciopara mantener su crecimiento y, finalmente, lIe-var a cabo la fertilizacion.

El interes de nuestro grupo es estudiar los me-canismos de transporte presentes en las mem-branas plasmaticas y vacuolar de diferentes ce-lulas vegetales. Uno de nuestros proyectos esta

enfocado al estudio de los mecanismos de trans-porte ionico de la membrana plasmatica de los pe-los radiculares del friio!' asf como su regulacionpor las bacterias del genero Rhizobium, durante lasfases iniciales del establecimiento de la simbio-sis (ver 5.13). Dentro de este proyecto tambien seestan estudiando los procesos que se desenca-denan despues del reconocimiento de los facto-res de nodulacion por las celulas de la planta yque, finalmente, resultan en la formacion del no-dulo rizoidal. Estamos interesados en determinarla posible participacion de elementos de una ca-dena de transduccion de sefiales donde cinasas,fosfatasas y/o protefnas G, pudieran estar involu-cradas.

eTransduccion de sefiales en la interaccion Rhizo-bium etli-fri jol

B. J. BARKLA, R. VERA-ESTRELLA Y O. PANTOJA

I 995/1/DBMP

PROGRAMA 4.16Transporte de solutos a traves de la membramaperibacteroidal

Como resultado del establecimiento de la simbio-sis Rhizobium-Ieguminosa, se lleva a cabo el desa-rrollo de nodulos en las rakes de la planta, don-de el proceso de fijacion de nitrogeno se realiza.Dentro de este, dos tipos de celulas se puedendiferenciar: las celulas infectadas y las celulas noinfectadas. Las primeras son nombradas asf de-bido a que su citoplasma se encuentra ocupadopor los simbiosomas, organelos donde las bac-terias son secuestradas y que presentan las con-diciones propicias para que la fijacion del nitro-geno se lIeve a cabo. EI nitrogeno reducido porlas bacterias en forma de amenia es transporta-do al citoplasma de las celulas infectadas a tra-yes de la membrana peri bacteroidal (membranaque rodea a los simbiosomasJ, suministrando asfel nitrogeno necesario para el optimo desarrollode las plantas. Las plantas, por su parte, suminis-

INFORME ANUAL 1995

tran los compuestos de carbono (principal mentemalato) que las bacterias requieren para la sfnte-sis de ATP durante la respiracion, el cual es nece-sario para la reduccion del nitrogeno atmosferico.Es asf posible que el intercambio de metabolitosa traves de la membrana peribacteroidal desem-pefie un papel importante en la fijacion de nitro-geno Se considera que la membrana peribacteroi-dal es un mosaico, constituida tanto por protefnasde la planta como por protefnas de la bacteria. EIproyecto que se esta desarrollando dentro de estaarea esta enfocado al estudio de los mecanismosde transporte que participan en el movimiento deamonia( 0) y malato a traves de la membrana pe-ribacteroidal, asf como su regulacion por otrosmetabolitos. Determinar el mecanismo de trans-porte activo responsable en la energizacion de es-ta membrana es otro objetivo. Con relacion a esteultimo aspecto, se tiene interes en determinar laposible presencia de una cadena transportadorade electrones como una vfa alterna.

• Estudio de los mecanismos de transporte ioni-co presentes en la membrana peribacteroidalde frijol

B. J. BARKLA, R. VERA-ESTRELLA Y O. PANTOJA

1995/l/DBMP

PROGRAMA 4.17Mecanismos de transporte con el potencialde conferir tolerancia a la salinidaden plantas superiores

La vacuola central de las celulas vegetales juegaun papel crucial en la acumulacion y el almace-

namiento de diversos solutos. Estos incluyen tan-to solutos con una funcion osmotica para el man-tenimiento de la turgencia de las celulas comosolutos que son potencial mente toxicos y quedeben ser secuestrados dentro de la vacuola, le-ios del metabolismo citoplasmatico. A nivel sub-celular, la compartamentalizacion de estos solutosesta controlado por transportadores especfficospresentes en el tonoplasto. Las propiedades deestos transportadores pueden determinar la ca-pacidad de las plantas para tolerar condicionesde estres. Por eiemplo, el secuestro de NaCI enla vacuola, se postula como uno de los mecanis-mos responsables para la sobrevivencia de lasplantas en medios salinos.

En este proyecto, nos enfocaremos a estudiarlos mecanismos de transporte involucrados enla acumulacion de Na en la vacuola, y como es-tos se yen influidos por el estres salino. Nuestroprograma se desarrollara empleando vacuolas yvesiculas purificadas del tonoplasto aisladas apartir de la epidermis, del mesofilo y de la rafz,tanto en condiciones normales como en condi-ciones de alta salinidad. Otro objetivo es c10narel gene que codifica para el antiporte Na/H, ba-sados en la identificacion de una protefna de 170kDa, que posiblemente esta asociada con el anti-porte Na/H. Esta protefna se aislara del tonoplas-to de M. cristallinum para obtener su secuencia. Ba-sados en esta, se desarrollaran oligonucleotidospara su empleo en el muestreo de un banco deexpresion.

• Desalinizacion biologica de suelos salinosB. j. BARKLA, R. VERA-ESTRELLA YO. PANTOJA

J 995/I/DBMP