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Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas volumen especial número 20 01 de abril - 15 de mayo, 2018 4289 Artículo Inoculación de halobacterias fijadoras de nitrógeno en la contribución a tolerancia al estrés salino en frijol tepary Prabhaharan Renganathan 1 Jesús Borboa-Flores 1 Ema Carina Rosas-Burgos 1 José Luis Cárdenas-López 1 Bernardo Murillo-Amador 2 Jesús Ortega-García 3 Edgar Omar Rueda-Puente 1 Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos-Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México CP 83000. ([email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]). 2 Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, SC. Instituto Politécnico Nacional No. 195, Col. Playa Palo de Santa Rita Sur, La Paz, Baja California Sur. CP 23096, México. [email protected]). 3 Departamento de Ciencias Químico Biológicas y Agropecuarias-Universidad de Sonora. Caborca, Sonora, México. CP 83690 ([email protected]). 4 Departamento de Agricultura y Ganadería-Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora, México. CP. 83000. ([email protected]). § Autor para correspondencia: [email protected]. Resumen El frijol tepary tolerante a la sequía (Phaseolus acutifolius A. Gray) es un cultivo microbiológicamente inexplorado en regiones áridas de México donde se consume como fuente de proteína dietética. Sin embargo, la salinidad del suelo dificulta la productividad de este cultivo. El aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno halotolerantes específicas (BFN) podría ser una práctica novedosa para mejorar la tolerancia a la sal y mejorar la productividad de los cultivos. En el presente estudio, se aislaron 24 BFN de semillas de tres ecotipos de tepary expuestos a altas salinidades (0, 0.25 y 0.5 M de NaCl) in vitro. Se caracterizaron cepas halotolerantes fijadoras de Nitrógeno. Entre los aislados halotolerantes, sólo uno mostró alta actividad nitrogenada de 6.97 ±1.1 nmol de cultivo h -1 . A partir del análisis 16S de rRNA, el microorganismo halotolerante exhibió una homología de secuencia de 99% con la bacteria conocida Bacillus amyloliquefaciens. Los resultados muestran que la inoculación con el aislado halotolerante identificado, tuvo efectos estimulantes sobre los parámetros de crecimiento, germinación de semillas, emergencia de semillas, longitud de brotes, longitud de raíz, biomasa, clorofila foliar y contenido de proteínas, cenizas y fibras brutas. Palabras clave: Azospirillum halopraeferens, Bacillus amyloliquefaciens, Phaseolus acutifolius, fijación de nitrógeno, stress salino. Recibido: enero de 2018 Aceptado: marzo de 2018

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Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas volumen especial número 20 01 de abril - 15 de mayo, 2018

4289

Artículo

Inoculación de halobacterias fijadoras de nitrógeno en la contribución a

tolerancia al estrés salino en frijol tepary

Prabhaharan Renganathan1

Jesús Borboa-Flores1

Ema Carina Rosas-Burgos1

José Luis Cárdenas-López1

Bernardo Murillo-Amador2

Jesús Ortega-García3

Edgar Omar Rueda-Puente4§

1Departamento de Investigación y Posgrado en Alimentos-Universidad de Sonora, Hermosillo, Sonora,

México CP 83000. ([email protected]; [email protected];

[email protected]; [email protected]). 2Centro de Investigaciones Biológicas del

Noroeste, SC. Instituto Politécnico Nacional No. 195, Col. Playa Palo de Santa Rita Sur, La Paz, Baja

California Sur. CP 23096, México. [email protected]). 3Departamento de Ciencias Químico

Biológicas y Agropecuarias-Universidad de Sonora. Caborca, Sonora, México. CP 83690

([email protected]). 4Departamento de Agricultura y Ganadería-Universidad de Sonora,

Hermosillo, Sonora, México. CP. 83000. ([email protected]).

§Autor para correspondencia: [email protected].

Resumen

El frijol tepary tolerante a la sequía (Phaseolus acutifolius A. Gray) es un cultivo

microbiológicamente inexplorado en regiones áridas de México donde se consume como fuente de

proteína dietética. Sin embargo, la salinidad del suelo dificulta la productividad de este cultivo. El

aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno halotolerantes específicas (BFN) podría ser una

práctica novedosa para mejorar la tolerancia a la sal y mejorar la productividad de los cultivos. En

el presente estudio, se aislaron 24 BFN de semillas de tres ecotipos de tepary expuestos a altas

salinidades (0, 0.25 y 0.5 M de NaCl) in vitro. Se caracterizaron cepas halotolerantes fijadoras de

Nitrógeno. Entre los aislados halotolerantes, sólo uno mostró alta actividad nitrogenada de 6.97

±1.1 nmol de cultivo h-1. A partir del análisis 16S de rRNA, el microorganismo halotolerante

exhibió una homología de secuencia de 99% con la bacteria conocida Bacillus amyloliquefaciens.

Los resultados muestran que la inoculación con el aislado halotolerante identificado, tuvo efectos

estimulantes sobre los parámetros de crecimiento, germinación de semillas, emergencia de

semillas, longitud de brotes, longitud de raíz, biomasa, clorofila foliar y contenido de proteínas,

cenizas y fibras brutas.

Palabras clave: Azospirillum halopraeferens, Bacillus amyloliquefaciens, Phaseolus acutifolius,

fijación de nitrógeno, stress salino.

Recibido: enero de 2018

Aceptado: marzo de 2018

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Introducción

El creciente problema del incremento de sales en las áreas de cultivo aunado a las bajas

precipitaciones y altas temperaturas de ambientes árido-salinos, exige soluciones integrales para

su productividad (Ungar 1982). El frijol tepary (Phaseolus acutifolius A. Gray) es una leguminosa

adaptada a las altas temperaturas y sequías del desierto de Sonora (Suroeste de los Estados Unidos

de América y noroeste de México).

Las semillas de esta especie se caracterizan por un alto contenido de proteína dietética (21.1 a

32.49%) en comparación con otras especies de Phaseolus; por ejemplo P. vulgaris (19.1-

29.7%), P. lunatus (19.7-24.9%), P. coccineus (20-27.4%), P. polyanthus (21.6-25.6%), P.

filiformis (24.2%) y P. Angustissimus (25.9%) (Nabhan, 1985). En general, los rendimientos

de tepary han sido estimados entre 200 y 900 kg ha-1. Se han reportado rendimientos de hasta

2000 kg ha-1 (Hamama y Bhardwaj, 2002; Ahmad et al., 2013) dependiendo de la temporada

de siembra y de la suplementación apropiada de fertilizantes nitrogenados (N).

En el noroeste de México, se aplican grandes cantidades de fertilizantes químicos a los suelos

para compensar la deficiencia de N y poder incrementar los rendimientos del frijol tepary,

desafortunadamente, el uso excesivo y continuo de estos fertilizantes incrementa la salinidad,

afectando las propiedades físicas y químicas del suelo, que en su conjunto alteran las

actividades microbianas, que podrían ser benéficas para los cultivos (Rueda-Puente et al., 2003,

2007, 2010). Para reducir los aportes de fertilizantes nitrogenados con el fin de retardar o

detener los aumentos adicionales en la salinidad del suelo y reducir los costos de fertilizantes,

las rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas, en particular las bacterias

fijadoras de N (RPCP-BFN), son una alternativa atractiva y sostenible para el cultivo de frijol

tepary en suelos salinos de regiones semiáridas y áridas, como son aquellos situados en el

estado de Sonora, México.

Los estudios sobre bacterias asociadas con los rendimientos de frijol tepary son escasos.

Estudios relacionados con RPCP-BFN han demostrado el efecto biopromotor y bioprotector

contra el estress ambiental en las plantas, por ejemplo, la sequía, el estrés osmótico e

inundación (Mayak et al., 2004), temperaturas extremas (Terré et al., 2007), deficiencia de

nutrientes (Cassan et al., 2009) y los metales tóxicos (Sandhya et al., 2010; Rokhzadi y

Toashih, 2011).

Durante las últimas décadas las RPCP-BFN, han sido aisladas y cultivadas como una alternativa

prometedora (Pathak y Keharia, 2013). Con base a lo anterior descrito, la hipótesis que se

plantea consiste si la inoculación con RPCP-BFN, sobre todo aquellas del tipo halotolerante

(HBFN) contribuyen a mejorar el efecto del estrés de salinidad en cultivos como el frijol tepary.

Por lo tanto, los objetivos del presente estudio fueron: i) aislar una bacteria halotolerante

fijadora de nitrógeno de rizosfera de P. acutifolius; y ii) identificar la contribución del aislado

(Bacillus amyloliquefaciens RP22) sobre la tolerancia al estrés por salinidad en semillas y

plántulas de P. acutifolius.

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Materiales y métodos

Semillas

Las semillas evaluadas en el presente estudio fueron aquellos ecotipos de San Judas (SJ), Indio

Yumi (IY) y Elena-Mora Property (EMP), los cuales fueron recolectadas de la sierra de Sonora-

Chihuaha (29° 05’ latitud norte 110° 57’ longitud oeste) en el estado de Sonora.

Halobacterias fijadoras de nitrógeno

Aislamiento

Para el aislamiento de bacterias, se llevó a cabo la técnica de Rueda et al. (2003). Las semillas se

trituraron con mortero y mortero para obtener el peso final de 4 g y las diluciones en serie (hasta

10-6) en solución salina estéril al 0.85%, se sembraron sobre medio de agar OAB libre de N acorde

a (Bashan et al., 1993) con tres concentraciones distintas de NaCl (0, 0.25 y 0.5 M) (Rueda et al.,

2003), se incubaron las placas de agar a 30 °C durante cuatro días, obteniéndose 24 colonias

individuales en agar, basadas en el fenotipo (color, brillo, forma, elevación y margen) según

Smibert y Krieg (1994), posteriormente los aislados purificados fueron almacenados a -80 ºC

(glicerol al 15%).

Fijación de nitrógeno (técnica de reducción de acetileno)

El ensayo de reducción de acetileno (ERA) a las cepas seleccionadas se realizó según lo descrito

por Reinhold et al. (1987). Los aislamientos halotolerantes se cultivaron en frascos de suero que

contenían 25 ml de medio líquido OAB libre de N y NaCl 0.5 M. Los resultados se compararon

con una halobacteria conocida (HBFN) Azospirillium halopraeferens AU10 (Reinhold et al.,

1987). El aislamiento que mostró la mayor actividad de reducción de acetileno fue seleccionado

para su identificación genética y para realizar una evaluación adicional con ensayos de

inoculación.

Identificación

La bacteria halotolerante seleccionada se identificó a nivel de género mediante secuenciación

parcial de genes de rRNA 16S por Acculab, Inc. (USA). La secuencia obtenida se comparó con

secuencias en la base de datos GenBank del Centro Nacional de Información de Biotecnología

(NCBI) utilizando el programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/;

http://www.megasoftware.net/) y luego se depositó en el GenBank bajo el número de acceso

KM652480. Además, un árbol filogenético fue construido usando MEGA6 freeware

(http://www.megasoftware.net/).

Ensayos de inoculación-diseño del experimento

Los ensayos de inoculación se llevaron a cabo en una cámara de crecimiento y dentro de un

invernadero. Ambos ensayos fueron asignados al azar en un diseño de bloque completo con un

diseño trifaccional (3×3×3)= 27 tratamientos con n repeticiones; 3 ecotipos de frijol (San Judas=

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SJ=, Indio Yumi =IY= y Elena-Mora Property= EMP=; 3 niveles de NaCl (0, 0.25 y 0.5 M) y 3

niveles de bacterias (Ba= Bacillus amyloliquefaciens, Ah= Azospirillium halopraeferens AU10,

U= los no inoculados. Una vez semillas esterilizadas las semillas, se inocularon con la HBFN

aislada y caracterizada en este estudio, usando la técnica de bomba de vacío de aire descrita por

Carrillo et al. (1998).

Ensayos en cámara de crecimiento

La germinación de 675 semillas (25 semillas por cada tratamiento) se realizó en placas Petri

esterilizadas, se sellaron con cinta de parafina para mantener las condiciones de humedad y se

colocaron en una cámara de crecimiento con un fotoperiodo de 16 h de luz (32 ±0.5 °C) y 8 h de

noche (25 ±0.5 °C) con una humedad relativa de 36 ±1% (HR). Después de 7 días, se registraron

las tasas de germinación de la semilla, el crecimiento (longitud de tallo y de la raíz) y los pesos

secos.

Ensayos en invernadero

Para los ensayos en el interior del invernadero, el sustrato utilizado en las macetas de plástico fue

vermiculita estéril sin nutrientes. Se sembraron 540 semillas (20 semillas por cada tratamiento) en

macetas y se registraron las tasas de emergencia al día 9. Las plántulas se cultivaron bajo

condiciones de control con un fotoperíodo 16 h día (32 ±0.5 ºC) y 8 h noche (25 ±0.5ºC) y con 36

±1% de HR. Las plantas fueron regadas cada tercer día, considerando derramar el agua para

prevenir un aumento en la salinidad con las correspondientes concentraciones de NaCl y

mantenerse hasta los 21 días.

Variables evaluadas

Las tasas de germinación y semillas de emergencia se calcularon utilizando la fórmula descrita

por Maguire (1962): M = n1/t1 + n2/t2 + ... n7/t7 ... n9/t9, donde n1, n2, ..., n7 ..., n9 son; 1

son el número de semillas germinadas; t1, t2, ..., t7 ..., t9 es el tiempo en días. El contenido de

clorofila foliar se midió con un medidor de clorofila (SPAD-502, Minolta, Japón). Las

longitudes de la raíz y del brote se midieron por separado con un calibrador digital (General

No. 143, General Tools Manufacturing Co., Inc., Nueva York, EE. UU). Las plantas se secaron

en una estufa a 110 ºC durante un tiempo de 36 h para estimar el peso en seco. El método de

micro-kjeldahl se empleó para determinar el N total y la proteína cruda (N×6.25), mientras que

la fibra cruda y los contenidos de cenizas fueron determinados gravimétricamente (Snedecor,

1956).

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (Andeva)

seguido del ensayo de diferencia mínima significativa de Tukey cuando se observaron diferencias

estadísticas. Los valores se expresan como medias ±error estándar y los valores significativos

fueron con p≤ 0.05.

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Resultados y discusión

Halobacteria fijadora de nitrógeno

Los recuentos totales de bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN) se muestran en el Cuadro 1. Se

pudo apreciar que los aislados en placas de agar de control (medio de agar OAB libre de N sin

NaCl) fueron de 8.6 a 12.6x 106 unidades formadoras de colonias (UFC g-1 y de 7.6 a 10.6×106

UFC g-1 para semillas con y sin testa, respectivamente. Los aislados en los ecotipos SJ y EMP

disminuyeron significativamente (p≤ 0.05) en placas de agar suplementadas con NaCl al 0.5 y 0.75

M. En el caso de las semillas de control en el ecotipo SJ (8.3-9.3×106 CFU g-1), los conteos

mostraron una tolerancia a NaCl de 45-54% (3.7-5×106 CFU g-1 semillas) y 29 - 33% (2.4-3.1×106

CFU g-1 semillas) de BFN cultivable total al 0.50 y 0.75 M de NaCl, respectivamente.

Cuadro 1. Unidades formadoras de colonias de HBFN asociadas a semilla de diferentes ecotipos

de Phaseolus acutifolius sobre agar OAB libre de N suplementado con diferentes

concentraciones de NaCl.

Semillas Ecotipos Conteo (×106 UFC g-1 semilla)

0 M NaCl 0.25 M NaCl 0.5 M NaCl 0.75 M NaCl

Con testa SJ 9.3 ±1.2a* 8.3 ±0.6ab 5 ±0.5bc 3.1 ±0.5a

IY 8.6 ±2.6a 8 ±1.1a 5 ±1.1ab 2.6 ±0.8ab

EMP 12.6 ±2a 8.6 ±0.6b 3.6 ±0.3c 2.3 ±0.3b

Sin testa (endospermo) SJ 8.3 ±0.4a 6.7 ±0.3b 3.7 ±0.9c 2.4 ±0.3b

IY 7.6 ±1.2a 7.4 ±1.2a 5 ±0.6ab 3.3 ±0.4a

EMP 10.6 ±0.9a 7.6 ±0.4b 4.4 ±0.3c 2.3 ±0.7b *= Valores representan una media ± error estandar (media de tres repeticiones). Diferente letra en la misma linea denota

diferencia significativa (p≤ 0.05; prueba de Tukey). Ecotipos SJ= San Judas; IY= Indio Yumi; EMP= Elena-Mora

Property.

De forma similar, los recuentos en el ecotipo de EMP mostraron una tolerancia a la sal 28-41%

(3.6-4.4×106 CFU g-1 semillas) y 18-22% (2.3×106 CFU g-1 semillas) de BFN cultivable total a 0.5

y 0.75 M de NaCl, mientras que en el control los valores eran 10.6-12.6x106 CFU g-1.

Con relación a la capacidad de fijación de N (reducción de acetileno), la cepa codificada como

RP22 tuvo la actividad de reducción de acetileno más alta (6.97 ±1.1 nmol cultivo-1 h-1), que es

similar a la referencia A. halopraeferens AU10 (7.83 ±1.3 nmol de cultivo-1 h-1). Este resultado

demuestra que el crecimiento mejoró en 28 y 43% con las bacterias aisladas a concentraciones de

NaCl entre 0.5 M y 0.75 M NaCl.

Análogamente, Rueda et al. (2003) propusieron que 5% de las cepas halotolerantes de áreas salinas-

planas redujeron el acetileno ~ 6.26 ±0.56 nmol de cultivo-1 h-1 (Klebsiella pneumoniae) con el

control A. halopraeferens, lo que produjo un valor de 7.1 ±1.7 nmol-1 h-1. Esto podría atribuirse a

la codependencia de otras bacterias, un fenómeno que es bastante común entre los microorganismos

(Diby y Harshad, 2015). La identificación genética del aislado bacteriano en el presente estudio,

basado en la secuencia de genes 16S rRNA, mostró una alta similitud (99%) con la bacteria

promotora del crecimiento vegetal Bacillus amyloliquefaciens (Figura 1).

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Figure 1. Árbol filogenético mostrando la similitud con el aislado Bacillus amyloliquefaciens RP22

(□) y la relación cercana con Bacillus amyloliquefaciens (○) y su relación con la

halotolerante (●) fijadora de N (▲) y endófito (■) bacteria del desierto. La alineación y

relación cercana con el árbol fue realizada utilizando MEGA6 (http://www.megasoftware.net/).

Las barras indican 10% de divergencia; un análisis bootstrap fue desarrollado con 1000 ensayos.

KJ433614, Bacillus amyloliquefaciens strain IARI-AR25; KM652480, Bacillus

amyloliquefaciens strain RP22; HM854239, Bacillus safensis strain KLH-14; KF646682,

Bacillus tequilensis strain DH-10; AB513629, Bacillus megaterium; KJ628451, Bacillus

subtilis strain HPCAQRKSM106; JN119340, Halobacillus sp. KLBMP 2429; EU867381,

Bacillus pumilus strain CCGE2028; KF831020, Bacillus firmus strain L-4; KF933708, Bacillus

baekryungensis strain QD56; KF444385, Bacillus aryabhattai strain HYR8(1); FJ032017,

Bacillus pumilus strain ES4; FN796812, Bacillus cereus strain GP17; HM151905, Bacillus

subtilis strain DAZ26; AY373358.1, Bacillus megaterium strain c5; KC178613, Bacillus flexus

strain DNEB39; KC790325, Bacillus methylotrophicus strain SY33; JX515571, Bacillus

subtilis strain H171.

El análisis filogenético basado en el gen 16S rRNA aislado del halotolerante NFB exhibió 99% de

similitud con una B. amyloliquefaciens (número de accesión KJ433614), una bacteria aislada del

frío desierto del noroeste del Himalaya por los análisis PGPR. Hasta donde se conoce, la especie

B. amyloliquefaciens nunca ha sido reportada para P. acutifolius, lo cual es indicativo de la

asociación de bacterias benéficas y la planta en estudio. Otras especies del género Bacillus han sido

aisladas e identificadas en otras legumnosas (B. pumilus, B. cepacia, B. japonicum, B. vallismortis,

B. mojavensis, B. atrophaeus, B. megaterium y B. Stearothermophilus) (Bashan et al., 1993;

Dobbelaere y Okon, 2007ab).

Ensayos de inoculación

Cuando las semillas fueron inoculadas con cepas bacterianas, los efectos negativos del NaOCl al

2% sobre la germinación de las semillas disminuyeron (Cuadro 2). Así, se obtuvieron mayores

tasas de germinación en condiciones de cámara de crecimiento con semillas inoculadas (53.3-

100%) que con semillas no inoculadas (46.7-86.7%) en los tres ecotipos de frijol tepary tratados

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con NaCl 0 M y 0.25 M. Además, la tasa de germinación fue fuertemente afectada cuando se aplicó

NaCl 0.50 M mostrando rangos de 0-13.3% y 6.7-26.7% para las semillas no inoculadas e

inoculadas, respectivamente (Cuadro 2).

Cuadro 2. Porcentajes de germinación y emergencia de semillas de tres ecotipos de Phaseolus

acutifolius bajo cámaras de crecimiento y ensayos en invernadero.

NaCl tratamiento Núm. inoculado (control) B. amyloliquefaciens A. halopraeferens AU10

Germinación cámara de crecimiento

0 M 46.7-86.7 93.3-100 86.7-100

0.25 M 53.3-66.7 73.3-100 53.3-80

0.5 M 0-13.3 20-26.7 6.7-20

Emergencia en invernadero

0 M 55.6-66.7 100 100

0.25 M 22.2-33.3 33.3-44.4 33.3-44.4

0.5 M 11.1-22.2 11.1-33.3 11.1-33.3

En cuanto a los parámetros medidos en condiciones de cámara de crecimiento, los tratamientos

de frijol tepary en las variables de brotes y raíces en plántulas, los efectos máximos de la

inoculación bacteriana con B. amyloliquefaciens RP22, así como A. halopraeferens AU10 fueron

para el ecotipo SJ, mostrando resultados significativos con p≤ 0.05 a 0 M de NaCl (8.9 y 10.5

cm de planta-1), entre 6.9 y 8.7cm planta-1 para B. amyloliquefaciens y A. halopraeferens al

agregar 0.25 M NaCl, en comparación con las plántulas no inoculadas que fueron más bajos: (7.8

y 8.5 y 5.8 y 6.7 cm planta-1 para 0 y 0.25 M NaCl (Figura 2).

Figura 2. Efecto de las concentraciones de NaCl y la inoculación bacteriana en la altura y el peso seco de las

plántulas de Phaseolus acutifolius en condiciones de cámara de crecimiento. Los valores representan la

media ± error estándar (n= 3). Diferente letra indica diferencias significativas (p≤ 0.05, prueba de Tukey)

de las plantas inoculadas (Ba= Bacillus amyloliquefaciens, Ah= Azospirillium halopraeferens AU10) en

relación con los controles no inoculados (U). Ecotipos SJ= San Judas; IY= Indio Yumi; EMP= Elena-Mora

Property.

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Las longitudes de las raíces presentaron diferencias estadísticas significativas (p≤ 0.05) entre las

plántulas inoculadas y no inoculadas en ecotipos IY y EMP, considerando todas las salinidades,

excepto el ecotipo SJ donde las plantas se inocularon con B. amyloliquefaciens RP22, (4.4 y 2.7

cm planta -1 a 0 y 2.5 M NaCl (p≤ 0.05) (Figura 2).

La producción de biomasa seca según el efecto de los tratamientos fueron estadísticamente

diferentes (p≤ 0.05); los incrementos en biomasa seca de las plantas inoculadas respecto a las no

inoculadas fueron de 17 y 38%, respectivamente. Coincidentemente con el ensayo de cámara de

crecimiento, los resultados del ensayo en invernadero (Figura 3) mostraron tasas de semilla de

emergencia más bajas y valores de crecimiento y biomasa en plántulas de los tres ecotipos de

frijoles tepary irrigados con NaCl al 0.25 y 0.5 M con NaCl a 0 M, este ensayo también confirma

el efecto promotor del crecimiento de las plantas sobre semillas y plántulas de ambas cepas

bacterianas inoculadas, lo cual reafirma la posibilidad de proponer a los microorganismos

benéficos como prospectos biofertilizantes (Stefana et al., 2013; Diby y Harshad, 2015).

Resultados similares indican que los efectos positivos de este tipo de bacterias aparentemente se

deben a la producción de sustancias promotoras de crecimiento según lo reportado en otros estudios

(Yadav, 2011; Rugheim et al., 2012).

Con relación a las variables de crecimiento y de biomasa en condiciones de invernadero, se

observaron diferencias significativas (p≤ 0.05) en longitudes de brotes en el ecotipo SJ,

considerando la inoculación con B. amyloliquefaciens RP22 (70 cm planta-1), así como A.

halopraeferens AU10 (58 cm planta-1), en relación con los controles no inoculados (U) (35 cm

planta-1) en NaCl M (Figura 3).

Figura 3. Efecto de las concentraciones de NaCl y la inoculación bacteriana sobre el crecimiento y el peso seco

de plántulas de Phaseolus acutifolius bajo condiciones de invernadero. Los valores representan la media

del ± error estándar (n= 3). Diferentes letras indican diferencias significativas (p≤ 0.05) de las plantas

inoculadas (Ba = Bacillus amyloliquefaciens, Ah= Azospirillium halopraeferens AU10) en relación con los

controles no inoculados (U). Ecotipos SJ= San Judas; IY= Indio Yumi; EMP= Elena-Mora Property.

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En cuanto al peso en seco, los valores máximos se registraron en plántulas inoculadas en los tres

ecotipos a 0, 0.25 y 0.5 M de NaCl en relación a los controles no inoculados (U). Sin embargo,

cabe mencionar que la salinidad reduce el peso seco, mientras que se incrementa en todos los

tratamientos (Figura 3). En particular, los valores de germinación, emergencia, crecimiento y

biomasa fueron mayores en las plántulas inoculadas con B. amyloliquefaciens RP22 que en las

inoculadas con A. halopraeferens AU10, particularmente en el ecotipo IY tratado con NaCl 0 y

0.25 M (Figuras 2 y 3).

Asimismo, el análisis de la clorofila foliar y los contenidos de proteínas, cenizas y fibra bruta

confirman el efecto de los tratamientos con NaCl y la inoculación bacteriana en relación con los

controles (no inoculados) sobre el crecimiento y la biomasa de las plántulas (Cuadro 3).

Cuadro 3. Efecto de las concentraciones de NaCl y la inoculación bacteriana sobre el contenido

total de clorofila, proteína, cenizas y fibra cruda en plántulas de Phaseolus acutifolius

bajo condiciones de invernadero.

Ecotipos NaCl

tratamientos Inoculantes Clorofila total Proteína (%)

Cenizas

(%)

Fibra cruda

(%)

SJ 0 M U 31.5 ±0.08b 11.9 ±0.07b 5.5 ±0.03b 17.8 ±0.5b

Ba 34.9 ±0.1a 14.4 ±0.07a 7.6 ±0.2a 21.9 ±0.9a

Ah 34.1 ±0.03a 14 ±0.2a 6.5 ±0.2a 22.9 ±0.5a

0.25 M U 8.9 ±8.9b 3.1 ±3.1b 1.4±1.4b 4.7 ±4.7b

Ba 29.4 ±0.4a 12.3 ±0.06a 7.2 ±0.2a 21.1 ±1a

Ah 29 ±0.02a 11.8 ±0.2a 6.4 ±0.2a 22.85 ±0.3a

0.5 M U 4.9 ±4.9c 2.3 ±2.3b 1 ±1b 4.1 ±4.1b

Ba 12.7 ±6.4a 5.1 ±2.5a 3.2 ±1.6a 8.4 ±4.2a

Ah 6.6 ±6.6b 2.5 ±2.5b 1.9±1.9b 4.1 ±4.1b

IY 0 M U 31.2 ±0.2b 11.29 ±0.04c 5.3 ±0.09b 17.5±0.9b

Ba 34.9 ±0.8a 14.3 ±0.09a 7.6 ±0.3a 23.3 ±0.05a

Ah 34.3 ±0.1a 13.66 ±0.2b 6 ±0.1b 23.1 ±0.2a

0.25 M U 8.9 ±8.9c 2.6 ±2.6c 1.3 ±1.3c 5.2 ±5.2c

Ba 30.3 ±0.8a 12.2 ±0.07a 7 ±0.05a 23.7 ±0.6a

Ah 19.6 ±9.8b 7.8 ±3.9b 4.2 ±2.1b 15.1 ±7.5b

0.5 M U 4.5 ±4.5b 2.5 ±2.5a 1 ±1a 3.7 ±3.7a

Ba 6.6 ±6.6a 2.4 ±2.4a 1.7 ±1.7a 4.1 ±4.1a

Ah 6 ±6a 2.6 ±2.6a 1.9 ±1.9a 4.4±4.4a

EMP 0 M U 32.5 ±0.06b 11.5 ±0.01c 5.6 ±0.03c 22.4 ±0.03a

Ba 35.2 ±0.4a 15 ±0.2a 8.6 ±0.4a 23.6 ±0.03a

Ah 34.1 ±0.03a 14.6 ±0.4b 6.2 ±0.06b 23.5 ±0.19a

0.25 M U 9.2 ±9.2b 3.2 ±3.2b 1.5 ±1.5b 7.2 ±7.2b

Ba 29.9 ±0.2a 12.7 ±0.2a 7 ±0.06a 21.8 ±0.2a

Ah 29 ±0.02a 12.1 ±0.03a 6.2 ±0.2a 22.1 ±0.1a

0.5 M U 5.8 ±5.8b 2.5 ±2.5b 1 ±1b 4.4 ±4.4b

Ba 18.6 ±0.61a 7.9 ±0.03a 5.8 ±0.4a 13.2 ±0.6a

Ah 19.3 ±0.6a 7.7 ±0.1a 5 ±0.5a 12.6 ±0.3a

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Conclusiones

El presente estudio representa ser un primer informe de Bacillus amyloliquefaciens como una

bacteria fijadora de nitrógeno asociada con la leguminosa Phaseolus acutifolius. Asimismo, es una

primera aproximación en las primeras etapas bajo condiciones de salinidad, específicamente con

frijol tepary, evaluando el microorganismo aislado y halotolerante comparado con un control

biológico Azospirillum halopraeferens AU10.

La halobacteriae B. amyloliquefaciens, aislada a partir de semillas de ecotipos de tepary, es capaz

de resistir altas concentraciones de sal (NaCl 0.75 M) y puede facilitar la promoción del

crecimiento de la planta en presencia de niveles de inhibición del crecimiento de la salinidad del

suelo que exceden 0.25 M NaCl.

La inoculación basada en bacterias benéficas como son las fijadoras de nitrógeno es un método

biológico y confiable, para ayudar a mantener o mejorar la fertilidad de los suelos que sostienen

los campos de tepary. Sin embargo, se sugiere desarrollar más evaluaciones en etapas fenológicas

más avanzadas y en otros ecotipos para comprender mejor los mecanismos de acción y las

reacciones particulares con cada ecotipo antes de recomendar la asociación de las bacterias a nivel

de campo.

Agradecimientos

El presente estudio fue apoyado por la Institución: Comisión Nacional Forestal (CONAFOR)

(Proyecto No. 14651). Los autores expresan su agradecimiento a la Universidad de Sonora

(UNISON) por la infraestructura y equipo proporcionado y la beca financiera parcial otorgada por

el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) durante los estudios de doctorado.

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