Preparacin de Informes en formato IEE

Viernes 24 de abril Universidad de los lagos, Campus Chinquihue Puerto Montt, Laboratorio de Ciencias qumicas.

Practico N1 pH: Determinacin del pH del agua destilada y Titulacin de aminoacido L-cystine.Karen Montesinos ( karenandrea.montesinos@alumnos.ulagos.cl)

Miguel Angulo (miguelangel.angulo@alumnos.ulagos.cl)RESUMEN: En este practico se realizaron dos experiencias relacionadas con la medicin del pH; en la primera experiencia, se midi el pH del agua destilada con la ayuda de un pH- metro, el valor terico del agua destilada es de 7, ya que se encuentra pura, desmineralizada, pero en la prctica resulto tener un pH de 5,48, esta diferencia en el pH terico- prctico, puede deberse a que el agua destilada disuelve el dixido de carbono del aire, hasta que est en equilibrio dinmico con la atmosfera. En la segunda experiencia se realiz la titulacin del aminocido L-cystine. Dicha titulacin acta sobre la base de un sistema buffer; en la cual la L-cystine acta como tampn; al agregar NaOH al HCl combinado con la L-cystine. Aproximadamente la capacidad buffer est entre pH 1,30 y 3,66.PALABRAS CLAVE: pH-metro, calibracin pH-metro, pH agua destilada, Titulacin aminocido L-cistina. Curva de titulacin, punto isoelctrico, efecto tamponante. INTRODUCCIN Medicion de pH

Debido a que todas las reacciones bioqumicas dependen en gran medida del pH (que se define como log(H) ), es imprtate poder medir el pH con gran exactitud. El pH-metro es un sensor electroqumico que sirve para medir el pH de una disolucin. Consta de dos electrodos, uno de vidrio y otro de calomelanos (cloruro de mercurio). Al medir el pH se mide la diferencia de potencial de dos soluciones separadas por una fina membrana de vidrio. El electrodo de vidrio tiene bulbo sensible, que se llena con HCl saturado con cloruro de plata. El potencial dentro de este electrodo es constante (pH 7), de manera que la medida va a depender solamente de la concentracin de protones de la solucin exterior. El alambre que se sumerge al interior permite conducir el potencial hasta un amplificador. Aminoacidos.

En los aminocidos, los grupos carboxilo (COOH) y amino (NH2) se puede protonar y desporotonar. Esta caracterstica y la estructura determinada de cada aminocido hacen que cada uno de ellos posea una curva de titulacin especfica. La titulacin es un proceso mediante el cual se introducen o se remueven protones, al agregar, respectivamente, cidos (H+) o bases (OH-). A medida que procede una titulacin, ocurren cambios en la estructura del aminocido, que involucran los grupos protonables. Estos cambios pueden ser representados en una curva, llamada curva de titulacin. El anlisis de estos grficos, proporcionan informacin sobre diversos aspectos del aminocido, entre otros, su capacidad amortiguadora o buffer. Los diferentes aminocidos que conforman las protenas tienen por lo menos dos grupos protonables- desprotonables: El carboxilo alfa, cuya pKa se denominara por convencin pK1, y el amino alfa, que tendr un pKa llamada pK2. Otro punto importante de reconocer en una curva de titulacin lo constituye el punto isoelctrico (pI) que, como su nombre lo indica, es el valor en el cual el aminocido se encuentra en su forma elctricamente neutra ( es decir, la suma de las cargas de los grupos protonables o desprotonables es igual a 0 ). En el punto isoelctrico, cualquier cambio de carga (variacin del nmero de equivalentes de OH- o H+) cambia las propiedades del cido-base del aminocido, y provoca un cambio brusco de pH; dicho de otro modo, es el punto de menor capacidad amortiguadora del aminocido. El punto isoelctrico se calcula mediante la siguiente relacin en todos aquellos aminocidos. (GMEZ et. Al. 2004) Aminocido cistina formacin. El grupo sulfhidrilo de la cistena es muy reactivo. La reaccin ms comn de este grupo es una oxidacin reversible que forma un disulfuro. La oxidacin de dos molculas de cistena forma cistina, una molcula que contiene un enlace disulfuro. Cuando dos residuos de cistena forman uno de estos enlaces, ste se denomina puente disulfuro. Este enlace puede producirse en una cadena individual para formar un anillo o entre dos cadenas separadas para formar un puente intermolecular. Los puentes disulfuro ayudan a estabilizar muchos polipptidos y protenas. (Mckee Trudy 2009) En los lquidos extracelulares, como la sangre (pH de 7.2 a 7.4) y la orina (pH 6.5), los grupos sulfhidrilo de la cistena (pKa 8.1) estn protonados y experimentan oxidacin para formar cistina. En los pptidos y en las protenas, el carcter nuclefilo de los grupos tiol protonados libres se aprovecha para estabilizar la estructura protenica y en reacciones de transferencia de tiol , no obstante los aminocidos libres en los lquidos hsticos pueden ser problemticos debido a la baja solubilidad de la cistina. En una enfermedad gentica denominada cistinuria, el transporte defectuoso de la cistina a travs de la membrana origina una eliminacin excesiva de cistina en la orina. La cristalizacin del aminocido produce la formacin de clculos (piedras) en los riones, en los urteres o en la vejiga urinaria. Los clculos pueden producir dolor, infecciones y hematuria. La concentracin de cistina en el rin se reduce aumentando de forma masiva la ingestin de lquidos y la administracin de penicilamina D. Se cree que la penicilamina (Fig. 5.14) es eficaz debido a la formacin del disulfuro de penicilamina-cistena, que es sustancialmente ms soluble que la cistina. (Mckee Trudy 2009)

Imagen 1.

OBJETIVOS Determinar el pH del agua destilada mediante la utilizacin de un pH- metro y discutir la diferencia con su valor teorico. Realizar una curva de titulacion del aminocido L-cistina, encontrar el punto isoelctrico y comprender su efecto tamponante. METODOLOGA

Materiales y reactivos: pH-metro,buretra, vaso precipitado 200 mL, solucin HCl 0,1 M, solucin de NaOH o,1 M, Solucion de calibracin pH-metro ( KCl 3 M ), papel milimetrado. 1. Determinacin Del pH del agua destilada. a. Se lava con agua destilada el electrodo que se encontraba previamente sumergido en una solucin de calibracin de KCl 0,3 M.

b. Con mucha precaucin se introduce el electrodo en un vaso precipitado con 100 mL de agua destilada.

c. Se agito el vaso precipitado para obtener un valor de pH correcto.

d. Se determin el valor del pH del agua, despus de aproximadamente 1 min luego de introducir el electrodo, procurando que el valor de este no cambie en la pantalla.

2. Titulacin del aminocido L-cistina.

a. Se pesaron 0,202g. en una balanza electrnica previamente tarada.

b. Se diluyo los 0,202g de L-cystina en aproximadamente 100 mL de HCl 0,1 M.

c. Se agita constantemente con la ayuda de un vaso precipitado.d. Se sac una muestra de aproximadamente 250 mL. en un vaso precipitado.

e. Se procedi a titular la muestra de L-cistina diluida en HCl, agregando 1 mL de NaOH 0,1 M. f. Se continu con el proceso de titulacin hasta llegar a pH cercano a 12. RESULTADOS Y DISCUSIN.

1. Medicin del pH del agua destilada.

Al medir con el pH-metro cierta cantidad de agua destilada, nos result un valor de 5,48. Bastante cido si consideramos que el pH es una escala logartmica y que el pH terico del agua destilada es de 7.

Si se agrega cido o base al agua, el pH de esta ltima varia marcadamente, porque el agua no es capaz de resistir el cambio de pH; est totalmente desprovista de accin buffer. Aun un cido muy dbil como el dixido de carbono disminuye el pH del agua de 7 a 5,7 cuando la pequea concentracin del gas presente en el aire se equilibra con el agua pura. Esta susceptibilidad extrema del agua destilada para cambiar el pH con pequeas cantidades de cidos o bases es a menudo de mucha importancia en las operaciones farmacuticas. Remington Farmacia, (Alfonso R. 2003)

En conclusin el valor relativamente cido del pH- practico del agua destilada, puede deberse a la absorcin del dixido de carbono atmosfrico, y/o un proceso no muy efectivo de purificacin del agua, por lo que podran haber quedado minerales, que podran variar el pH neutro terico del agua destilada.2. Titulacin de enzima L-cistina. Grafico 1. Curva de titulacin enzima L-cistina. Podemos observar una clara capacidad tamponante desde los 0 mL de agregado de NaOH hasta aproximadamente los 40 mL agregados de NaOH, donde se rompe la capacidad buffer de la enzima aumentando el pH en cantidades considerables, mas especficamente de pH 3,66 aumenta a pH 8,47. Entonces que provoca este cambio de pH tan brusco? , Por qu se rompe la capacidad buffer de la l-cistina?, La respuesta radica en el Punto isoelctrico. En el punto isoelctrico, cualquier cambio de carga (variacin del nmero de equivalentes de OH- o H+) cambia las propiedades del cido-base del aminocido, y provoca un cambio brusco de pH; dicho de otro modo, es el punto de menor capacidad amortiguadora del aminocido. (GMEZ 2004).

Entonces analizando el punto isoelctrico de la Enzima L-cystine, tenemos que cuando fue diluida en el cido fuerte HCl, ocurri una protonacion de todos sus residuos (grupos carboxilos y grupos aminos), quedando la molcula cargada positivamente +2, debido a que el grupo carboxlico se encontraba protonado COOH, con una carga neutra, y el grupo Amino NH3+ cargado positivamente y como hay dos grupos aminos en la molcula, se suman las cargas de los dos grupos amino, quedando una carga total de la enzima L-cistina de +2. De esta forma podemos calcular a que pH se encuentra el punto isoelctrico, donde la molcula tiene carga total 0 y pierde su efecto tamponante.

Tabla 1. Valores de pKa Aminocido L-cistina. (Extrado de Tabla 5. Restos de aminocidos protenicos no codificables, Protenas. Mara de la Luz Velzquez Monroy & Miguel ngel Ordorica Vargas)Nombre aminocidoPMpKa1COOHpKa2NH3

Cistina240,31,652,267,859,85

Al agregar NaOH a la solucin, sus grupos COOH y NH3 se van desprotonando, momentos en los cuales poseen determinado pKa. Con esto se puede calcular el punto isoelctrico, determinando las zonas buffer o tamponantes de la solucin (como se explic con anterioridad). Se tienen 2 zonas donde la molcula cambia de carga, por lo que como muestra la imagen 1, si se suman ambos pKa , y ese valor se divide en 2, se obtiene el punto isoelctrico. Este valor es de 4,75. Sin embargo el grfico y de manera experimental, se determin que el punto isoelctrico estaba en 1,955 (tomando que el punto isoelctrico estaba entre el pKa1 y el pKa2). Esto se puede explicar ya que al momento de diluir la L-cystine, esta no se disolvi en su totalidad, por lo que la cantidad de L-cystine fue menor, y a su vez, se disolvi en 250 mL, lo que hace que una baja cantidad de L-cystine (soluto) se diluya en una gran cantidad de HCl (solvente); haciendo que el pH baje considerablemente, bajando todos los valores asociados a dicho pH.Imagen 1: determinacin del punto isoelctrico terico de la enzima L-Cystine. BIBLIOGRAFIA.-Gmez Salas G. Fornaguera J. Bioqumica: la Ciencia de la Vida (2004) pp. 40. EUNED. Costa Rica.-McKee. Trudy. Bioqumica las bases moleculares de la vida 4aed. (2009) pp. 136. McGraw-Hill. Mxico.-Alfonso R. Gennaro. Farmacia (2003) pp. 279. Editorial Mdica Panamericana. Argentina.

- Restos de aminocidos protenicos no codificables, Protenas. Mara de la Luz Velzquez Monroy & Miguel ngel Ordorica Vargas)- Voet D. G. Voet J. Bioqumica (2006) Editorial Mdica Panamericana. Argentina.Estructura de la cistina. El residuo de cistina presenta dos grupos de cistena unidos mediante un puente de disulfuro. (Voet et. Al.)

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