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Instituto Politécnico Nacional
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y
TECNOLOGÍA AVANZADA – Querétaro
POSGRADO EN TECNOLOGÍA AVANZADA
Remoción de metales por microorganismos productores de polisacáridos
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA
Presenta: IQI. Diana Guadalupe Cruz Vega
Directoras de tesis: Dra. Norma G. Rojas Avelizapa
Dra. Luz I. Rojas Avelizapa Santiago de Querétaro, Qro. Junio de 2008
b
c
Agradecimientos,
A la Dra. Norma G. Rojas Avelizapa y la Dra. Luz I. Rojas Avelizapa por su asesoría y
apoyo para este trabajo de tesis.
A el Dr. Jaime García-Mena y la M en C. Elsa Cervantes Gonzáles agradezco su valiosa
asesoría en la identificación por métodos moleculares realizada en el Laboratorio de
Genómica Ambiental del CINVESTAV Zacantenco.
A la Lic. Claudia Reyes por su intermediación para realizar la cuantificación de metales en
el Laboratorio de Metalurgia de la Facultad de Química de la UNAM .
A la Dra. Eva González Jasso, Dr. Pedro A. Vázquez Landaverde y al Dr. Reynaldo Pless
Elling por la revisión detallada y sugerencias para mejorar el contenido de esta tesis.
A mis compañeras y compañeros (Griselda, Giovanna, Lupita, Wendy, Sagrario, Vicente,
Sara, etc.) así como al personal del CICATA Querétaro por todo su apoyo brindado.
Y ante todo al CICATA-Querétaro y al Instituto Politécnico Nacional por brindarme la
oportunidad de continuar con mi preparación académica.
Esta tesis de maestría contó con el financiamiento de la Secretaría de Investigación y
Posgrado (SIP) del IPN, con clave: 20070222, así mismo agradezco al CONCAYT por la
beca otorgada.
d
Dedicatoria,
Este trabajo está dedicado a mis hijos: Bruno, Paulina, Sebastián, y a mi esposo: José Luis,
pues fueron mi principal motivación e inspiración para lograr esta meta.
Gracias también a toda mi familia (aunque no los mencione a cada uno) pues sin ustedes no
habría sido posible llegar hasta donde ahora estoy.
i
ÍNDICE
ÍNDICE.... ......................................................................................................................................................................... i
Índice de figuras........................................................................................................................................................... iv
Índice de tablas...............................................................................................................................................................v
Resumen.......................................................................................................................................................................... vi
Summary........................................................................................................................................................................ vii
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 1
1.1 Problemática de la contaminación por metales.......................................................................... 1
1.1.1 Metales de importancia por sus características tóxicas.......................................................... 4
1.2 Tecnologías para el tratamiento de sitios contaminados con metales............................... 6
1.2.1 Tratamientos físico-químicos............................................................................................................. 8
1.2.2 Tratamientos biológicos........................................................................................................................ 9
1.2.2.1 Fitorremediación...................................................................................................................................... 9
1.2.2.2 Biorremediación....................................................................................................................................... 9
1.3 Polisacáridos microbianos................................................................................................................. 10
1.3.1 Composición............................................................................................................................................ 11
1.3.2 Importancia biológica.......................................................................................................................... 13
1.3.3 Importancia comercial ........................................................................................................................ 14
1.4 Antecedentes indirectos...................................................................................................................... 16
1.4.1 Capacidad de remoción de metales por microorganismos.................................................. 16
1.4.2 Mecanismos de remoción de metales por microorganismos............................................... 19
1.4.2.1 Bioabsorción............................................................................................................................................ 20
1.4.2.2 Bioacumulación...................................................................................................................................... 20
1.4.2.3 Biomineralización.................................................................................................................................. 20
1.4.2.4 Quimisorción mediada por microorganismos........................................................................... 20
1.4.3 Estudios de remoción de metales por microorganismos productores de biopolímeros............................................................................................................................................................. 20
1.4.3.1 Microorganismos involucrados en la remoción de metales................................................. 22
1.5 Antecedentes directos.......................................................................................................................... 24
2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................................. 25
3. OBJETIVOS ............................................................................................................................................ 26
3.1 Objetivo general..................................................................................................................................... 26
3.2 Objetivos específicos............................................................................................................................ 26
ii
4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................................ 27
4.1 Fuente de microorganismos y caracterización.......................................................................... 27
4.1.1 Morfología colonial y tinción de Gram........................................................................................ 27
4.1.2 Tinción de esporas................................................................................................................................. 27
4.1.3 Tinción de cápsula................................................................................................................................. 28
4.1.4 Tinción de polisacáridos extracelulares....................................................................................... 28
4.1.5 Tinción de cristales paraesporales................................................................................................. 29
4.2 Identificación de microorganismos por amplificación parcial de 16S rDNA.............. 29
4.2.1 Extracción de ácidos nucleicos totales.......................................................................................... 29
4.2.2 Caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos totales.............................................. 30
4.2.3 Amplificación de la región 16S rDNA.......................................................................................... 30
4.2.4 Secuenciación de los productos de PCR...................................................................................... 31
4.2.5 Análisis de las secuencias................................................................................................................... 32
4.3 Conservación de los microorganismos......................................................................................... 32
4.4 Selección de microorganismos por su capacidad para acumular metales.................... 33
4.4.1 Crecimiento en cultivo sólido........................................................................................................... 35
4.4.1.1 Evaluación de crecimiento en presencia de discos de inhibición ...................................... 35
4.4.1.2 Evaluación de crecimiento en agar nutritivo-metal................................................................ 35
4.4.2 Remoción de metales en cultivo líquido....................................................................................... 36
4.4.2.1 Cinética de crecimiento en cultivo líquido.................................................................................. 36
4.4.2.2 Evaluación de la remoción de metales en cultivo líquido ..................................................... 37
4.4.2.2.1 Determinación de metales por espectrometría de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente......................................................................................................................................... 38
4.5 Crecimiento y producción de EPS de Bacillus (PL7) y Serratia (PL18)......................... 39
4.6 Remoción de plomo por Bacillus (PL7) ....................................................................................... 39
4.7 Remoción de plomo por el EPS producido por Bacillus (PL7).......................................... 40
4.8 Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7)........................................ 41
4.8.1 Azúcares totales...................................................................................................................................... 41
4.8.2 Azúcares reductores............................................................................................................................. 41
4.8.3 Proteína total........................................................................................................................................... 42
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN......................................................................................................43
5.1 Caracterización morfológica de los microorganismos........................................................... 43
5.2 Identificación de microorganismos por métodos moleculares........................................... 46
5.3 Conservación de microorganismos................................................................................................ 50
5.4 Selección de microorganismos por su capacidad de remoción de metales.................... 51
iii
5.4.1 Evaluación de tolerancia a metales utilizando discos de inhibición................................. 52
5.4.2 Medio agar metal................................................................................................................................... 54
5.4.2.1 Remoción de metales en cultivo sólido......................................................................................... 62
5.4.3 Evaluación de la remoción de metales por biomasa............................................................... 65
5.4.3.1 Curvas de crecimiento de los microorganismos en estudio ................................................. 65
5.4.3.2 Remoción de metales por microorganismos en estudio........................................................ 71
5.5 Cinética de crecimiento y producción de EPS por Bacillus (PL7) y Serratia (PL18)75
5.6 Remoción de plomo por biomasa y EPS de Bacillus (PL7) ................................................. 76
5.7 Caracterización parcial del EPS aislado a partir de Bacillus (PL7)................................ 78
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................ 79
Bibliografía .................................................................................................................................................................... 80
iv
Índice de figuras
Figura 1 Principales destinos y fuentes de emisión de metales en el ambiente.................... 3
Figura 2 Procesos de transformación de metales en suelo............................................................... 3
Figura 3 Estructura celular de bacterias Gram (+) y Gram (-) ................................................. 11
Figura 4 Formación del enlace O-glicosídico......................................................................................... 12
Figura 5 Localización celular de procesos microbianos de captación y detoxificación de metales .........................................................................................................................................................17
Figura 6 Mecanismos biológicos involucrados en la remoción de metales .......................... 19
Figura 7 Región 16S rDNA secuenciada................................................................................................... 31
Figura 8 Tinción de Gram de los microorganismos en estudio crecidos en agar............. 45
Figura 9 Tinción negativa de cápsula del microorganismo PL14.............................................. 45
Figura 10 Dendograma de los aislados del Pitch Lake en estudio............................................. 49
Figura 11 Diámetro (mm) de la inhibición de crecimiento de los microorganismos en estudio en presencia de las sales de Cd y Zna
.............................................................................. 52
Figura 12 Evaluación del crecimiento de los microorganismos en medio agar-metal a 30°C y 72 h...................................................................................................................................................... 54
Figura 13 Crecimiento de los microorganismos en medio agar-plomo a 30°C y 48 h .. 56
Figura 14 Crecimiento de microorganismos en medio agar-selenio a 30°C y 48 h ........ 58
Figura 15 Crecimiento de microorganismos en medio agar-vanadio a 30°C y 48 h ..... 59
Figura 16 Crecimiento de microorganismos en medio agar-zinc a 30°C y 72 h .............. 60
Figura 17 Relación entre el diámetro de halo y el diámetro de colonia desarrollados en presencia de distintas concentraciones de metales................................................................... 63
Figura 18 Curvas de crecimiento de los microorganismos en estudio en caldo nutritivo a 30oC durante 36 h..................................................................................................................................... 66
Figura 19 Crecimiento y producción de polisacáridos extracelulares a) Bacillus (PL7), b) Serratia (PL18) ........................................................................................................................................ 75
Figura 20 Remoción de plomo por biomasa y EPS de Bacillus (PL7) en solución de pH 7............................................................................................................................................................................... 77
v
Índice de tablas
Tabla 1 Descripción de ventajas y desventajas de las tecnologías para el tratamiento de sitios contaminados con metales 7
Tabla 2 Tecnologías de tratamiento aplicables en la remediación de sitios contaminados con metales 8
Tabla 3 Polisacáridos extracelulares producidos por microorganismos y sus aplicaciones 15
Tabla 4 Estudios y concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) reportadas para distintos microorganismos 18
Tabla 5 Microorganismos productores de EPS con capacidad de remoción de metales 23
Tabla 6 Codificación de los microorganismos en estudio 24
Tabla 7 Intervalos de concentración para cada metal 34
Tabla 8 Morfología colonial de los microorganismos en estudio provenientes del Pitch Lake 44
Tabla 9 Morfología microscópica de los microorganismos en estudio provenientes del Pitch Lake 44
Tabla 10 Secuencias depuradas de los microorganismos evaluados 47
Tabla 11 Conservación de los microorganismos en estudio 51
Tabla 12 Características de los halos formados después de la exposición a H2S 62
Tabla 13 Valores de crecimiento calculados a partir de la fase exponencial 70
Tabla 14 Capacidad de remoción de metales por la biomasa microbiana de los microorganismos en estudio 72
Tabla 15 Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7) 78
vi
Resumen
Este proyecto de investigación presenta el estudio de siete microorganismos, los cuales
fueron aislados de muestras originarias de un lago de brea conocido como Pitch Lake, localizado en
Trinidad y Tobago. El estudio consistió en evaluar la capacidad que estos microorganismos
presentan para remover metales y producir polisacáridos. Lo anterior debido a la creciente
problemática de la contaminación por metales en el ambiente, los efectos negativos de estos
contaminantes sobre la salud de los organismos vivos, incluido el ser humano, así como el creciente
interés en la remoción microbiana de metales y la aplicación de biopolímeros extracelulares
producidos por diversos microorganismos.
Inicialmente, se realizó la caracterización morfológica y microscópica de los
microorganismos en estudio, lo cual, junto con herramientas de biología molecular permitieron su
identificación. Parte importante y medular del trabajo fue evaluar la capacidad de estos
microorganismos para remover metales como cadmio, cromo, níquel, plomo, selenio, vanadio y
zinc en cultivo líquido y sólido. Lo anterior permitió seleccionar aquellos microorganismos que
presentan una mayor capacidad de remoción del metal blanco. Así también, se determinó la
producción de polisacáridos extracelulares (EPS) por los microorganismos seleccionados, para
posteriormente evaluar el papel de estos y del EPS en la remoción del metal de interés.
Los resultados más relevantes indican que seis de los siete microorganismos fueron
identificados como Bacillus sp., con un 100% de homología, pertenecientes al grupo cereus-
thuringiensis, mientras que el séptimo de ellos presentó un alto porcentaje, 98%, de homología con
Serratia marcescens. Los estudios de tolerancia y remoción de metales indicaron que con excepción
de cromo y zinc, en forma de cloruro, el resto de los metales evaluados fueron tolerados por los
microorganismos en estudio, encontrando una afinidad de estos microorganismos hacia los metales
de Ni>Pb>Znb>V en medio sólido. Sin embargo, considerando la capacidad de remoción de metales
en cultivo líquido, la afinidad de los microorganismos resultó ser Pb>Znb>V>Se>Ni, aunque ésta
depende fuertemente del microorganismo, del metal y de la concentración evaluada. La remoción de
plomo por el EPS de Bacillus (PL7) fue mayor comparada con la remoción presentada por la
biomasa en pH 7, además la caracterización parcial del EPS realizada indicó que presenta un bajo
contenido de proteína (1.14%) y un 17% de azucares reductores.
Los resultados obtenidos revelaron que la remoción de diversos metales por los
microorganismos estudiados fueron comparables, y en algunos casos mayores, a la reportada en la
literatura por lo cual se hace necesario un estudio más profundo de los mismos así como de los
mecanismos y condiciones que favorecen la remoción.
vii
Summary The research project presents the study of seven microorganisms, which were isolated from
samples that came from Pitch Lake, located in Trinidad and Tobago. The study consisted into
evaluate the capacity of these microorganisms to remove metals and produce extracellular
polysaccharides. The previous due to the recent and increasing problematic of environmental
pollution by metals, the negative effect of these pollutants on living organisms health, including the
human, moreover the increasing interest in the microbial removal of metals and the use of
extracellular biopolymers produced by several microorganisms.
Initially, the morphological and microscopical characterization of the studied
microorganisms was done, which join to molecular biology tools allowed the identification of
microorganisms. An important and central part of the present work was to evaluate microorganisms
for their capacity to remove metals such as cadmium, chromium, nickel, lead, selenium, vanadium
and zinc in liquid and solid media. Previous information allowed the selection of those
microorganisms that showed a higher target metal removal. Also, there was evaluated the
production of extracellular polysaccharides (EPS) by selected microorganisms, afterwards, the role
of both biomass and EPS were evaluated for their capacity to remove the target metal.
The most relevant results indicated that six of the seven microorganisms corresponded to
Bacillus sp, with an homology of 100%, belonging to the cereus-thuringiensis group, the seventh
one showed a high percentage of homology, 98%, with Serratia marcescens. The studies of
tolerance and metal removal indicated that, with exception of chromium and zinc, in the chloride
salt, the rest of the evaluated metals were tolerated by studied microorganisms, with a microbial
affinity to metals of Ni>Pb>Znb>V in solid media. However, considering the capacity of metal
removal in liquid culture, the microbial affinity to metals was Pb>Znb>V>Se>Ni, although it
depended strongly of evaluated microorganism, metal salts and their concentration. Removal of lead
by the EPS of Bacillus (PL7) was higher compared to removal by biomass at pH 7, moreover the
partial characterization of the EPS showed a low content of protein (1.14%) and a 17% of reducing
sugars.
Results obtained indicated that removal of several metals by microorganisms tested were well
compared, and in some cases superior, to reports in literature, because of this it will be necessary to
do a deeper study about these microorganisms and also the mechanisms and conditions that favor
the removal.
Introducción
1
1. INTRODUCCIÓN La contaminación por metales de suelos, aguas superficiales y subterráneas así
como sedimentos, se ha incrementado en forma paralela a la actividad industrial debido a la
falta de normatividad en la materia y a la inadecuada disposición y manejo de desechos
industriales y municipales.
Los metales se encuentran en el subsuelo en forma de minerales, por lo que durante
su extracción, beneficio y purificación se producen desechos potencialmente tóxicos que
son liberados al ambiente contaminando el aire, suelo y cuerpos de agua, lo que ha
ocasionado un daño serio al ecosistema. Además, durante los procesos de fundición y
refinación de metales se generan partículas que son depositadas en distintos lugares por la
acción del viento, así también por la descarga de aguas residuales con altos contenidos de
metales.
1.1 Problemática de la contaminación por metales La emisión de elementos metálicos hacia la atmósfera procede tanto de fuentes
naturales como antropogénicas (derivadas de las actividades humanas). Entre las
principales fuentes de emisión de metales en México se tienen las siguientes (INE-
SEMARNAT, 2007):
♣ actividades mineras de extracción de oro, plata y cobre principalmente
♣ fundición primaria y secundaria de diversos metales
♣ producción de carbón y coque (carbón mineral)
♣ combustión de combustóleo y carbón en la generación de electricidad
♣ industria de cloro-sosa
♣ incineración de residuos peligrosos y biológico infecciosos
Además de lo anterior, dentro del territorio mexicano, se han identificado sitios
abandonados con alto contenido de residuos peligrosos, en los cuales y de acuerdo con
información proporcionada por el INE-SEMARNAT (Volke et al., 2005), el 36%
Introducción
2
corresponde a metales (Cr, Hg, Pb, Zn), As, cianuro, baterías y el 13.5% corresponde a
escorias de fundición (As, Cd, Pb), por lo que se puede considerar que casi en la mitad de
estos sitios se encuentran residuos de metales.
La contaminación del suelo con metales produce diversos efectos en los ecosistemas
(Carrizales et al., 2006; INE-SEMARNAT, 2005; Razo et al., 2004; Ongley et al., 2003;
Castro-Larragoitia et al., 1997) siendo los principales:
♣ transporte de contaminantes hacia aguas superficiales y subterráneas
♣ absorción y acumulación de contaminantes por plantas y animales
♣ intoxicación de seres vivos por contacto directo en los sitios contaminados
Asimismo, el tratamiento inadecuado de efluentes residuales tiene como
consecuencia el transporte de los contaminantes hacia el agua de ríos, lagos y presas
principalmente, y dependiendo de la naturaleza del contaminante, éste puede precipitar y
aumentar los contenidos presentes en los sedimentos que sirven de alimento para los
organismos base en la cadena alimenticia (Acuagranjas, 2005; INE-SEMARNAT, 2002).
Conjuntamente, cuando se realiza el tratamiento de aguas residuales se generan lodos de
desecho, los cuales en algunas ocasiones son utilizados como aditivos para suelos de
cultivo (Ibáñez-Burgos et al., 2006).
Separadamente de la generación de desechos líquidos y sólidos, durante las
actividades industriales, mineras, incineración de desechos municipales y residuos
peligrosos también se generan descargas aéreas en forma de partículas de diversos tamaños,
las cuales pueden permanecer suspendidas por lapsos de tiempo variables. Estas partículas
pueden afectar directamente a los organismos al entrar en el sistema respiratorio o bien,
depositarse en suelos y cuerpos de agua. La Figura 1 muestra el destino de los metales en el
ambiente, así como algunas de las principales fuentes generadoras.
Introducción
3
Figura 1 Principales destinos y fuentes de emisión de metales en el ambiente
Una gran cantidad de metales tienen como destino final el suelo, y dependiendo de
las condiciones físicas, químicas y ambientales que se presenten en el mismo pueden
presentarse diversos procesos que hacen que el metal sea inmovilizado, lixiviado,
volatilizado o absorbido (Figura 2).
Figura 2 Procesos de transformación de metales en suelo
(http://www.unex.es/edafo/GCSP/GCSL4CEMetalesPesados.htm)
Organismos
Descarga AIRE
Desechos sólidos
SUELO
Lixiviado
AGUA
SEDIMENTO
Actividades industriales
Tratamiento
Lodo
Agricultura
Combustibles fósiles
Descarga líquida
Introducción
4
1.1.1 Metales de importancia por sus características tóxicas La toxicidad de los metales depende principalmente de tres factores: (1) la
concentración en que se encuentran, muchos metales en cantidades traza se consideran
necesarios para el funcionamiento adecuado de los organismos pero al aumentar la
concentración pueden llegar a ser tóxicos a los mismos; (2) el tipo de especie que forman
en un medio específico, sólo ciertas especies de metales con determinadas cargas son
tóxicas, es decir, presentan características físicas o químicas que los hace estar
biodisponibles; (3) la persistencia del contaminante, ya que los metales no pueden ser
degradados o descompuestos únicamente se distribuyen en el entorno de distintas maneras
(Kiely, 1999).
Los metales evaluados en el presente trabajo, cadmio, cromo, níquel, plomo,
vanadio y zinc así como el metaloide selenio, presentan características que les permiten
acumularse y originar efectos adversos en la salud del hombre. En los siguientes párrafos se
resumen las características más importantes de cada uno de ellos.
El cadmio (Cd) se utiliza comercialmente en depósitos electrolíticos, aleaciones,
soldaduras, estabilizadores de plásticos, baterías, etc., las descargas al ambiente provienen
de la combustión de combustibles fósiles, incineración de basura, fundición y de la
extracción de zinc. En suelos se absorbe por la materia orgánica y en medio ácido se
absorbe por plantas. También puede bioacumularse en organismos de agua dulce (ASTDR,
1999). Los principales efectos del cadmio sobre los seres humanos son la acumulación del
metal libre en hígado y riñón, así como daño al sistema nervioso central y al sistema
inmune además de infertilidad. Una concentración de Cd de 100 nmol/l en sangre se
considera un nivel crítico si la exposición es crónica (ESST, 2007).
El uso del cromo (Cr) depende de su estado de oxidación, Cr(0) se emplea en acero
y aleaciones, mientras que Cr(III) y Cr(VI) se utilizan en curtido y como catalizador, por lo
que las descargas al ambiente se originan por actividades antropogénicas (industria textil,
de pinturas, cementera y curtidurías) (ATSDR, 1994). El Cr, dependiendo su estado de
oxidación, puede unirse fuertemente al suelo dependiendo del tipo y condiciones del mismo
Introducción
5
o bien ser disuelto y migrar a capas más profundas (aguas subterráneas). El Cr(III) es
esencial en sistemas biológicos, mientras el Cr(VI) es la forma más tóxica al ser humano
afectando el tracto respiratorio, sin que exista un nivel seguro de exposición claramente
establecido, sin embargo, la exposición aguda a niveles superiores de CrVI de 50 mg/m3 en
aire aumenta la incidencia de cáncer en los órganos respiratorios (ESST, 2007).
El uso del níquel (Ni) incluye aleaciones de acero inoxidable, joyería, monedas,
válvulas, baterías y como catalizador. Las descargas de níquel al ambiente son originadas
por la incineración de basura y las plantas de fundición, así como por las aguas residuales.
El Ni se deposita en suelo y se moviliza en medio ácido hasta alcanzar el agua subterránea,
se adhiere en sedimentos que contienen Fe y Mn. Se considera un elemento traza esencial,
aunque los polvos de refinación de Ni y el bisulfuro de Ni se consideran carcinógenos; en
forma de carbonilo de níquel es altamente tóxico, pues la exposición aguda accidental por
inhalación puede producir desde nauseas, dolor de pecho y malestar gastrointestinal hasta la
muerte (ATSDR, 2005).
En cuanto al plomo (Pb), se puede decir que aproximadamente 40% se utiliza en
forma metálica, 35% en compuestos químicos y un 25% en aleaciones (ESST, 2007). La
descarga al ambiente proviene de fundiciones, proceso y producción secundaria de metales,
manufactura de pigmentos, pinturas y químicos. Es retenido por el suelo mediante
procesos de adsorción, intercambio iónico, precipitación y acomplejamiento con la materia
orgánica (Volke et al., 2005). Se absorbe y acumula vía percutánea, respiratoria y digestiva;
se distribuye en sangre, tejidos blandos (riñón, médula ósea, hígado y cerebro) y tejido
mineralizado (huesos y dientes). De acuerdo con la Administración para la Salud y la
Seguridad en el Trabajo de los Estados Unidos (OSHA), una concentración de plomo
correspondiente a 40 µg/dl en sangre es el límite de exposición máxima admisible (ESST,
2007).
El selenio (Se) es utilizado en la industria del caucho y vidrio, eléctrica, electrónica
y como pigmento y pesticida. Es liberado al ambiente tanto por procesos naturales como
por actividades humanas. El Se se considera un metal traza esencial pues forma parte de los
Introducción
6
aminoácidos selenocisteína y selenometionina (ATSDR, 2003). El Se(0) es estable en suelo
y co-precipita en sedimentos. Es bioacumulado y biomagnificado por organismos acuáticos.
Algunos compuestos como óxido de selenio, seleniuro de hidrógeno (en concentraciones
mayores a 5 mg/m3 es intolerable) y oxicloruro de selenio son peligrosos con efectos en los
pulmones, tracto intestinal y lesiones de la piel (ESST, 2007).
El vanadio (V) es ampliamente utilizado en aleaciones, partes de automóviles y
como catalizador. Se emite al ambiente principalmente por la combustión de petróleo
crudo. Tiende a acumularse en suelos y sedimentos (ATSDR, 1992). Se considera un
elemento traza esencial, aunque tiene efectos adversos sobre el sistema respiratorio; el
límite de exposición en el aire de trabajo, marcado por la OSHA, es de 0.05 mg/m3 para
polvos de V2O5 y de 0.1 mg/m3 para vapores del mismo compuesto durante la jornada de
trabajo (ESST, 2007).
El zinc (Zn) se utiliza en aleaciones de latón y bronce, así como en cubiertas
anticorrosivas. Este metal ingresa al ambiente por la producción del acero, la minería, y la
combustión de petróleo (ATSDR, 2005b). Permanece en suelo, formando compuestos
insolubles, y se moviliza a pH neutro o ácido (Volke et al., 2005). Es un elemento traza
esencial pero la exposición crónica produce anemia y daño al páncreas. El fosfuro de zinc
(plaguicida) al igual que el cloruro de zinc (cuyo límite de exposición ocupacional es de 2
mg/m3), son las sales más peligrosas provocando incluso la muerte por intoxicación (ESST,
2007).
1.2 Tecnologías para el tratamiento de sitios contaminados con metales La remoción de un contaminante de un sitio puede realizarse utilizando diversos
tipos de tecnologías, las cuales se clasifican dependiendo de los principios utilizados, así la
elección dependerá de las características del sitio y del contaminante. El primer paso
consiste en evaluar si el proceso se realizará in situ (en el sitio) o ex situ (fuera del sitio) lo
cual se logra mediante un análisis de factibilidad, considerando las ventajas y desventajas
que pueden presentarse en ambos casos (Tabla 1).
Introducción
7
Tabla 1 Descripción de ventajas y desventajas de las tecnologías para el tratamiento de
sitios contaminados con metales
Tipo de proceso
Ventajas Desventajas
In situ
No requiere transporte
del material
Menor costo
Mayor tiempo de tratamiento
Algunas veces no se asegura la uniformidad
Dificultad para verificar la eficiencia del proceso
Ex situ
Menor tiempo de
tratamiento
Mayor seguridad en
cuanto a uniformidad
Requiere excavación
Mayor costo e ingeniería
Manipulación del material y consecuente
exposición del contaminante
Tomado de Volke et al., 2005
De acuerdo con información reportada por la Agencia de Protección al Ambiente de
los E.U.A. (EPA, 2004), las tecnologías in situ representan el 42% de los tratamientos de
remediación aplicados en suelos y aguas contaminadas, y aproximadamente el 75% de los
proyectos de este tipo se refiere a contaminantes orgánicos mientras que poco más del 25%
considera contaminantes metales o metaloides, algunos otros proyectos consideran tanto
contaminantes orgánicos como metales. Entre las tecnologías de tratamiento más utilizadas
para sitios contaminados por metales, se encuentran la solidificación/estabilización, seguida
por el tratamiento químico y separación física (EPA, 2004). En México, se ha evaluado la
factibilidad de aplicación de diversas tecnologías en la remediación de suelos contaminados
con metales, entre éstas se encuentran: separación física, lavado de suelos, remediación
electrocinética, solidificación/estabilización y biorremediación utilizando bacterias sulfato
reductoras (Velasco et al., 2004).
Con base en el tipo de agente que se aplica para la remoción de los contaminantes,
las tecnologías se dividen en tres: físico-químicas, térmicas y biológicas (Volke y Velasco,
2002) aunque cabe señalar que para la remoción de metales, los tratamientos térmicos no se
consideran un tratamiento ya que se producen residuos en los cuales se encuentran
contenidos los metales. Algunos ejemplos de tecnologías aplicadas en sitios que presentan
contaminación por metales se enlistan en la Tabla 2.
Introducción
8
Tabla 2 Tecnologías de tratamiento aplicables en la remediación de sitios contaminados
con metales
Tipo de
tratamiento Suelo Aguas profundas
Químico
Oxidación/reducción: agente
patentado base fosfato, químico
reductor
Barrera reactiva permeable
Oxidación/reducción con diversos
materiales como: ditionito de sodio,
Fe2+ +piedra caliza+ KMnO4,
H2O2, FeSO4 +HCl, NaOH +HCl
Precipitación de metales
Físico
Inundación (tensoactivo)
Lavado de suelos
Separación electrocinética
Solidificación/estabilización
Inundación (tensoactivo)
Separación electrocinética
Separación física
Biológico Biorremediación
Fitorremediación
Biorremediación
Fitorremediación
Térmico Incineración
Vitrificación N/A
FUENTE: EPA 2004 N/A: no aplica
1.2.1 Tratamientos físico-químicos En este tipo de tratamiento se aprovechan las propiedades físicas y/o químicas de
los contaminantes o del medio contaminado para separar o contener la contaminación.
Entre sus ventajas se encuentran el que son económicamente factibles, requieren de
periodos cortos de tratamiento y el equipo necesario es accesible y no requiere mucha
energía. Las principales desventajas que presenta consisten en que se generan residuos que
deben tratarse nuevamente o disponerse, lo cual genera un aumento en los costos, además
de que la movilidad de los contaminantes puede aumentar (Volke y Velasco, 2002).
Introducción
9
1.2.2 Tratamientos biológicos Este tipo de tratamientos tiene dos grandes divisiones, la fitoremediación y la
biorremediación, y consiste en el empleo de organismos vivos o productos derivados de
ellos, para contener o remover compuestos tóxicos como los metales. Los procesos a través
de los cuales se realiza el tratamiento dependen de las características de los
microorganismos y especies vegetales utilizadas y en el caso de la remoción de metales
pueden consistir en la precipitación, absorción o formación de complejos.
Las ventajas del uso de estos tratamientos es que pueden ser selectivos en cuanto al
contaminante a tratar, efectivos en cuanto a costos y se consideran tecnologías más
benéficas para el ambiente (Volke y Velasco, 2002). Las desventajas, se refieren
principalmente a los largos periodos de tratamiento y la necesidad de equipos específicos
(reactores, etc.) así como la generación de cantidades importantes de biomasa microbiana.
1.2.2.1 Fitorremediación Consiste en el uso de plantas, las cuales remueven, acumulan o estabilizan el
contaminante en suelos, sedimentos o aguas. Los mecanismos que pueden estar
involucrados en la remoción de metales son, (1) fitoextracción o fitoacumulación en la cual
el contaminante pasa a la planta a través de la raíz y se acumula en las hojas y tallos, (2)
fitoestabilización por compuestos químicos producidos y liberados por las plantas para
inmovilizar algunos contaminantes en el entorno entre la raíz y el suelo (EPA, 2004).
1.2.2.2 Biorremediación Esta estrategia depende de la actividad metabólica de los microorganismos capaces
de utilizar los contaminantes como fuente de alimento y energía o bien producir
compuestos para acomplejar y secuestrar algunos metales (Volke y Velasco, 2002).
Algunas de las técnicas incluidas en esta categoría son el bioventeo, biopilas, biorreactores,
tratamiento co-metabólico, composteo, fertilización, bioaumentación, por mencionar
algunas (EPA, 2004).
Introducción
10
Una característica determinante en la elección de la tecnología a emplear es que los
metales no son susceptibles de ser degradados, por lo que, únicamente se disminuye su
toxicidad o su movilidad haciendo uso de distintos procesos. Sin embargo, se tienen
reportes que señalan que la remoción de metales utilizando sistemas de remediación con
microorganismos puede ser eficiente y rentable en el tratamiento de sedimentos
contaminados mediante el uso de reactores de lecho fluidizado utilizando bacterias sulfato
reductoras (Seidel et al., 2004) así como biopolímeros modificados (Kostal et al., 2005). En
el tratamiento de suelos contaminados con metales se ha evaluado la precipitación de
plomo haciendo uso de consorcios de bacterias sulfato reductoras en reactor anaerobio de
flujo ascendente con una eficiencia de remoción del 99.8% (Volke et al., 2005).
En cuanto al tratamiento de aguas contaminadas, se ha utilizado biomasa viva en
forma de biopelícula e inmovilizada en diversos tipos de soporte y en distintos
biorreactores (pellets de reactor anaerobio de flujo ascendente, discos biológicos rotatorios,
cama fija, filtros de percolación, cama fluidizada y tipo air-lift); estos sistemas tienen el
inconveniente de que generan grandes cantidades de biomasa que debe ser dispuesta (Gadd
y White, 1993). También es posible utilizar biomasa muerta tratada con álcali para mejorar
la capacidad de absorción de metales y a partir de la cual se forman gránulos o pellets, el
metal absorbido es liberado por un tratamiento posterior y los gránulos de biomasa se
regeneran para su reutilización (Cañizares-Villanueva, 2000).
En la siguiente sección y debido a que el objetivo del presente trabajo es estudiar la
capacidad que presentan microorganismos productores de polisacáridos, provenientes de un
lago de brea, en la remoción de metales se presenta información sobre el papel que pueden
jugar estos bio-productos.
1.3 Polisacáridos microbianos Existen gran variedad de microorganismos con características de producción de
polisacáridos extracelulares (EPS) con distintas composiciones y propiedades y el estudio
de ellos tiene diversas aplicaciones desde la retención y remoción de contaminantes hasta la
Introducción
11
explotación comercial de las propiedades específicas como espesantes, gelificantes, etc.
(ver Tabla 3).
Los polímeros extracelulares, junto con algunas glicoproteínas, se conocen con el
nombre general de glicocalix pero pueden constituir distintos tipos de estructuras: (1)
cápsula celular, la cual está unida covalentemente a la superficie celular, (2) capa viscosa,
“slime layer” o exopolisacárido (EPS), la cual puede estar unida débilmente a la pared
celular o ser excretada al medio (Ruas-Madiedo y de los Reyes-Gavilán, 2005), este tipo de
cápsula o capa se encuentra altamente hidratada, con un contenido de agua de hasta un 98%
(Wilkinson, 1958). Entre los microorganismos productores de polisacáridos extracelulares,
existen tanto bacterias Gram positivas como Gram negativas. Algunas diferencias
estructurales entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas así como la ubicación del
glicocalix en las mismas se muestran en la Figura 3.
Figura 3 Estructura celular de bacterias Gram (+) y Gram (-) (Ruas-Madiedo y de los
Reyes-Gavilán, 2005)
1.3.1 Composición Los polisacáridos están formados por unidades simples (monosacáridos) de
glúcidos, los cuales se encuentran unidos mediante enlaces O-glicosídicos, este tipo de
Membrana citoplasmática
Citoplasma
Pared celular (peptidoglicano y ácido lipoteicoico)
Glicocalix (cápsula y EPS)
Membrana exterior (lipopolisacárido, LPS)
Pared celular (peptidoglicano)
Membrana citoplasmática
Citoplasma
Periplasma
Glicocalix (cápsula y EPS)
Gram positiva Gram negativa
Introducción
12
enlace tiene lugar entre el radical –OH del carbono hemiacetálico y el grupo alcohol del
otro monosacárido (Figura 4). Los polisacáridos forman una estructura que puede ser lineal
o ramificada y se clasifican de acuerdo a su composición en homogéneos (formados por un
solo tipo de monómero) o heterogéneos (formados por dos y hasta cinco azúcares
diferentes).
Figura 4 Formación del enlace O-glicosídico
Los homopolisacáridos conteniendo glucosa pueden clasificarse en función del tipo
de enlace en α-D-glucano y β-D-glucanos. Los α-D-glucanos presentan ramificaciones en
sus estructuras y tres o más tipos de uniones (ejemplos: almidón y glucógeno), mientras que
los β-D-glucanos (ejemplo: celulosa y quitina) son polímeros lineales de moléculas neutras
unidas por un solo tipo de enlace y polímeros ramificados con dos tipos de enlace. Los
heteropolisacáridos están formados por unidades que varían en cuanto a tamaño y
naturaleza, en cada unidad las hexosas pueden presentar un tipo de enlace α, β o ambos en
alternancia, además pueden estar presentes en forma piranósica o furanósica, el punto de
enlace también puede variar entre las posiciones 2,3,4,6; un heteropolisacárido típico es una
estructura ramificada compleja cuya proporción de componentes no puede ser reducida a
una pequeña unidad repetitiva (Wilkinson, 1958).
Algunos de los polímeros extracelulares de bacterias con propiedades de remoción
de metales han sido bien caracterizados: Janecka et al. (2002) reportaron que el EPS de
Sinorhizobium 9702-M4, está formado por 51.8% de glucosa, 21.15% de galactosa, 13.8%
de ácido glucurónico, 10.5% de manosa, 1.7% de arabinosa y 0.3% de N-acetil-
glucosamina; Ozdemir et al. (2005) determinaron que la composición del EPS producido
por Chryseomonas luteola TEM05 es 33% de azúcares totales y 26% de proteína; Kazy et
al. (2002) evaluaron la composición de EPS en cepas de Pseudomonas aeriginosa
resistente y sensible a cobre, encontrando que el mayor contenido en ambos EPS era de
Introducción
13
alginato seguido por galactosa, piruvato, acetato, galactosamina y glucosa principalmente,
además de que la cantidad de EPS producido por la cepa resistente fue poco menor del
doble de la cantidad producida por la cepa sensible; McLean et al. (1990) describen las
características del polímero capsular formado por poly-γ-ácido glutámico producido por
Bacillus licheniformis, Arias et al. (2003) analizaron el EPS producido por Halomonas
maura y reportaron que estaba compuesto por 65.34% de carbohidratos, 2.57% de
proteínas, 8.14% de ácidos urónicos y 0.185% de acetiles. La mayoría de los EPS
microbianos tienen naturaleza aniónica debido al contenido de ácidos urónicos y el
componente más común es el ácido D-glucurónico.
El papel que desempeñan los EPS y su composición en la remoción de metales se
tratará con detalle en la sección 1.4.
1.3.2 Importancia biológica La composición de los polisacáridos extracelulares varía dependiendo del
organismo que lo produce y puede ser grueso, fino, rígido o flexible. Las capas rígidas
forman una matriz impermeable (cápsula) que repele algunos colorantes como la tinta
china. Se ha sugerido que la producción de EPS así como su función, es dependiente de la
naturaleza del ambiente en que se encuentra el microorganismo (Whitfield, 1988), y que
algún factor en el ambiente favorece la selección de variantes mucoides (Wilkinson, 1958).
Los polisacáridos extracelulares (EPS) desempeñan diversas funciones en un
microorganismo, la mayoría de las cuales son de protección y se encuentran relacionadas
con dos propiedades que tienen en común la mayoría de los EPS: son muy hidrofílicos y le
confieren algún tipo de carga eléctrica a la superficie celular. Algunas de las funciones que
se les atribuyen incluyen las siguientes:
(1) son importantes en la adherencia o fijación a sustratos, formando biopelículas,
causantes de corrosión y obstrucción de tuberías, formación de placa dental y caries,
formación de biopelículas en catéteres y prótesis quirúrgicas, etc., así como la adhesión a la
flora autóctona en intestinos de mamíferos,
Introducción
14
(2) resistencia a la acción de células fagocitarias, en sistemas patológicos la cápsula
es un factor de virulencia ya que muchas de ellas no son reconocidas como material extraño
por el sistema inmune,
(3) contribuyen a la resistencia, a la desecación (retención de cantidades de agua
importantes) y también proporcionan un sistema amortiguador protegiendo la célula de una
pérdida o ganancia rápida de agua además de protección contra la depredación por
protozoarios,
(4) funcionan como una resina de intercambio mejorando la difusión de nutrientes
hacia la célula,
(5) protección contra agentes bacterianos (anticuerpos, antibióticos, metales
pesados, detergentes, etc.),
(6) en bacterias fijadoras de N2 atmosférico actúan como barrera a la difusión de O2
evitando la inactivación de la nitrogenasa, o como fase de reconocimiento entre la bacteria
y la planta específica, por mencionar algunos (Madigan et al., 2004; Whitfield, 1988;
Wilkinson, 1958).
1.3.3 Importancia comercial Los polisacáridos microbianos ofrecen ventajas frente a los de origen vegetal o de
algas, entre ellas se encuentra la gran cantidad de especies microbianas que son capaces de
sintetizarlos así como la variedad que presentan en cuanto a composición y propiedades
funcionales, además de que su producción puede realizarse bajo condiciones controladas en
reactores y por lo tanto es renovable. A pesar de esto, sólo unos cuantos EPS son
explotados comercialmente (Tabla 3).
Introducción
15
Tabla 3 Polisacáridos extracelulares producidos por microorganismos y sus aplicaciones
Nombre Microorganismo productor Usos Referencia
Alginato Azotobacter, Pseudomonas Gelificante, estimulación del sistema inmune. Sabra et al., 2001
Biofill®,
Celulosa
Gengiflex®
Gluconacetobacter xylinum
Estabilización de emulsiones, fabricación de “piel
artificial”, inmovilización de proteínas y células, aditivo
de alimentos, etc.
Chávez-Pacheco et al.,
2004
Clairana ® Beijerinckia sp Agente de suspensión, gelificante, emulsificante,
espesante en alimentos. Moreira et al., 2003
Curdlan Agrobacterium sp
Alcaligenes faecalis
Preparación de geles en cromatografía, absorbentes y
como aditivo de alimentos. Lee et al., 1997
Dextran
Acetobacter sp.
Leuconostoc mesenteroides,
Gluconobacter oxydans
Aditivo, emulsificador, estabilizador, transportador. Se
utiliza para dar volumen en plasma-sangre.
Naessens et al., 2005
Qader et al., 2005
Gelan Sphingomonas paucimobilis
Sphingomonas spp.
Espesante, formación de geles en fitogel así como en
cultivos bacterianos y en materiales absorbentes.
Sutherland, 2001
Sutherland, 1997
Xantana
Xanthomonas campestris
Xanthomonas gummisudans
Xanthomonas phaseoli
Estabilizante de suspensiones en la industria alimentaria
y en la recuperación terciaria del petróleo. Agente
encapsulante, floculante, adhesivo, agente gelificante.
Sutherland, 2001
Introducción
16
1.4 Antecedentes indirectos La interacción entre metales y microorganismos es determinada por diversos
factores tales como el tipo de microorganismo, la especie química del metal y el nivel en
que se lleva a cabo dicha interacción. En este capítulo se presenta una revisión del estado
del arte de la aplicación de microorganismos y sustancias producidas por ellos (EPS) en la
remoción de metales tóxicos, los mecanismos a través de los cuales se realiza la
interacción, así como los distintos microorganismos que han sido estudiados.
1.4.1 Capacidad de remoción de metales por microorganismos La interacción entre la biomasa, ya sea viva o muerta, con metales puede llevarse a
cabo tanto en el interior, en el exterior o en la superficie de la célula (Suárez y Reyes,
2002). De acuerdo con el trabajo de Gadd y White (1993) la localización de algunos
procesos de captación de metales puede darse en el espacio intracelular, periplásmico,
pared celular, materiales asociados a células y reacciones extracelulares, tal como se
muestra en la Figura 5.
Diversos mecanismos tienen lugar en el interior, exterior y alrededores del
microorganismo, dependiendo del tipo de interacción que se presenta entre el metal y el
microorganismo. A nivel extracelular pueden presentarse mecanismos de movilización e
inmovilización, también pueden secretarse compuestos orgánicos de bajo peso molecular
con alta afinidad por el hierro (sideróforos). La interacción con la superficie celular
depende de la composición estructural característica del microorganismo (ver Figura 3), por
lo que las bacterias Gram positivas presentan mayor capacidad de unión con especies
metálicas con respecto a las Gram negativas (Suárez y Reyes, 2002). A nivel intracelular, el
metal acumulado desencadena transformaciones enzimáticas o síntesis de proteínas
específicas (metalotioninas).
Introducción
17
Figura 5 Localización celular de procesos microbianos de captación y detoxificación
de metales (Gadd y White, 1993)
De acuerdo con diversos estudios reportados (Hernández et al., 1998; Roane, 1999;
Taniguchi et al., 2000; Richards et al., 2002; Yilmaz, 2003; Hetzer et al., 2006) la
capacidad de acumulación o remoción de metales varía dependiendo del metal o metales en
cuestión, el microorganismo involucrado y las condiciones de cultivo en que se realice el
experimento.
En la Tabla 4 se presentan algunos estudios realizados sobre la capacidad de
remoción de metales que presentan algunos microorganismos, así como las concentraciones
mínimas inhibitorias que presentan hacia algunos de los metales evaluados en el presente
trabajo. Cabe indicar que esta información se tomó como referencia para establecer los
intervalos de concentración evaluados en el presente trabajo.
Reacciones extracelulares Precipitación por productos excretados (sulfuro, oxalatos) Formación de complejos y quelación Sideróforos
Intracelular Enlazamiento no específico/quelación Compartamentalización en organelos Reacciones redox Metalotioninas
Pared celular Adsorción Intercambio iónico Unión covalente Reacciones redox Precipitación
Membrana celular/espacio periplásmico Adsorción/intercambio iónico Reacciones redox Precipitación Difusión y transporte
Materiales asociados a la célula (polisacáridos, cápsulas) Intercambio iónico Atrapamiento de partículas Enlazamiento no específico Precipitación
Introducción
18
Tabla 4 Estudios y concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) reportadas para distintos microorganismos
Microorganismo Origen Metal CMI (mM) Referencia
Bacterias G+ neutrófilas
Bacilos G- acidófilos
Agua, sedimentos, suelo de mina
de carbón
Zn
Ni
1, 10, 20
1, 5
Castro-Silva et al.
2003
Bacillus circulans EB1 Suelo contaminado
con metales pesados
Cu, Co
Cd, Ni
Mn, Zn
2.5, 2.0
2.0, 10.0
24.0, 22.0
Yilmaz, 2003
Bacillus megaterium Suelo contaminado Pb 0.6 Roane, 1999
Brevibacterium sp. HZM-1 Suelo de mina de zinc Zn 15 Taniguchi et al., 2000
Enterobacter cloacae Suelo de refinería Ni, V 21, 6 Hernández et al., 1998
Escherichia hernannii Suelo de refinería Ni, V 10-21, 4-6 Hernández et al., 1998
Cepas de Frankia Suelo
Cd, Cr
Ni, Pb
Se
<0.1– 0.4, 0.1-1.75
0.2-0.5, 5.0-8.0
0.3-3.5
Richards et al., 2002
Geobacillus stearothermophilus Aguas termales Cd 0.6 Hetzer et al., 2006
Geobacillus. thermocatenulatus Aguas termales Cd 0.6 Hetzer et al., 2006
Cepas de Gluconobacter Colección microbiana
Cd
Co
Zn
8, 10
6, 10
>15
Leigh-Emma, 2000
Pseudomonas marginalis Suelo Pb 2.5 Roane, 1999
Ralstonia eutropha
ATCC 43123 Colección microbiana
Cd, Co
Zn
9, 10
12 Leigh-Emma, 2000
Ralstonia metallidurans CH34 Suelo contaminado Se 6 Roux et al,. 2001
Introducción
19
1.4.2 Mecanismos de remoción de metales por microorganismos Como se mencionó previamente, el tipo de interacción que existe entre los
microorganismos y los metales está en función de las características del metal tales como
estado de oxidación y especiación, así como del tipo del microorganismo en estudio.
De esta forma, la principal división que se tiene se relaciona con el efecto que se
produce en la movilidad del metal, es decir, si es movilizado, un proceso conocido como
lixiviación microbiana, o inmovilizado lo cual puede ocurrir por diversos mecanismos
(Vullo, 2003). La Figura 6 ilustra como se clasifican los mecanismos involucrados en la
remoción de metales.
Figura 6 Mecanismos biológicos involucrados en la remoción de metales (Vullo, 2003)
A continuación se da la descripción de cada uno de los mecanismos de
inmovilización de metales por microorganismos (Vullo, 2003; Valls y de Lorenzo, 2000).
Es importante señalar que la mayoría de las veces es difícil establecer con certeza el
mecanismo que tiene lugar.
SISTEMA BIOLÓGICO
Movilización
Inmovilización
Biolixiviación
Biosorción Bioacumulación Biomineralización Quimisorción mediada por
microorganismos Biotransformación
Introducción
20
1.4.2.1 Bioabsorción Se caracteriza por una interacción fisicoquímica del metal con ligandos de la
superficie celular, este tipo de interacción es el que se lleva a cabo cuando se produce un
polímero extracelular y ofrece la ventaja de remover en forma específica los metales aún en
concentraciones bajas.
1.4.2.2 Bioacumulación El metal se transporta al interior de la célula mediante un gasto de energía y puede
ser almacenado en organelos. Cuando un metal sufre una biotransformación ocurre un
cambio de tipo químico tal como cambio en el estado de oxidación, metilación, etc.
1.4.2.3 Biomineralización Se refiere a la precipitación del metal como carbonato, hidróxido, sulfuro o fosfato.
1.4.2.4 Quimisorción mediada por microorganismos Primero se lleva a cabo una biomineralización formándose un depósito primario el
cual funciona como núcleo de cristalización para capturar el metal de interés.
1.4.3 Estudios de remoción de metales por microorganismos productores de biopolímeros
La producción de biopolímeros extracelulares, incluidos entre estos los
polisacáridos, se encuentra ampliamente distribuida tanto entre especies procedentes de
suelo como de ambientes marinos. Estos biopolímeros extracelulares pueden estar
formados por polisacáridos y proteínas o una mezcla de ambos. La interacción con diversos
metales depende de las propiedades de los grupos funcionales presentes en estos
biopolímeros.
Recientemente se ha reportado el uso de un biopolímero semejante a la elastina
(ELP) formado de residuos de histidina (manipulado para aumentar la cantidad de estos
últimos) en la remoción de cadmio del suelo con una eficiencia del 55%. Una característica
Introducción
21
importante de este biopolímero es que puede ser recuperado por precipitación por cambio
de temperatura, lo cual permite que sea reutilizado, la desventaja es que la eficiencia de
recuperación del mismo por precipitación disminuyó debido a la presencia de zinc en la
muestra de suelo (Prabhukumar et al., 2004). El ELP también se ha modificado para que
contenga una proteína metaloregulatoria de elevada afinidad y especificidad por el
mercurio, las propiedades de dicho biopolímero consisten en una combinación de ambos
componentes, es decir, puede enlazar mercurio de forma selectiva aún en presencia de otros
metales y además puede ser separado por precipitación y regenerado para uso continuo, la
concentración de mercurio pudo ser disminuida hasta niveles de partes por billón (Kostal et
al., 2005)
De igual forma existen diversos reportes acerca de la remoción de metales por
polímeros extracelulares extraídos de lodos activados provenientes de plantas de
tratamiento de aguas residuales. La composición de estos biopolímeros varía
considerablemente dependiendo de su origen, pero en general tienen un alto contenido de
proteínas, ácidos húmicos, ácidos urónicos, polisacáridos y pequeñas cantidades de ácidos
nucleicos y lípidos; se ha demostrado además que existe una correlación positiva
importante entre el número de sitios de enlazamiento y el contenido de proteína,
polisacáridos y sustancias húmicas (Guibaud et al., 2005).
En cuanto al uso de polisacáridos extracelulares (EPS) en la remoción de metales de
suelos, se ha reportado que la eficiencia de esta remoción disminuye si se trabaja con suelos
contaminados por prolongados periodos de tiempo (décadas) (Jensen-Spaulding et al.,
2004). Otros estudios evaluaron el tiempo de permanencia o mineralización de EPS en el
suelo y el efecto de la adición de EPS sobre la movilidad de cobre, se concluyó que la
degradación del biopolímero es más rápida y mayor en condiciones aerobias pues en
condiciones anaerobias la mayor descomposición tiene lugar los primeros diez días y
representa el 40% del total del EPS adicionado; el mismo estudio demostró que la adición
de polisacáridos bacterianos favorece la movilización del cobre ya que la cantidad de cobre
soluble presente en el suelo tratado fue 6.2 veces mayor que en el control (Zhou et al.,
2004).
Introducción
22
1.4.3.1 Microorganismos involucrados en la remoción de metales Los microorganismos con capacidad de producción de polisacáridos extracelulares y
retención de metales son muy diversos y pertenecen a especies distintas con características
específicas en cuanto a la composición del EPS producido. La Tabla 5 resume la
composición de EPS producidos por algunos microorganismos reportados así como el/los
metales evaluados. De acuerdo con lo anterior, la capacidad de retención o remoción de
metales depende en gran medida de la composición del EPS producido.
Introducción
23
Tabla 5 Microorganismos productores de EPS con capacidad de remoción de metales
Microorganismo Metal composición de EPS Referencia
Bacillus licheniformis Mg, Ca, Mn, Ni, Cu, Al, Cr, Fe Poli-γ ac. glutámico 0.015% proteína, 0.008% ac. urónicos
McLean et al., 1990
Bacillus firmus MS-102 Pb, Cu, Zn 87% azúcar total, 38% ácido urónico 6.3 % ácido pirúvico
Salehizadeh y Shojaosadati, 2003
Chryseomonas luteola TEM05 Cd, Co 33% azúcares totales, 26% proteína total Ozdemir et al., 2005
Halomonas maura Pb 65.3% carbohidratos, 2.5% proteínas 8.1% ácidos urónicos, 0.18% acetiles
Arias et al., 2003
Pseudomonas aeruginosa Cu
33% alginato, 10% galactosa, 8.5% piruvato, 6.5% acetato, 4.2% galactosamina, 2.6% glucosa 2.1% manosamina, 1.8% quinosamina 1.6% glucosamina, 0.7% manosa
Kazy et al., 2002
Paenibacillus jamilae Pb, Cu, Zn, Co, Ni, Cd Fucosa, Glucosa, Arabinosa, Xilosa Ramnosa, Manosa, Galactosa
Aguilera et al., 2001 (ver Morillo et al. 2006)
Paenibacillus polymyxa P13 Cu Manosa Prado et al., 2005
Sinorhizobium 9702-M4 Cd, Cu, Pb, Zn
51.8% glucosa, 21.1% galactosa 13.8% ac. Glucurónico, 10.5% manosa 1.7% arabinosa, 0.3% N-acetil glucosamina
Jensen-Spaulding et al., 2004
Zoogloea ramigera Cd 11 D-glucosa, 3 D- galactosa, 1.5 Ac. piruvico Ikeda et al., 1982
(ver Park et al., 1999)
Introducción
24
1.5 Antecedentes directos Los microorganismos utilizados en este trabajo se aislaron de 8 muestras acuosas y
sólidas provenientes del lago de brea conocido como Pitch Lake, el cual se encuentra
localizado en Trinidad y Tobago. Estudios previos, realizados en la ENCB-IPN y el
Instituto Mexicano del Petróleo, llevaron a cabo el aislamiento de 22 microorganismos, de
los cuales en el presente trabajo sólo se estudian 7. Lo anterior obedece a que estos
microorganismos presentaron cierta capacidad de retener metales como son níquel,
manganeso, selenio y vanadio, además su apariencia parecía indicar la producción de
polisacáridos extracelulares (datos no publicados).
La Tabla 6 enumera a los aislados en estudio y la codificación que se les dio para el
desarrollo del presente trabajo.
Tabla 6 Codificación de los microorganismos en estudio
Aislado Codificación
1 PL3
2 PL4
3 PL7
4 PL13
5 PL14
6 PL18
7 WTFI
Justificación
25
2. JUSTIFICACIÓN
La contaminación de aguas, sedimentos y suelos por metales pesados, surge como
consecuencia de actividades humanas tanto industriales como relacionadas con la
agricultura y el inadecuado procesamiento y disposición de residuos que contienen estos
materiales. Este problema es cada vez más grave ya que produce efectos directos sobre los
ecosistemas y en la salud de las poblaciones. En México se tienen reportes de
contaminación con metales tales como arsénico, plomo, cobre, zinc en diferentes
localidades tanto en aguas como en suelos y sedimentos.
Los metales no son susceptibles de ser degradados como puede suceder con los
compuestos orgánicos (bifenilos, dioxinas), por lo que no se puede hablar de su eliminación
en el sentido elemental debido a lo cual únicamente varía la concentración así como la
forma química en que se encuentren. Existen diferentes técnicas empleadas en la remoción
de metales tanto de suelo como de agua, las cuales son empleadas cuando se tienen
concentraciones elevadas, pero cuando se tienen concentraciones muy bajas estas técnicas
no son costeables y es en estas situaciones en las que se ha propuesto la aplicación de los
sistemas biológicos como una alternativa.
La ventaja principal del uso de sistemas biológicos para la remediación de suelos y
aguas contaminados con metales es que permiten una remoción eficiente, además de que
ésta puede ser selectiva en cuanto a los metales contaminantes, con un mínimo impacto
sobre las características del suelo o efluente.
En la naturaleza pueden encontrarse gran cantidad de microorganismos tolerantes o
acumuladores de metales y el estudio de ellos permitirá el desarrollo de tecnologías de
remediación biológica más efectivas.
Objetivos
26
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Evaluar la capacidad de remoción de metales que presentan los microorganismos
productores de polisacáridos extracelulares provenientes de un lago de brea.
3.2 Objetivos específicos 1.- Conocer las características de morfología y de producción de polisacáridos en los
microorganismos en estudio.
2.- Identificación de microorganismos por técnicas de biología molecular.
3.- Evaluar y seleccionar métodos de conservación a corto plazo de los microorganismos en
estudio.
4.- Selección de los microorganismos por su capacidad de remover diferentes metales en
cultivo sólido.
5.- Estudiar la cinética de crecimiento y producción de EPS por los microorganismos
previamente seleccionados.
6.- Evaluar la remoción de metal por biomasa con respecto a la remoción presentada por el
EPS de Bacillus (PL7).
7.- Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7).
Materiales y métodos
27
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 Fuente de microorganismos y caracterización Los microorganismos utilizados en el presente trabajo fueron proporcionados por el
laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB-IPN. Su origen y codificación se
presentan en la Tabla 6 del presente trabajo (sección 1.5). Los microorganismos en estudio
fueron caracterizados en cuanto a morfología colonial y microscópica, además se realizaron
diversas tinciones para evaluar su Gram, formación de esporas y cristales paraesporales así
como para evidenciar la presencia de cápsula y la producción de EPS.
4.1.1 Morfología colonial y tinción de Gram Cada microorganismo se sembró en placas de agar nutritivo por la técnica de estría
y estas se incubaron durante 18 h a 30oC, en seguida se determinaron las características de
morfología colonial.
La tinción diferencial de Gram se realizó utilizando el equipo de tinción de Gram
(Golden Bell) siguiendo el protocolo tradicional (Madigan et al., 2004) que consistió en
fijar el frotis al calor seguido por adición de solución de cristal violeta en cantidad
suficiente para cubrir el portaobjeto, luego se adicionó una solución fijadora de lugol y en
seguida se realizó la extracción del colorante con mezcla de alcohol-acetona, finalmente se
adicionó safranina como colorante de contraste, entre cada adición de reactivo se hizo un
enjuague con agua. Las preparaciones fueron observadas en un microscopio óptico con
objetivo de inmersión (resolución 100X), evaluándose tanto la forma como el color.
4.1.2 Tinción de esporas La verificación de formación de esporas por los aislados se realizó por tinción
diferencial de Wirtz-Conklin en la cual se utilizaron cultivos en fase estacionaria (cultivos
de 24 h de incubación). La técnica consistió en preparar un frotis del aislado a evaluar y
adicionar suficiente colorante verde de malaquita para cubrir el portaobjetos, se colocó
Materiales y métodos
28
encima del mechero y se calentó sin hervir durante 10 min, evitando que el sistema se
secara; se enjuagó con abundante agua y se tiñó con safranina durante 1 min, finalmente se
enjuagó y se dejó secar. La preparación se observó al microscopio con objetivo de
inmersión (100X).
Las esporas retuvieron el primer colorante (verde) mientras que las células
vegetativas sólo retuvieron el segundo colorante (rosa), lo cual permitió diferenciarlas y
observar las esporas teñidas.
4.1.3 Tinción de cápsula Para evaluar la presencia de cápsula en los aislados se realizó tinción en fresco
utilizando tinta china, lo anterior consistió en mezclar una asada de microorganismo en una
pequeña cantidad de tinta china y mezclar. Las preparaciones se observaron al microscopio
utilizando objetivo de inmersión (100X) así como en microscopio de contraste de fases.
4.1.4 Tinción de polisacáridos extracelulares La evaluación de producción de EPS por los microorganismos se realizó siguiendo
el método reportado por Ruijssenaars y Hartmans (2001) para la evaluación de la
producción de polisacarasas. Este método emplea un colorante (rojo Congo, Golden Bell) el
cual interactúa de forma no covalente con los EPS haciéndolos visibles en la placa.
El método fue realizado inoculando por picadura cada uno de los aislados en placas
de agar nutritivo e incubando por 18 h a 30oC. Luego de la incubación se cubrió la
superficie de la placa conteniendo las colonias a evaluar, con una solución acuosa de rojo
Congo (1 g/l) y se dejó reposar durante 20 min. Posteriormente, se enjuagó con agua
desmineralizada y se cubrió con una solución 1 M de NaCl por 20 min. Finalmente, se
enjuagó con agua desmineralizada y se observó si había retención de colorante por las
colonias de cada microorganismo; una coloración roja fue considerada como prueba
positiva.
Materiales y métodos
29
4.1.5 Tinción de cristales paraesporales La producción de cristales paraesporales es una manera de diferenciar cepas de
Bacillus thuringiensis (Bt) del Bacillus cereus. La metodología empleada para la tinción de
cristales paraesporales producidos por Bt se reporta por Ammonds (2002) y consistió en
utilizar frotis fijados al calor de colonias esporuladas y teñirlas con una solución de azul de
Coomassie (0.133%) en ácido acético (50%), después de lavar y secar el portaobjeto, éste
se observó al microscopio con objetivo de inmersión (100X).
Los cristeles proteicos intracelulares también llamados cuerpos paraesporales se
tiñen de color azul oscuro.
4.2 Identificación de microorganismos por amplificación parcial de 16S rDNA La identificación de los aislados se llevó a cabo en distintas etapas y se realizó en
las instalaciones del Laboratorio de Genómica Ambiental del Departamento de Genética
del CINVESTAV Unidad Zacatenco bajo la asesoría del Dr. Jaime García-Mena.
En seguida se presenta el protocolo que se empleó para la extracción de ácidos
nucleicos totales así como para la amplificación parcial de 16S rDNA y la identificación de
los aislados productores de polisacáridos por comparación con los datos reportados por el
Gen Bank (NCBI).
4.2.1 Extracción de ácidos nucleicos totales Cada aislado se hizo crecer en medio Luria-Bertani (1.0% triptona, 0.5% extracto de
levadura, 1.0% NaCl) durante 18 h en baño con temperatura controlada a 28oC y agitación
recíproca de 150 rpm. Se tomó una muestra del cultivo y se realizó una tinción de Gram
para evaluar ausencia de contaminación. El medio de cultivo se centrifugó a 5500 rpm y se
recuperó el paquete de células contenidas en el sedimento resuspendiéndolo en agua
desionizada.
Posteriormente, se realizó la extracción de ácidos nucleicos totales adicionando un
volumen de fenol (equilibrado con Tris-HCl, pH 8.0). Se mezcló y centrifugó el contenido
Materiales y métodos
30
a 14000 rpm por 5 min a 4ºC, después de esto se recuperó el sobrenadante y se adicionó un
volumen igual de cloroformo. Se mezcló e inmediatamente se centrifugó a 14000 rpm por 5
min a 4ºC. El sobrenadante se recuperó y se adicionaron 0.5 volúmenes de CH3COONa
(3.0 M pH 5.2) y 2 volúmenes de etanol absoluto para precipitar el DNA.
El DNA precipitado se recuperó centrifugando a 14000 rpm, posteriormente el
sobrenadante se eliminó y se realizó un lavado con etanol al 70% y se centrifugó a 14000
rpm. Finalmente se decantó el sobrenadante, se dejó secar al aire cada uno de los tubos que
contenían la pastilla con los ácidos nucleicos totales. Por último, la pastilla se disolvió en
buffer TE 1X pH 8 (Tris-HCl 0.5 M pH 8 y EDTA 1mM).
4.2.2 Caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos totales Los ácidos nucleicos totales extraídos fueron caracterizados por fraccionamiento en
gel de agarosa al 0.7%, el cual se preparó disolviendo 1.4 g de agarosa en 20 ml de TBE
0.5X (5.4 g Tris base, 2.75 g de ácido bórico, 0.37 g EDTA), la gelificación se realizó en el
molde de geles adicionando 0.5 µl de bromuro de etidio (1 mg/ml), el buffer de carga para
la electroforesis consistió de azul de bromofenol al 0.25 % y glicerol al 30 %. La
electroforesis se realizó a 112 volts durante 40 min aproximadamente. El DNA se
cuantificó por espectrometría a una longitud de onda de 260 nm con la dilución apropiada.
Se consideró que 1 U A260 = 50 µg /ml.
4.2.3 Amplificación de la región 16S rDNA Los productos de PCR se obtuvieron utilizando los primers Bac349F/CGOR605, la
reacción se realizó adicionando buffer de PCR 1X, DNA molde, primer (CG0R605 5’-
CCCGGGAACGTATTCACCG-3’ y Bac349F 5’- AGGCAGCAGTDRGGAAT-3’),
desoxinucleótidos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), MgCl2 y Taq polimerasa en las
concentraciones reportadas por Cervantes-González (2007). La reacción se llevó a cabo en
un termociclador Gene Amp PCR System 2400 bajo las siguientes condiciones:
precalentamiento a 94ºC durante 5 min, desnaturalización a 94ºC durante 30 seg,
alineamiento a 59.7 ºC durante 30 seg, alargamiento a 72ºC durante 30 seg y un tiempo de
Materiales y métodos
31
permanencia final de 7 min a 72ºC, este ciclo se repitió 25 veces. Una vez finalizada la
reacción de PCR, se determinaron los productos por análisis cualitativo en un gel de
agarosa al 1% y se cuantificaron de manera similar a la utilizada para ácidos nucleicos
totales.
La siguiente etapa consistió en la purificación de los productos de PCR por
precipitación de los mismos con 2 volúmenes de alcohol absoluto y dejando en reposo por
12 h para luego centrifugar a 14000 rpm y realizar un lavado de la pastilla con etanol 70%,
se centrifugó a 14000 rpm, se eliminó el sobrenadante y la pastilla formada se dejó secar al
aire para finalmente resuspenderla en buffer TE 1X.
Después del procedimiento anterior se determinaron los productos por análisis
cuantitativo en gel de agarosa al 1% y se realizó la cuantificación espectrofotométrica de
manera similar a la utilizada para ácidos nucleicos totales.
4.2.4 Secuenciación de los productos de PCR Se secuenciaron los productos de PCR de aproximadamente 1371 pb. Para llevar a
cabo la reacción de secuenciación se utilizó el Big Dye Terminador v3.1 Cycle Sequencing
kit (Applied Biosystems). Se mezcló 1 µl del producto de PCR Bac349F/CGO605, 1 µl de
primer (Bac349F no clamp y BF82CG antisense), 1 µl de mezcla de reacción, 2 µl buffer
5X y 15 µl de agua. El intervalo de secuenciación se muestra en la Figura 7.
Figura 7 Región 16S rDNA secuenciada
Bac349F- BF82CGAntisense ( TaOpt 55.0 º C )
Bac349F no clamp
BF82CGAntisense
Bac349F- BF82CGAntisense ( TaOpt 55.0 º C )
Bac349F no clamp
BF82CGAntisense
16 S rDNA
Materiales y métodos
32
La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador Gene Amp PCR
System 2400 bajo las siguientes condiciones: precalentamiento a 96ºC durante 5 min,
desnaturalización a 60ºC durante 10 seg, alineamiento a 50ºC durante 5 seg, y alargamiento
a 60ºC durante 4 min, este ciclo se repitió durante 25 veces .
Los productos obtenidos fueron purificados adicionando 5 µl de EDTA (125 mM
pH 8) y 60 µl de etanol absoluto, la mezcla fue incubada a temperatura ambiente durante 30
min, posteriormente se centrifugó durante 20 min a 14000 rpm y se procedió
inmediatamente a eliminar todo el sobrenadante con una micropipeta. Finalmente, la
pastilla se lavó dos veces con 250 µl de etanol al 70%. Por último, las reacciones fueron
secuenciadas con el equipo ABI-PRISM en los laboratorios de CINVESTAV Unidad
Zacatenco.
4.2.5 Análisis de las secuencias Para realizar la depuración de las secuencias generadas se utilizó el programa
BioEdit y los análisis filogenéticos fueron realizados en MEGA 4 (Tamura et al., 2007).
Las secuencias depuradas, incluidas en la sección 7.3, fueron analizadas mediante análisis
BLAST v2.2.14 de NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/) con el fin de obtener información
acerca de los microorganismos almacenados en el Gen Bank con los cuales presentan
homología. Las secuencias fueron cortadas y alineadas luego se infirió la historia evolutiva
utilizando el método Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) con un bootstrap (muestreo con
reemplazamiento) de 500 réplicas. Las distancias evolutivas fueron calculadas utilizando el
método Maximum Composite Likelihood (Tamura et al., 2004).
4.3 Conservación de los microorganismos Una vez que se determinó la pureza de los microorganismos de interés, éstos fueron
conservados. La conservación a corto plazo se evaluó en tres medios diferentes: suelo,
papel filtro y agar nutritivo/glicerol. La efectividad de los métodos así como la selección
del método más adecuado, se basó en la viabilidad de los cultivos después de distintos
Materiales y métodos
33
periodos de incubación (30, 60 y 90 días) así como la observación de las características
morfológicas de cada uno de los aislados en los distintos medios de conservación.
El procedimiento que se siguió fue el siguiente:
(1) Se esterilizaron viales conteniendo suelo previamente tamizado en malla No. 20,
viales con piezas de papel filtro con área de 5 mm2 aproximadamente y viales con
agar nutritivo inclinado. Los viales con suelo se esterilizaron tres días seguidos para
eliminar los microorganismos y esporas que pudiese contener, después de esto se
evaluó la esterilidad mediante inoculación de una muestra en placa de agar nutritivo e
incubación por 18 h a 30oC.
(2) Se tomó una asada de cada aislado a partir de un cultivo en agar nutritivo y se disolvió
en 5 ml de agua estéril, luego se colocaron 2 ml de la solución anterior en cada uno de
los viales (suelo y papel filtro) y se dejó secar en condiciones estériles. Se cerraron los
viales herméticamente y se dejaron a temperatura ambiente.
(3) Para la conservación en viales con agar nutritivo inclinado, se inoculó por estría cada
uno de los microorganismos sobre la superficie del agar y se dejaron en incubación a
30oC durante 18 h. Después de la incubación se verificó el crecimiento de los
microorganismos y se cubrió con 5 ml de glicerol estéril hasta cubrir completamente
el agar. Se selló cada vial herméticamente y se mantuvieron a temperatura ambiente.
La evaluación de viabilidad, morfología colonial y contaminación se realizó
tomando una muestra de cada vial de suelo y agar nutritivo/glicerol, la cual se resembró en
placas de agar nutritivo inoculando por estría e incubando a 30oC durante 18 h. Para los
conservados en papel filtro, el método de evaluación consistió en introducir uno de los
papeles filtro con inóculo en caldo nutritivo estéril y se dejó en incubación por 18 h en
seguida se tomó una asada de éste caldo inoculado y se sembró por estría en placas de agar
nutritivo.
4.4 Selección de microorganismos por su capacidad para acumular metales La metodología utilizada para la evaluación de la capacidad de acumulación de los
diferentes metales en estudio se presenta dividida de acuerdo con el tipo de medio en que se
Materiales y métodos
34
realizó, es decir, tanto en cultivo sólido como en líquido. Las concentraciones de cada sal
de metal se establecieron de acuerdo con los reportes de la literatura. Se evaluaron tres
niveles diferentes de concentración para cada metal (Tabla 7), codificadas como (-1) para la
concentración más baja, (0) para concentración media y (1) para la concentración más alta;
así como también dos sales distintas de zinc con el fin de evaluar la importancia de la
especiación de este metal.
Las sales utilizadas en el experimento fueron: dicromato de potasio (Golden Bell),
cloruro de zinc (Karal), nitrato de cadmio (Productos Químicos Monterrey), nitrato de
plomo (Karal), nitrato niqueloso (Golden Bell), selenito de sodio (Golden Bell), sulfato de
zinc (Karal).
Tabla 7 Intervalos de concentración para cada metal
Concentración (mM) Sales
1 0 -1
Cd(NO3)2 4 2.5 1
K2Cr2O7 5 3 1
Ni(NO3)2 7 5 3
Pb(NO3)2 6 4 2
Na2SeO3 6 3 1
NaVO3 5 3 1
ZnSO4 9 6 3
ZnCl2 15 10 5
1: nivel alto, 0: nivel medio, -1: nivel bajo
Inicialmente fue necesario preparar soluciones patrón de los metales a evaluar, la
concentración patrón fue de 0.1 M para todas las sales con excepción del cloruro de zinc
que se preparó a una concentración 0.5 M debido a que las concentraciones a evaluar
fueron mayores (ver Tabla 1). El material utilizado en la preparación se lavó previamente
con HNO3 al 10%. Las soluciones patrón se esterilizaron por filtración, utilizando filtros de
celulosa 0.2 µm, el filtrado se conservó en frascos estériles hasta su uso.
Materiales y métodos
35
4.4.1 Crecimiento en cultivo sólido La evaluación de crecimiento se realizó en presencia de metal en placas utilizando
dos diferentes técnicas: a) discos de inhibición y, b) crecimiento en agar nutritivo con
metal.
4.4.1.1 Evaluación de crecimiento en presencia de discos de inhibición Esta evaluación se realizó mediante el método diseñado por Munger (ver Leigh-
Emma, 2000). El crecimiento o inhibición de crecimiento se realizó inoculando placas de
agar nutritivo con 0.1 ml de cultivos frescos de cada uno de los aislados (OD620=0.8-1.0).
Posteriormente, se colocaron sobre el agar, los discos (7 mm de diámetro) impregnados con
las soluciones del metal (según Tabla 7) y se incubaron a 30oC durante 72 h con
seguimiento a las 18 h, 24 h, 48 h y 72 h, este experimento no se realizó por duplicado.
Como control negativo se incluyó un disco impregnado con agua estéril por cada caja. Una
vez transcurrido el tiempo de incubación se midieron las zonas de inhibición formadas.
4.4.1.2 Evaluación de crecimiento en agar nutritivo-metal En esta etapa se prepararon diferentes matraces conteniendo agar nutritivo, y a una
temperatura de 60°C cada uno de los matraces fue adicionado con cantidades calculadas de
la solución patrón de cada metal con el fin de obtener las distintas concentraciones a
evaluar (ver tabla 7). Posteriormente, se vació el medio en cajas Petri, el cual una vez
solidificado fue inoculado por picadura con cada uno de los microorganismos en estudio.
Las placas se incubaron a 30oC y el crecimiento se evalúo a las 24 h, 48 h y 72 h. Este
experimento se realizó por triplicado incluyendo los controles respectivos a) placas con el
metal sin inoculación, y b) placas de agar nutritivo sin metal.
Una vez que se observó crecimiento o después de 72 h de incubación, se procedió a
realizar el revelado de acumulación y/o remoción de metal mediante la formación del
sulfuro del metal correspondiente y la formación del halo respectivo. La técnica de revelado
consistió en exponer las placas con crecimiento, a ácido sulfhídrico, el cual fue generado in
situ de acuerdo con el método propuesto por Pümpel et al. (1995) modificado, de manera
que la producción de H2S se realizó en cada una de las cajas Petri conteniendo los
Materiales y métodos
36
microorganismos. Se midió con regla el diámetro de la colonia desarrollada (mm) así como
el diámetro del halo formado (mm).
4.4.2 Remoción de metales en cultivo líquido Con el fin de evaluar la remoción de metales por la biomasa de los distintos
microorganismos en estudio, fue necesario establecer el tiempo en que cada uno se
encuentra en la fase estacionaria temprana, es decir, conocer el crecimiento de los mismos
en medio líquido libre de metales.
4.4.2.1 Cinética de crecimiento en cultivo líquido El seguimiento del crecimiento de los microorganismos en estudio se realizó en
matraces Erlenmeyer conteniendo 40 ml de caldo nutritivo e incubando a 30oC y 120
revoluciones por minuto (rpm) en baño con temperatura controlada y agitación recíproca. A
cada uno de los matraces se les agregó una asada del microorganismo en evaluación,
incubado en agar nutritivo durante 18 h a 30oC. El crecimiento se siguió durante 36 h,
tomando muestras cada 2 h durante las primeras 12 h y luego a las 24 h y 36 h.
La determinación de crecimiento se realizó evaluando la absorbancia de una
muestra del cultivo (con la dilución apropiada cuando fue necesario) medida a 620 nm en
espectrofotómetro UV-VIS Lambda 35 (Perkin Elmer). Paralelamente, se determinó la
cantidad de proteína presente en el cultivo siguiendo el método de Bradford (1976) para lo
cual se utilizaron el Reactivo de Bradford (Sigma) y Albúmina de suero bovino (BSA,
Sigma-Aldrich) como estándar, las lecturas se realizaron a una longitud de onda de 595 nm.
Los valores de absorbancia a 620 nm y proteína a 595 nm se graficaron con respecto
al tiempo y, a partir de la gráfica, se estableció el lapso de crecimiento exponencial. Los
valores de crecimiento al inicio y final de la fase exponencial se utilizaron para los cálculos
de tasa de crecimiento, tiempo de generación y número de generaciones para cada uno de
los microorganismos.
La tasa de crecimiento se determinó mediante la siguiente ecuación:
Materiales y métodos
37
01
01
tt
NN
−−
=µ
En la cual:
µ : tasa de crecimiento (h-1)
:N crecimiento en tiempo inicial (N0) y final (N1)
:t periodo de crecimiento exponencial (h), inicial (t0) y final (t1)
El tiempo de generación se calculó utilizando la siguiente fórmula:
( )01
01
log3.3 NN
ttg
−=
En donde:
:g tiempo de generación (h)
El número de generaciones se relaciona con el tiempo de generación mediante la
siguiente ecuación:
g
ttn 01 −
=
donde n es el número de generaciones.
4.4.2.2 Evaluación de la remoción de metales en cultivo líquido Para el experimento de remoción, siguiendo el método reportado por Pümpel et al.
(1995). Se separaron alícuotas de 3 ml del cultivo, en caldo nutritivo, de cada uno se los
microorganismos (condiciones determinadas en sección 4.4.2.1 para cada microorganismo),
y se centrifugaron a 8000 rpm, se separó el sobrenadante y la pastilla se resuspendió con
agua desmineralizada, se centrifugó nuevamente a 8000 rpm, el sobrenadante se desechó y
la pastilla obtenida (biomasa) se empleó para el experimento. Una pastilla de biomasa
obtenida de esta manera para cada uno de los microorganismos, fue introducida al horno a
40oC durante 24 h y se pesó en una balanza analítica con el fin de conocer la cantidad (g)
utilizada en cada experimento.
Materiales y métodos
38
Cada pastilla de biomasa se colocó en tubos Falcon de 15 ml y se resuspendió en un
volumen de 3 ml de solución metálica a evaluar (ver Tabla 7), los tubos fueron incubados a
30oC y 120 rpm durante 24 h, después de este tiempo se centrifugaron a 8000 rpm durante
10 min para separar el sobrenadante y la pastilla obtenida a la cual se le realizaron dos
lavados con agua desmineralizada.
El sobrenadante y el agua recuperada de los lavados se colocaron en matraces
Erlenmeyer de 125 ml y se digirieron con HNO3 de acuerdo al método EPA 3010 A (1992)
para determinar la cantidad de metal presente (ver sección 4.4.2.2.1). Los resultados se
reportan en miligramos de metal removido por gramo de biomasa (mg metal /g biomasa).
4.4.2.2.1 Determinación de metales por espectrometría de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente
La determinación de metales en el sobrenadante de los cultivos se realizó mediante
la digestión de la muestra siguiendo el método EPA 3010 A (1992). Este método consistió
en acidificar la muestra con HNO3 concentrado y calentar hasta reducir el volumen hasta 5
ml, luego se agregó una cantidad medida de HNO3 concentrado (5 ml) y se calentó a reflujo
hasta que la solución fuera transparente, se dejó enfriar y adicionó una mezcla de HCl:agua
(1:8), se calentó nuevamente hasta disolución de las sales precipitadas, finalmente se dejó
enfriar y se aforó a 25 ml con agua desmineralizada. Como controles se digirieron 3 ml de
cada una de las soluciones metálicas utilizadas (en las tres concentraciones evaluadas).
Para determinar la concentración de metal presente en cada muestra, éstas fueron
analizadas en un espectrómetro de emisión óptica con plasma acoplado inductivamente
(ICP-OES) modelo Optima 4300 DV (Perkin Elmer). Para la cuantificación de los metales
presentes, se utilizaron tres estándares de concentración 0.1, 10 y 100 ppm. Cada muestra
fue analizada por triplicado y el resultado que se presenta representa el promedio de las tres
determinaciones.
La cantidad de metal removida por cada tratamiento se determinó por la diferencia
entre la cantidad determinada en el control y la cantidad determinada en el sobrenadante.
Materiales y métodos
39
4.5 Crecimiento y producción de EPS de Bacillus (PL7) y Serratia (PL18) Una vez que se analizaron los resultados de remoción para los diferentes metales y
microorganismos evaluados, se seleccionó a los aislados Bacillus (PL7) y Serratia (PL18),
y al plomo para continuar con los estudios subsecuentes. Cabe indicar que esta selección se
basó en la capacidad que presentaron los microorganismos en la remoción de metales y el
metal removido en mayor cantidad, además de la importancia ambiental de este último.
Esta etapa del estudio consistió en dar seguimiento al crecimiento de los
microorganismos seleccionados y a su capacidad de producción de EPS. Para realizar lo
anterior, se prepararon matraces Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 40 ml de caldo
nutritivo, se inocularon con 100 µL de cultivos frescos de cada uno de los microorganismos
y se incubaron a 30oC y 120 rpm hasta por 52 h. El crecimiento se siguió evaluando la
absorbancia (620 nm) y proteína (Bradford, 1976) cada 4 h durante las primeras 12 h y
luego cada 6 h hasta las 32 h y finalmente a las 52 h. Se sacrificaron matraces por tiempo
tomando 20 ml del medio para separar y precipitar el EPS producido.
El método empleado para separar el EPS es el reportado por Valdman et al. (2005),
el cual consistió en calentar la muestra en baño de agua a 100oC durante 20 min para luego
separar las células por centrifugación a 8000 rpm por 20 min. Posteriormente, el
sobrenadante se filtró al vacío utilizando membranas de nitrocelulosa 0.22 µm. Al filtrado
obtenido se le agregaron dos volúmenes de etanol frío, y se refrigeró a -4oC durante 24 h.
Pasado este tiempo el EPS así precipitado se separó por centrifugación a 4000 rpm durante
20 min, la pastilla de EPS se dejó secar a 30oC y se pesó. Los resultados se reportan como
miligramos de EPS obtenido por litro de medio de cultivo (mg/l).
Con la información generada, se obtuvieron el tiempo de mayor producción de EPS
para cada uno de los microorganismos en estudio, así como la cantidad de EPS producido.
4.6 Remoción de plomo por Bacillus (PL7) Por cuestiones de operación, esta parte del estudio únicamente consideró la
evaluación Bacillus (PL7) y a su EPS producido en la remoción de plomo.
Materiales y métodos
40
Para realizar lo anterior se procedió de la siguiente manera: se preparó un cultivo
fresco de Bacillus (PL7) en caldo nutritivo (8 h a 30oC y 120 rpm), de este cultivo se
tomaron alícuotas de 3 mL, se colocaron en tubos Falcon de 15 ml y se centrifugó a 8000
rpm, se desechó el sobrenadante y la biomasa obtenida fue suspendida en 3 ml de solución
reguladora de pH 7 (J.T. Baker), posteriormente se adicionó una cantidad conocida de la
solución patrón de Pb para tener una concentración 6 mM. Los tubos se dejaron en
incubación a 30oC y 120 rpm por 72 h. Pasado el tiempo de incubación se centrifugaron
para separar la biomasa y el sobrenadante, éste último fue sometido al proceso de digestión
(EPA, 1992) y con ello se logró cuantificar la remoción de plomo debido a la biomasa por
ICP-OES. A partir del cultivo inicial se determinó el peso seco de biomasa por gravimetría
después de haberla secado a 40oC durante 24 h.
Cada experimento se realizó por triplicado e incluyó controles (sin biomasa) para
cuantificar la remoción neta del metal así como también se evaluó la remoción al tiempo
cero.
4.7 Remoción de plomo por el EPS producido por Bacillus (PL7) Para evaluar la remoción de plomo por el EPS, fue necesario hacer crecer a Bacillus
(PL7) y producir el EPS, precipitarlo y separarlo de la biomasa (sección 4.5); una vez
obtenido, éste se resuspendió en una solución amortiguadora de pH 7 hasta obtener una
concentración de EPS de 0.5 mg/ml. A partir de esta solución se separaron alícuotas de 3
ml en tubos Falcon de 15 ml, a los cuales se adicionó solución de Pb(NO3)2 para alcanzar
una concentración de 6 mM.
Al igual que para la biomasa, los tubos se dejaron en incubación durante 0 y 72 h.
Pasado este tiempo, se les agregó un volumen de etanol frío para precipitar el complejo
EPS-Pb formado.
Materiales y métodos
41
La cuantificación de plomo se realizó en el sobrenadante luego de separar el
complejo EPS-Pb por centrifugación. La cuantificación del metal en el sobrenadante se
determinó por ICP-OES (sección 4.4.2.2.1) a una longitud de onda de 220.353 nm.
4.8 Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7) La caracterización del EPS consistió en realizar las determinaciones de azúcares
totales, proteína total y azúcares reductores.
4.8.1 Azúcares totales Para determinar el contenido de azúcares totales se siguió el método de fenol-ácido
sulfúrico (Dubois et al., 1957) utilizando una curva de dextrosa (J.T.Baker) en un intervalo
de concentración de 0.02-0.14 mg/ml. Esta técnica consistió en tomar una alícuota de 0.5
ml de muestra (de concentración 0.135 mg/ml del EPS) y adicionar 0.3 ml de fenol al 20%
y 1.25 ml de H2SO4 concentrado, se dejó en reposo 10 min a temperatura ambiente y luego
se mantuvo en baño de agua a una temperatura de 25-30oC durante 10-20 min.
4.8.2 Azúcares reductores Para la cuantificación de azúcares reductores fue necesario hidrolizar el EPS para lo
cual se siguió el protocolo reportado para la determinación de glucógeno en hígado de rata
modificado. Esta metodología consistió en disolver el EPS seco (16.6 mg) en un volumen
de 2 ml de agua desmineralizada para lograr una concentración de 8.09 mg/ml, se tomaron
alícuotas de 0.2 ml a las cuales se adicionaron 0.3 mL de HCl 2 N y se dejó en baño de
agua hirviendo durante distintos lapsos de tiempo (0, 3, 6, 9, 12, 15, 25 min),
posteriormente se neutralizó con 0.5 mL de NaOH 1.2 N.
Una vez obtenido el hidrolizado por cada tiempo considerado, éste se hace
reaccionar con 0.5 mL de reactivo conteniendo ácido 3,5-dinitrosalicílico (Aldrich), fenol,
sulfito de sodio, hidróxido de sodio y sal de Rochelle de acuerdo con el método reportado
por Miller (1959), y se aforó con agua hasta un volumen de 10 mL. Los resultados de
absorbancia a 540 nm obtenidos para cada tiempo de hidrólisis se interpolan en la curva de
Materiales y métodos
42
calibración construida con una solución de dextrosa (en un intervalo de concentración de 0-
5 mg/ml).
4.8.3 Proteína total El contenido de proteína en el EPS se determinó utilizando la solución de EPS
preparada para la determinación de azucares reductores (8.09 mg/ml) a la cual se adicionó
el reactivo de Bradford (Aldrich), de acuerdo al protocolo reportado por el distribuidor del
reactivo. El contenido de proteína en el EPS se cuantificó interpolando en la curva de
calibración construida utilizando BSA (Sigma-Aldrich) como estándar en un intervalo de
concentración de 0-1.4 mg/l.
4.8.4 Análisis estadístico utilizado Cuando se indica los experimentos fueron realizados al menos por duplicado, y se
reportan como el promedio de las lecturas ± la desviación estándar. El análisis estadístico
de los datos obtenidos fue realizado mediante análisis de varianza ANOVA de una vía para
verificar si existen diferencias entre los tratamientos, en el caso de los experimentos de
tolerancia a metales en medio sólido se utilizó el método Holm-Sidak por comparación
múltiple contra un grupo control. El análisis estadístico fue realizado mediante el programa
SigmaStat versión 3.0 para Windows.
Resultados y discusión
43
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente capítulo se describen los resultados obtenidos de la caracterización e
identificación de los microorganismos en estudio provenientes de un lago de brea, así como
la evaluación de la tolerancia que presentan los mismos hacia diversos metales en medio
sólido. Posteriormente, se presentan los resultados de remoción de metales por biomasa en
cultivo líquido, a partir de los cuales se seleccionaron los microorganismos y el metal a
evaluar en las etapas posteriores; en seguida se evaluó la producción de EPS así como la
remoción de plomo por la biomasa y el EPS del microorganismo que presentó mayor
remoción de plomo en concentración 6 mM. Finalmente, se realizó la caracterización
parcial del EPS de Bacillus (PL7).
5.1 Caracterización morfológica de los microorganismos El conocimiento de las características de morfología colonial, así como la respuesta
de los microorganismos hacia distintos reactivos de tinción (Gram, cápsula, esporas,
producción de polisacáridos extracelulares y cristales paraesporales) son un requisito previo
para la identificación de un microorganismo, aunado a una serie de pruebas bioquímicas
que nos permiten la identificación del género y la especie. También es importante
considerar que la identificación de estos microorganismos debe apoyarse en técnicas de
biología molecular para tener un resultado más concluyente.
A partir de los resultados de la caracterización se logró establecer que los
microorganismos en estudio (Tablas 8 y 9) presentan diferencias en su morfología colonial,
así como en la respuesta a las distintas tinciones. De esta forma, se tiene que seis de los
siete microorganismos en estudio (PL3, PL4, PL7, PL13, PL14 y WTFI) son bacilos Gram
(+), ver Figura 8, formadores de esporas y positivos a la tinción de polisacáridos
extracelulares, de los cuales únicamente PL14 presentó cápsula (Figura 9) y cristales
paraesporales. Solo uno de ellos (PL18) es un bacilo corto Gram (-), ver Figura 8, sin
embargo, para éste no fue posible determinar si produce polisacáridos extracelulares.
Resultados y discusión
44
Tabla 8 Morfología colonial de los microorganismos en estudio provenientes del Pitch Lake
Tabla 9 Morfología microscópica de los microorganismos en estudio provenientes del Pitch Lake
Aislado Forma Gram Espora Cápsula Cristales
PL3 bacilo + + - -
PL4 bacilo + + - -
PL7 bacilo + + - -
PL13 bacilo + + - -
PL14 bacilo + + + +
PL18 bacilo corto - - - -
WTFI bacilo + + - -
+ positivo, - negativo
Aislado Tamaño
(mm)
Forma Elevación Borde Color Superficie Aspecto Consistencia
PL3 2 puntiforme plano ondulado blanco rugoso húmedo suave
PL4 2 irregular plano entero blanco liso húmedo suave
PL7 5 circular plano ondulado blanco rugoso seco suave
PL13 4 irregular plano entero blanco liso seco suave
PL14 4 irregular plano ondulado blanco rugoso húmedo viscoso
PL18 1 puntiforme plano entero translúcido liso húmedo suave
WTFI 4 irregular plano ondulado blanco rugoso seco suave
Resultados y discusión
45
Los resultados obtenidos, junto con los resultados de la identificación por
secuenciación parcial de 16S rDNA, que se presenta en la siguiente sección, permitieron
llevar a cabo la identificación de los microorganismos en estudio.
a b c d
e f g
Figura 8 Tinción de Gram de los microorganismos en estudio crecidos en agar
a)PL3, b) PL4, c) PL7, d) PL13, e) PL14, f) PL18, g) WTFI Observación en microscopio óptico a una resolución de 100X
Figura 9 Tinción negativa de cápsula del microorganismo PL14
Observación en microscopio óptico a una resolución de 100X
Resultados y discusión
46
5.2 Identificación de microorganismos por métodos moleculares Con base en la metodología descrita en la sección 4.3 se obtuvieron las
secuencias depuradas de los aislados a identificar. Estas secuencias presentaron
diferencias en tamaño entre los distintos aislados debido a que se obtuvieron como
resultado de la secuenciación de los segmentos forward así como del reverse y el
alineamiento entre ellos. La secuencia depurada de PL18 se obtuvo utilizando
únicamente la secuencia forward ya que la reacción de secuenciación reverse no
proporcionó resultados favorables con los primers utilizados. La Tabla 10 presenta las
secuencias depuradas obtenidas del análisis realizado; cabe indicar que no fue posible
identificar, dentro de las secuencias, a los primers utilizados en la reacción de PCR
debido al tamaño de los segmentos amplificados en PCR (1371 pb aproximadamente).
El procesamiento de las secuencias generadas y las secuencias de los
microorganismos con los que presentan homología mediante el programa MEGA 4, dio
como resultado la generación del árbol filogenético (dendograma) de los
microorganismos en estudio (Figura 10).
La Figura 10 corresponde al árbol óptimo con la suma de la longitud de ramas =
0.769587. El porcentaje de árboles replicados en los cuales se agrupan los aislados en la
prueba bootstrap se muestra próximo a las bifurcaciones (Felsenstein, 1985). El árbol se
encuentra a escala, con la longitud de las ramas en las mismas unidades de las distancias
evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas fueron
calculadas usando el método Maximum Composite Likelihood y están en unidades del
número de bases sustituidas por sitio. Todas las posiciones con gaps (espacios) fueron
eliminadas de la hoja de datos final, la cual presentó un total de 357 posiciones.
Es importante señalar que la identificación de microorganismos por métodos de
biología molecular (amplificación de 16S rDNA) ha sido utilizada ampliamente (Pepi
et. al., 2007, Yilmaz, 2003; Janecka et al., 2002) pues permite establecer las relaciones
filogenéticas existentes y clasificar un aislado de manera rápida y precisa (Rodicio y
Mendoza, 2004).
Resultados y discusión
47
Tabla 10 Secuencias depuradas de los microorganismos evaluados
Microorganismo Secuencia
PL3
CACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTGAACTGCATGGTCGAAATGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACAGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCT
PL4
CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGTTGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCGGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGTTTCCGCCTTTAGTGCTGAGTAACGCATTA
PL7
CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACT
Resultados y discusión
48
PL13
CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTA
PL14
ACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCC
PL18
CGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGATCTCGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATACGTTCATCAATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGGGCTCAGGTGCGAAAGCG
WTFI
TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACT
Resultados y discusión
49
Figura 10 Dendograma de los aislados del Pitch Lake en estudio
PL4
PL13 Bacillus cereus CICCHLJ Q62 EF528282 Bacillus sp. JDM-2-1 EF584539
Bacillus thuringiensis IS5056 Bacillus thuringiensis TSA2 EF638801 Bacillus cereus NBRC 15305 16S ribosomal
Bacillus thuringiensis DiSz8 EF195084 Bacillus cereus V12 AM765995.1 PL14
Bacillus sp. FN31 DQ462190 Bacillus sp. M16-1 EF690408 Bacillus sp. TBM353 EF612721 Bacillus sp. H-12 Bacillus cereus NH12-2 EF690431 Bacillus sp. NS73 EF633172 PL3
Bacillus sp. NH14-1 EF690432 WTFI Bacillus thuringiensis RT EF638795 Bacillus cereus BRL02-55 DQ339680 Bacillus cereus 2810-S4 AM504128 Bacillus cereus N2-4 EF690419
PL7 B. thuringiensis F1-02a 16S ribosomal Bacillus cereus HDYM-5 EF428235.2
Bacillus sp. PG1-2/34 AM397435 Bacillus thuringiensis LQ EF638798 Bacillus thuringiensis N17 AM712183
Bacillus cereus LWL1 AM419197
Bacillus sp. K6-03 EF612330 Bacillus cereus 213 EF593043 Bacillus thuringiensis S32 AB116122
Serratia marcescens A3 EF208030 PL18 Serratia sp. FLGB17 EF195339 Serratia marcescens QL-01 AY485680 Serratia sp. PSGB07 EF195347 uncultured Serratia sp. H1C22 AY963523
100
0.1
Resultados y discusión
50
A partir del dendograma generado (Figura 10) se estableció que los
microorganismos codificados como PL3, PL4, PL7, PL13, PL14 y WTFI pertenecen al
género Bacillus, específicamente al grupo cereus-thuringiensis, y con base en los resultados
obtenidos durante la caracterización microscópica de estos microorganismos en cuanto a
formación de cristales paraesporales, es posible descartar a PL3, PL4, PL7, PL13 y WTFI
como B. thuringiensis ya que éstos no forman cristales paraesporales, característica
importante de esta bacteria, mientras que el microorganismo PL14 si los presentó. Sin
embargo, es interesante resaltar que el microorganismo codificado como PL14, identificado
como B. thuringiensis, presentó cápsula, lo cual es novedoso para una bacteria de este tipo.
Lo anterior hace necesario la realización de estudios adicionales para identificar
completamente esta bacteria. Por otro lado, el análisis filogenético indicó que el
microorganismo PL18 presentó un 98% de homología con Serratia marcescens; aún
cuando este microorganismo no presenta producción de pigmento (prodigiosina) existen
algunas variantes de no-pigmentadas reportadas (Haddix y Werner, 2000). La identificación
de PL18, en este estudio, no puede considerarse concluyente ya que no fue posible obtener
la secuencia en reversa de este microorganismo por el método empleado.
La identificación de los microorganismos utilizados en el presente estudio se
considera una aportación importante, ya que actualmente no se cuenta con información
sobre el tipo de microorganismos presentes en el lago de brea Pitch Lake. Así, la
identificación realizada de estos puede ser utilizada como un indicativo del potencial de
aplicación que pudieran presentar estos géneros en la remoción o degradación de
contaminantes tales como hidrocarburos de alto peso molecular en condiciones no
convencionales de crecimiento.
5.3 Conservación de microorganismos La conservación de los microorganismos en suelo y papel filtro seleccionados
durante los 180 días fue efectiva para la mayoría de estos, ya que al reactivarlos se obtuvo
un crecimiento abundante y no se detectó la presencia de contaminación, las células se
mantuvieron viables en los periodos de tiempo evaluados y la morfología que presentaron
correspondió a la del microorganismo inoculado. Los resultados se resumen en la Tabla 11.
Resultados y discusión
51
Tabla 11 Conservación de los microorganismos en estudio
Aislado Suelo Papel filtro Agar nutritivo/glicerol
PL3 ++++ ++++ ++++
PL4 ++++ ++++ +++
PL7 ++++ ++++ +++
PL13 +++ +++ +++
PL14 +++++ ++++ ++++
PL18 ++++ ++++ -
WTFI ++++ ++++ ++++
d - días, ++++ crecimiento abundante, +++ buen crecimiento, - sin crecimiento
La conservación de los microorganismos en suelo y papel filtro resultó efectiva,
seguramente debido a que la mayoría de estos, con excepción de PL18, son capaces de
formar esporas lo cual les permite permanecer viables en el medio hasta que se presenten
condiciones ambientales más favorables (Madigan et al., 2004). La efectividad de
conservación a corto plazo en los medios empleados, permitió el empleo de métodos de
conservación sencillos y de muy bajo costo.
Sin embargo, es importante señalar que se presentaron diversos inconvenientes,
específicamente, para el caso de la conservación en agar nutritivo/glicerol pues las colonias
se desprenden del agar, lo cual dificulta su muestreo, además para el microorganismo PL18,
conservado en este medio, a los 30 días se presentó un cambio en la morfología colonial,
perdiéndose el cultivo a los 60 días de conservación.
5.4 Selección de microorganismos por su capacidad de remoción de metales La selección de los microorganismos por su capacidad de remoción de metales
consistió en la evaluación de tolerancia/remoción, tanto en medio sólido como en medio
líquido. Así también, la evaluación de tolerancia hacia metales en medio sólido se realizó
por dos distintos métodos descritos en la sección 4.4.1. A continuación se presentan los
resultados obtenidos de acuerdo con la técnica empleada.
Resultados y discusión
52
5.4.1 Evaluación de tolerancia a metales utilizando discos de inhibición Los resultados de la evaluación de inhibición de crecimiento de cada aislado por
distintos metales contenidos en discos a diferentes concentraciones indicaron que todos los
microorganismos crecieron en presencia de los discos impregnados de metal con excepción
de Cd y Zna (cloruro de zinc).
El efecto sobre el crecimiento para cada microorganismo debido a la presencia de
las sales de Cd y Zna se muestra en la Figura 11, entendiéndose que a mayor diámetro (mm)
corresponde mayor inhibición del crecimiento.
0
3
6
9
12
15
18
1 2.5 4 5 10 15
Cd Zn a
Metal y concentración (mM)
Inhi
bici
ón d
e cr
ecim
ient
o (m
m)
Bacillus (WTFI)Serratia (PL18)Bacillus (PL14)Bacillus (PL13)Bacillus (PL7)Bacillus (PL4)Bacillus (PL3)
Figura 11 Diámetro (mm) de la inhibición de crecimiento de los microorganismos en
estudio en presencia de las sales de Cd y Zna
Una concentración baja (1 mM) de Cd en el disco, permitió el crecimiento de los
microorganismos: Bacillus (WTFI), (PL14), (PL13), (PL7) y Serratia (PL18). Además, en
presencia de discos con Zna en concentración de hasta 10 mM, se presentó crecimiento de
Bacillus (WTFI), (PL14), (PL3) y Serratia (PL18), éste último fue el único que mostró
capacidad de crecer hasta una concentración de 15 mM, lo cual resulta muy interesante para
un microorganismo de este tipo.
Resultados y discusión
53
A partir de la Figura 11 se observó que los discos impregnados con Cd inhibieron el
crecimiento de Bacillus (PL3) y (PL4) en las tres concentraciones evaluadas, siendo esta
inhibición de mayor magnitud para Bacillus (PL4), mientras que en el caso de Bacillus
(PL7), (PL13), (PL14), (WTFI) y Serratia (PL18) solo se presentó inhibición en niveles de
concentración de 2.5 y 4 mM; los microorganismos con una mayor inhibición de
crecimiento fueron Bacillus (PL4) y (PL13) en la concentración 4 mM y Bacillus (WTFI)
en concentraciones 2.5 y 4 mM; el menor efecto sobre el crecimiento por presencia de Cd
se observó en el aislado Serratia (PL18), aunque es importante notar que su crecimiento se
vio afectado en las concentraciones 2.5 y 4 mM. La capacidad de tolerancia a Cd, evaluada
por este método, disminuye al aumentar la concentración de este metal en el medio; por lo
que estos resultados deberán contrastarse con los evaluados en medio líquido con metal.
Los discos conteniendo Zna inhibieron el crecimiento de los microorganismos
evaluados en mayor medida al aumentar la concentración, además de esto únicamente
Bacillus (PL4) y (PL13) presentaron inhibición de crecimiento en las tres concentraciones
evaluadas; mientras que los mayores halos de inhibición del crecimiento se presentaron
para Bacillus (PL4) en una concentración 10 mM y Bacillus (PL3), (PL14), (PL7) en
concentración de 15 mM.
De acuerdo con lo anterior, el metal que resultó ser más tóxico para los
microorganismos en estudio es el Cd, seguido por el Zna, y este efecto se ve incrementado
al aumentar la concentración del metal; a pesar de lo anterior, algunos de los
microorganismos fueron capaces de tolerar ambos metales. El mayor efecto de inhibición
sobre el crecimiento ocasionado por discos impregnados con Cd y Zna, se presentó para
Bacillus (PL4); mientras que Serratia (PL 18) es el que mostró menor efecto en su
crecimiento por Cd y es capaz de crecer en presencia de Zna. Es importante señalar que este
resultado aun debe ser contrastado con los resultados de crecimiento/tolerancia en medio
sólido para definir su efectividad pues no se ha establecido con certeza si la concentración
utilizada en el disco se difunde en igual medida al medio y si es capaz de indicar la
tolerancia real de los microorganismos hacia las concentraciones de metal evaluadas
(Leigh–Emma, 2000).
Resultados y discusión
54
5.4.2 Medio agar-metal La tolerancia (capacidad de crecimiento en presencia del metal) de los
microorganismos hacia distintos metales se evaluó también mediante la inoculación de los
microorganismos en placas de agar nutritivo conteniendo el metal a diferentes
concentraciones, tal como se describe en la sección 4.4.1.2.
Los resultados de crecimiento de cada uno de los microorganismos medido como
diámetro de colonia (en mm) así como el crecimiento en agar nutritivo sin metal (control)
se presentan de acuerdo al metal y a la concentración evaluada (Figura 12, 13, 14, 15 y 16).
El crecimiento de los microorganismos en medio conteniendo cadmio, cromo y
níquel se muestra de manera conjunta dentro de la Figura 12, a partir de ella puede
observarse que algunos microorganismos fueron capaces de crecer principalmente en las
concentraciones bajas de los metales evaluados.
0
4
8
12
16
20
24
28
0 1 1 3 5
Cd Cr Ni
Concentración de metal (mM)
Cre
cim
ient
o de
col
onia
(m
m)
Bacillus (WTFI)Serratia (PL18)Bacillus (PL14)Bacillus (PL13)Bacillus (PL7)Bacillus (PL4)Bacillus (PL3)
Figura 12 Evaluación del crecimiento de los microorganismos en medio agar-metal a 30°C
y 72 h
Indica que se presentaron diferencias significativas respecto al control, método Holm-Sidak
Resultados y discusión
55
A partir de la Figura 12 también se puede observar que los microorganismos que
presentaron capacidad de tolerar una concentración 1 mM de Cd fueron únicamente
Bacillus (PL7) y (PL3) aunque el tamaño de la colonia desarrollada fue significativamente
menor comparada con el control (método Holm-Sidak).
En presencia de Cr exclusivamente se presentó crecimiento, en la concentración 1
mM, para los microorganismos Bacillus con excepción de (PL4), permitiendo el desarrollo
de colonias con un mayor diámetro respecto al control (método Holm-Sidak). Una
característica importante consistió en que las colonias desarrolladas en este medio tuvieron
un color transparente independientemente del aislado del que se tratase.
En el caso del crecimiento en presencia de Ni, los microorganismos identificados
como Bacillus, con excepción de (WTFI), fueron capaces de crecer en la concentración 3
mM aunque con diferencias significativas con respecto al control (método Holm-Sidak)
para Bacillus (PL14), (PL13), (PL7) y (PL3), mientras que únicamente Serratia (PL 18) fue
capaz de crecer en las concentraciones 3 y 5 mM de níquel, con igual tamaño de colonia en
ambas, y sin mostrar diferencias con respecto al control (método Holm-Sidak).
A partir de la Figura 12 también se puede observar que el Cd y Ni fueron tóxicos
para Bacillus (WTFI), mientras que Cd y Cr lo fueron para Serratia (PL18). De acuerdo
con estos resultados, el cadmio presentó una mayor toxicidad hacia los microorganismos
evaluados lo cual no es consistente con los resultados obtenidos utilizando discos de
inhibición pues aunque a través de ambos métodos se evidenció que este metal resulta mas
tóxico hacia los microorganismos, la tolerancia con respecto a la concentración es diferente.
En distintos artículos se ha reportado la tolerancia de diferentes microorganismos
hacia los metales evaluados anteriormente. Tal es el caso del estudio de B. circulans EB1
en presencia de cadmio a una concentración de 2 mM (Yilmaz, 2003) así como la hiper-
resistencia presentada por B. cereus HQ-1 a una concentración 12 mM en medio sólido (Hu
et al., 2006). El crecimiento de algunos microorganismos identificados como Bacillus en
Resultados y discusión
56
presencia de Cr 1 mM indican que estos presentan resistencia a este metal en forma de CrVI
de manera similar a la reportada por Richards et al. (2002) para algunas cepas de Frankia.
La tolerancia de los microorganismos evaluados hacia níquel en concentración de
3 y hasta 5 mM concuerda con la reportada en la literatura para bacterias aisladas de agua,
suelo y sedimentos provenientes de una mina (Castro-Silva et al., 2003) aunque es baja
comparada con la reportada por Yilmaz (2003) para B. circulans EB1 (10 mM) y para E.
cloacae CNB60 (21 mM) reportada por Hernández et al. (1998).
El crecimiento de los distintos microorganismos en agar adicionado con Pb en
diferentes concentraciones se presenta en la Figura 13, el tiempo de incubación considerado
fue de 48 h ya que el tamaño de las colonias desarrolladas en la concentración menor (2
mM) fue de hasta 28 mm en este período de tiempo.
0
4
8
12
16
20
24
28
0 2 4 6
Pb (mM)
Cre
cim
ien
to d
e co
lon
ia (
mm
)
Bacillus (WTFI)Serratia (PL18)Bacillus (PL14)Bacillus (PL13)Bacillus (PL7)Bacillus (PL4)Bacillus (PL3)
Figura 13 Crecimiento de los microorganismos en medio agar-plomo a 30°C y 48 h
Indica que se presentaron diferencias significativas respecto al control, método Holm-Sidak
Resultados y discusión
57
A partir de los resultados de crecimiento de los microorganismos Bacillus en
presencia de Pb, incluidos en la Figura 13, se puede notar que sólo la concentración 2 mM
presentó diferencias significativas positivas (método Holm-Sidak), esto es, el diámetro de
colonia obtenido es mayor (hasta 3 veces) a aquel observado en los controles, aunque es
importante señalar que se presentó cambio en la morfología de las colonias desarrolladas
por estos microorganismos, de circular a arborescente, lo cual pudiera ser un indicativo de
que se encuentran sujetas a un estrés; cuando la concentración de plomo aumentó a 4 mM
solo crecieron algunos microorganismos Bacillus (PL7), (PL4), (PL3). Al aumentar la
concentración a 6 mM solo se desarrollaron Bacillus (PL4) y (PL3) aunque el crecimiento,
en todos los casos, fue significativamente menor (hasta 4 veces) comparado con el control
(método Holm-Sidak).
En cuanto a la tolerancia presentada por Serratia (PL18), este microorganismo fue
capaz de crecer en las concentraciones 2 y 4 mM sin presentar diferencias significativas con
respecto al control (método Holm-Sidak), aunque hubo cambio en la coloración de colonia,
de translúcida en el control a café rojizo, en presencia de plomo; es importante señalar que
al aumentar la concentración de plomo en el medio a 6 mM este microorganismo ya no fue
capaz de crecer.
Los resultados anteriores indican que los microorganismos evaluados presentan
tolerancia hacia el plomo en el intervalo de lo reportado por Roane (1999) para B.
megaterium (0.6 mM) y P. marginalis (2.5 mM), así como con lo reportado por Richards et
al. (2002) para B. subtilis (3.0 mM). Es importante señalar que no se encontraron reportes
en la literatura acerca de la tolerancia que presenta Serratia sp. en presencia de plomo en
medio sólido.
El efecto de la concentración de selenio en el medio en que fueron inoculados los
distintos microorganismos se muestra en la Figura 14, el tiempo de incubación fue de 48 h
pues al término de este periodo las colonias desarrolladas tuvieron un tamaño de entre 4 y 5
mm, el cual es considerado como adecuado para su evaluación.
Resultados y discusión
58
0
4
8
12
16
20
24
28
0 1 3 6Se (mM)
Cre
cim
ient
o de
col
onia
(m
m)
Bacillus (WTFI)Serratia (PL18)Bacillus (PL14)Bacillus (PL13)Bacillus (PL7)Bacillus (PL4)Bacillus (PL3)
Figura 14 Crecimiento de microorganismos en medio agar-selenio a 30°C y 48 h
Indica que se presentaron diferencias significativas respecto al control, método Holm-Sidak
En la Figura 14, se evidencia que la presencia de la sal de Se únicamente produjo
efectos significativos en el crecimiento de Bacillus (PL4) el cual fue menor con respecto al
control (método Holm-Sidak) en las concentraciones 1 y 3 mM; mientras que Bacillus
(PL13) presentó diferencias significativas positivas (método Holm-Sidak) únicamente en la
concentración 3 mM. Resulta interesante el hecho de que el crecimiento de la mayoría de
los microorganismos evaluados no presentó diferencias significativas con respecto al
control (método Holm-Sidak) en el intervalo de concentración 1 a 6 mM, lo cual pareciera
indicar que este metaloide es esencial en el crecimiento o que los microorganismos
disponen de sistemas metabólicos para tolerarlo.
Es importante señalar que en todos los casos, las colonias desarrolladas tuvieron una
coloración roja, lo cual es un indicativo de que el metaloide fue reducido al estado
elemental e incorporado, aunque haría falta un estudio que profundice en los mecanismos a
través de los cuales tiene lugar este suceso. Los resultados obtenidos indican además que
los microorganismos evaluados presentan una tolerancia comparable a la reportada para R.
Resultados y discusión
59
metallidurans CH34 la cual se reportó como 6 mM (Roux et al., 2001). En cambio no se
encontraron reportes para Bacillus o Serratia.
Los resultados de tolerancia de los microorganismos en evaluación hacia el vanadio,
en distintas concentraciones, se muestran en la Figura 15.
0
4
8
12
16
20
24
28
0 1 3 5
V (mM)
Cre
cim
ient
o d
e c
olo
nia
(m
m)
Bacillus (WTFI)Serratia (PL18)Bacillus (PL14)Bacillus (PL13)Bacillus (PL7)Bacillus (PL4)Bacillus (PL3)
Figura 15 Crecimiento de microorganismos en medio agar-vanadio a 30°C y 48 h
Indica que se presentaron diferencias significativas respecto al control, método Holm-Sidak
La Figura 15 permite observar que el crecimiento de los distintos microorganismos
se vio favorecido en las distintas concentraciones de vanadio; para los microorganismos
identificados como Bacillus se tuvo un crecimiento significativamente mayor (método
Holm-Sidak), en lo casos de: Bacillus (WTFI) y (PL7) en concentraciones 1 y 3 mM, y
Bacillus (PL14), (PL13), (PL4) y (PL3) en las tres concentraciones evaluadas. Es
importante señalar que Serratia (PL18) no presentó diferencias de crecimiento
significativas con respecto al control (método Holm-Sidak) en las distintas concentraciones
que se evaluaron, aunque la morfología de las colonias desarrolladas en la concentración 5
mM cambió de translúcida (control) a gris opaco. Estos resultados permiten sugerir que el
vanadio no resultó ser tóxico para los microorganismos en el intervalo de concentración
evaluado en el presente trabajo.
Resultados y discusión
60
En cuanto a su tolerancia al vanadio, los microorganismos en estudio presentaron
similitud con lo reportado para los aislados identificados como E. hermannii, E. cloacae y
Sh. oneidensis los cuales toleran concentraciones de vanadio (en forma de ión vanadilo) de
4.6 mM, 6.1 mM (Hernández et al., 1998) y 5 mM (Carpentier et al., 2003)
respectivamente.
Finalmente el efecto de las sales de Zn evaluadas, cloruro y sulfato, se presenta en la
Figura 16.
0
4
8
12
16
20
24
28
0 5 3 6 9
Zn a Zn bZn (mM)
Cre
cim
ient
o de
col
onia
(m
m)
Bacillus (WTFI)
Serratia (PL18)
Bacillus (PL14)
Bacillus (PL13)
Bacillus (PL7)
Bacillus (PL4)
Bacillus (PL3)
Figura 16 Crecimiento de microorganismos en medio agar-zinc a 30°C y 72 h
Indica que se presentaron diferencias significativas respecto al control, método Holm-Sidak
De acuerdo con la Figura 16, el empleo de sales diferentes de zinc produjo
resultados de crecimiento distintos. La presencia de Znb (sulfato) favoreció el crecimiento
de los microorganismos evaluados en las concentraciones 3 y 6 mM, pero cuando esta
concentración aumentó a 9 mM los microorganismos presentaron una disminución del
crecimiento, con excepción de Bacillus (PL14) el cual ya no fue capaz de tolerar esta
concentración. Los microorganismos Bacillus (PL3) y (PL13) desarrollaron colonias de
tamaño significativamente mayor con respecto al control (método Holm-Sidak) en las
concentraciones 3 y 6 mM; mientras que en la concentración 9 mM, los microorganismos
Resultados y discusión
61
Bacillus (PL3), (PL4), (PL7), (PL13) y (WTFI) crecieron con un diámetro de colonia
significativamente menor con respecto al control (método Holm-Sidak). El microorganismo
Serratia (PL18) fue capaz de tolerar las distintas concentraciones de Znb aunque
únicamente en la concentración 6 mM se presentaron diferencias positivas en el
crecimiento con respecto al control (método Holm-Sidak).
Únicamente Bacillus (PL3) fue capaz de crecer en concentración 5 mM de Zna
(cloruro) aunque el crecimiento fue significativamente menor que en el control (método
Holm-Sidak); lo anterior indica que esta sal de zinc presenta una mayor toxicidad hacia los
aislados en estudio y que la concentración tolerada por los mismos pudiera encontrarse por
debajo de la concentración mínima evaluada (<5 mM) la cual es baja en comparación con
las concentraciones reportadas de 7.7 mM para el microorganismo identificado como
Bacillus el cual presentó 100% de homología con B. thuringiensis (Pepi et al., 2007), 11.6
mM para Pseudomonas sp. (Malik y Jaiswal, 2000) y 22 mM para B. circulans EB1
(Yilmaz, 2003). Estos resultados permiten establecer que este método de evaluación de
tolerancia para Zna arroja resultados confiables en comparación con el método de
inhibición de crecimiento por discos impregnados con el mismo metal.
Resulta interesante el hecho de que los microorganismos evaluados toleren en
mayor cantidad la sal de sulfato comparada con la de cloruro de Zn; aunque la sal más
utilizada para evaluar remoción es Zna, Garza (2005) reporta una concentración mínima
inhibitoria para B. cereus (aislado de agua industrial) de aproximadamente 12 mM y para B.
brevis (aislado de suelo de planta de refinación de petróleo) de aproximadamente 9 mM
utilizando sulfato de zinc. Por lo anterior, los microorganismos evaluados presentaron una
tolerancia hacia el zinc (sulfato) en el intervalo de lo reportado en literatura.
Los resultados de las evaluaciones de crecimiento indican únicamente que el
microorganismo fue capaz de tolerar la presencia del metal en su medio, pero no indican su
capacidad para absorberlo y removerlo del medio. Para evidenciar la remoción del metal
del medio sólido se siguió la metodología descrita en la sección 4.4.1.2 y los resultados se
detallan en la siguiente sección.
Resultados y discusión
62
5.4.2.1 Remoción de metales en cultivo sólido Con el fin de evaluar la remoción del metal por los distintos microorganismos, las
cajas Petri obtenidas en la sección anterior fueron expuestas a ácido sulfhídrico (ver sección
4.5.1.2) con el fin de formar el sulfuro del metal correspondiente y, de esta manera, evaluar
la presencia del halo transparente alrededor de la colonia (ausencia de metal), lo cual sería
indicativo de la capacidad de un cultivo de tomar el metal que se encuentra a su alrededor,
considerando también como positivo el cambio de coloración de la colonia.
La Tabla 12 muestra los resultados de la formación o presencia del halo alrededor
de la colonia, así como la descripción del aspecto que presentó este después de la
exposición de las cajas Petri a H2S. La presencia del halo transparente indicó que el metal
fue completamente removido pues en esta zona no existió metal que reaccionara y formarse
el sulfuro metálico correspondiente.
Tabla 12 Características de los halos formados después de la exposición a H2S
Metal Conc (mM)
PL3 PL4 PL7 PL13 PL14 PL18 WTFI
Cd 1 - * - * * * *
Cr 1 - - - - - * -
5 * * * * * +claro * Ni
3 - + claro + claro + claro + claro + claro *
6 - - * * * * *
4 + opaco + opaco + opaco * * + oscuro * Pb
2 + opaco + opaco + opaco + opaco + opaco + oscuro + opaco
5 - - - - - + transp -
3 + claro - - - - + transp - V
1 +claro - - + opaco - + transp + opaco
Zna 5 - * * * * * *
9 - - - - * + transp -
6 - - - - - - - Znb
3 - - - + transp - + transp -
- no formación de halo, transp.= transparente, * no se evalúo
Resultados y discusión
63
A partir de los datos de la Tabla 12 se tiene que no se observó la formación del halo
en las placas de Petri conteniendo Cd, Cr, Zna, lo que sugiere que los microorganismos no
son capaces de removerlo del medio, lo mismo ocurre para la concentración 6 mM de
plomo. El halo formado por las diferentes colonias de microorganismos identificados como
Bacillus presentó características similares y fue dependiente del metal en estudio, con
excepción de Bacillus (PL3) en presencia de vanadio. Solamente Serratia (PL18) fue capaz
de formar halos en presencia de Ni, Pb, V y Znb, con excepción de la concentración 6 mM
de Znb; así, este microorganismo resultó de interés por su mayor capacidad de tolerancia y
remoción de metales en cultivo sólido.
Con la finalidad de comparar la magnitud del halo desarrollado con respecto al
diámetro de la colonia para los distintos microorganismos en estudio, se estableció la razón
(cociente) entre estos dos valores para cada una de las sales metálicas, concentración y
microorganismo evaluado. Un valor alto de esta razón indica una mayor capacidad de
remoción de metal con respecto a la cantidad de biomasa de un microorganismo en
particular. Los resultados se muestran en la Figura 17.
0
1
2
3
4
5
6
3 5 2 4 1 3 5 3 9
Ni Pb V Zn b
Concentración metálica (mM)
Raz
ón d
iám
etro
s ha
lo/c
olon
ia
Bacillus (WTFI)
Serratia (PL18)
Bacillus (PL14)
Bacillus (PL13)
Bacillus (PL7)
Bacillus (PL4)
Bacillus (PL3)
Figura 17 Razón entre el diámetro de halo y el diámetro de colonia desarrollados en
presencia de distintas concentraciones de metales
Resultados y discusión
64
A partir de la Figura 17 se tiene que la magnitud de la razón del diámetro del halo
con respecto al diámetro de colonia fue mayor para las colonias que crecieron en presencia
de níquel, seguido por las colonias en plomo (4 mM), zinc (sulfato) y finalmente en
vanadio.
En presencia de níquel al 3 mM, el valor de la razón de diámetros halo/colonia en
orden descendente fue presentada por colonias de PL13=PL18= PL7 >PL4>PL14, mientras
que en la concentración 5 mM el valor de la razón diámetros halo/colonia que presentó el
único microorganismo capaz de crecer (PL 18) fue de igual magnitud a la que presentó en
la concentración 3 mM. En presencia de plomo, la mayor razón diámetros halo/colonia se
obtuvo por los microorganismos Bacillus (PL7), Serratia (PL18) y Bacillus (PL4) en la
concentración 4 mM comparada con la concentración de 2 mM, en la cual la razón de
diámetros halo/colonia fue menor debido a que las colonias que crecieron en esta última
concentración fueron de mayor diámetro y de morfología diferente.
Entre los aislados capaces de desarrollar colonias en presencia de Znb, la mayor
razón diámetros halo/colonia se obtuvo para Serratia (PL18) en concentración 3 mM. Las
colonias crecidas en vanadio desarrollaron un diámetro de halo pequeño por lo cual la
magnitud de la razón diámetros halo/colonia fue también muy pequeña para todos los
microorganismos, en las tres concentraciones evaluadas.
En resumen, Serratia (PL 18) presentó la mayor razón diámetros halo/colonia en
presencia de níquel, plomo, Znb y vanadio en las distintas concentraciones evaluadas,
además de que la colonia revelada en presencia de níquel adquirió un color gris oscuro
indicativo de la posible acumulación del metal.
Como ya se mencionó en párrafos anteriores, los resultados obtenidos muestran que
los microorganismos estudiados presentan características de tolerancia y de remoción de
metales comparables a los reportados por distintos autores, además de que uno de ellos,
Serratia (PL18), presenta tolerancia y remoción hacia metales que no se han reportado
anteriormente.
Resultados y discusión
65
5.4.3 Evaluación de la remoción de metales por biomasa Con el fin de establecer el tiempo en el cual cada uno de los microorganismos se
encuentra en su fase metabólica más estable fue necesario dar seguimiento al crecimiento
de los mismos mediante la determinación de absorbancia y de proteína total. Una vez
establecido el tiempo en que cada microorganismo se encuentra al término de la fase de
crecimiento logarítmica e iniciando la fase estacionaria, se consideró este tiempo como el
más adecuado para tomar el inóculo y proceder con los experimentos planteados (sección
4.4.3).
5.4.3.1 Curvas de crecimiento de los microorganismos en estudio El seguimiento del crecimiento de los aislados permitió establecer el periodo de
crecimiento logarítmico o exponencial (rápido) a partir de lo cual se obtiene información
importante como tiempo de generación y velocidad de crecimiento, las cuales son
específicas para cada microorganismo, así como el tiempo en que cada microorganismo se
encuentra en un estado metabólico estable.
La Figura 18 muestra las curvas de crecimiento correspondientes a los
microorganismos en estudio, los valores obtenidos a partir de las gráficas sobre velocidad
de crecimiento, tiempo de generación y número de generaciones se resume en la Tabla 13.
Las curvas de crecimiento se graficaron acorde con las metodologías empleadas, esto es, se
evalúo crecimiento por absorbancia a 620 nm y mediante la cuantificación de proteína total
(Figura 18).
Resultados y discusión
66
0 10 20 30
0
1
2
3
4
Absorbancia Proteína
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
(62
0 nm
)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Proteína (m
g/ml)
a
0 10 20 30
0
1
2
3
4
Absorbancia Proteína
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
(62
0 nm
)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Proteína (m
g/ml)
b
Figura 18 Curvas de crecimiento de los microorganismos en estudio en caldo nutritivo a
30oC y 120 rpm durante 36 h
a)Bacillus (PL3), b)Bacillus (PL4)
Resultados y discusión
67
0 10 20 30
0
1
2
3
4
Absorbancia Proteína
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
(62
0 nm
)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Proteína (m
g/ml)
c
0 10 20 30
0
1
2
3
4
Absorbancia Proteína
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
(62
0 nm
)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Proteína (m
g/ml)
d
Figura 18 (continuación) c) Bacillus (PL7), d) Bacillus (PL13)
Resultados y discusión
68
0 10 20 30
0
1
2
3
4
Absorbancia Proteína
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
(62
0 nm
)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Proteína (m
g/ml)
e
0 10 20 30
0
1
2
3
Absorbancia Proteína
Tiempo (h)
Abs
orba
ncia
(62
0 nm
)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Proteína (m
g/ml)
f
Figura 18 (continuación) e) Bacillus (WTFI), f) Serratia (PL18)
Resultados y discusión
69
En la Figura 18a se presenta el crecimiento de Bacillus (PL3) y puede observarse
que la tendencia de crecimiento es similar para ambos métodos, es decir, se tiene un
crecimiento rápido hasta las 12 h, después de este tiempo el crecimiento permanece estable
hasta que empieza a descender a las 24 h. En la Figura 18b se muestra el crecimiento de
Bacillus (PL4), en ella se observa que el crecimiento determinado por proteína es más alto
si se compara con el método de absorbancia, además de que la fase de crecimiento rápido
por proteína termina a las 8 h mientras que por absorbancia termina a las 12 h de
incubación.
El crecimiento de Bacillus (PL7), mostrado en la Figura 18c, resultó en valores de
absorbancia menores a 2 aunque la tendencia, al igual que en el caso de los valores de
proteína, indican un crecimiento rápido hasta las 8 h seguido de la fase estacionaria. En el
caso de Bacillus (PL13), mostrado en la Figura 18d, el crecimiento rápido determinado por
termina a las 8 h, mientras que por absorbancia lo hace hasta las 12 h, en el punto final (32
h) aumentó el contenido de proteína y la lectura de absorbancia, lo cual puede ser debido a
la producción de sustancias proteicas que aumentan la turbidez.
La Figura 18e muestra el crecimiento de Bacillus (WTFI), se puede observar que el
crecimiento, determinado por proteína alcanzó la fase estacionaria a las 8 h de incubación
mientras que mediante seguimiento de absorbancia lo hizo hasta las 12 h. Para el caso de
Serratia (PL18), la Figura 18f indica que el crecimiento, determinado por lo dos métodos
empleados, termina su fase de crecimiento rápido luego de 12 h de incubación.
De acuerdo con lo antes expuesto, se tiene que en el caso de los microorganismos en
estudio la fase de crecimiento rápido se encuentra comprendida entre las 8 y 12 h
dependiendo del microorganismo, seguida por una fase estacionaria hasta las 32 h después
de la inoculación. Es importante señalar que Bacillus (PL3) presentó la mayor lectura de
absorbancia (a 620 nm) y Serratia (PL18) presentó el mayor contenido de proteína, el cual
fue superior a la que se obtuvo para los aislados Bacillus. Pattison et al. (2003) reportan el
crecimiento de diversos microorganismos pertenecientes al género Bacillus en caldo
nutritivo, ya que éstos alcanzan la fase estacionaria después de 24 h (medido a 540 nm).
Resultados y discusión
70
Tabla 13 Valores de crecimiento calculados a partir de la fase exponencial
µ µ µ µ (h-1) g (h) n Microorganismo
A620 Proteína A620 Proteína A620 Proteína
Bacillus (PL3) 0.1611 0.0176 1.81 2.31 6.6 5.2
Bacillus (PL4) 0.1382 0.0207 1.35 1.37 8.8 5.8
Bacillus (PL7) 0.1299 0.0200 1.24 1.16 6.4 6.9
Bacillus (PL13) 0.1148 0.0184 1.86 1.43 6.5 5.6
Serratia (PL18) 0.0945 0.0216 1.77 1.62 6.8 7.4
Bacillus (WTFI) 0.1099 0.0249 1.59 1.21 7.5 6.6
µ: tasa de crecimiento, g: tiempo de generación, n: número de generaciones.
En cuanto al crecimiento para Serratia marcescens, Haddix y Werner (2000)
reportaron un estudio de una variante pigmentada cuyo crecimiento, en caldo nutritivo
adicionado con maltosa y medido a 620 nm, alcanza la fase estacionaria aproximadamente
a las 9 horas de inoculación con un tiempo de duplicación de 54 min; de acuerdo con los
datos obtenidos para el microorganismo identificado como Serratia (PL18), el tiempo de
duplicación en caldo nutritivo y determinado utilizando los valores de proteína, es de 1.62 h
(aproximadamente 97 min).
De acuerdo a los valores calculados y mostrados en la Tabla 13, se puede decir que
los resultados fueron distintos cuando se utilizan los datos obtenidos por cada una de las
metodologías, aunque los valores de proteína se consideran más adecuados en el
seguimiento de crecimiento. Así en el caso de los microorganismos identificados como
Bacillus, los valores de tiempo de generación determinados a partir de la absorbancia a 620
nm se encuentran en el intervalo de 1.2 a 1.8 h (72–108 min) siendo el mayor de ellos para
los microorganismos Bacillus (PL3) y (PL13) y el menor para (PL7); mientras que los
valores determinados a partir de la cantidad de proteína se encuentran en el intervalo entre
1.1 a 2.3 h (66-138 min) siendo el mayor valor para Bacillus (PL3) y el menor para (PL7).
Resultados y discusión
71
Los valores anteriores pueden compararse con el tiempo de duplicación de E. coli
por ser de los menores, 20 min (Madigan et al., 2004), de manera que los microorganismos
estudiados no presentan diferencias importantes en cuanto a sus parámetros de crecimiento.
5.4.3.2 Remoción de metales por microorganismos en estudio La evaluación de la remoción de metales se realizó siguiendo el procedimiento
descrito en la sección 2.4.3 para lo cual se emplearon soluciones de níquel, selenio, vanadio
y zinc (sulfato) ya que los aislados desarrollaron halo de remoción en medio sólido.
Es importante señalar que se excluyó el análisis del Bacillus (PL14) debido a que de
acuerdo a un análisis exhaustivo de los resultados de pruebas bioquímicas, 16S rDNA y la
presencia de cápsula, se pensó que podría tratarse de Bacillus anthracis, aunque la
presencia del cristal paraesporal solo es característico de B. thuringiensis. A este respecto
cabe mencionar que cereus, thuringiensis y anthracis pertenecen al grupo I de Bacillus, y
sus características bioquímicas y del 16S son prácticamente idénticas, además de que las
pruebas para distinguir a uno de otro son morfológicas: B. thuringiensis, presenta un cristal
paraesporal, B. anthracis presenta cápsula y B. cereus no tiene ni cápsula ni cristal. En el
caso de PL14 se encontraron cristal paraesporal y cápsula, lo cual no permite colocarlo ni
con el grupo cereus ni con anthracis. Es importante mencionar que si se tratara de B.
anthracis, no necesariamente se trataría de una cepa patógena, las probabilidades de que lo
fuera serían de un 5%. Sin embargo por motivos de seguridad, de que su tolerancia a los
metales no fue sobresaliente y que la razón diámetros halo/colonia fue considerablemente
menor comparada con otros microorganismos, se decidió ya no trabajar con este.
Los estudios de remoción se realizaron utilizando la biomasa de los distintos
microorganismos e incubándola en presencia de distintos metales y diferentes
concentraciones. Al finalizar el tratamiento se determinó la cantidad de metal removida en
miligramos por gramo de biomasa de cada microorganismo, los resultados obtenidos se
muestran en la Tabla 14.
Resultados y discusión
72
Tabla 14 Capacidad de remoción de metales por la biomasa microbiana de los
microorganismos en estudio
Metal Conc. (mg/L)
Bacillus (WTFI)
Serratia (PL18)
Bacillus (PL13)
Bacillus (PL7)
Bacillus (PL4)
Bacillus (PL3)
176 - 35.30 37.09 38.08 11.59 -
294 - 41.6 - - - - Ni
410 - 51.6 - - - -
414 - 53.7 21.45 67.39 2.02 10.40
828 - 128 - 90.11 82.82 45.80 Pb
1243 - 131 - 168.48 77.37 124.80
79 48.7 15.90 35.21 41.09 43.81 46.96
236 55.33 33.7 80.0 43.37 62.50 56.07 Se
473 60.43 22.8 58.85 41.96 71.43 63.57
51 51.21 16.11 32.35 21.30 - 14.32
152 53.19 54.91 51.29 56.76 45.97 91.65 V
254 57.20 50.44 72.22 63.16 76.12 78.30
196 - 68.20 56.60 73.72 26.31 7.89
393 85.13 61.85 76.78 74.03 64.01 40.20 Znb
588 8.29 81.70 87.40 68.29 74.13 34.59 Los valores se encuentran en unidades de mg de metal/g de biomasa, - no determinado
Con base en los resultados, mostrados en la Tabla 14, se tiene que la remoción
mostrada por la biomasa de Bacillus (WTFI) fue, en orden descendente, Zn>Se>V;
mientras que esta remoción para Serratia (PL18), también en orden descendente, fue
Pb>Znb>V>Ni, este microorganismo presentó la mayor capacidad de remoción de níquel
(51 mg Ni+2/g biomasa). Para la biomasa de Bacillus (PL13), la remoción de los distintos
metales se reporta en el siguiente orden descendente Znb>Se>V>Pb>Ni; mientras que para
Bacillus (PL7) la remoción fue Pb>Znb>V>Se>Ni, la remoción de plomo presentada por
este microorganismo fue la mayor (168 mg Pb+2/g biomasa). Para Bacillus (PL4) la
remoción fue Pb>V>Znb>Se>>Ni; finalmente para Bacillus (PL3) la afinidad de remoción
fue Pb>V> Se>Znb.
Resultados y discusión
73
A partir de este estudio, se evidenció que la afinidad de los microorganismos
estudiados por los distintos metales depende del microorganismo en estudio, lo cual, de
alguna forma corrobora que estamos trabajando con microorganismos distintos, aunque es
importante resaltar que esta afinidad en general es mayor hacia el plomo seguido por zinc,
selenio, vanadio y finalmente níquel, lo cual concuerda con los resultados de Kim et al.,
(2007) quienes reportaron la afinidad de Bacillus spp como Pb>Ni >Zn.
Bacillus (PL13) presentó la mayor capacidad de remoción para zinc y selenio; así
los valores de remoción de zinc, en general, presentada por los microorganismos
estudiados, son mayores a algunos de los valores de bioabsorción de zinc reportados por
distintos autores, que mencionan valores de 41.6 mg Zn2+/g biomasa para Brevibacterium
sp. (Taniguchi, et al., 2000) y 21 mg Zn2+/g biomasa para Bacillus spp. (Kim et al., 2007),
mientras que éstos fueron menores que lo reportado para Bacillus cereus de 4.6 mol/g
biomasa (da Costa y Pereira, 2001).
En cuanto a la remoción de plomo, se puede mencionar que cuatro de los
microorganismos evaluados (PL18, PL7, PL4 y PL3) presentan una mayor capacidad
comparada con los valores reportados para Bacillus spp de 97 mg Pb2+/g biomasa (Kim et
al., 2007), Enterobacter sp. J1 de 50 mg Pb2+/g biomasa (Lu et al., 2006), Bacillus cereus
de 28 mg Pb2+/g biomasa (Lalitagauri et al., s.f.) y Bacillus sp. de 7.5 mg Pb2+/g biomasa
húmeda (Nourbakhsh et al., 2002). Garza-González, 2005, reportó valores de remoción
cercanos a los encontrados en el presente estudio al utilizar C. pyrenoidosa teniendo una
remoción de 134 mg Pb2+/g biomasa.
A pesar de que la afinidad de los microorganismos estudiados por el níquel fue
menor, en comparación con el resto de los metales evaluados, los valores de remoción
obtenidos son superiores a los resultados reportados en la literatura para Bacillus spp. de
39.6 mg Ni2+/g biomasa (Kim et al., 2007), Bacillus brevis de 16 mg Ni2+/g biomasa y el
hongo A. Falciforme de 24.86 mg Ni2+/g biomasa (Garza-González, 2005), así como con lo
reportado para Serratia marcescens de 28 mg Ni2+/g biomasa (Kannan y Ramteke, 2002).
Resultados y discusión
74
En cuanto a la capacidad de remoción de selenio por microorganismos, únicamente
se encontraron reportes que mencionan la capacidad de reducción de Se(IV) a Se(0) por
diferentes microorganismos, pero no sobre su capacidad de bioabsorción. Otro estudio solo
indica la máxima velocidad de remoción específica de Se para Shewanella putrefaciens, un
microorganismo aislado del lago Macquarie, siendo esta velocidad de 3040 µg Se(IV).g
biomasa -1. h-1 (Carroll, 1999).
La remoción de vanadio tampoco ha sido reportada en los términos del experimento
realizado en este trabajo, pues la mayor parte de los estudios se han enfocado a evaluar la
reducción del vanadio por diversos microorganismos como Acidithiobacillus ferrooxidans
y Acidithiobacillus thiooxidans con la finalidad de lixiviar este metal presente en
catalizadores (Bredberg et al., 2004).
Con base en lo anterior, se tiene que la capacidad de remoción presentada por la
biomasa de los microorganismos en estudio es alta para cualquiera de los metales
considerados, además de que el microorganismo identificado como Serratia (PL18)
presenta capacidades de remoción que lo hacen un microorganismo novedoso, pues no se
encontraron trabajos reportados similares.
A pesar de lo anterior, la finalidad de esta evaluación fue seleccionar al
microorganismo(s) y el metal con mejor capacidad de remoción o cuyo estudio resulte de
mayor impacto por sus efectos sobre la salud y al medio ambiente.
De esta forma, se decidió continuar con el estudio de la remoción de plomo, por ser
uno de los metales más tóxicos para el ambiente y el ser humano, utilizando dos
microorganismos: Bacillus (PL7) y Serratia (PL18). En este punto también se consideró la
producción de polisacáridos extracelulares y su efecto en la remoción del metal.
Resultados y discusión
75
5.5 Cinética de crecimiento y producción de EPS por Bacillus (PL7) y Serratia (PL18) La producción de polisacáridos extracelulares (EPS) por Bacillus (PL7) y Serratia
(PL18) así como el crecimiento, evaluado como proteína total, en caldo nutritivo, se
presenta en la Figura 19.
0 10 20 30 40 50 60
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
proteína EPS
Tiempo (h)
Pro
teín
a to
tal (
mg/
ml)
0
50
100
150
EP
S (m
g/l)
a
0 10 20 30 40 50 60
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Proteína EPS
Tiempo (h)
Pro
teín
a to
tal (
mg/
l)
0
50
100
150
200
EP
S (m
g/l)
b
Figura 19 Crecimiento y producción de polisacáridos extracelulares a) Bacillus (PL7) en
caldo nutritivo, b) Serratia (PL18) en caldo nutritivo, a 30°C, 120 rpm y 54 h de incubación
Resultados y discusión
76
De acuerdo con la Figura 19a, la cantidad de EPS obtenido a partir del cultivo de
Bacillus (PL7) en caldo nutritivo presentó un máximo a las 8 h de incubación, es decir, al
término de la fase de crecimiento rápido, y la cantidad máxima de EPS producida en estas
condiciones fue de aproximadamente 150 mg de EPS secos por litro de medio (caldo
nutritivo). En la Figura 19b, puede observarse que la producción de EPS de Serratia
marcescens alcanzó un máximo a las 12 h de incubación, que coincide con el final de la
fase de crecimiento rápido, el valor máximo de EPS secos obtenidos fue de 180 mg por
litro de medio (caldo nutritivo) aproximadamente.
Las cantidades de EPS obtenidas a partir de los cultivos de los microorganismos en
evaluación fueron pequeñas en comparación con los 6 g/l producido por Serratia
marcescens en medio mínimo de sales adicionado con 20 g de sucrosa reportado por Pruthi
y Cameotra (1997), así como con la acumulación de 10 g/l producido por Bacillus sp. en
medio de sales mínimo adicionado con 2% de glucosa reportado por Yun y Park (2000). A
pesar de lo anterior, resulta importante resaltar el hecho de que los microorganismos
estudiados son capaces de producir polisacáridos extracelulares aunque para lograr una
sobreproducción de éstos se hace necesario un estudio más profundo.
5.6 Remoción de plomo por biomasa y EPS de Bacillus (PL7) La evaluación de remoción de plomo se realizó únicamente para la biomasa de
Bacillus (PL7) y sus EPS, de acuerdo con la metodología descrita en las secciones 4.6 y
4.7., considerando la remoción del metal al tiempo cero (inicial) y después de 72 h (final)
de incubación.
Resultados y discusión
77
0
2
4
6
8
10
12
14
inicial final
Tiempo
Plo
mo
re
mo
vido
(m
g/g
) .
EPS
biomasa
Figura 20 Remoción de plomo por biomasa y EPS de Bacillus (PL7) en solución de pH 7,
al tiempo cero (inicial) y después de 72 h (final) a 30oC y 120 rpm.
De acuerdo con los resultados de remoción obtenidos, e indicados en la Figura 20,
es posible establecer que se tiene una mayor remoción de iones de plomo cuando se utiliza
el EPS producido y separado a partir de Bacillus (PL7), aunque no existen diferencias
estadísticas significativas con respecto al tiempo de tratamiento (método ANOVA).
Mientras que la cantidad de plomo removida por la biomasa de Bacillus (PL7) tampoco
presentó diferencias significativas con respecto al tiempo (ANOVA). Lo anterior es
consistente con el tiempo de bioabsorción máxima para Bacillus sp de 30 min reportado por
Tunali et al. (2006) así como también con el tiempo de 30 min reportado para la remoción
de plomo por Bacillus cereus (Lalitagauri et al., s.f.)
Los resultados obtenidos al evaluar la remoción de plomo por la biomasa de
Bacillus (PL7) en pH 7, son menores que la remoción obtenida cuando se evaluó sin control
de pH; lo anterior puede ser ocasionado por la solubilidad de los iones metálicos (Tunali et
al., 2006) así como por el efecto sobre el estado de ionización de los grupos funcionales en
el bioabsorbente (Salehizadeh, 2003). Por lo antes expuesto, la evaluación del efecto del pH
deberá ser considerado en trabajos futuros.
Resultados y discusión
78
5.7 Caracterización parcial del EPS aislado a partir de Bacillus (PL7) Los resultados de contenido de proteína, azúcares totales y azúcares reductores del
EPS producido por Bacillus (PL7) se indican en la Tabla 15.
Tabla 15 Caracterización parcial del EPS producido por Bacillus (PL7)
Composición química Contenido (mg/mg EPS)
Proteína 0.0114±0.001
Azucares totales 0.2047±0.035
Azucares reductores 0.1705±0.0136
El contenido de proteína en el EPS producido por Bacillus (PL7) fue bajo
(aproximadamente 1.14%), aunque también en la caracterización del EPS producido por
Bacillus firmus no fue detectada la presencia de proteína (Salehizadeh y Sahojaosadati,
2003). La cantidad de azúcares totales y reductores presente en el EPS en estudio, indican
que la mayor composición pudiera ser de compuestos distintos a azucares tal como se
reporta para Pseudomonas aeruginosa (Kazy et al., 2002) y Bacillus licheniformis (Mc
Lean et al., 1990).
A fin de establecer una mejor caracterización del EPS producido por Bacillus (PL7),
la caracterización deberá ser reforzada con otro tipo de estudios tales como
espectrofotometría infrarroja o cromatografía en capa fina.
Conclusiones y recomendaciones
79
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
1.- Los microorganismos en estudio, provenientes de un lago de brea, fueron ubicados
taxonómicamente por métodos de biología molecular y caracterización de morfología
microscópica y macroscópica, perteneciendo cinco de ellos a Bacillus cereus, uno
presentando características de Bacillus thuringiensis pero con la presencia de cápsula por lo
cual no puede establecerse con certeza su relación filogenética, mientras que el otro fue
identificado como Serratia marcescens con un 98% de homología.
2.- Se demostró la capacidad de tolerancia de los microorganismos en estudio hacia
diversos metales como cromo, níquel, plomo, vanadio, selenio y zinc mediante la
evaluación de su crecimiento en presencia de éstos en medio sólido; sobresale la capacidad
de Serratia (PL18) por su capacidad de remoción de níquel, plomo, zinc y vanadio.
Adicionalmente, el zinc en su sal sulfato fue tolerado en mayor medida que el cloruro de
zinc.
3.- Los microorganismos presentaron una alta capacidad de tolerancia y reducción de Se
(IV), lo cual resulta novedoso principalmente para el microorganismo identificado como
Serratia marcescens. De esta forma, resulta interesante el evaluar la formación de
partículas de Se(0) en el interior de la células de las bacterias evaluadas.
4.- Se demostró la capacidad de remoción de diversos metales por la biomasa de los
microorganismos en estudio, esta capacidad resultó en algunos casos superior a la reportada
para bacterias similares. Por lo anterior, se sugiere estudiar con mayor detalle esta
capacidad, evaluando la influencia de distintos factores como pH, cantidad de biomasa, sal
metálica, concentración por mencionar algunos.
5.- Los microorganismos Bacillus (PL7) y Serratia (PL18) presentaron producción de
polisacáridos extracelulares durante su crecimiento por lo que se sugiere que su capacidad
de remoción está en función de esta producción. De esta manera, se recomienda evaluar
diferentes medios de cultivo para optimizar la producción de EPS.
Bibliografía
80
Bibliografía Acuagranjas 2005, 'Estudio del estado que guarda la pesca en la presa La Purísima, Gto.',
Secretaría de desarrollo agropecuario del estado de Guanajuato, México, pp. 1-27.
Ammonds, D 2002, 'Usefulness of staining parasporal bodies when screening for Bacillus
thuringiensis', J Invertebr Pathol, vol. 79, pp. 203-204
Arias, S, del Moral, A, Ferrer, M, Tallon, R, Quesada, E, Béjar, V 2003, 'Mauran, an
exopolysaccharide produced by the halophilic bacterium Halomonas maura, with a
novel composition and interesting properties for biotechnology', Extremophiles, vol.
7, pp. 319-326.
Agency for toxic substances and disease registry (ASTDR) 2005, Toxicological profile for
nickel. U.S. Department of Health and Human Services
<http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp15.html>
ATSDR 2005b, Toxicological profile for zinc. U.S. Department of Health and Human
Services <http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp60.html>
ATSDR 2003, Toxicological profile for selenium. U.S. Department of Health and Human
Services <http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp92.html>
ATSDR 1999, Toxicological profile for cadmium. U.S. Department of Health and Human
Services < http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp5.html>
ATSDR 1994, Toxicological profile for chromium. U.S. Department of Health and Human
Services <http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp7.html>
ATSDR 1992, Toxicological profile for vanadium. U.S. Department of Health and Human
Services <http://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiles/tp58.html>
Bradford, MM 1976, 'A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding', Anal Biochem,
vol. 72, pp. 248–254.
Bredberg, K, Karlsson, HT, Holst, O 2004, 'Reduction of vanadium (V) with
Acidithiobacillus ferrooxidans and Acidithiobacillus thiooxidans', Biores Technol,
vol. 92, pp. 93-96.
Bibliografía
81
Cañizares-Villanueva, RO 2000, 'Biosorción de metales pesados mediante el uso de
biomasa microbiana', Rev Latinoam Microbiol, vol. 42, pp. 131-143.
Carpentier, W, Sandra, K, De Smet, I, Brigé, A, De Smet, L, Van Beeumen, J 2003,
'Microbial reduction and precipitation of Vanadium by Shewanella oneidensis', Appl
Environ Microbiol, vol. 69, pp. 3636-3639.
Carrizales, L, Razo, I, Téllez-Hernández, J, Torres-Nerio, R, Torres, A, Batres L, Cubillas,
A, Díaz-Barriga, F 2006, 'Exposure to arsenic and lead of children living near a
copper-smelter in San Luis Potosí, Mexico: Importance of soil contamination for
exposure of children', Environ Res, vol. 101, no.1, pp.1-10.
Carroll, B 1999, 'Microbial and geochemical aspects of selenium cycling in a estuarine
system – Lake Macquarie, NSW', Ph D Thesis, Dep. of Chemical Engineering,
University of Sydney, Australia.
Castro-Larragoitia J, Kramar U, Puchelt H 1997, '200 years of mining activities at La
Paz/San Luis Potosí/Mexico – consecuences for environment and geoquemical
exploration’, J Geochem Explor, vol. 58, no. 1, p. 81-91.
Castro-Silva, M, de Souza, A, Gerchenski, A, Batista, D, Rodrigues, A, Lima, P, Rubi, L
2003, 'Heavy metal resistance of microorganisms isolated form coal mining
environments of santa catarina', Brazilian J Microbiol, vol. 34, suppl. 1, pp. 45-47.
Cervantes-González, E 2007, 'Efecto de la adición de materiales quitinosos y queratinosos
en la biodegradación de hidrocarburos', Tesis doctorado, Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, México.
Chávez-Pacheco, JL, Martínez, YS, Contreras, ZM, Escamilla, ME 2004, 'Celulosa
bacteriana en Gluconacetobacter Xylinum: biosíntesis y aplicaciones', Tip revista
especializada en Ciencias Químico-Biológicas, vol. 7, pp. 18-45, disponible en:
http://redalyc.uaemex.mx
da Costa, ACA, Pereira, F 2001, 'Bioaccumulation of copper, zinc and lead by Bacillus sp.,
Bacillus cereus, Bacillus sphaericus and Bacillus subtilis', Brazilian J Microbiol, vol.
32, pp. 1-5.
Dubois, M, Gilles, K, Hamilton, J, Rebers, P, Smith, F 1956, 'Colorimetric method for
determination of sugar and related substances', Anal Chem, vol. 28, pp. 350–356.
Bibliografía
82
Enciclopedia de salud y seguridad en el trabajo 2007, Capítulo 63: Metales, propiedades
químicas y toxicidad. <http://www.mtas.es/insht/EncOIT/pdf/tomo2/63.pdf >
Environmental Protection Agency (EPA) 2004, Treatment Technologies for site cleanup:
annual status report, 11th edition, Office of superfund remediation and technology
innovation, U.S.A. <http://www.clu-in.org/download/remed/asr/11/asr.pdf>
EPA 1992, Method 3010A: Acid digestion of aqueous samples and extracts for total metals
for analysis by FLAA or ICP spectroscopy.
Felsenstein, J 1985, 'Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap',
Evolution, vol. 39, pp.783-791.
Gadd, GM, White, C 1993, 'Microbial treatment of metal pollution – a working
biotechnology?', Trends Biotecnol, vol. 11 pp.353-359.
Garza González, MT 2005, 'Aislamiento de microorganismos con alta capacidad de tolerar
y remover Pb(II), Cr(VI), Cd(II), Cu(II), Zn(II) y Ni(II)', Tesis Doctorado, Facultad
de Biología, Universidad de La Habana.
Guibaud, G, Comte, S, Bordas, F, Dupuy, S, Bauru, M 2005, 'Comparison of the
complexation of extracellular polymeric substances (EPS), extracted form activated
sludges and produced by pure bacteria strains for cadmium, lead and nickel',
Chemosphere, vol. 59, pp. 629-638.
Haddix, PL, Werner, TF 2000, 'Spectrophotometric assay of gene expression: Serratia
marcescens pigmentation', Bioscene, vol. 26, pp. 3-13.
Hernández, A, Mellado, R, Martínez, JL 1998, 'Metal accumulation and vanadium-induced
multidrug resistance by enviromental isolates of Escherichia hermannii and
Enterobacter cloacae', Appl Environ Microbiol, vol. 64, no. 11, pp. 4317-4320.
Hetzer, A, Daughney, C, Morgan, H 2006, 'Cadmium ion biosorption by the thermophilic
bacteria Geobacillus stearothermophilus and G. thermocatenulatus', Appl Environ
Microbiol, vol. 72, no. 6, pp. 4020-4027.
Hu, Q, Qi, H, Bai, Z, Dou, M, Zeng, J, Zhang, F, Zhang, H, 2006, 'Biosorption of cadmium
by a Cd2+ hyperresistant Bacillus cereus strain HQ-1 newly isolated from a lead and
zinc mine', W J Microbiol Biotechnol, vol. 23, pp. 971-976.
Ibañez-Burgos, A, Vera, J, Rovira, JM, Sastre-Conde, I 2006. 'Efecto de compost de lodos
residuales sobre enfermedades foliares por hongos en cultivo de almendro',
Bibliografía
83
Environmental Biotechnology and Engineering, Proceedings of the Second
International Meeting on Environmental Biotechnology and Engineering (2IMEBE),
26-29 Septiembre, 2006, México D.F., México.
INE-SEMARNAT 2007, Dirección de investigación sobre sustancias químicas y riesgos
ecotoxicológicos. Contaminación por metales pesados, temas de interés.
<http://www.ine.gob.mx/dgicurg/sqre/interes.htm>
INE-SEMARNAT 2005, 'Evaluación de tecnologías de remediación para suelos
contaminados con metales', etapa 2, consultado 27 de Junio 2006,
<http://www.ine.gob.mx/cenica/download/metales_eii2005.pdf>
INE-SEMARNAT 2002, Plan de acción de la presa La Zacatecana para la contención de
metales pesados. Consultado 11 de
Septiembre de 2006, disponible en línea en:
<www.ine.gob.mx/dgicurg/download/Proyectos-2002/zacatecana.pdf >l
Janecka, J, Jenkis, M, Brackett, N, Lion, L, Ghiorse, W 2002, 'Characterization of a
Sinorhizobium isolated and its extracellular polymer implicated in pollulant transport
in soil', Appl Environ Microbiol, vol. 68, no.1, p. 423-426.
Jensen-Spaulding, A, Shuler, M, Lion, L 2004, 'Mobilization of adsorbed copper and lead
form naturally aged soil by bacterial extracellular polymers', Water Res, vol. 38, pp.
1121-1128.
Kannan, A, Ramteke, PW 2002, 'Uptake of nickel (II) by Serratia marcescens', J Environ
Biol, vol. 23 pp. 57-59.
Kazy, S, Sar, P, Singh, S, Sen, A, and D’Souza, S 2002, 'Extracellular polysaccharides of a
copper-sensitive and a copper-resistant Pseudomonas aeruginosa strain: synthesis,
chemical nature and copper binding', World J. Microbiol Biotechnol, vol. 18, pp. 583–
588.
Kiely, G 1999, Ingeniería ambiental, fundamentos, entornos, tecnologías y sistemas de
gestión. Mc Graw Hill, España.
Kim, SU, Cheong, YH, Seo, DC, Hur, JS, Heo, JS, Cho, JS 2007, 'Characterization of
heavy metal tolerance and biosorption capacity of bacterium strain CPB4 (Bacillus
spp.)', Water Sci Techol, vol. 55, pp. 105-111.
Bibliografía
84
Kostal, J, Prabhukumar, U, Lao L, Chen, A, Matsumoto, M, Mulchandani, A, Chen, W
2005, 'Customizable biopolymers for heavy metal remediation', J Nanoparticle Res,
vol. 7, pp. 517-523.
Kurek, E, Czaban, J, Bollag, JM 1982, 'Sorption of cadmium by microorganisms in
competition with other soil constituents', Appl Environ Microbiol, vol. 43, pp. 1011-
1015.
Lalitagauri, R, Subham, P, Debabrata, B, Parimal, C sf., 'Bioaccumulation of Pb(II) from
aqueous solutions by Bacillus cereus M1 16', J Haz Subs Res, vol.5, pp. 1-21.
Consultado 1 de Abril de 2008, disponible en línea: .
<http://www.engg.ksu.edu/HSRC/JHSR/v5_no1.pdf>
Lee, IY, Seo, WT, Kim, GJ, Kim, MK, Park, CS, Park, YH 1997, 'Production of curdlan
using sucrose or sugar cane molasses by two-step fed-batch cultivation of
Agrobacterium species', J Ind Microbiol Biotech, vol. 18, pp. 255-259.
Leigh-Emma, B 2000, Heavy metal resistance in the genus Gluconobacter, Master of
Science degree, Virginia Tech., Blacksburg, VA.
Lu, WB, Shi, JJ, Wang, CH, Chang, JS 2006, 'Biosorption of lead, copper and cadmium by
an indigenous isolate Enterobacter sp. J1 possessing high heavy-metal resistance', J
Hazardous Mat B, vol, 134, pp. 80-86.
Madigan, MT, Martinko, JM, Parker, J 2004, Brock, biología de los microorganismos, 10ª
edición, Pearson Prentice Hall, España.
Malik, A, Jaiswal, R 2000, 'Metal resistance in Pseudomonas strains isolated form soil
treated with industrial wastewater', W J Microbiol Biotechnol, vol. 16, pp. 177-182.
Mc Lean, R, Beauchmein, D, Clapham, L, Beveridge, T 1990, 'Metal-Binding
Characteristics of the Gamma-Glutamyl Capsular Polymer of Bacillus licheniformis
ATCC 9945', Appl Environ Microbiol, vol. 56, no. 12, pp. 3671-3677.
Miller, GL 1959, 'Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar'.
Anal Chem, vol. 31, pp. 426–428.
Moreira, NA, del Pino, FAB, Vendruscolo, TC 2003, 'Study on the biopolymer production
by enzymatic pathway through cellular inactivation and lyse and with viable cells by
Beijerinckia sp. 7070', Ciênc Tecnol Aliment [online], vol. 23, no. 2 [cited 2007-03-
Bibliografía
85
01], pp. 300-305. ISSN 0101-2061. doi: 10.1590/S0101-20612003000200034,
Available on line from:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-
20612003000200034&lng=en&nrm=iso>.
Morillo, JA, Aguilera, M, Ramos-Cormenzana, A, Monteoliva-Sánchez, M 2006,
'Production of a metal-binding exopolysaccharide by Paenibacillus jamilae using
two-phase olive-mill waste as fermentation substrare', Curr Microbiol, vol. 53, pp.
189-193.
Naessens, M, Cerdobbel, A, Soetaert, W, Vandamme, E 2005, 'Dextran dextrinase and
dextran of Glucanobacter oxydans', J Ind Microbiol Biotechnol, vol. 32, pp. 323-334.
Nourbakhsh, MN, Kiliçarslan, S, Ilhan, S, Ozdag, H 2002, 'Biosorption of Cr6+, Pb2+ and
Cu2+ ions in industrial waste water on Bacillus sp.', Chem Eng J, vol. 85, pp. 351-355.
Ongley, L, Armienta, A, Mango, H 2003, 'Concentrations of heavy metals in soil,
Zimapán', México, J Phys IV - Proceedings, vol. 107, no.2, pp. 983-986.
Ozdemir, G, Ceyhan, N, Manav, E 2005, 'Utilization of an exopolysaccharide produced by
Chryseomonas luteola TEM05 in alginate beads for adsorption of cadmium and
cobalt ions', Bioresour Technol, vol. 9, pp. 1677–1682.
Park, JK, Jin, YB, Chang, HN, 1999, 'Reusable bioabsorbents in capsules from Zoogloea
ramigera cells for cadmium removal', Biotech Bioeng, Vol. 63, no. 1, pp. 116-121.
Pattison, TL, Lindsay, D, Von-Holy, A 2003, 'In vitro growth response of bread-spoilage
Bacillus strains to selected natural antimicrobials', J Basic Microbiol, vol. 43, pp.341-
347.
Pepi, M, Volterrani, M, Renzi, M, Marvasi, M, Gasperini, S, Franchi, E, Focardi, SE 2007,
'Arsenic-resistant bacteria isolated from contaminated sediments of the Orbetello
Lagoon, Italy, and their characterization', J Appl Microb, vol. 103, pp. 2299-2308.
Prabhukumar, G, Matsumoto, M, Mulchandani, A, Chen, W 2004, 'Cadmium removal from
contaminated soil by tunable biopolymers', Environ Sci Technol, vol.. 38, pp. 3148-
3152.
Prado, AM, Valdman, E, Leite, SG, Battaglini, F, Ruzal, SM 2005, 'Biosorption of copper
by Paenibacillus polymyxa cells and their exopolysaccharide', World J Microbiol
Biotechnol, vol. 21, pp. 1157-1163.
Bibliografía
86
Pruthi, V, Cameotra, SS 1997, 'Short communication: production of a biosurfactant
exhibiting excellent emulsification and surface active properties by Serratia
marcescens', World J Microbiol Biotechnol, vol. 13, pp. 133-135.
Pümpel, T, Pernfub, B, Pigher, B, Diels, L, Schinner, F 1995, 'A rapid screening method for
the isolation of metal-accumulating microorganisms', J Ind Microbiol, vol. 14, pp.
213-217.
Qader, S, Iqbal, L, Aman, A, Shireen, E, Azhar, A 2005, 'Production of Dextran by newly
isolated strains of Leuconostoc mesenteroides PCSIR-4 and PCSIR-9', Turk J
Biochem, vol. 31, pp. 21-25.
Razo, I, Carrizales, L, Castro, J, Díaz-Barriga, F, Monroy, M 2004, 'Arsenic and heavy
metal pollution of soil, water and sediments in a semi-arid climate mining area in
Mexico'. Water Air Soil Pollut, vol. 152, no. 1-4, pp. 129-152.
Richards, JW, Krumholz, GD, Chval, MS, Tisa, LS 2002, 'Heavy metal resistance patterns
of Frankia Strains', Appl Environ Microbiol, vol. 68, no. 2, pp. 923-927.
Roane, TM 1999, 'Lead resistance in two bacterial isolates from Heavy Metal-
Contaminated Soils', Microb Ecol, vol. 37, pp. 218-224.
Rodicio, MR, Mendoza, MC. 2004, 'Identificación bacteriana mediante secuenciación del
ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en microbiología clínica',
Enferm Infecc MIcrobiol Clin, vol. 22, pp. 238-245.
Roux, M, Sarret, G, Pignot-Paintrand, I, Fontecave, M, Coves, J 2001, 'Mobilization of
selenite by Ralstonia metallidurans CH34', Appl Environ Microbiol, vol. 67, pp. 769-
773.
Ruas-Madiedo, P, de los Reyes-Gavilán, C 2005, 'Invited Review: methods for the
screening, isolation, and characterization of exopolysaccharides produced by lactic
acid bacteria', J Dairy Sci, vol. 88, pp. 843-856, consultado 12 de Diciembre 2006,
disponible en línea: <http://jds.fass.org/cgi/content/full/88/3/843>
Ruijssenaars, HJ, Hartmans, S 2001, 'Plate screening methods for the detection of
polysaccharase-producing microorganisms', Appl Microbiol Biotechnol, Vol. 55, pp.
143-149.
Sabra, W, Zeng AP, Deckwer, WD 2001, 'Bacterial alginate: physiology, product quality
and process aspects', Appl Microbiol Biotechnol, vol. 56, pp. 315-325.
Bibliografía
87
Saitou, N, Nei, M 1987, 'The neighbor-joining method: A new method for reconstructing
phylogenetic trees', Mol Biol Evol, vol. 4 , pp. 406-425.
Salehizadeh, H, Shojaosadati, SA 2003, 'Removal of metal ions from aqueous solutions by
polysaccharide produced from Bacillus firmus', Water Res, vol. 37, pp. 4231-4235.
Seidel, H, Loser, C, Zehnsdorf, A, Hoffmann, P, Schmerold, R 2004, 'Bioremediation
process for sediments contaminated by heavy metals: feasibility study on a pilot
scale', Environ Sci Technol, vol. 38, pp. 1582-1588.
Suárez, P, Reyes, R 2002, 'La incorporación de metales pesados en las bacterias y su
importancia para el ambiente', Interciencia, vol. 27, pp. 160-164.
Sutherland, IW 2001, 'Microbial polysaccharides form gram-negative bacteria', Int Dairy J,
vol. 11, pp. 663-674.
Sutherland, IW 1997, Microbial EPS, disponible en línea:
<http://www.iupac.org/publications/pac/1997/pdf/6909x1911.pdf>
Tamura, K, Dudley, J, Nei, M, Kumar, S 2007, 'MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis (MEGA) software version 4.0', Mol Biol Evol, 10.1093/molbev/msm092.
Tamura, K, Nei, M, Kumar, S 2004, 'Prospects for inferring very large phylogenies by
using the neighbor-joining method', PNAS, vol. 101, pp.11030-11035.
Taniguchi, J, Hemmi, H, Tanahashi, K, Amano, N, Nakayama, T, Nichino, T 2000, 'Zinc
biosorption by a zinc-resistant bacterium, Brevibacterium sp. Strain HZM-1', Appl
Microbiol Biotechnol, vol. 54, pp. 581-588.
Tunali, S, Çabuk, A, Azar, T 2006, 'Removal of lead and copper ions from aqueous
solutions by bacterial strain isolated form soil', Chem Eng J, vol. 115, pp. 203-211.
Valdman, E, Gomes, S, Caldas, S 2005, 'Effect of biosurfactant concentration on cadmium
biosorption by Serratia sp. isolated from a tropical soil', Comunicação técnica ao XIII
International Conference on Heavy Metals in the Environment, ICHMET, 05-09
Junio de 2005, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, ISBN 85-7227-2127.
Valls, M, de Lorenzo, V 2002, 'Exploting the genetic and biochemical capacities of bacteria
for the remediation of heavy metal pollution', FEMS Microbiol Rev, vol. 26, pp. 327-
338.
Velasco, TJA, de la Rosa, PA, Solórzano, OG, Volke, ST 2004, Primer informe del
proyecto: evaluación de tecnologías de remediación para suelos contaminados con
Bibliografía
88
metales. Dirección general del centro nacional de investigación y capacitación
ambiental. INE-SEMARNAT, México.
Volke, ST, Velasco, TJ 2002, Tecnologías de remediación para suelos contaminados,
Instituto Nacional de Ecología, México.
Volke, ST, Velasco, TJ, de la Rosa, PD 2005, Suelos contaminados por metales y
metaloides: muestreo y alternativas para su remediación. Instituto Nacional de
Ecología, México.
Vullo, D. 2003, 'Microorganismos y metales pesados: una interacción en beneficio del
medio ambiente', Revista QuímicaViva, vol. 2, no. 3, consultada Noviembre 9 2006.
<http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/Actualizaciones/metales/metales.htm>
Wilkinson, JF 1958, 'The extracellular polysaccharides of bacteria', Bacteriol Rev, vol. 22,
no. 1, pp.46-73, disponible en línea:,
<http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=180929&blobtype=pdf>
Whitfield, C, 1988, 'Bacterial extracellular polysaccharides', Can J Microbiol, vol. 34, pp.
415-420.
Yilmaz, E 2003, 'Metal tolerance and biosorption capacity of Bacillus circulans strain EB1',
Res Microbiol, vol. 154, pp. 409-415.
Yun, UJ, Park, HD 2000, 'Overproduction of an extracellular polysaccharide possessing
high lipid emulsion stabilizing effects by Bacillus sp.', Biotechnol Letters, vol. 22, pp.
647-650.
Zaidi, S, Musarrat, J, 2004, 'Characterization and nickel sorption kinetics of a new metal
hyper-accumulator Bacillus sp.', J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ
Eng, vol. 39 pp. 681-691.
Zhou, LX, Zhou, SG, Zhan XH, 2004, 'Sorption and biodegradability of sludge bacterial
extracellular polymers in soil and their influence on soil copper behavior', J Environ
Qual, vol. 33, pp. 154-162.