informe purificacion comatografica m1 lacc2

IES SARDIÑEIRA

ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS

Noelia Deibe Pérez

Alba Gándara Crespo

Paula Pérez Morandeira

LACC2 M1

Curso 2013/2014

Purificación cromatográfica GFP

FECHA INICIO: FECHA FINALIZACIÓN: TIEMPO EMPLEADO (SESIONES) CONTROLADA:

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ELABORADO POR: REVISADO POR: APROBADO POR: Página 2 de 7

M1 LACC2 Carlos de Paz

Resultados:

Imagen de los tubos de cultivo bajo luz UV:

Como se puede observar en la imagen adjunta, aparece fluorescencia en ambos tubos lo que

nos indica que en los mismos se han desarrollado células bacterianas transformadas capaces de

expresar el gen de la proteína verde brillante (GFP).

Imagen del microtubo de centrífuga + bajo luz UV (primera observación):

El precipitado obtenido tras la etapa de centrifugado, en la que se separan las células

bacterianas transformadas (precipitado) del medio de cultivo en el que han crecido

(sobrenadante), emite fluorescencia lo que nos indica la presencia de dichas células en el mismo.



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Imagen del microtubo de centrífuga + bajo luz UV (segunda observación):

Tras añadir solución “TE” y lisozima al microtubo aparece una leve fluorescencia en el sobrenadante

debido a que en esta etapa, la lisozima ha liberado los componentes solubles, incluida la GFP, del

interior de las células bacterianas y, debido a la centrifugación, los componentes celulares de mayor

tamaño se han depositan mientras que los más pequeños, incluyendo la GFP que es la responsable de

la fluorescencia, permanecen en el sobrenadante.

Imagen de la columna cromatográfica bajo luz UV tras añadirle 250µL de sobrenadante del nuevo microtubo + al que se le habían añadido

250 µL del sobrenadante del anterior microtubo + y 250 µL de “Binding Buffer”:

Se observa fluorescencia en la parte superior de la columna cromatográfica lo que es debido a que en

esta etapa se mezclan a partes iguales el sobrenadante que contiene GFP y “Binding Buffer” de modo

que el sobrenadante tiene entonces la misma concentración de sal que la columna equilibrada. Así

obtenemos una solución de alta concentración de sal en la que las regiones hidrofóbicas de las

proteínas están más expuestas y son capaces de interactuar y enlazarse con las regiones hidrofóbicas

de la columna cromatográfica, uniéndose de este modo la GFP a la parte superior de la misma.



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Imagen de la columna cromatográfica bajo luz UV tras añadirle 250µL de “Wash Buffer”:

Se observa como un anillo fluorescente comienza a penetrar en la matriz de la columna cromatográfica lo que es debido a que en esta

etapa el “Wash Bufer” añadido se utiliza para eliminar las proteínas débilmente asociadas a la columna de la misma, mientras que las

proteínas fuertemente hidrofóbicas, incluyendo la GFP, permanecen unidas a ella.



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Imágenes de la columna cromatográfica bajo luz UV tras añadirle 750µL de “TE Buffer”:

Sigue observándose fluorescencia en la parte superior de la columna cromatográfica lo que no es normal teniendo en cuenta que la adición

de “TE Buffer” tiene como objetivo eluir la GFP de la columna ya que, al ser un tampón de baja salinidad hace que la conformación de la

GFP cambie de modo que las interacciones hidrofóbicas entre la GFP y la columna se interrumpen y las partes hidrofílicas de la proteína están

más expuestas a la superficie, teniendo por lo tanto más afinidad por el tampón que por la columna de modo que la GFP termina por eluirse

como puede verse en la segunda de las imágenes adjuntas tomada tras repetir las etapas de lavado y elución y en la que ya no se observa

fluorescencia en la columna.



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Imágenes de los tubos tras finalizar todo el procedimiento:

Como puede verse en la imagen adjunta, no se aprecia diferencia alguna de color entre los 3 tubos lo que resulta normal teniendo en

cuenta que la GFP no se ha eluido y, por lo tanto, no ha de aparecer fluorescencia en ninguno de los mismos.

Por otro lado diremos que, si todo hubiera ido bien, en el tubo número 3 debería de haber aparecido fluorescencia al eluirse la GFP de la

columna y ser recolectada en el mismo, mientras que en los otros dos tubos no debería presentarse ningún tipo de fluorescencia lo que

puede verse en la segunda de las imágenes adjuntas tomada tras repetir las etapas de lavado y elución.

Conclusiones y observaciones:

Para finalizar diremos que desconocemos las causas por las que la GFP no se ha eluido teniendo en cuenta que el procedimiento que se ha seguido

es el indicado en el manual del Kit. Añadiremos también que hemos repetido las etapas de lavado y elución para que la GFP se eluyera de la

columna y poder así utilizarla en la práctica siguiente teniendo más éxito en esta ocasión.



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Fuentes de información:

Manual: Green Fluorescent Protein (GFP) Purification Kit.

Video:

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