inhibiciÓn de fosfolipasa d en chlamydia trachomatis

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

PRESENTADO BAJO LA MODALIDAD:

EXPERIMENTAL

Facultad : Ciencias De La Salud

Programa: Medicina

INHIBICIÓN DE FOSFOLIPASA D EN CHLAMYDIA TRACHOMATIS

Armenia-Quindío

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UNIVERSIDAD DEL QUINDIO SISTEMA INTEGRADO DE GESTIÓN

Código: M.IN-03.02.01.F.01 Versión: 03 Fecha: 2011/05/10 Página 1 de 10

FORMATO PRESENTACIÓN DE PROYECTOS

FICHA RESUMEN

Título: Inhibición de fosfolipasa D en Chlamydia Trachomatis

Investigador Principal: Natalia Bravo Flórez, Laura Salazar Castro, Laura María Román Chica, Juan Carlos Trujillo Forero.Grupo de Investigación: Semillero de investigaciónLínea de Investigación: Semillero de investigaciónFacultad: Ciencias de la SaludTotal de Investigadores: 4Entidad: Universidad Del Quindío

Lugar de Ejecución del Proyecto: Universidad del Quindío

Ciudad: Armenia

Duración del Proyecto: 3 meses

Tipo de Proyecto: Experimental

Valor Solicitado a la Universidad del Quindío: $3.000.000Valor Total del Proyecto: $3.000.000

Descriptores / Palabras Claves: Factores de virulencia, Chlamydia Trachomatis, Fosfolipasa D.

Resumen: La infección por Chlamydia Trachomatis es una de las enfermedades de transmisión sexual más comunes, causando aproximadamente 1,307, 893 casos al año en USA. Para evaluar el efecto de la inhibición de la fosfolipasa D de Chlamydia Trachomatis, se realizará un estudio de tipo experimental en el cual se cultivará dicho microorganismo en células Vero, para posteriormente someter a las colonias a diferenes concentraciones de y finalmente evaluar su efectividad mediante el método Alamar Blue.

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FICHA DEL PROYECTO

TITULO: Inhibición de fosfolipasa D en Chlamydia Trachomatis .

INVESTIGADOR PRINCIPAL: Natalia Bravo Flórez, Laura Salazar Castro, Laura María Román Chica, Juan Carlos Trujillo Forero.

GRUPO DE INVESTIGACIÓN: Semillero de investigación

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN: Semillero de investigación

FACULTAD: Ciencias De La Salud

Aceptamos asumir COMO INVESTIGADORES la responsabilidad por la conducta científica del proyecto y entregar los informes escritos requeridos.

Nombre Firma CédulaLaura Stephanía Salazar Castro 1.094.924.738

Natalia Bravo Flórez 1.061.735.592

Laura María Román Chica 1.094.932.483

Juan Carlos Trujillo Forero 1.094.899.535

Estudiantes participantes en el proyectoNombre Programa Académico Semestre

Laura Stephanía Salazar Castro Medicina V

Natalia Bravo Flórez Medicina V

Laura María Román Chica Medicina V

Juan Carlos Trujillo Forero Medicina V

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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PRESENTADO BAJO LA MODALIDAD: Experimental.

a. Título del Proyecto: Inhibición de la fosfolipasa D en Chlamydia Trachomatis.

b. Nombre de los Investigadores:Investigador principal: Natalia Bravo Flórez, Laura Salazar Castro, Laura María Román Chica,

Juan Carlos Trujillo Forero.

c. Planteamiento del Problema:¿La inhibición de la fosfolipasa D de Chlamydia Trachomatis disminuye su citotoxicidad en cultivos celulares?

d. Justificación: Con el ánimo de iniciar la búsqueda de proyectos de investigación, durante nuestras sesiones del núcleo integrador en las cuales se trataba de profundizar sobre los diferentes agentes infecciosos que causan la gran mayoría de enfermedades de transmisión sexual de la actualidad, nos surgió la duda con respecto a los factores de virulencia de un agente en especial; la Chlamydia Trachomatis, ya que en todo lo que logramos ahondar y entender sobre ella fue muy poco, y no porque no hiciéramos la búsqueda o investigación correcta; sino porque la bibliografía en la cual hablan sobre el tema se queda algo corta. La verdad es que todo esto nos causó mucha curiosidad, es raro que al ser la Chlamydia Trachomatis uno de los principales agentes causantes de dichas patologías infecciosas lo que se encuentre de sus mecanismos de virulencia sea tan escaso, y creemos, por todo lo anterior explicado, que es preciso realizar un proyecto de investigación y con ello lograr identificar otros factores de virulencia de la Chlamydia Trachomatis, específicamente el papel de la fosfolipasa D en la citotoxicidad de dicho microorganismo. Es claro que realizar una investigación exhaustiva sobre un microorganismo no es una labor muy fácil, como hemos conocido todos estos descubrimientos sobre cada uno de ellos se han ido desarrollando de una forma lenta a lo largo de toda la historia, pero creemos que con la tecnología y conocimientos microbiológicos que ya existen en la actualidad, se puede lograr que sea más fácil detectar lo que nos proponemos, y es por ello que trataremos de utilizar las diferentes pruebas y mecanismos de detección de la Chlamydia Trachomatis y al tener el patógeno aislado llegar a conocer, estudiar, y profundizar en su forma de invasión y los minuciosos mecanismo que utiliza para conseguirlo que aún no se han identificado.

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e. Objetivos

1. General

Evaluar el efecto de la inhibición de la fosfolipasa D en la citotoxicidad de Chlamydia Trachomatis.

2. Específicos

Evaluar la efectividad de en la inhibición de la fosfolipasa D de Chlamydia Trachomatis.

Determinar la dosis respuesta protectora del bromo fenil bromuro en la inhibición de la fosfolipasa D de Chlamydia Trachomatis en cultivos celulares.

f. Estado General del Tema. Marco Teórico:

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La Chlamydia es un tipo de bacteria gram – intracelular obligada perteneciente a la familia chlamydiaceae que se subdivide en 4 especies diferentes: chlamydia pneumoniae, chlamydia trachomatis, chlamydia pecorum, chlamydia psittaci. LAS CHLAMYDIAS SON BACTERIAS QUE CARECEN DE PARED DE PEPTIDOGLUCANOS PERO CON PRESENCIA DE PROTEÍNAS DE UNIÓN A LAS PENICILINAS Y QUE ADOPTAN UNA CARACTERÍSTICA TINTORIAL GRAM NEGATIVA, ADEMÁS DE ESO DEBEN VIVIR POR OBLIGACIÓN DENTRO DE LA CÉLULA YA QUE SON MICROORGANISMOS INMÓVILES Y QUE DEPENDEN COMPLETAMENTE DICHAS CÉLULAS PARA LLEVAR A CABO SU METABOLISMO. SU CICLO DE DESARROLLO SE LLEVA A CABO MEDIANTE LA ADOPCIÓN DE DOS FORMAS DIFERENTES: LA PRIMERA ES UNA FORMA EXTRACELULAR METABÓLICAMENTE INACTIVA PERO INFECTIVAMENTE ACTIVA QUE CONTIENE DNA Y RNA, LA CUAL ES DENOMINADA CUERPO ELEMENTAL, UNA ESTRUCTURA RÍGIDA Y REDONDEADA QUE SE TIÑE DE PÚRPURA CON GIEMSA Y DE ROJO CON COLORACIÓN DE MACCHIAVELLO Y QUE ADEMÁS PRESENTAN ANTÍGENOS ESPECIE-ESPECÍFICOS Y ANTÍGENOS SEROTIPO- ESPECÍFICOS, QUE INDUCEN LA FAGOCITOSIS; LA SEGUNDA ES UNA FORMA INTRACELULAR DE FORMA BACILAR METABÓLICAMENTE ACTIVA LLAMADA CUERPO RETICULADO, EL CUAL ESTÁ DESPROVISTO DE NUCLEOIDE DENSO Y QUE SE TIÑE DE AZUL CON LA TINCIÓN DE GIEMSA.

La membrana celular de la Chlamydia Trachomatis está compuesta por proteínas ricas en cisteína, las que se encuentran en mayor cantidad son las proteínas MOMP con un peso de 40 Kda, con función de porina y que contiene epítopes antigénicos; las proteínas 60Kda situada en el espacio periplásmico, las proteínas 12-15 Kda. En estudios recientes se han encontrado otras 2 proteínas más, la hsp 60 y la hsp 70 involucradas en la patogenicidad de la EPI. La Chlamydia Trachomatis se divide en 18 serotipos diferentes conforme a la estructura de la MOMP.

Dentro del ciclo de vida la Chlamydia Trachomatis necesita de un sulfato de heparina sobre la superficie de dicho microorganismo para que pueda adherirse a las células huésped, posteriormente el cuerpo elemental se introduce a esta célula por medio de fagocitosis, el cual al estar dentro de la vacuola fagocítica pasa a denominarse cuerpo reticulado y se divide varias veces por fisión binaria para formar el cuerpo de inclusión desde el cual se pueden liberar nuevos cuerpos elementales hacia el exterior de la célula. Este ciclo dura de 24 a 48 horas.

La Chlamydia es un microorganismo aeróbico que como fuente de carbono utiliza el aminoácido glutamato, el análisis de la transcripción demuestra que este microorganismo extrae el ATP del huésped en la primera fase de la infección activa, mientras que en la infección persistente utiliza ATP y sintetiza ATP por su propia cuenta.

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Dentro de las manifestaciones clínicas causadas por la infección por Chlamydia Trachomatis en las mujeres se presentan alteraciones en el flujo vaginal, disuria, dispareunia, dolor pélvico, se puede producir cervicitis, endometritis, EPI, uretritis, abscesos en las glándulas de Bartholini, salpingitis, entre otras. La infección por Chlamydia Trachomatis también puede producir complicaciones en el recién nacido por contaminación durante el trabajo de parto como conjuntivitis y neumonía neonatal. Otras patologías que puede causar este microorganismo son el tracoma y el linfogranuloma venéreo.

Un factor de virulencia es una molécula que en su ausencia no modifica la viabilidad de un microorganismo, pero en su presencia aumenta su capacidad patógena; en el caso específico de Chlamydia Trachomatis se han encontrado diversos tipos de factores de virulencia como las proteínas de membrana externa MOMP, la producción de heparán sulfato y la expresión de fosfolipasas tanto A2 como C como D, siendo la D la más abundante y la más patógena de todas. La fosfolipasa D una enzima localizada en la membrana plasmática que hidroliza el lípidofosfatidilcolina a ácido fosfatídico (que queda alojado en la membrana) y colina, dicha reacción causa diversos efectos a nivel sistémico como lo son el daño de la membrana celular del huésped, la interrupción de las vías de señalización intracelulares y la alteración del trasporte vesicular intracelular.

g. Metodología:

Se solicitarán las bacterias a la siguiente dirección: Laboratory of Intracellular Parasites, Rocky Mountain Laboratories, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 903 S. 4th Street, Hamilton, MT 59840

Después de la obtención de los microorganismos estos se cultivarán en céluas Vero según los métodos de Valdibia & Nguyen et al. 2011. En donde 4x103 células/cm2, serán cultivadas con medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y penicilina estreptomicina al 1% y posteriormente se incubará a 37°C, con 5% de CO2 y se esperará aproximadamente 24 horas para iniciar el monitoreo de crecimiento y cambio de medio cultivo que se realizará día por medio.

Para la inhibición de la fosfolipasa D se utilizará bromo fenil bromuro a diferentes concentraciones.

Para la obtención de resultados se utilizará el método Alamar Blue, el cual se mezcla con la solución de las células, se incuban durante 1-4 horas protegido de la luz, y se lee la fluorescencia o absorbancia. La cantidad de fluorescencia o absorbancia es proporcional al número de células vivas y corresponde a la actividad metabólica celular. Las células dañadas y no viables tienen una

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menor actividad metabólica innata y por lo tanto generan una señal proporcionalmente menor que las células sanas.

h. Impacto social y económico: Mediante la inhibición de la fosfolipasa D de Chlamydia Trachomatis , se verán beneficiados mujeres y hombres que a diario se diagnostican de uretritis, o en el caso más grave de las mujeres: enfermedad inflamatoria pélvica, causadas por este agente. De esta manera reducirán los costos que esta patología implica, como su tratamiento, exámenes paraclínicos, personal médico, o estancia hospitalaria. Así mismo disminiurán los costos indirectos que los pacientes puedan acarrear por la incapacidad que dicha enfermedad puede llegar a generar, ya sea por la auscencia laboral o pérdida del trabajo.

i. Resultados esperados directos e indirectos

Identificar y evaluar la efectividad del bromo fenil bromuro en la inhibición de la fosfolipasa D en Chlamydia Trachomatis.

Mediante el reconocimiento de dicho factor de virulencia de chlamydia trachomatis, , se espera conocer y dilucidar más a fondo la historia natural de la enfermedad y su evolución en el ser humano, y así esclarecer conceptos desconocidos hasta hoy.

j. Estrategias de comunicación incluyendo publicaciones:

Al finalizar el trabajo de investigación se darán a conocer los resultados obtenidos por diferentes vías como lo serán:

1. Una exposición que se realizara en el aula a los compañeros de curos y el docente.

2. Se realizara una exposición en el espacio de los viernes de 7 a 8 en el (CPC) para que toda la comunidad académica se entere de lo realizado.

3. Se harán los trámites correspondientes para hacer la publicación de la investigación en alguna revista científica reconocida.

4. Se expondrá la investigación en el congreso estudiantil de investigación médica (CECIM).

5. Se publicaran los resultados en la revista académica de la universidad.

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k.Bibliografía • Ortiz OL, Medina R. Chlamydia trachomatis: avances y perspectivas, PUB L I CAC IÓN C I ENT Í F I CA I S SN: 1

7 9 4 - 2 3 7 0 VOL . 1 No . 1 ENE RO - DICIEMBRE DE 2003

• Urbina MT, Medina R, Muñoz G , Sanchez I. Infección por Chlamydia trachomatis. Rev Obstet Ginecol Venez 2010;70(2):90-96

• US National Library of Medicine National Institutes of Health. Chlamydia trachomatis strains and virulence: rethinking links to infection prevalence and disease severity. En linea. Tennessee. 2010 Jun 15. [ Consulta el 20 de julio de 2012] . Disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

• US National Library of Medicine National Institutes of Health. Analyses of multiple-site and concurrent Chlamydia trachomatis serovar infections, and serovar tissue tropism for urogenital versus rectal specimens in male and female patients. En linea Octubre de 2011 [ Consulta el 20 de julio de 2012]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

l. Cronograma de actividades:

ACTIVIDADES ** MESESI-II III-IV V-VI VII-VIII IX-X XI-XII

Diseño del proyecto X

Petición de la muestra X

Cultivo celular X

Tratamiento con inhibidor X

Obtención de resultados X

Interpretación de dichos resultados X

Publicaciones X

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inhibiciÓn de fosfolipasa d en chlamydia trachomatis

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