UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZULAFACULTAD DE CIENCIASESCUELA DE BIOLOGÍALABORATORIO AVANZADO DE BIOQUÍMICASEMESTRE I-2013

Inhibición de la actividad amilolítica del gorgojo de arroz

(Sitophilus oryzae L.) por extractos de caraotas (Phaseolus vulgaris L.), variedades blanca y negra.

Rircardo RomeroCI 20093640

ProfesorAlexander Laurentín

Caracas, Noviembre de 2013

Introducción

Las alfa-amilasas constituyen una familia de hidrolasas encargadas de escindir los enlaces α-D-(1,4)-glucano del almidón, glucógeno y otros carbohidratos relacionados (Pereira, 1999). Está presente tanto en plantas, insectos, hongos y animales. Es la más impórtate enzima digestiva de muchos insectos que se alimentan exclusivamente de granos durante su estado larval y adulto, ya que el clivaje del almidón por la alfa-amilasa es el primer paso en la degradación enzimática de polisacáridos, que es esencial para la asimilación de carbohidratos. El gorgojo de arroz (Sitophilus oryzae L.) cae dentro de este grupo. Hallar e aislar inhibidores para esta enzima puede ser una herramienta para el control de la población de este insecto, que es considerado una plaga por las pérdidas que provoca a la industria agrícola. El inhibidor prevendría el crecimiento del insecto a través de la inhibición de la digestión del almidón en el intestino. Trayendo como resultado que las larvas muriesen de hambre (Yamada y col, 2001).

La caraota es la especie más conocida del género Phaseolus en la familia de la Fabáceas. Se han encontrado en los granos de caraotas inhibidores para alfa-amilasa pancreática bovina y porcina (Szwarchbort, 1998; Antón-Le Berre y col, 1998). Esto motivó el estudio de este inhibidor sobre la alfa amilasa del gorgojo de arroz.

Es importante manejar algunos conceptos para afrontar la lectura de este trabajo:

Se define la  actividad enzimática como la cantidad de enzima, es nuestro caso, medida en μL que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en producto – Almidón en maltosa en nuestro ensayo- en unidad de tiempo.

La actividad específica es la actividad enzimática por kilogramo de proteína. Esta última es proporcional a la pureza de la enzima. (Nelson y Cox, 2006).

Objetivos

1. Ensayar métodos útiles para el estudio de la actividad enzimática, como: cuantificación de glucosa, azúcares reductores y proteínas.

2. Obtener extractos del gorgojos de arroz (Sitophilus oryzae, L) y de caraotas negras y blancas (Phaseolus vulgaris, L.), y estimar su concentración de proteínas.

3. Estimar cuantitativamente el efecto inhibitorio de los extractos obtenidos

sobre la actividad amilolítica del gorgojo de arroz (Sitophilus oryzae, L) y sobre la alfa-amilasa pancreática porcina.

Materiales y Métodos

Curva de calibración de Glucosa oxidasa/peroxidasa

Se utilizó el estuche comercial glucosa oxidasa/peroxidasa de la marca Invelab; este incluía el reactivo de trabajo y el patrón de glucosa (1 g/L), cabe señalar que el reactivo había expirado. Se preparó, por duplicado, cinco puntos para la curva de calibración con sus respectivos blancos (20 μL, 15 μL, 10 μL, 5 μL y blanco). Fue necesario atemperar el reactivo de trabajo y el patrón de glucosa antes de cada ensayo. Para preparar cada muestra se agregó, en el siguiente orden, la cantidad patrón de glucosa necesario en la muestra, agua destilada (si se requería) y 1 mL de reactivo de trabajo; para obtener 1,02 mL de volumen final. Se mezcló en vórtex y se dejó reposar a temperatura ambiente por 30min. Por último, se leyó la absorbancia a 510 nm.

La reacción que ocurre es la siguiente:

Curva de calibración de maltosa

Para la realización de este ensayo se usó como patrón maltosa 10 g/L. Se preparó, por duplicado seis puntos para la curva con su respectivo blanco (2,6 mg; 1,6 mg; 1,2 mg; 0,8 mg; 0,4 mg; blanco). Se agregó las cantidades de maltosa y agua destilada respectivas para cada muestra y 1 mL de DNS, hasta obtener 2 mL de volumen final. Luego, se llevaban a baño de María en ebullición por 10 min, y ulteriormente a baño de María a temperatura ambiente por 2 min. Se añadieron 15 mL de agua destilada a cada tubo y, por último, se leyó la absorbancia a 530nm.

Curva de calibración de BSA

Para la realización de este ensayo se usó como patrón de BSA a 0,5 g/L. Se preparó, por duplicado cinco puntos para la curva con su respectivo blanco (20 μg, 40 μg, 60 μg, 80 μg y blanco). Se preparó la solución de cobre alcalino agregando, en este orden, CuSO4 al 1 %, tartrato Na/K 2 % y NaCO3 2 % en NaOH 0,1 mol/L. Se agregó las cantidades de BSA y agua destilada respectivas para cada muestra hasta un volumen final de 0,5 mL y 2,5 mL de solución de cobre alcalino; inmediatamente después se pasó por vortex. Luego se esperó 10 min. En este tiempo se hizo una dilución 1:1 de reactivo de Folin-Ciocateu y agua. Pasado los 10 min, se agregó 0,25 mL del reactivo a las muestra y se pasó por vortex inmediatamente. Se esperó 30 min y por ultimo se leyó la absorbancia a 580 nm.

Extracción de enzima alfa-amilasa

En el presente estudio se utilizó gorgojos adultos de arroz, Sitophilus oryzae L. (Coleóptera: Curculionidae), mantenidos en el Laboratorio de Polisacáridos Vegetales, Instituto de Biología Experimental, Universidad Central de Venezuela.

Se colectó 90 gorgojos y se colocaron en frío durante 5min. Luego se pasaron en un homogenizador Potter-Elvehjem tipo D, agregándosele 6 mL de buffer acetato pH 5,01. Se aplicaron golpes de homogenizador hasta que no fueron reconocibles partes de gorgojos, en nuestro caso, fueron necesarios 30 golpes; todo esto, se mantuvo la temperatura del homogenato a aproximadamente 4°C. La suspención se centrifugó a 16000 x g por 5 min. El sobrenadante obtenido se guardó, en alícotas de 2 mL, en el refrigerador para su uso posterior. La cuantificación de proteínas de este extracto se realizó con el método de Lowry y col. (1951).

Extracción de inhibidor

Las leguminosas usadas para la extracción de inhibidor fueron caraotas blancas negras y negras Phaseolus vulgaris L., esta última se extrajo bajo dos condiciones distintas: con testa y sin testa; la caraota blanca sólo se extrajo con testa.

Para a extracción, se molieron los cotiledones de las caraotas hasta obtener una harina fina. Luego se suspendieron 5 g de esta harina en 25 mL de buffer acetato pH 5,1 y se sometieron a agitación por 2 horas a temperatura ambiente. Se centrifugó esta suspensión a 2000 rpm por 15 min y luego se filtró. El filtrado se guardó en eppendorf en alicotas de 0,5 mL dentro del refrigerador. La cuantificación de proteínas de este extracto se realizó con el método de Lowry y col. (1951).

Ensayo de actividad alfa-amilasa

Se prepararon ensayos duplicando la concentración de inhibidor, desde un factor de dilución de 32 hasta 1, una muestra de patrón de maltosa y el blanco de esta, cada una por duplicado. En cada tubo se colocó 40 μL de extracto enzimático sin diluir y 40 μL de inhibidor con la dilución respectiva a la muestra, excepto al control, que carecía de inhibidor. Se esperó 5 min para la formación del cóctel enzima-inhibidor, luego se agregó la cantidad de buffer acetato pH 5,1 correspondiente a la muestra para alcanzar un volumen de 500 μL, y se llevó a baño de María a 45 ± 1 °C por, al menos 15 min. Durante este tiempo se preparó el almidón al 5%: en una fiola de 125 mL se agregó 0,5 g de almidón soluble en agua y 10 mL del mismo buffer usado anteriormente, se tapó con una metra, y se calentó en un plancha de calentamiento por 1 min a máxima capacidad (o hasta que las paredes de la fiola estuvieran empañadas), luego se disminuyó la intensidad de la plancha hasta la mitad durante 5 min (o hasta que la solución se tornase transparente). Por ultimo, la solución de almidón se colocaba en baño de María a 45 ± 1 °C. A cada muestra se le añadió 500 μL de almidón, para iniciar la reacción, y luego de 3 min se agregó 1ml de DNS (3,5- acido dinitrosalicílico) para detener la reacción. Las muestras eran llevadas a baño de María en ebullición por 10 min, luego a agua a temperatura ambiente por 2 min, ulteriormente a cada muestra se le agregó 15 mL de agua destilada y por ultimo se leyó la absorbancia a 530nm.

En los ensayos con alfa amilasa pancreática se realizó el mismo protocolo pero, en ves de buffer acetato pH 5,1, se usó buffer fosfato pH 7 y se realizaron ensayos hasta un factor de dilución del inhibidor de 4. La concentración de la enzima fue 0,2 g/L.

Actividad enzimática

La actividad enzimática (ASA), de cada ensayo, fue determinada a través de siguiente fórmula:

ASA (mmol/s.L)= mg de maltosa a x 10^6 b x 1000 c 1000d x 40 μLe x 342f x 180g

a= Producto de la reacción amilolítica. Estimado experimentalmente mediante una curva de calibración.b= Factor de conversión: μL a L. c= Factor de conversión: moles a mmol. d= Factor de conversión: mg a g.e= Alicota de extracto enzimático en μL.f= Masa molecular de la maltosa; en gramos por mol.g= Tiempo de la reacción en segundos.

Actividad enzimática específica

La actividad enzimática específica (ASAe), de cada ensayo, fue determinada a través de siguiente formula:

ASAe (mol/s.kg)= mg de maltosa a x 10^9 b 1000d x μg de proteínae x 342f x 180g

a= Producto de la reacción amilolítica. Estimado experimentalmente mediante una curva de calibración.b= Factor de conversión: μg a g. d= Factor de conversión: mg a kg.e= Contenido de proteínas en la alícuota de 40 μL, medida en μg.f= Masa molecular de la maltosa, en gramos por mol.g= Tiempo de la reacción en segundos.

Resultados

Figura 1-. Curva de calibración de Glucosa oxidasa/peroxidasa

La figura 1 muestra la curva de calibración de la glucosa oxidasa/peroxidasa. Las barras de error representan la desviación estandár (n=3).

y = 0,0353x - 0,002

R2 = 1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 5 10 15 20

Glucosa (μg)

Abs

orba

ncia

a 5

10 n

m 0,00197

y = 0,004x + 0,0047

R2 = 0,9987

0,000,050,100,150,200,250,300,350,40

0 20 40 60 80

BSA (μg)

Abso

rban

cia

a 58

0 nm

Figura 2-. Curva de calibración de maltosa

La figura 2 muestra la curva de calibración de maltosa.Las barras representan la desviación estándar (n=3).

Figura 3-. Curva de calibración de BSA.

La figura 3 muestra la curva de calibración de BSA.Esta se realizó con el método de Lowry y col (1951). Las barras representan la desviación estándar (n=5)

y = 0,352x - 0,0074

R2 = 0,9996

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0

Maltosa (mg)

Abs

orba

ncia

a 5

30 n

m 0,00737

y = 0,00402 + 0,00197

Tabla 1-. Concentración de proteínas en extractos. Concentración de proteína de los distintos extractos obtenidos y usadas en los ensayos amilolíticos.

Extracto [proteína] g/L

1. Caraota blanca* 26,96

2. Caraota blanca*† 34,94

3. Caraota negra sin testa 13,16

4. Caraota negra sin testa† N/D

5. Caraota negra con testa 23,33

A. Insecto* 0,85

B. Insecto 0,71

C. Insecto 0,97* =Extraído por Noymar Luque.†= Extraído en aguaN/D= No determinado

Tabla 2-. Actividad enzimática (ASA).Tabla comparativa de la actividad enzimática de alfa- amilasa de gorgojos con distintos inhibidores extraídos de caraotas, bajo distintas condiciones y variando la concentración de dichos inhibidores.

  Dilución del inhibidor

Inhibidor Control 1/32 1/16 1/8 1/4 1/2 1

4. Caraota negra sin testa† A 44,1 52,2 51,2 53,9 54,9 60,4 66,8

3. Caraota negra sin testa, primer ensayo B 76,5 72,2 72,4 68,4 74,3 72,4 73,0

3. Caraota negra sin testa, segundo ensayo B 84,6 89,3 82,8 84,6 89,4 91,4 140,1

1. Caraota blanca* B 116,9 111,6 116,8 116,8 116,0 N/D N/D

5. Caraota negra con testa C 81,7 76,8 85,4 85,2 87,5 89,2 93,4Los valores están expresados en mmol/s.L (n=1)*= No se realizó muestras en este ensayo con esa concentración de inhibidor.†= En esta condición, el inhibidor se extrajo en agua (y no en buffer).N/D= No determinado.Extracto de insecto en el coctel de reacción: A:136,00 mg/L; B: 28,40 mg/L; C: 38,80 mg/L

Tabla 3-. Actividad enzimática específica (ASAe). Tabla comparativa de la actividad enzimática específica, de alfa- amilasa de gorgojos, con distintos inhibidores extraídos de caraotas, bajo distintas condiciones y variando la concentración de dichos inhibidores.

  Dilución del inhibidor

Inhibidor Control 1/32 1/16 1/8 1/4 1/2 1

4. Caraota negra sin testa† A 62,5 74,1 72,6 76,4 77,8 85,6 94,6

3. Caraota negra sin testa, primer ensayo B 108,5 102,3 102,6 97,0 105,3 102,7 103,5

3. Caraota negra sin testa, segundo ensayo B 120,0 126,6 117,4 120,0 126,7 129,5 198,6

1. Caraota blanca* B 121,0 115,6 120,9 120,9 120,1 N/D N/D

5. Caraota negra con testa C 84,6 79,5 88,4 88,2 90,6 92,3 96,7Los valores están expresados en mol/s.kg (n=1)*= No se realizó muestras en este ensayo con esa concentración de inhibidor.†= En esta condición, el inhibidor se extrajo en agua (y no en buffer). N/D= No determinado.Extracto de insecto en el coctel de reacción: A:34,00 mg/L; B: 28,40 mg/L; C: 38,80 mg/L

Tabla 4-. Actividad enzimática (ASA) de alfa-amilasa pancreática.Tabla comparativa de la actividad enzimática, de alfa-amilasa pancreática, con dos inhibidores extraídos en agua de caraotas blancas y negras respectivamente, variando la concentración de dichos inhibidores.

  Dilución del inhibidorInhibidor Control 32 16 8 4Caraotas blancas*† 13,9 8,8 8,5 8,9 9,9Caraotas negras sin testa† 17,4 15,3 14,6 15,4 16,0

Los valores están expresados en mmol/s.L (n=1)La α-amilasa pancreática porcina (Sigma) fue preparada a 0,2 g/L* Extraído por Noymar Luque.† Extraído en agua.Enzima en el coctel de reacción: 8 mg/L

Tabla 5-. Actividad enzimática específica (ASA) de alfa-amilasa pancreática.Tabla comparativa de la actividad enzimática específica, de alfa-amilasa pancreática, con dos inhibidores, extraídos en agua, de caraotas blancas y negras respectivamente variando la concentración de dichos inhibidores.

  Dilución del inhibidorInhibidor Control 32 16 8 4Caraotas blancas*† 69,7 44,2 42,5 44,4 49,7Caraotas negras sin testa† 87,1 76,5 72,8 77,2 80,0

Los valores están expresados en mol/s.kg (n=1)La α-amilasa pancreática porcina (Sigma) fue preparada a 0,2 g/L

* Extraído por Noymar Luque.† Extraído en agua.Enzima en el coctel de reacción: 8 mg/L

Discusión

La finalidad del ensayo con glucosa fue adiestrar al estudiante en el manejo de los equipos necesarios para el estudio de la actividad amilolítica. Cabe recordad que el estuche comercial de glucosa oxidasa había claudicado. Tal vez por esto la pendiente de la ecuación de la recta, de la curva de calibración, es 17 % superior (ver figura 1) a las reportadas por Gonzáles (2013) y Martín (2010): y=0,0307x + 0,001 (R2=0,999) y y=0,0294x (R2=0,9729) respectivamente.

La realización de una curva de calibración de maltosa también tuvo la finalidad de adiestrar al estudiante para los ensayos de actividad amilítica, y para tener un patrón para determinar la cantidad de maltosa producida en los ensayos de amilólisis –aunque cada ensayo tuvo su propio patrón de maltosa-. La ecuación de la recta, ver figura 2, fue parecida a la reportada por Gonzáles (2013): y=0,3809x – 0,011 (R2=0,999).

La curva de calibración de BSA fue necesaria para la determinación de la concentración de proteína de los extractos utilizados en los ensayos de actividad amilolítica (ver tabla 1). La pendiente es similar a la reportada por Martín (2010): y=0,0038x (R2=0,9978) (ver figura 3).

Si vemos la tabla 1, notaremos que los extractos de caraotas con testa tienen una concentración de proteínas más altas que los extractos de caraota sin testa. Esto se debe a qué la testa contiene proteínas, además de taninos, fibra y varios compuestos fenólicos (Gonzales y col, 2005). Al comparar el extracto 1 con el extracto 2, notamos que el extraído el buffer tiene una menor concentración de proteínas que el extraído en agua. Esto puede deberse a que, al pH en que se encontraba el buffer (pH 5,01) algunas proteínas estaban en su punto isoeléctrico y precipitaron. La concentración de proteínas en los extractos de insectos obtenidos fueron mayor a la reportada por Szwarcbart, (1980); el reportó 0,4 g/L en su extracto de gorgojos adultos, pero hay que tener en cuenta que este autor usó una relación de 2 gorgojos por mL de buffer.

Para que se pueda afirmar que ocurrió inhibición en algún ensayo enzimático, la actividad enzimática (ASA) de las muestras con inhibidor debe ser menor que la ASA del control. Al fijarnos en la Tabla 2, notamos que en ninguna de las muestras ocurrió inhibición, de manera significativa, de la actividad amilolítica de la enzima. La Tabla 3, referente a la actividad enzimática específica, denota estos mismos resultados: los extractos de caraotas (Phaseolus vulgaris) no inhiben a la enzima alfa amilasa de gorgojo de arroz (Sitophilus oryzae). Se podría pensar que el ácido tánico presente en la testa de las caraotas podría actuar como un inhibidor inespecífico de la enzima del gorgojo (Jaffe, 1973), pero no fue así; no

se observó diferencias relevantes entre la ASA del ensayo con extracto de caraotas negras sin testa, en buffer, como inhibidor y el ensayo con caraotas negras con testa. Trabajos previos han descrito que los granos de leguminosa poseen inhibidores específicos para amilasas como, por ejemplo, la pancreática bovina y la de cerdo (Jaffe, 1973; Szwarcbart, 1980; Antón-Le Berre y col, 1998). Además, los ensayos realizados con alfa-amilasa pancreática (ver tabla 4 y 5) concuerdan con esos resultados. Todo esto nos lleva a pensar que la actividad amilolítica del gorgojo no es inhibida por estos inhibidores. Esta sentencia es consistentes con los resultados obtenidos por Szwarcbart, (1980).

Existen inhibidores que actúan tanto en alfa amilasas de insectos como en de mamíferos (Strobl y col, 1998); inhibidores que actúan contra alfa amilasas de insectos pero no contra la de mamíferos (Pereira y col, 1998), y, como indican estos resultados, inhibidores que no afectas la alfa amilasa de insectos pero sí la de mamíferos.

Distintos estudios (Silano y col, 1975; Ming-Shun Chen y col ,1992) señalan que la alfa amilasa del gorgojo del arroz es inhibida por inhibidores presentes en el trigo. Este dato es indispensable para la posible explicación de por qué los inhibidores de las caraotas no afectan a la enzima del insecto: Las plantas, por selección natural, desarrollan defensas contra depredadores, como inhibidores de alfa amilasa. Extractos de insectos devoradores de trigo tienen una actividad amilolítica mayor en ensayos con inhibidores presentes en el trigo, que de insectos que no devoran trigo (Silano y col, 1975). Probablemente, la razón de que este último grupo no devore trigo sea por dichos inhibidores. Probablemente este grupo de insectos anteriormente fueron devoradores de trigo, pero la selección natural fijó en las plantas de trigo inhibidores específicos para ese grupo, que tuvo que cambiar circunstancialmente su dieta. Siguiendo esta línea de razonamiento y viendo los resultados obtenidos, se esperaría que el gorgojo de arroz fuera un ávido devorador de caraotas; pero no así, se ha reportado en otros estudios que el gorogojo de arroz no logra sobrevivir con una dieta compuesta por caraotas (Szwarchbort, 1980). Creemos que las caraotas no han sido seleccionados como mecanismo de defensa inhibidores específicos contra alfa amilasas de gorgojos de arroz, pero sí otro tipo de defensa, como los taninos en sus testa.

Pasemos a discutir otro punto álgido de la tabla 2 y 3: Las diferencias entre el extracto de caraotas negra sin testa en agua (extracto 4) y el extracto de caraotas negras sin testa en buffer (extracto 3). La actividad ASA del extracto 3 es casi el doble que el suspendido en agua. Esta diferencia puede deberse a que la enzima usada para el ensayo cuyo inhibidor usado fue CNSTA fue extraía casi 6 meses antes de dicho ensayo (fue extraía el 9/11/12 y el ensayo fue realizado el 8/5/2013), y la enzima usada en los ensayos con extracto 3 como inhibidor fue extraía el mismo día de uno de los ensayos y 3 días antes del otro. Resumiendo, la enzima usada en ensayo con extracto 3 era más activa, probablemente, porque estaba recién extraída. De otro modo no se explica por qué habría una diferencia tan grande de las ASA entre las condiciones del inhibidor ya que, tal como se explico párrafos atrás, el inhibidor no afecta a la enzima del gorgojo de arroz.

Pero ahora analicemos los resultados del ensayo con amilasa pancreática (Tablas 4 y 5): la actividad enzimática (ASA) disminuyó, en cada una de las diluciones del inhibidor, con respecto al control. En el ensayo con caraotas blancas, las muestras con inhibidor mostraron una ASA similar, excepto la muestra con el inhibidor más concentrado, cuya actividad ASA fue mayor. Cómo no se realizaron replicas de este ensayo, no se puede comprobar si este resultado es producto de un error experimental o si esta diferencia es significativa respecto al resto.  Se esperaba que a medida que la concentración del inhibidor disminuyera, la ASA aumentara  (Yamada, T y col, 2001); pero no se observó eso, es probable que no se diluyera suficientemente el inhibidor para observar esa tendencia. Hay que acotar que no se trabajó en la temperatura óptima de la enzima, que son 37 °C, sino a 45 °C.

Conclusión

Aparentemente la enzima alfa-amilasa del gorgojo de arroz no es blanco para los inhibidores presentes en las caraotas crudas, pero la alfa-amilasa pancreática sí es blanco para estos inhibidores.

Al parecer, las curvas de calibración de glucosa realizadas con reactivos caducados presentan una pendiente mayor a las reportadas en otros estudios, con el reactivo en buen estado.

Las curvas de calibración de maltosa y BSA fueron similares a las reportadas en estudios previos.

Al parecer, los extractos de caraotas negras con testa presentan una mayor concentración de proteínas que los extractos sin testa.

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