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EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO DEL HONGO Psilocybe cubensis EN
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
MARIA PAULINA COGOLLO ZULETA
MARISOL VALENCIA QUERUBIN
UNIVERSIDAD EAFIT
ESCUELA DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE PROCESOS
MEDELLIN
2010
EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO DEL HONGO Psilocybe cubensis EN
MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
MARIA PAULINA COGOLLO ZULETA
MARISOL VALENCIA QUERUBÍN
Trabajo De Grado Para Optar Por El Título De Ingeniera De Procesos
ASESOR
JOSÉ RODRIGO MORENO SUÁREZ
UNIVERSIDAD EAFIT
ESCUELA DE INGENIERIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE PROCESOS
MEDELLIN
2010
Nota de aceptación
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Jurado
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Jurado
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Jurado
Medellín, 18 de Enero de 2010
iv
María Paulina
A mi familia por brindarme su amor y apoyo en todo momento y por darme tantas
oportunidades que me han hecho crecer como persona
A Marisol mi mejor amiga por su amistad y por la firmeza y lucha en la realización
de este proyecto
v
Marisol
A mi familia por su amor y su apoyo incondicional durante mi carrera
A mi tío Walter por su ejemplo de disciplina y perseverancia, a quien le agradezco
lo que soy hoy como persona
A mi novio por darme fuerzas y apoyarme siempre cuando sentía que todo en el
proyecto estaba fallando
A Paulina a quien considero mi hermana y mi amiga. Sin ti este proyecto de grado
no sería realidad
vi
Agradecimientos
Deseamos expresar los más sinceros agradecimientos a las personas que
contribuyeron significativamente a la realización de este proyecto
Alex A. Sáez, Químico, Universidad de Antioquia. Magister en
Biotecnología, Universidad Nacional.
Byron Durán, Ingeniero Ambiental, Universidad Católica de Oriente.
Jorge Suárez, Gerente y propietario Comercializadora de Champiñones-
Santa Elena.
Personal colaborador de los laboratorios de Ingeniería de Procesos, Édgar
Arbeláez y Jhon Estrada.
vii
CONTENIDO
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... x
LISTA DE GRÁFICOS ................................................................................................... xi
LISTA DE ANEXOS ...................................................................................................... xii
RESUMEN ..................................................................................................................... xiii
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 15
1. OBJETIVOS ........................................................................................................... 17
1.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................ 17
1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ..................................................................... 17
2. MARCO REFERENCIAL ...................................................................................... 18
2.1. GENERALIDADES DE LOS HONGOS ................................................... 18
2.2. DESCRIPCIÓN DEL HONGO P. cubensis ............................................. 19
2.2.1. Sombrero o píleo .................................................................................. 19
2.2.2. Lamelas ................................................................................................. 19
2.2.3. Estípite o tallo ....................................................................................... 20
2.2.4. Características microscópicas ........................................................... 21
2.2.5. Hábito, hábitat y distribución .............................................................. 21
2.3. AGENTES CONTAMINANTES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DEL P. cubensis ........................................................................................................ 21
2.4. ALCALOIDES PRESENTES EN DIFERENTES ESPECIES DE Psilocybe ..................................................................................................................... 22
2.5. TRIPTAMINA ............................................................................................... 27
2.6. ESTÁNDAR INTERNO ............................................................................... 28
2.7. LA PSILOCIBINA Y LA LEY ...................................................................... 29
2.8. PRODUCCIÓN Y CULTIVO ...................................................................... 30
2.8.1. Cultivo en sustratos esterilizados ...................................................... 31
Etapas del cultivo .................................................................................................. 31
Cultivo sustrato de trigo ........................................................................................ 32
Cultivo compost de champiñón ........................................................................... 32
Parámetros de crecimiento .................................................................................. 33
viii
Estrategias básicas para la formación de hongos ........................................... 35
2.9. APLICACIONES Y USOS DE LA Psilocibina ......................................... 36
2.10. ESTADO DEL ARTE ................................................................................... 37
3. METODOLOGIA .................................................................................................... 41
3.1. PROPAGACIÓN DE LA CEPA ................................................................. 41
3.2. OBTENCIÓN DEL MICELIO DE SIEMBRA (SEMILLA DEL HONGO) ……………………………………………………………………………….41
3.3. OBTENCIÓN DE LOS CUERPOS FRUCTIFEROS .............................. 44
3.3.1. Siembra en sustrato de trigo .............................................................. 44
3.3.2. Siembra en compost de champiñón ................................................. 44
3.4. DISEÑO DE EXPERIMENTOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO .............. 47
Variables de respuesta ......................................................................................... 50
3.5. RECOLECCIÓN DE CUERPOS FRUCTIFEROS ................................. 51
3.6. EXTRACCIÓN DE LA PSILOCIBINA ....................................................... 52
3.7. EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA ........................ 53
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS ................................................................................ 54
4.1. SUSTRATO DE TRIGO ............................................................................. 54
4.2. COMPOST DE CHAMPIÑÓN ................................................................... 55
4.2.1. Crecimiento de cuerpos fructíferos en el tiempo ............................ 55
4.2.2. Variables cuantitativas evaluadas en la producción de cuerpos fructíferos ................................................................................................................ 57
4.2.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LOS TRATAMIENTOS ................... 59
4.2.3.1. Tamaño de píleo .................................................................................. 59
4.2.3.2. Precocidad de colonización ................................................................ 60
4.2.3.3. Rendimiento .......................................................................................... 61
4.2.3.4. Eficiencia biológica .............................................................................. 63
4.3. ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA ..... 63
4.4. ESTUDIO CUANTITATIVO DE LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA .. 63
CONCLUSIONES .......................................................................................................... 68
RECOMENDACIONES ................................................................................................ 70
BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................. 71
ANEXOS ......................................................................................................................... 76
ix
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Determinación sistemática del P. cubensis ................................................... 22
Tabla 2. Escala de potencia silométrica, comparativo de algunos hongos del género Psilocybe . ............................................................................................................. 25
Tabla 3 Composición química sustrato de trigo .......................................................... 32
Tabla 4. Composición química compost de champiñón ............................................. 33 Tabla 5. Parámetros de crecimiento .............................................................................. 35
Tabla 6. Diseño de experimentos para obtención de cuerpos fructíferos ................ 45 Tabla 7. Nuevo diseño de experimentos para obtención de cuerpos fructíferos .... 48 Tabla 8. Velocidad de crecimiento en los tratamientos ............................................... 57
Tabla 9. Eficiencia biológica, Rendimiento y Precocidad de colonización para los tratamientos con cosecha ................................................................................................ 58
Tabla 10. Promedio de los tratamientos para las variables de respuesta ............... 59
Tabla 11. Áreas y tiempos de retención obtenidos de los cromatogramas por tratamiento .......................................................................................................................... 65 Tabla 12. Concentración de Psilocibina (%) ................................................................ 66
Tabla 13. Análisis de varianza para el tamaño de píleo por tartamiento ................. 76
Tabla 14. Análisis de varianza para la precocidad de colonización por tratamiento .............................................................................................................................................. 77
Tabla 15. Análisis de varianza para el rendimiento por tratamiento ......................... 80
Tabla 16. Análisis de varianza para Eficiencia biológica por tratamiento ................ 80
Tabla 17. Análisis de varianza para la cantidad de alcaloide Psilocibina ................ 86
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Píleo de P. Cubensis ....................................................................................... 19
Figura 2. Lamelas y esporada de P. cubensis ............................................................ 20
Figura 3. Tallo del hongo P. cubensis ............................................................................ 20 Figura 4. Características de P. cubensis esporas, cistidios y basidios .................... 21 Figura 5. Estructura química de la Psilocibina ............................................................. 23
Figura 6. Estructura química de la Serotonina ............................................................. 23
Figura 7. Porcentajes de alcaloide en diferentes especies Psilocybe ...................... 26
Figura 8. Combinación máxima de los porcentajes de Psilocibina, Psilocina y Baeocystina en diferentes especies de Psilocybe ....................................................... 27
Figura 9. Estructura molecular de la triptamina ............................................................ 28
Figura 10. Descomposición de Psilocibina en el cuerpo humano ............................. 39
Figura 11. HPLC-ECD Determinación de Psilocina ..................................................... 39 Figura 12. Cepa P. cubensis ........................................................................................... 41
Figura 13. Preparación medio líquido extracto de malta e inoculación de pellets .. 42 Figura 14. Obtención de pellets ...................................................................................... 42
Figura 15. Preparación de semilla .................................................................................. 43 Figura 16. Colonización de semilla ................................................................................. 43
Figura 17. Siembra en compost de champiñón ............................................................ 45
Figura 18. Diseño de experimentos sin cobertura ....................................................... 46
Figura 19. Sustrato de trigo y compost de champiñón con cobertura ...................... 47
Figura 20. Contaminación bacteriana en sustrato de trigo y compost de champiñón .............................................................................................................................................. 47
Figura 21. Tratamientos contaminados com Penicillium en sustrato de trigo ......... 48
Figura 22. Adición de cobertura en tratamientos de compost de champiñón ......... 49
Figura 23. Aparición de capóforos .................................................................................. 49 Figura 24. Recolección de cuerpos fructíferos en compost de champiñón ............. 51
Figura 25. Cromatografía de extracción de la Psilocibina de P. cubensis ............... 52 Figura 26. Presencia de Psilocibina en cuerpos fructíferos ....................................... 53 Figura 27. Estructura química de la cafeína ................................................................. 64
Figura 28. Muestra analizada mediante el reactivo de dragendorff .......................... 82
Figura 29. Muestra analizada mediante la cromatografía de capa fina y el reactivo de Dragendorff ................................................................................................................... 82
Figura 30. Cromatografía de extracción del hongo P. cubensis de hongos recolectados en campo abierto ....................................................................................... 83 Figura 31. Estándar interno de la cafeína ..................................................................... 84
Figura 32. Cromatograma tratamiento testigo .............................................................. 84 Figura 33. Cromatograma tratamiento 0.1 g de triptamina......................................... 85 Figura 34. Cromatograma tratamiento 0.2 g de triptamina......................................... 85
Figura 35. Cromatograma tratamiento 0.4 g de triptamina......................................... 86
xi
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Crecimiento de estípite en el tiempo ........................................................... 55 Gráfico 2. Crecimiento de píleo en el tiempo ................................................................ 56
Gráfico 3. Tiempo promedio de precocidad de colonización para los tratamientos 61 Gráfico 4. Rendimiento promedio para los tratamientos............................................. 62
Gráfico 5. Concentración de Psilocibina (ppm) ............................................................ 67
Gráfico 6. LSD para tamaño de píleo por tratamiento ................................................. 76
Gráfico 7. LSD para la precocidad de colonización por tratamiento ......................... 77
Gráfico 8. Rendimiento en tratamiento de testigo ........................................................ 78 Gráfico 9. Rendimiento en tratamiento de 0,1 g de triptamina .................................. 78
Gráfico 10. Rendimiento en tratamiento de 0,2 g de triptamina ................................ 79 Gráfico 11. Rendimiento en tratamiento de 0,4 g de triptamina ................................ 79
Gráfico 12. LSD para el rendimiento por tratamiento .................................................. 80 Gráfico 13. LSD para Eficiencia biológica por tratamiento ......................................... 81
Grafico 14. Box and Whisker plot para la cantidad de alcaloide Psilocibina ........... 87
xii
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1.Tabla ANOVA para tamaño de píleo por tratamiento .................................. 76
Anexo 2. Intervalos LSD para tamaño de píleo por tratamiento ................................ 76 Anexo 3. Tabla ANOVA para precocidad de colonización por tratamiento. ............ 77
Anexo 4. Intervalo LSD para precocidad de colonización por tratamiento .............. 77 Anexo 5. Gráfico de rendimiento en tratamiento de testigo ....................................... 78
Anexo 6. Gráfico de rendimiento en tratamiento de 0,1 g de triptamina .................. 78
Anexo 7. Gráfico de rendimiento en tratamiento de 0,2 g de triptamina .................. 79
Anexo 8. Gráfico de rendimiento en tratamiento de 0,4 g de triptamina .................. 79
Anexo 9. Tabla ANOVA para el rendimiento por tratamiento ................................... 80 Anexo 10. Intervalo LSD para el rendimiento por tratamiento ................................... 80
Anexo 11. Tabla ANOVA para Eficiencia biológica por tratamiento ......................... 80 Anexo 12. Intervalo LSD para Eficiencia biológica por tratamiento .......................... 81
Anexo 13. Prueba de reactivo dragendorff ................................................................... 81
Anexo 14. Prueba de reactivo de dragendorff en presencia de cromatografía de capa fina ............................................................................................................................. 82 Anexo 15. Identificación de la presencia de Psilocibina por medio de HPLC ......... 83
Anexo 16. Cromatograma estándar interno (Cafeína) ................................................ 84 Anexo 17. Cromatograma tratamiento testigo .............................................................. 84
Anexo 18. Cromatograma tratamiento 0.1 g de triptamina......................................... 85
Anexo 19. Cromatograma tratamiento 0.2 g de triptamina......................................... 85
Anexo 20. Cromatograma tratamiento 0.4 g de triptamina......................................... 86
Anexo 21. Tabal ANOVA para la cantidad de alcaloide Psilocibina ......................... 86
Anexo 22. Gráfico Box and Whisker plot para la cantidad de alcaloide Psilocibina87
xiii
RESUMEN
El hongo Psilocybe cubensis cobra significativa importancia a nivel de
investigación clínica y psiquiátrica, gracias a la presencia en sus tejidos de un
alcaloide llamado Psilocibina. Este alcaloide es derivado de la triptamina y posee
una estructura química similar a la de los neurotransmisores llamados serotonina
(5 hidroxitriptamina), melatonina y otros neurorreguladores. La serotonina es una
hormona la cual se forma endógenamente a partir del aminoácido triptofano y es la
responsable de la regulación del apetito mediante la saciedad, equilibrar el deseo
sexual, controlar la temperatura corporal, la actividad motora y las funciones
perceptivas y cognitivas (Brailosky, 2002).
En la actualidad el uso de la Psilocibina está prohibido en la mayoría de los
países, debido a sus efectos alucinógenos y psicoactivos; sin embargo, en los
Estados Unidos la FDA aprobó varios estudios sobre el uso de la Psilocibina.
MAPS (Multidiciplinary Association for Psychedelic Studies) ha publicado
diferentes estudios con dosis de Psilocibina realizados en pacientes que presentan
desordenes obsesivo-compulsivos, pacientes terminales de cáncer, con autismo
infantil, entre otros (Hanes, 1996). Por esta razón surgió la idea de realizar la
extracción de este alcaloide mediante el cultivo del hongo en medios sólidos,
evaluando diferentes dosis de un precursor químico (triptamina).
Se evaluaron dos medios de cultivo sólidos (sustrato de trigo y compost de
champiñón) con el motivo de identificar cuál de estos era el más propicio para el
crecimiento del P. cubensis y la producción de Psilocibina, utilizando diferentes
concentraciones de precursor químico (triptamina) para analizar la incidencia de
este en la producción del alcaloide. En el sustrato de trigo no se obtuvieron los
resultados esperados, debido a que todos los tratamientos presentaron
contaminación con otros microorganismos que impidieron la propagación del
micelio del P. cubensis y la producción de los cuerpos fructíferos. El compost de
champiñón presentó un adecuado crecimiento micelial y desarrollo de cuerpos
fructíferos en la mayoría de los tratamientos experimentales.
La precocidad de colonización fue similar en todos los tratamientos, teniendo en
cuenta que no todas las réplicas de los tratamientos presentaron primordios,
mostrando aparición de los primeros carpóforos alrededor de los 40 días. El mayor
rendimiento obtenido en los tratamientos fue de 0.11 g de hongos frescos
xiv
cosechados /cm2 de área ocupada por el sustrato húmedo con 0.1 g de triptamina
(réplica 1), 0.11 y 0.16 g de hongos frescos cosechados /cm2 de área ocupada por
el sustrato húmedo con 0.2 g de triptamina (réplica 1 y réplica 3 respectivamente),
debido a que estos presentaron mayor cantidad de cuerpos fructíferos que los
demás tratamientos; igualmente los mejores resultados en cuanto a la eficiencia
biológica (variable base para establecer el rendimiento), fueron los tratamientos
con 0.1 y 0.2 g de triptamina.
La resolución de los picos obtenidos por HPLC del extracto del P. cubensis fue
mayor a medida que la concentración de la triptamina aumentaba en los
tratamientos. Testigo, 0.1, 0.2 y 0.4 g con áreas de 497.30, 550.20, 1316.70 y
1381.00 mm2 respectivamente; así mismo los tiempos de retención arrojados por
el HPLC mostraron la presencia de la Psilocibina en un rango de 4 a 6 min para
cada uno de los ensayos, lo que permite evidenciar que no existen diferencias
significativas entre la similitud de los picos y las cantidades de triptamina utilizada.
El precursor químico utilizado en el proyecto arrojó los resultados esperados en
cuanto a la cantidad de alcaloide obtenido, porque al momento de realizar la
cuantificación por medio de la ayuda de un estándar interno (cafeína) se encontró
que a mayor cantidad de precursor químico utilizado mayor cantidad de alcaloide
obtenido. En el tratamiento con 0.4 g de triptamina se obtuvo un porcentaje de
Psilocibina de 0.0922 %, mientras que el porcentaje obtenido en el extracto del
testigo para este alcaloide fue de 0.0353 %.
Palabras claves:
Psilocybe cubensis, Psilocibina, triptamina, cafeína, serotonina, sustrato de trigo,
compost de champiñón, estándar interno, precursor químico, HPLC.
15
INTRODUCCIÓN
Los hongos del género Psilocybe, el cual incluye la especie P. cubensis se ha
incrementado considerablemente en los últimos años, debido a su fácil cultivo y
manejo en medios sólidos como el estiércol de bovinos, caballos y elefantes.
Estos hongos crecen fácilmente en temporadas de primavera y verano, donde la
mayoría de las especies se desarrollan en gran proporción, dos meses antes de
llegar el verano o período caliente y durante el periodo de lluvia, entre febrero y
noviembre (Gottlieb, 1997).
El uso de los hongos alucinógenos como lo es el P. cubensis, se remota a los
indígenas de Sudamérica, pero también a culturas de otros lugares como Argelia,
India y Europa medieval. En cualquier caso el interés por estos hongos respondía
únicamente a inquietudes religiosas, culturales o curativas (Griffiths et al., 2008).
El empleo de este tipo de hongos resurgió en 1957 con la publicación de un
artículo titulado “en busca del hongo mágico” por R. Gordon Wasson en la revista
Life y con el cultivo en el laboratorio del hongo Psilocybe mexicana por parte del
microbiólogo francés Roger Hiem. Poco después, se aislaron alcaloides indólicos
responsables de la actividad psicoactiva de los hongos. Algunos investigadores
utilizaron la Psilocibina con fines terapéuticos en la década de los sesenta, pero
las investigaciones cesaron ante la situación legal de estas sustancias y sólo en
contadas ocasiones, como es el caso de Suiza en los años 90, se autorizó su uso
(Gottlieb, 1997).
El género Psilocybe contiene en sus tejidos tres tipos de alcaloides (Psilocibina,
Psilocina, Baeocystina) donde el más importante es la Psilocibina, derivado de la
triptamina y muy similar al neurotransmisor Serotonina (Brailosky, 2002). La
Psilocibina ha tomado gran importancia debido a las investigaciones realizadas en
el ámbito medicinal y psiquiátrico, en tratamientos de enfermedades en pacientes
con desordenes del comportamiento y en pacientes terminales de cáncer (Hanes,
1996), haciendo de éste alcaloide un medicamento seguro y confiable ya que su
uso no es perjudicial para la salud y no genera dependencia alguna (Lee et al.,
2004).
Para el desarrollo del proyecto se utilizaron medios de cultivos sólidos como el
sustrato de trigo y el compost de champiñón, con el fin de evaluar el crecimiento
16
del P. cubensis y la producción de Psilocibina en presencia de un precursor
químico (Triptamina), y finalmente la extracción de este alcaloide. Estos medios de
cultivo son generalmente subproductos agrícolas que presentan un alto contenido
de nutrientes y los cuerpos fructíferos de los hongos que se producen son mucho
más resistentes y tienen mejor adaptabilidad al medio donde crecen (Doelle y
Mitchell, 1992).
17
1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar a escala de laboratorio el crecimiento del hongo Psilocybe cubensis,
mediante el uso de dos medios de cultivo sólidos enriquecidos con el precursor
químico triptamina.
1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Para que se cumpla el objetivo general, se plantean los siguientes objetivos
específicos:
Identificar el medio de cultivo más propicio para el crecimiento y
propagación del P. cubensis y la producción de Psilocibina.
Evaluar la eficiencia biológica, el rendimiento y la precocidad de
colonización del hongo Psilocybe cubensis en dos medios de cultivo
sólidos.
Evaluar el efecto del precursor químico (triptamina) sobre la producción de
Psilocibina por medio de la técnica de HPLC.
18
2. MARCO REFERENCIAL
2.1. GENERALIDADES DE LOS HONGOS
Los hongos pertenecen al reino Fungi en el cual se hallan una gran cantidad de
organismos eucariotas, descomponedores y heterótrofos. Poseen características
muy particulares que los hacen diferentes de las plantas porque carecen de
clorofila. La forma en la que se alimentan es por absorción y pueden reproducirse
tanto sexual y asexualmente (Miles y Chang, 1999).
Los hongos se originan a partir de esporas, células especializadas que cumplen la
misma función de las semillas en las plantas. Cuando las esporas encuentran las
condiciones adecuadas de humedad, temperatura, luz y nutrientes, entre otras,
germinan y producen hifas, estructuras filamentosas que constituyen la unidad
estructural fundamental de la mayoría de los hongos (Miles y Chang, 1999). Las
hifas se ramifican y forman una masa algodonosa llamada micelio, el cual se
extienden sobre el medio o superficie (materia orgánica, madera, entre otros) y
produce los cuerpos fructíferos. En realidad, el verdadero cuerpo del hongo lo
constituye el micelio, y los cuerpos fructíferos son el equivalente de los frutos en
un árbol. Los cuerpos fructíferos son las estructuras que se observan a simple
vista sobre un sustrato, medio o superficie y su función es producir esporas que
son dispersadas por el agua, el viento, insectos y otros factores y finalmente
mueren. Los cuerpos fructíferos son estacionales y aparecen solo en ciertas
épocas del año, pero el micelio permanece sobre el sustrato, incluso durante
cientos de años (Miles y Chang, 1999).
Los hongos constituyen uno de los grupos de organismos más importantes para la
vida del hombre, debido a que son los responsables de gran parte de la
descomposición de la materia orgánica, aumentando la disponibilidad de
nutrientes en el suelo; pueden ser comestibles, venenosos o psicotrópicos;
muchos son patógenos; otros, producen ciertas sustancias benéficas o intervienen
en procesos de elaboración de algunos comestibles (Miles y Chang, 1999).
19
2.2. DESCRIPCIÓN DEL HONGO P. cubensis
2.2.1. Sombrero o píleo
El sombrerillo mide entre 1.5-8 cm de diámetro; es campanulado al principio y
posteriormente convexo, a veces plano-depreso; superficie lisa a fibrilosa o
finamente escamosa, las fibrillas y escamas de color amarillo opaco en el disco y
blanco amarillento hacia el margen. Himenóforo formado por lamelas pardo-
grisáceo a negruzcas, próximas, con el margen blancuzco (figura 1) (Chacon et
al., 2005). Las esporas son café púrpura, cuando se lesiona o se manipula el
hongo adopta un color azul-negro (Stamets, 1996).
El contenido de Psilocibina en el hongo P. cubensis, es mucho mayor en la parte
del sombrerillo, en un rango de 0.44-1.35%, mientras que en el tallo el contenido
de Psilocibina se encuentra en un rango de 0.05-1.27% (Wurst et al., 1984).
Figura 1. Píleo de P. Cubensis
2.2.2. Lamelas
Se encuentran unidas al sombrerillo, están cercanas unas a otras y son
ligeramente largas en el centro (figura 2). Su color se torna gris pálido en los
cuerpos fructíferos jóvenes, transformándose en un profundo púrpura oscuro en la
etapa de madurez del hongo (Stamets, 1996).
20
Figura 2. Lamelas y esporada de P. cubensis
2.2.3. Estípite o tallo
Puede alcanzar una altura de 40-150 mm de largo por 5-15 mm de ancho (figura 3). Se tornar blancuzco y cambia a un color amarillento y puede presentar un color azulado cuando es maltratado con fuerza. La superficie es lisa y estriada en su cúspide o cima. Presenta un anillo en la parte superior (apical) del estípite, de consistencia membranosa y color amarillo claro. (figura 2) (Stamets, 1996).
Figura 3. Tallo del hongo P. cubensis
21
2.2.4. Características microscópicas
El hongo presenta esporas púrpuras oscuras y tiene en su estructura células
fértiles (basidios) en donde ocurre la producción de esporas (figura 4) (Stamets,
1996).
Figura 4. Características de P. cubensis esporas, cistidios y basidios (Kasuya
y Guzmán, 2004)
Las esporas del P.cubensis, son café oscuras, miden alrededor de 10,2-16,5 µm x
5,9-10 µm, presenta poros apicales y una superficie lisa. Los cistidios son
amarillos y de paredes gruesas, hyaline y subcapitate. Los basidios presentan una
descripción microscópica hyaline 4-esporas (Kasuya y Guzmán, 2004).
2.2.5. Hábito, hábitat y distribución
El hongo P. cubensis es estercolero (crecen sobre el estiércol de bovinos, caballos
y elefantes) y gregario; se encuentra en el Sureste de los Estados Unidos, México,
Cuba, Centro América, Sur América, Este de Asia (India, Tailandia, Vietnam y
Camboya), Colombia, Australia y se desarrollan muy fácilmente en primavera y
verano, en donde las mayoría de las especies proliferan en gran proporción dos
meses antes de llegar el verano o período caliente y durante el período de lluvia
entre Febrero y Noviembre (Gottlieb, 1997).
2.3. AGENTES CONTAMINANTES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO
DEL P. cubensis
Los tipos de agentes contaminantes que pueden afectar el crecimiento del P.
cubensis se pueden clasificar en 3 grupos:
22
Grupo A: Rápido crecimiento de color azul-marrón con un olor medicinal
producido por esporas del hongo de los géneros Penicillium o Aspergillus (figura
21). Este grupo constituye la causa mayoritaria de contaminación dentro de los
procesos biotecnológicos de cultivos. Existe otro moho que suele frecuentar y
atacar al P. cubensis, el cual es de aspecto negro-verde oliváceo del género
Rhizopus (García, 1991).
Grupo B: Aparición de un exudado de color amarillento (figura 20) con un aspecto
aceitoso que se destaca por su fuerte olor fétido. Se trata de una contaminación
bacteriana producida por una inadecuada limpieza en los instrumentos utilizados
en el proceso. Aparece rápidamente, haciendo inútil el medio de cultivo para
cualquier desarrollo micelial (García, 1991).
Grupo C: existen otros procesos infecciosos que pueden afectar el cultivo. La
etiología de esta contaminación se busca esta vez en moscas y ácaros que
pululan y colonizan los medios de cultivo para alimentarse o para la puesta de
huevos (García, 1991).
2.4. ALCALOIDES PRESENTES EN DIFERENTES ESPECIES DE
Psilocybe
P. cubensis es el nombre de una especie de hongos del género Psilocybe
llamados así debido a las propiedades enteógenas que son el resultado de las
diferentes sustancias químicas que poseen, principalmente la Psilocibina. El P.
cubensis es conocido también como golden tops, cubies, san Isidro y hongos
kentesh (Stamets, 1996).
La determinación sistemática de la especie es la siguiente:
Tabla 1. Determinación sistemática del P. cubensis (Paris y Hurabielle, 1981)
Reino Fungi
Phyllum Basidiomycota
Clase Hymenomycetes
Orden Agaricales
23
Familia Strophariaceae
Género Psilocybe
Especie Psilocybe cubensis
Los principios activos del P. cubensis son derivados de la triptamina. El más
importante de éstos es la Psilocibina ó 4-fosforilhidroxi N,N dimetiltriptamina (figura
5) (Stamets, 2000).
Figura 5. Estructura química de la Psilocibina (Téllez, 2005).
La Psilocibina es un alcaloide que posee una estructura química similar a la de los
neurotransmisores llamados serotonina (5-hidroxitriptamina), melatonina y otros
neurorreguladores (figuras 5 y 6) (Stamets, 1996).
Figura 6. Estructura química de la Serotonina (Téllez, 2005).
La serotonina es una hormona que se forma endógenamente a partir del
aminoácido triptofano por hidroxilación seguida de carboxilación. Las neuronas
que contienen serotonina se encuentran localizadas en los nucleos de rafé, en la
línea media del tallo encefálico, hipotálamo, neocorteza, médula espinal y sistema
límbico. La serotinina es la responsable de la percepción sensorial y participa en el
control de los estados del sueño y vigilia, el inicio del reposo nocturno, el ánimo,
24
las emociones, el control de la temperatura, la dieta, la conducta sexual y la
conducta suicida (Brailosky, 2002).
Los hongos del género Psilocybe por medio de sus principios activos como la
Psilocibina ejercen las siguientes acciones moleculares en el sistema nervioso
central:
Agonista competitivo con el neurotransmisor serotonina por los receptores
serotoninérgicos 5HT, especialmente por los receptores excitatorios 5HT2 y
5HT3, que se encuentran localizados en la sinapsis cerebral (hipotálamo,
sistema límbico, cerebelo y retina) (Ganong, 1994).
Los estímulos de los receptores 5HT2 y 5HT3 producen aumento de los
segundos mensajeros trifostato de inocitol (IP3) y diacilgliceriol (DAG), que
producen un aumento en la conductancia en la membrana celular para el
Sodio y una disminución en la conductancia para el Potasio. Estas
acciones hacen que las células de los tejidos donde se encuentran
localizados estos neuroreceptores se tornen más excitables (Goodman,
1996).
Antagonismo competitivo con el neurotransmisor serotonina por los
receptores serotoninérgicos 5HT, especialmente por aquellos receptores
localizados en el músculo liso (Ganong, 1994).
Las especies de hongo Psilocybe, han sido analizadas a través de los años debido
a sus efectos psicoactivos. La variación de los rangos de Psilocibina, Psilocina y
Baeocystina presentes en cada una de las diferentes especies se aprecia en la
tabla 2.
25
Tabla 2. Escala de potencia silométrica, comparativo de algunos hongos del
género Psilocybe (Stamets, 1996).
ESPECIES %
PSILOCIBINA
%
PSILOCINA
%
BAEOCYSTINA REFERENCIA
P. azurescens 1.78 0.38 0.35 Stamets y Gartz 1995
P. bohémica 1.34 0.11 0.02 Gartz y Muller 1989;
Gartz (1994)
P.
semilanseata 0.98 0.02 0.36 Gartz 1994
P. baeocystis 0.85 0.59 0.10 Repke et al. 1977; Beug
y Bigwood 1982
P. cyanescens 0.85 0.36 0.03 Stijve y Kuyper 1985;
Repke et al. 1977
P. tampanensis 0.68 0.32 n/a Gartz 1994
P. cubensis 0.63 0.60 0.025 Gartz 1994; Stijve y de
Meijer 1993
P. weilii (nom.
prov.) 0.61 0.27 0.05
P.
hoogshagenii 0.60 0.10 n/a Heim y Hofmann 1958
P. stuntzii 0.36 0.12 0.02 Beug y Bigwood 1982;
Repke et al. 1980
P.
cyanofibrillosa 0.21 0.04 n/a Stamets et al. 1980
P. liniformans 0.16 n/a 0.005 Stijve y Kuyper 1985
Además de estos, se encuentran presentes otra índole de alcaloides como:
Baeocystina, Norbaeocystina y/o Aeruginacina (Gartz, 1989), citado por Stamets,
(1996). En general la Baeocystina se encuentra en menor concentración en
comparación con la Psilocibina y la Psilocina (Stamets, 1996).
Los porcentajes de los alcaloides mostrados en la tabla 2, se basan en porcentaje
peso seco. Un gramo de hongo seco contiene 1% de Psilocibina, lo que equivale a
10 mg del alcaloide (Stamets, 1996). Se excluye la potencia del hongo con la
adición del precursor químico (Triptamina) en el sustrato, tal y como lo
experimentó Gartz (1989).
26
Figura 7. Porcentajes de alcaloide en diferentes especies Psilocybe (Stamets,
1996).
27
Figura 8. Combinación máxima de los porcentajes de Psilocibina, Psilocina y
Baeocystina en diferentes especies de Psilocybe (Stamets, 1996).
2.5. TRIPTAMINA
Es una monoamina alcaloidal (figura 9), se basa en la estructura del anillo indol y
está relacionada químicamente con el triptofano. La triptamina se encuentra en
pequeñas cantidades en el cerebro de los mamíferos y se cree que desempeña el
papel de un neurotransmisor. Es también la columna vertebral de un grupo de
compuestos conocidos colectivamente como triptaminas. Este grupo incluye a
muchos compuestos activos como los neurotransmisores y las drogas psicodélicas
(Wang et al., 2007).
Los derivados de la triptamina más conocidos son la serotonina y la melatonina.
Alcaloides derivados de la triptamina se encuentran en hongos, plantas y animales
y son utilizados habitualmente por los seres humanos por sus efectos
28
psicotrópicos. Algunos ejemplos destacados son: la Psilocibina de los hongos
mágicos y la Dimetiltriptamina (DMT) en las plantas como chacruna, a menudo
utilizada en infusiones ayahuasca. Muchas triptaminas sintéticas también se han
elaborado, tales como el sumatriptan en drogas para la migraña y sus familiares
(Jones, 1986).
Figura 9. Estructura molecular de la triptamina (Jones, 1986).
Gartz (1989) determinó que los niveles de la Psilocibina naturalmente son
aproximados al 0.1% a partir de una mezcla esterilizada de estiércol de vaca y
arroz (2:1), pero esta cantidad de alcaloide podría aumentarse hasta 3,3% con la
adición de 25 mg de triptamina por cada 10 g de sustrato (Stamets, 2000).
2.6. ESTÁNDAR INTERNO
El método del estándar interno debe su nombre a la forma como se preparan las
muestras al ser analizadas. Es una sustancia que se añade a todas las muestras
en cantidad conocida y suficiente para poder ser determinada sin problema (SI y
analito). Su adición no debe causar ningún tipo de interferencia en el análisis y
debe proporcionar una señal analítica similar al analito en el análisis pero
distinguible del mismo. El estándar interno no debe estar presente en la matríz en
estudio (Castillo, 2003).
Los métodos basados en la adición de un estándar interno generalmente se
utilizan cuando el analista está interesado en la concentración de uno o algunos
29
de los componentes y el método de análisis es susceptible a errores tanto
sistemáticos como al azar. El método está basado cuando las señales del analito y
el estándar interno responden proporcionalmente a las fluctuaciones del método y
del instrumental empleado, entonces la razón de estas señales es independiente a
tales fluctuaciones; de esta forma el método compensa por errores provenientes
de la manipulación de la muestra por analizar (Castillo, 2003).
Existen muchos métodos analíticos que requieren adicionar un estándar interno
para poder ser cuantificados debido a que los errores pueden llegar a ser grandes.
Agregando un estándar interno la exactitud y precisión del método resulta ser el
adecuado (Castillo, 2003).
2.7. LA PSILOCIBINA Y LA LEY
La Psilocibina y la Psilocina están controladas en virtud del Convenio de las
Naciones Unidas sobre Sustancias Sicotrópicas de 1971 y figuran en el titulo 21
sección 1(c) del código de los Estados Unidos de la edición de 1970, aunque la
clasificación de los hongos que las contienen no siempre esté clara. Seis estados
miembros de la UE han fortalecido su legislación sobre estos productos desde
2001, en respuesta a la inquietud suscitada por la prevalencia de su uso:
Dinamarca (2001), Países Bajos (2002), Alemania, Estonia, Reino Unido (2005) e
Irlanda (2006) (Guzmán et al., 2000).
La legislación contra el uso de hongos alucinógenos plantea varios problemas a
los legisladores. Ante todo, no debe penalizarse injustificadamente a las personas
en cuyas tierras crecen los hongos de forma natural. Una solución consiste en
especificar que los hongos son ilegales si se manipulan o se preparan según la
legislación irlandesa y británica, lo que denota intención de utilizarlos. Así mismo,
el tribunal supremo neerlandés ha declarado que deben estar bajo control cuando
se sequen o procesen. Al aumentar el número de establecimientos especializados
en drogas naturales que se valían de este resquicio legal para vender hongos
frescos, en el Reino Unido se sostuvo en el 2004 que incluso el envasado es una
forma de preparación, pero finalmente en el 2005 se modificó la legislación
británica con el fin de hacerla aplicable a los hongos alucinógenos, sin mención de
su estado (Guzmán et al., 2000).
30
La legislación antidroga de Grecia, Italia, Chipre y Lituania incluye una cláusula
general que prohíbe el cultivo de plantas de las que se pueden extraer sustancias
narcóticas. Sin embargo, es discutible si un hongo es estrictamente una planta;
por ello, en el 2005 se modificó la legislación Alemana para adoptar el término
sustancias orgánicas en lugar del anteriormente utilizando plantas y animales, con
el fin de no dejar ningún resquicio para los hongos. Los cambios de la legislación
han influido sobre la oferta y el volumen global de ventas de hongos alucinógenos
a través de Internet (Guzmán et al., 2000).
En Colombia existe la ley 30 de 1986 por la cual se adopta el Estatuto Nacional de
Estupefacientes (ENE), el cual dicta que las sustancias psicotrópicas se deben
cultivar, transportar, comercializar y consumir de acuerdo a las normas que expida
el ministerio de salud. Dichas sustancias se limitaran únicamente a fines médicos
y científicos, conforme la reglamentación que para el efecto expida el ministerio de
salud. En esta ley no se especifica cuáles son las sustancias psicotrópicas lo que
no indica que el alcaloide Psilocibina sea una sustancia ilegal (ENE, 1986).
2.8. PRODUCCIÓN Y CULTIVO
El cultivo de setas es una técnica relativamente moderna que iniciaron los
franceses en el siglo XVII y que rápidamente se propagó por Europa. En América
se mejoró sustancialmente el método dando inicio a lo que hoy se conoce por
fungicultura. Lógicamente el interés principal fue el culinario, de ahí que el primer
hongo cultivado fuese el champiñón (Agaricus bisporus). La técnica básica se ha
ido adaptando a los requerimientos propios de cada tipo de seta. En los años
setenta aparecieron diferentes métodos para el cultivo de hongos psilocíbicos que
provocaron la independencia del consumidor frente al mercado negro. La técnica
se le conocía como "San Antonio" y resultaba un poco laboriosa y requería
conocimientos y experiencias de laboratorio (Martínez, et al., 1991).
De todas las especies de setas psilocibínicas el P. cubensis es sin duda la más
conocida. La principal razón es su facilidad de cultivo en sustrato de arroz integral,
trigo y vermiculita (material con aspecto de trocitos de corcho, utilizado en
jardinería e hidroponía que se caracteriza por absorber mucha cantidad de agua).
Desde hace un par de décadas en Estados Unidos, Holanda y más recientemente
en España, el cultivo doméstico de esta seta no cesa de crecer (Flegg, 1987).
31
2.8.1. Cultivo en sustratos esterilizados
Etapas del cultivo
Preparación del sustrato: Verificar que los sustratos sólidos se encuentren
en buen estado para el cultivo donde crecerán los hongos.
Desinfección, pasteurización o esterilización: El sustrato una vez preparado
debe esterilizarse para garantizar la no contaminación del sustrato por otros
microorganismos. Generalmente se realizan tratamientos térmicos.
Semilla o inóculo: Se produce en medio líquido (extracto malta), hasta
obtener formación de pellets.
Micelio: Se inoculan los pellets obtenidos en el medio líquido en sustrato de
trigo.
Siembra: En esta etapa se mezcla el sustrato con el micelio y el precursor
químico.
Incubación: El sustrato sembrado es colocado en bolsas de polipropileno y
en cajas plásticas a una humedad relativa superior al 85%, una temperatura
de 18°C y luz difusa (penumbra), hasta observar la formación completa de
los cuerpos fructíferos.
Producción: Durante esta etapa se debe regar y cosechar los hongos. Estos
generalmente se producen en oleadas, de tal modo que, al cabo de una
semana se cosecha todo lo producido por bolsa y cajas y comienzan a
desarrollarse tardando nuevamente una semana en llegar al estado adulto
(Stamets, 2000).
Los sustratos en fase sólida son aquellos donde se da el crecimiento microbiano y
la generación de productos ocurre en la superficie de sustratos sólidos como:
crecimiento en suelos, cultivos de superficie, formación de ensilados o compost,
cultivo de hongos, crecimiento en afrecho celulósico, técnicas de alimentos
fermentados como el pan, el queso madurado con hongos, encurtidos y embutidos
(Hesseline, 1983).
Las ventajas de utilizar sustratos sólidos son:
Los medios de cultivo sólido son simples, generalmente subproductos
agrícolas que presentan un alto contenido de nutrientes.
32
La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las
contaminaciones, especialmente de bacterias y levaduras.
Pueden emplearse, frecuentemente conidios como inóculo en los procesos
de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos y las
manipulaciones en la preparación del inóculo.
Los cuerpos fructíferos de los hongos que se producen son mucho más
resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se
aplican (Doelle y Mitchell, 1992).
Cultivo sustrato de trigo
Presenta ventajas considerables con relación a otros derivados agrícolas, como su
fácil almacenamiento sin que se presente descomposición o fermentación del
mismo y una menor contaminación a causa de mohos o bacterias debido a la
composición química única de la paja de trigo (Savoie et al., 2000) (tabla 3).
Tabla 3 Composición química sustrato de trigo (Savoie et al., 2000).
Composición Sustrato de trigo
Proteína (%) 7.9
Carbono (%) 52.5
C/N (%) 41.0
Lignina (%) 8.6
Celulosa (%) 35.2
Cultivo compost de champiñón
Posee una alta relación C/N la cual hace que la descomposición de dicho sustrato
sea lenta, mejorando las condiciones químicas y biológicas de éste (Savoie et al.,
2000), permitiendo que el hongo P. cubensis tenga una fuente de nutrientes
adecuada para su óptimo crecimiento (tabla 4).
33
Tabla 4. Composición química compost de champiñón (Stofella y Kahn, 2005).
Composición Compost de champiñón
pH 8.2-7.3
Conductividad Eléctrica (µS.cm-1) 2380-14210
C/N (%) 15:1-9.1
Materia Seca 55.3-53.1
Nitrógeno Nítrico 5.8
Nitrógeno Amoniacal 2.8
Nitrógeno Total Disponible 9-4
Fósforo 11.2-2.9
Potasio 18.2-3-3
Calcio 83.4-27
Magnesio 3.8-2.3
Sodio 4.1-1.4
Cloro 7.5-1.5
Zinc 0.97-0.44
Cobre 0.37
Parámetros de crecimiento
En el nivel de desarrollo en cuanto al crecimiento del hongo, se encuentran las
siguientes etapas y parámetros de crecimiento:
Cultivo en cajas y bolsas
Se lleva a cabo según los estándares de preparación establecidos previamente.
En el cultivo en cajas se utiliza una capa de cobertura con un espesor de 2.54 - 5
cm (Stamets y Chilton, 1983).
pH inicial: 6.8 - 7.2
Humedad Relativa: > 90%
Temperatura del sustrato: 29 a 30 ºC
Duración: 5 a 10 días
CO2 : 5000 a 10000 ppm
Requerimiento de luz: deberá ser en total oscuridad
34
Intercambio de aire fresco: 0 volumen/hora
Formación de micelio
Esta etapa se da cuando se ha colonizado todo el sustrato, se caracteriza por un
color blanco y una textura algodonosa, presentando un color azul cuando la
formación del micelio se ha completado, evidenciando de esta forma, la presencia
del alcaloide Psilocibina (Stamets y Chilton, 1983).
Humedad Relativa: 90%
Temperatura: 29 a 30ºC
Duración: 10 a 14 días
CO2 : 5000 a 10000 ppm
Requerimiento de luz: n/a
Intercambio de aire fresco: 0 volumen/hora
Formación de primordios (Stamets y Chilton, 1983).
Humedad Relativa: 95 a 100%
Temperatura: 23 a 25 ºC
Duración: 6 a 10 días
CO2 : 5000 ppm
Requerimiento de luz: natural difusa o exposición de 12 a 16 horas/día
con luz fluorescente
Intercambio de aire fresco: 1-3volumen/hora
Formación de cuerpos fructíferos (Stamets y Chilton, 1983).
Se da entre la 4a y 5a semana de cultivo.
Humedad Relativa: 85 a 92%
Temperatura: 23 a 25 ºC
Duración: 5 días
CO2 : < 5000 ppm
Requerimiento de luz: natural indirecta
Intercambio de aire fresco: 1-3volumen/hora
Contenido de Humedad del Hongo: 92% de agua y 8% de materia seca
Contenido Nutricional del Hongo: sin establecer.
En la siguiente tabla se resumen todos los parámetros de crecimiento:
35
Tabla 5. Parámetros de crecimiento (Stamets y Chilton, 1983).
Etapa Duración Humedad Temperatura CO2 Luz
Formación
del Micelio
10 a 14
días 90% 29 a 30ºC
5000 a 1000
ppm
Intercambio de
aire fresco: 0
volumen/ hora
n/a
Formación
de
Primordios
6 a 10 días 95 a 100% 23 a 25ºC
5000 ppm
Intercambio de
aire fresco: 1-3
volumen/ hora.
Recuerde que
el aire debe
estar libre de
contaminantes,
tales como el
polvo
Natural
difusa o
exposición
de 12 a 16
horas/día con
luz
fluorescente
Formación
de
Cuerpos
Fructíferos
5 días 85 a 92% 23 a 25ºC
<5000 ppm
Intercambio de
aire fresco: 1-3
volumen/ hora
Natural
indirecta
Etapa de
Cosecha
Cuando el sombrero se vuelve convexo y poco después se da una ruptura
parcial del velo
Estrategias básicas para la formación de hongos
Muchos de los factores ambientales proveen condiciones ideales para el
desarrollo y crecimiento del hongo. Usualmente una pequeña variación en la
temperatura junto con la adición de agua produce un incremento en la humedad,
36
favoreciendo el óptimo desarrollo del hongo. El agua es esencial para la absorción
de nutrientes que necesita el micelio (Stamets y Chilton, 1983).
Los niveles altos de humedad son necesarios durante la etapa de fructificación
para reducir evaporación del sustrato, de tal modo que se promueva la formación
de los primordios. El mejor crecimiento de los carpóforos puede correlacionarse
con la alta humedad atmosférica y el crecimiento micelial cambia
considerablemente con el contenido de agua del sustrato (Shoji, 1998).
2.9. APLICACIONES Y USOS DE LA Psilocibina
Algunas de las principales aplicaciones y usos de la Psilocibina se han dado en los
Estados Unidos, donde la FDA aprobó a partir del 2001 varios estudios sobre su
uso.
En el campo de la medicina se presentan varios usos, muchos de ellos publicados
por MAPS (Multidiciplinary Association for Psychedelic Studies es una revista que
ha publicado diferentes estudios acerca del uso y los beneficios de Psilocibina),
los cuales describen tratamientos realizados a pacientes con cáncer, además
han publicado estudios en efectos de la cognición para mejorar los conocimientos
adquiridos a partir de la percepción, estimulando el desarrollo de la creatividad. Y
estudios sobre tratamientos psicofarmacológicos en el control de prisioneros de la
cárcel Concord en Massachusetts para evitar la reincidencia de ellos (Perrine,
1999)
Otro uso de la Psilocibina se realizó por parte del psiquiatra Charles Grob quien
lideró un proyecto en el Harbor-UCLA Medical Center, donde suministraba a
pacientes enfermos terminales de cáncer distintas dosis de Psilocibina, Grob
observó que los pacientes redujeron su ansiedad, mejorando el ánimo y logrando
en ellos una mayor aceptación de su situación médica (Moreno y Delgado, 1997).
En el campo de la psiquiatría, el uso de la Psilocibina se remonta al año de 1962
en una institución psiquiátrica en Long Beach, California. Se usó Psilocibina para
tratar niños afectados con esquizofrenia y autismo infantil, los resultados en los
pacientes fueron de mejor comportamiento y aceptación social (Gary, 1997).
37
2.10. ESTADO DEL ARTE
Las especies de hongos del género Psilocybe originarios de Nepal, no han sido
muy estudiadas; sin embargo las demás especies de la región se han venido
estudiado desde comienzos del siglo XVIII (Berkeley, 1854). El estudio realizado
de las diferentes especies de Psilocybe fueron exploradas en diferentes
localidades:
Koradi ubicada en el norte cerca al Tibet, la cual presenta una región de
zona templada.
Kathmandú ubicada en el centro del país y Dhulikhel ubicada al este de
Kathmandú, presentan clima húmedo subtropical.
Royal Chitwan Nacional Park en el sur cerca de la India, presenta un clima
tropical considerado evergreen forest.
De las localidades mencionadas, solamente se encontró el género Psilocybe en
Dhulikhel y Chitwan Park, donde se realizaron diferentes estudios a las especies
Psilocibicas. Se estudió la longitud, el ancho y espesor de las esporas y la
actividad psicotrópica de los hongos (figura 4).
Las especies Psilocibicas estudiadas fueron: Psilocybe percevali,
P. pseudobullacea y P. cubensis. Los resultados arrojados por la investigación
certifican que el P. cubensis posee actividad alucinógena y efectos psicoactivos
(Kasuya y Guzmán, 2004).
El incremento de la popularidad de los hongos mágicos, se debe al fácil acceso
que hay para adquirir hongos con propiedades psicoactivas en el mercado negro,
a los kits de cultivo que se encuentran vía internet y a las tiendas de recreación
ubicadas en Europa. La Psilocibina se ha convertido en una herramienta
importante para estudios neurobiológicos de los estados de alteración de la
conciencia. Un incremento en el número de publicaciones científicas han renacido
de la investigación con Psilocibina debido a sus “modelos sicóticos” ya que
38
algunos estudios han investigado las propiedades farmacocinéticas de la
Psilocibina en humanos (Hasler y Bourquin, 2002).
El estudio clínico reportado en el artículo “Renal excretion profiles of Psilocin
following oral administration of Psilocybin: a controlled study in man”, fue aprobado
por el comité del hospital universitario de psiquiatría en Zürich, la administración
de la Psilocibina fue controlada y autorizada por la oficina federal Suiza de salud
pública y las personas seleccionadas fueron sometidas a estudios psiquiátricos
para asegurar que no tuvieran registro de parientes con desordenes psiquiátricos
o adicciones a las drogas (Hasler y Bourquin, 2002). En el proceso de desarrollo,
los médicos suministraron Psilocibina por vía oral en dosis de 212±25 µg/Kg de
peso corporal. La investigación observó que el cuerpo posee la capacidad de
degradar la Psilocibina a Psilocina, ésta se reduce a un aldehído el cual se
descompone formando 2 metabolitos debido a una de-aminación (4-hydroxyindol-
3-yl-acetic acid) y una oxidación (4-hydroxytryptophol) (figura 10). (Hasler y
Bourquin, 2002).
39
Figura 10. Descomposición de Psilocibina en el cuerpo humano (Hasler y
Bourquin, 2002).
El análisis para definir los efectos que posee la Psilocibina en los humanos, se
realizó por medio de la recolección de la orina de los voluntarios; donde por medio
de un estudio HPLC (figura 11) se cuantificó la cantidad de Psilocina presente en
las excreciones urinarias (Hasler y Bourquin, 2002).
Figura 11. HPLC-ECD Determinación de Psilocina (Hasler y Bourquin, 2002).
Este estudio permitió conocer que a dosis entre 10 a 18 mg de Psilocibina, se
induce a estados alterados de conciencia. Luego de 60 minutos de haberse
suministrado la droga, los voluntarios experimentaron cambios en la percepción
sensorial afectando el humor, alteraciones en la percepción del tiempo y el
espacio, ilusiones visuales y alucinaciones. Las dosis de Psilocibina utilizadas en
el estudio fueron toleradas por los voluntarios, los cuales presentaron pocas
reacciones adversas tales como nauseas y mareos lo que lleva a concluir que la
Psilocibina es totalmente segura para usos experimentales en individuos
saludables (Hasler y Bourquin, 2002).
40
El artículo “The effects of consciousness-expanding drugs on prisoner
rehabilitation” describe como desde 1960 se realizaron estudios acerca del uso de
“Hongos Mágicos” para el tratamiento de enfermedades psiquiátricas y
psicológicas. Uno de los proyectos y el más importante fue realizado por
estudiantes de la Universidad de Harvard, el cual inició en el Instituto Correccional
Concord Massachusetts donde se pretendía realizar una investigación detallada
acerca de los efectos de la conciencia con el uso de dosis de Psilocibina en
prisioneros (Leary, 1969).
En Marzo de 1961 se dió inicio al estudio de los efectos de la Psilocibina en
prisioneros de la correccional de Concord, éste estaba conformado por seis
prisioneros voluntarios y dos estudiantes de la Universidad de Harvard. A todos los
participantes se les suministró 20 mg del hongo mágico, incluyendo a los
estudiantes de Harvard ya que uno de los requisitos para llevar a cabo el estudio
fue que personal de la universidad participara en el desarrollo del proyecto para
asegurar que el uso de la Psilocibina era totalmente seguro y no era perjudicial
para la salud. Los participantes reportaron experimentar un incremento de los
sentidos, en la vista y el oído. (Leary, 1969).
Después de seis meses de tratamiento los prisioneros cambiaron de actitud
presentando un decrecimiento en la conducta hostil, cinismo, delincuencia e
irresponsabilidad, tomando además un comportamiento mucho más maduro y
social. El proyecto tuvo una duración de dos años, en donde participaron 168
personas de las cuales 131 eran reclusos y 37 personal de la Universidad de
Harvard; los cuales luego del suministro de la droga no presentaron ningún
episodio de violencia ni efectos negativos en la salud física o mental lo cual
confirma que los efectos de la Psilocibina en bajas concentraciones tiene efectos
positivos y satisfactorios (Leary, 1969).
41
3. METODOLOGIA
3.1. PROPAGACIÓN DE LA CEPA
Se realizó la inoculación de la cepa proporcionada por el cepario de la Universidad
Católica de Oriente ubicado en el Laboratorio de Micologia, en agar extracto malta
(MEA). La cepa se aisló en la cámara de flujo laminar en donde se inoculó una
muestra de 1x1cm del micelio del hongo en cajas Petri con 20ml de MEA
obteniéndose la réplica de la cepa del P. cubensis (figura 12).
El crecimiento radial micelial de la cepa en las cajas Petri presentó colonización
total alrededor de 15 días. Estas se mantuvieron en incubadora a una temperatura
de 27ºC.
Figura 12. Cepa P. cubensis
3.2. OBTENCIÓN DEL MICELIO DE SIEMBRA (SEMILLA DEL HONGO)
Para la obtención del micelio de siembra se inocularon pellets que se produjeron a
partir de medio líquido (extracto de malta), este medio líquido se preparó con 100
ml de agua destilada y 2 g de extracto de malta en 6 erlenmeyer en los cuales se
inocularon con 5 cuadros de 1x1 cm de la cepa obtenida previamente, en cada
erlenmeyer (figura 13).
42
Figura 13. Preparación medio líquido extracto de malta e inoculación de
pellets
Los erlenmeyers se mantuvieron en el sheaker por 10 días a 27ºC y 150 rpm
hasta observar la formación de abundantes pellets (figura 14).
Figura 14. Obtención de pellets
Posterior a la obtención de los pellets, se procedió a la inoculación de éstos en
trigo, el cual fue previamente esterilizado y se utilizó en proporciones de 600 g en
400 ml de agua en bolsas de polipropileno, las bolsas con el trigo se llevaron al
autoclave a 121°C y 15 psi por dos horas, con una humedad del 50%, en base
húmeda (figura 15).
43
Figura 15. Preparación de semilla
El día posterior a la esterilización, se inocularon las bolsas con trigo con los pellets
que fueron obtenidos en el medio líquido. Este procedimiento se realizó en la
cámara de flujo laminar con los debidos cuidados de esterilización; las bolsas se
mantuvieron en la incubadora a una temperatura de 27°C, hasta observar en ellas
la colonización total del sustrato de trigo por el micelio del hongo; este proceso
tuvo una duración aproximada de 12 días (figura 16).
Figura 16. Colonización de semilla
44
3.3. OBTENCIÓN DE LOS CUERPOS FRUCTIFEROS
Se utilizó triptamina como precursor químico en el desarrollo del proyecto ya que
esta sustancia es la única que se encontró reportada en la literatura por Gartz
(1989), debido que al utilizar 25 mg de triptamina en 10 g de sustrato se
incrementa en un 3,3% la cantidad de alcaloide presente en el hongo (Psilocibina).
Los medios de cultivo que se utilizaron se dispusieron en bolsas de polipropileno y
cajas plásticas respectivamente. Esto se debe a que el compost de champiñón
tiene un comportamiento más eficiente en bolsas, el cual ha sido demostrado
experimentalmente y es la forma más común en la que se utiliza comercialmente
dicho sustrato. Por su parte el sustrato de trigo se dispuso en cajas, ya que debe
tener una cobertura; la cobertura le garantiza una alta humedad al sustrato, lo cual
permite la formación de los cuerpos fructíferos del hongo (Steineck, 1987).
3.3.1. Siembra en sustrato de trigo
Para la obtención de los cuerpos fructíferos, se esterilizaron 12 bolsas de
polipropileno con 300 g de trigo en 200 ml de agua cada una por dos horas en
autoclave. En el trigo esterilizado se inocularon 50 g de semilla, la cual
previamente se mezcló con el precursor químico, esta mezcla fue sembrada en las
cajas plásticas (25 cm de largo, 19 cm de ancho y 11 cm de profundidad) las
cuales se limpiaron con peróxido, para disminuir los riesgos de contaminación en
el área de siembra. Todo el procedimiento se realizó en la cámara de flujo laminar
de la Universidad Católica de Oriente.
3.3.2. Siembra en compost de champiñón
El compost de champiñón no fue sometido a ningún tipo de esterilización, debido a
que este se encontraba pasteurizado. La siembra se realizó en bolsas de
polipropileno (40 cm de largo por 30 cm de ancho) con 500 g de sustrato el cual
presentaba una humedad de 65%. De igual forma que el experimento en trigo el
precursor químico fue mezclado con la semilla y posteriormente inoculado en el
sustrato. Las bolsas fueron cerradas con aros de PVC, servilletas y resortes, lo
cual permite la liberación del CO2 presente en el compost de champiñón, debido a
que este puede inhibir la colonización de la semilla en el sustrato (figura 17).
45
Figura 17. Siembra en compost de champiñón
El compost de champiñón está compuesto por: bagazo de caña, tamo de arroz
(cascarilla) y pollinaza.
A partir de un diseño de experimentos de dos factores (sustratos sólidos y
precursor químico), con dos niveles para el primer factor y 4 niveles para el
segundo factor, se encuentra un total de 8 tratamientos (tabla 6) los cuales se
realizaron por triplicado para un total de 24 tratamientos.
Tabla 6. Diseño de experimentos para obtención de cuerpos fructíferos
Tratamiento Factor
Sustrato trigo Compost champiñón Triptamina
1 500 g 500 g 0 g
2 500 g 500 g 1.0 g
3 500 g 500 g 2.0 g
4 500 g 500 g 3.0 g
Posterior a la siembra en los sustratos sólidos realizada a partir del diseño de
experimentos, los tratamientos fueron llevados al cuarto de incubación de la UCO,
donde la humedad relativa es alrededor de 75% y una temperatura promedio de
46
17ºC. La colonización completa del sustrato tardó un mes, la cual comparada con
la literatura fue lenta (figura 18).
Figura 18. Diseño de experimentos sin cobertura
Transcurrido el mes se procedió a colocar la cobertura (compuesta de tierra y
Carbonato de Calcio) que ayuda al desarrollo del hongo y la aparición de los
primeros carpóforos, debido a que ésta protege el micelio de la desecación,
proporciona una reserva de agua para el desarrollo de los primordios y favorece el
crecimiento de la microflora especial que estimula el proceso de fructificación
(Pacioni, 1990). La cobertura se utilizó con un espesor de 1cm (figura 19) en
ambos sustratos. Los tratamientos fueron regados día por medio con abundante
agua para mantener la cobertura húmeda. Transcurridos 15 días no se observó la
aparición de carpóforos debido a que todos los tratamientos incluídos los testigos
presentaron contaminación total y aparición de insectos en ambos sustratos (figura
20).
47
Figura 19. Sustrato de trigo y compost de champiñón con cobertura
Figura 20. Contaminación bacteriana en sustrato de trigo y compost de
champiñón
3.4. DISEÑO DE EXPERIMENTOS Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Debido a la contaminación presente en los sustratos sólidos, se realizaron
nuevamente los ensayos con una variación en el diseño de experimentos respecto
a la cantidad de triptamina utilizada (0.1, 0.2 y 0.4 g) que equivale a porcentajes
de concentraciones de 0.03%, 0.06% y 0.13% respectivamente, puesto que en el
diseño de experimentos anterior se comprobó que la cantidad de triptamina
utilizada en los tratamientos actuó como inhibidor de crecimiento del micelio por lo
cual no se obtuvieron cuerpos fructíferos, teniendo en cuenta además la
contaminación presente en los sustratos.
El nuevo diseño de experimentos de 2 factores (sustratos sólidos y precursor
químico), con 2 niveles para el primer factor y 4 niveles para el segundo factor, se
48
encuentra un total de 8 tratamientos (tabla 7) los cuales también se realizaron por
triplicado.
Tabla 7. Nuevo diseño de experimentos para obtención de cuerpos
fructíferos
Tratamiento Factor
Sustrato trigo Compost champiñón Triptamina
1 300 g 300 g 0 g
2 300 g 300 g 0.1 g
3 300 g 300 g 0.2 g
4 300 g 300 g 0.4 g
Los tratamientos se prepararon con la misma cantidad de semilla (50 g lo que
equivale a una tasa de inoculación del 10%). La adición del precursor químico se
realizó directamente en los sustratos sólidos porque en los tratamientos anteriores
se notó un retraso en la propagación del micelio del hongo en los sustratos debido
a la mezcla de la semilla con el precursor. Se utilizaron 300 g de sustrato ya que
se disminuyó la concentración del precursor (Triptamina) y por ello se requirió una
menor cantidad de este.
En el nuevo diseño de experimentos ambos sustratos se sembraron en cajas. En
el compost de champiñón se observó una colonización completa transcurrido un
mes, mientras que en el sustrato de trigo se presentó contaminación aparente del
hongo Penicillium, dicha contaminación pudo haber sido causada por la edad del
micelio de siembra (aproximadamente 2 meses de almacenamiento) (figura 21).
Figura 21. Tratamientos contaminados con Penicillium en sustrato de trigo
49
La inoculación de la semilla en el compost de champiñón se realizó en el
laboratorio de micología de la UCO libre de viento y rodeado de mecheros para
evitar la presencia de microorganismos en el ambiente. Se observó la colonización
completa del micelio en el sustrato transcurrido un mes y se procedió a colocar la
cobertura en los tratamientos. Esta se preparó en un recipiente con poca cantidad
de agua y se adicionó una pequeña capa (2 mm de espesor) que cubriera
solamente la superficie de los tratamientos (figura 22).
Figura 22. Adición de cobertura en tratamientos de compost de champiñón
Los tratamientos se regaron diariamente con poca agua, manteniendo la humedad
del sustrato. La aparición del primer carpóforo se presentó a los 13 días luego de
la adición de la cobertura (figura 23).
Figura 23. Aparición de capóforos
50
El análisis estadístico se realizó por medio del Software Statgraphics plus 5.1
basado en un análisis de varianza (ANOVA). Fue necesario realizar un ajuste en el
software al momento de ingresar los factores del diseño debido a la contaminación
masiva del sustrato de trigo se cambió la clase factorial de múltiple nivel por la
categoría de factorial simple. Este modelo se denomina análisis de Varianza de
clasificación en un sentido porque solo se investiga un factor. Además se requiere
que el experimento se realice en orden aleatorio, de manera que el medio
ambiente en el que se usan los tratamientos (llamados a menudo unidades
experimentales) sea lo más uniforme posible. Por lo tanto, este diseño
experimental es completamente aleatorizado (Montgomery, 1991).
Variables de respuesta
Las variables cuantitativas determinadas fueron:
Eficiencia biológica (EB): Esta unidad de medida da una información
precisa cuando se tiene el sustrato ya esterilizado en los bloques
respectivos. Igualmente constituye la base para establecer el rendimiento
(Leatham y Stalham, 1987).
100coscos
húmedosustratodeg
echadosfreshongosdegBIOLÓGICAEFICIENCIA
Rendimiento: Da idea del área que se necesita para mantener una
cantidad determinada y constante de producción. Esta medida permite
establecer los cálculos teóricos para una producción a escala (Leatham y
Stalham, 1987).
2
cos
cmhumedosustratoelporocupadaÁrea
freshongosgORENDIMIENT
Precocidad de colonización: Es el tiempo transcurrido entre el día de la
inoculación de la semilla en el sustrato y el día en que aparecen los
primeros carpóforos (primordios) (Leatham y Stalham, 1987).
51
Cuantificación del alcaloide: Da idea de la cantidad de alcaloide
presentes en las muestras obtenidas en la extracción realizada en el
ultrasonido y evaluadas en el HPLC (Dellacassa, 2002).
SIiónConcentracSIÁrea
AlcaloideÁreaALCALOIDEIÓNCONCENTRAC
Donde SI es estándar interno
3.5. RECOLECCIÓN DE CUERPOS FRUCTIFEROS
La recolección de los cuerpos fructíferos se realizó pasados 7 días de la primera
aparición de los primordios en el compost de champiñón. Los hongos se
colectaron mediante un corte transversal cerca de la base inferior del mismo
(figura 24), sin que las hifas del hongo se vean afectadas, en caso que se desee
obtener segundas cosechas. Los especímenes colectados se dejaron secar por 4
días al aire libre y en oscuridad permanente, debido a que la luz del sol puede
llegar a oxidar la Psilocibina presente en el hongo (Anastos et al., 2005).
Figura 24. Recolección de cuerpos fructíferos en compost de champiñón
52
3.6. EXTRACCIÓN DE LA PSILOCIBINA
La técnica que se utilizó para extraer la Psilocibina, se encuentra reportada en el
artículo “Hongos Alucinógenos en el Mercado Alemán. Simples Instrucciones para
la Examinación e Identificación” de la revista Forensic Science International por
Musshoff, F. Madea, B. Beike , J. 2000. El cual describe un método poco
tradicional en el que utilizan el ultrasonido como método de extracción.
El método propuesto consiste en triturar 100 mg de hongo seco y adicionarle 9 ml
de metanol. La mezcla es llevada al ultrasonido por 120 minutos a una
temperatura máxima de 50ºC, luego la mezcla es filtrada y el clarificado es llevado
al HPLC para la respectiva identificación y cuantificación de Psilocibina presente
en la muestra. La columna utilizada es LiChrospher 60RP-select B (250X4mm,
5μm), el solvente A consiste en 20 mM de KH2PO4 y el solvente B es acetonitrilo.
(Musshoff, F. et al., 2000).
Para la extracción realizada se utilizaron 2,8 g de hongo seco en 50 ml de
metanol, debido a que en ensayos previos se comprobó que con la cantidad
reportada en el artículo, el metanol se evaporaba completamente sin obtener
ningún resultado en la extracción del alcaloide de interés (figura 25).
Figura 25. Cromatografía de extracción de la Psilocibina de P. cubensis
(Musshoff, F. et al., 2000).
53
3.7. EVALUACIÓN DE LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
El método que se utilizó para realizar la evaluación cualitativa de la presencia de
Psilocibina fue la cromatografía de capa fina, utilizando como agente revelador el
reactivo de Dragendorff, la cual da positiva a la presencia del alcaloide mostrando
una coloración naranja-marrón.
Figura 26. Presencia de Psilocibina en cuerpos fructíferos
Otro método para determinar la presencia de Psilocibina es directamente sobre el
hongo; se hace una presión fuerte en el pie o estípite (magulladura) revelando una
coloración azul típica de la presencia de Psilocibina en el hongo (figura 26).
54
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS
4.1. SUSTRATO DE TRIGO
El micelio del hongo fue colonizando el sustrato correctamente durante la primera
semana después de haberlo inoculado y posteriormente se observó contaminación
en todos los tratamientos, la cual fue progresiva en el tiempo. Por esta razón se
descartó el sustrato, puesto que no se observó posibilidad alguna de propagación
del micelio debido a su alta cantidad de contaminantes (figura 21).
Todos los grupos de contaminación descritos en el marco teórico se presentaron
en el desarrollo del diseño de experimentos, por tal motivo no se obtuvieron
cuerpos fructíferos y ningún tipo de resultado positivo en la utilización del sustrato
de trigo. A pesar de los problemas presentados el sustrato resultó siendo el
adecuado para la obtención del micelio ya que hubo una colonización completa en
dicho procedimiento y sin rasgos de contaminación.
Aunque la literatura reporta que el sustrato de trigo es adecuado para obtener
cuerpos fructíferos de P. cubensis por su alto contenido de nutrientes y su bajo
riesgo de contaminación, en este caso el resultado fue contrario a lo esperado. La
contaminación pudo deberse a una inadecuada esterilización del sustrato y de los
materiales utilizados para la siembra o a microorganismos presentes en la cámara
de flujo laminar debido a un bajo mantenimiento de ésta puesto que los ensayos
se realizaron varias veces presentando todos los mismos agentes de
contaminación.
La contaminación del sustrato no permitió obtener los suficientes resultados para
determinar las variables de respuesta (eficiencia biológica, rendimiento,
precocidad de colonización y cantidad de alcaloide), que solo se pueden medir
después de la cosecha, compararlas estadísticamente y determinar el mejor
tratamiento.
55
4.2. COMPOST DE CHAMPIÑÓN
El compost de champiñón, previamente desinfectado por pasteurización, produjo
carpóforos en la mayoría de los tratamientos, excepto 2 réplicas de testigos (0 g
de triptamina) y en una réplica con 0.4 g de triptamina; por tal razón se puede
afirmar que éste sustrato es adecuado para obtener cuerpos fructíferos del hongo
P. cubensis (tabla 9).
4.2.1. Crecimiento de cuerpos fructíferos en el tiempo
Aparte de realizar los análisis estadísticos a cada una de las variables de
respuesta evaluadas, se efectuó un estudio adicional para observar la incidencia
que tiene el precursor químico en el crecimiento del estípite y el píleo. Para esto
se escogió de cada tratamiento un hongo al azar, al cual se le realizaron
mediciones de estípite y píleo con el fin de observar el crecimiento durante 7 días,
tiempo en el cual el hongo presenta la mayor cantidad de alcaloide y se encuentra
en etapa de adultez (gráficos 1 y 2).
Gráfico 1. Crecimiento de estípite en el tiempo
En el gráfico 1 se observa el comportamiento del crecimiento del estípite de los
hongos seleccionados de cada tratamiento, en el tiempo. Se aprecia que la
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3 4 5 6 7
Estí
pit
e (m
m)
Crecimiento de Estípite vs Tiempo
Estípite testigo
Estípite 0.1 g
Estípite 0,2 g
Estípite 0,4 g
56
pendiente del hongo del estípite, del tratamiento 0.4 g de triptamina es menor,
mientras que las demás pendientes tienen un comportamiento muy similar. La
causa de este retraso, comparado con los demás tratamientos, puede deberse a la
cantidad de triptamina utilizada, pues se ha observado a lo largo de la
investigación que a mayor cantidad de triptamina, el crecimiento es mucho más
lento.
Gráfico 2. Crecimiento de píleo en el tiempo
En el gráfico 2 las pendientes muestran un comportamiento diferente comparado
con el gráfico 1. El comportamiento de las pendientes muestran el resultado y el
crecimiento del píleo de los hongos elegidos en los diferentes tratamientos, así
mismo se puede observar que los tratamientos de 0.2 y 0.4 g de triptamina
presentan un menor crecimiento en el tiempo comparado con los hongos de los
tratamientos de testigo y 0.1 g de triptamina; esto es causado por la cantidad de
precursor químico utilizado en cada uno de los tratamientos.
Para poder determinar el mejor tratamiento en el crecimiento del hongo se calculó
la velocidad de crecimiento en el estípite y en el píleo (mm/día), teniendo en
cuenta que los datos tomados corresponden a la fase exponencial o de
crecimiento (tabla 8).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 2 3 4 5 6 7
Dia
met
ro p
íleo
(m
m)
Tiempo (Días)
Crecimiento de Sombrerillo vs Tiempo
Píleo Testigo
Píleo 0,1 g
Píleo 0,2 g
Píleo 0,4 g
57
Tabla 8. Velocidad de crecimiento en los tratamientos
Tratamiento
Pendiente=Velocidad
de crecimiento
estípite (mm/día)
Pendiente=Velocidad
de crecimiento píleo
(mm/día)
Testigo 2.453 0.964
0.1 g 2.014 1.11
0.2 g 1.814 0.867
0.4 g 1.175 0.982
La tabla 8 corresponde a las pendientes (velocidad de crecimiento) mostradas en
los gráficos 1 y 2. Se observa que el mejor tratamiento es el hongo analizado del
testigo debido a su mayor crecimiento (durante 7 días) en estípite 2.543 mm/día y
en el píleo 0.964 mm/día. Lo cual nos da una idea de que a mayor cantidad de
precursor químico utilizado, menor es la velocidad de crecimiento de los cuerpos
fructíferos puesto que la energía se utiliza para producir mayor cantidad de
metabolito secundario (Psilocibina).
4.2.2. Variables cuantitativas evaluadas en la producción de cuerpos
fructíferos
Se obtuvo cosecha en todos los tratamientos más no en todas las réplicas de los
tratamientos, arrojando las variables de respuestas mostradas en la tabla 9.
58
Tabla 9. Eficiencia biológica, Rendimiento y Precocidad de colonización para
los tratamientos con cosecha
Variables
de
Respuesta
Testigo 0.1 g de Triptamina
Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 1 Réplica 2 Réplica3
Eficiencia
Biológica
(%)
0 7.24 0 8.17 3.33 2.00
Rendimiento
(g/cm2) 0 0.10 0 0.11 0.05 0.03
Precocidad
de
Colonización
(días)
0 40 0 37 39 41
Tamaño de
píleo (mm) 0 7.7 0 8.4 6.9 8
Variables
de
Respuesta
0.2 g de Triptamina 0.4 g de Triptamina
Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Eficiencia
Biológica
(%)
8.00 5.00 11.67 3.67 3.67 0
Rendimiento
(g/cm2) 0.11 0.07 0.16 0.05 0.05 0
Precocidad
de
Colonización
(días)
40 40 40 39 40 0
Tamaño de
píleo (mm) 6.3 7.1 5.9 7.2 6.1 0
59
Tabla 10. Promedio de los tratamientos para las variables de respuesta
Variables
de
Respuesta
Testigo 0.1 g de
triptamina
0.2 g de
triptamina
0.4 g de
triptamina
Eficiencia
Biológica
(%)
7.24 4.50 8.22 2.44
Rendimiento
(g/cm2) 0.10 0.06 0.12 0.03
Precocidad
de
Colonización
(días)
30.00 39.00 40.00 26.33
El promedio realizado a los diferentes tratamientos con respecto a las variables de
respuesta (tabla 10), muestra que el tratamiento con 0.2 g de triptamina presentó
mayor eficiencia biológica y rendimiento comparados con los demás tratamientos.
Esto puede deberse a que todas las réplicas del tratamiento con 0.2 g de
triptamina presentaron cuerpos fructíferos. También la variación de los resultados
obtenidos en los promedios pueden ser causados por el comportamiento de cada
réplica ya que no todas presentaron aparición de carpóforos ni la misma cantidad
de cuerpos fructíferos por área de sustrato en el mismo período de tiempo.
4.2.3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA LOS TRATAMIENTOS
4.2.3.1. Tamaño de píleo
El análisis de varianza obtenido para el tamaño de píleo (anexo 1), arroja un valor
de F (1.74) y P (0.2355) lo que indica que no existen diferencias significativas
(p>0.05), es decir, los tratamientos no influyen en el tamaño del píleo para las
diferentes concentraciones de triptamina utilizadas.
Los tamaños de píleo reportados por Musshoff, F. et al., (2000) están entre 4-15
cm., Kasuya y Guzmán (2004) obtuvieron carpóforos con píleos de 4-8 cm y los
60
reportados por Tsujikawa et al., (2003) fueron de 2,6-11,5 cm. Estos valores
ubican los tratamientos reportados, dentro del rango de tamaño de píleo
especificados en la literatura.
Por su parte, el análisis de varianza arrojado por el software para la precocidad de
colonización (anexo 3), igual que en el tamaño del píleo indica que no existen
diferencias significativas (p>0.05) es decir, que los tratamientos no influyen en el
tamaño del píleo ni la precocidad de colonización.
Los valores P para el tamaño del píleo (0.2355) y la precocidad de colonización
(0.2279) son el resultado de la similitud de los datos para los tratamientos
evidenciados en los intervalos LSD (anexos 2 y 4).
4.2.3.2. Precocidad de colonización
Los resultados evidenciados en el anexo 4 para la precocidad de colonización
muestran que los tratamientos presentaron aparición de los primeros carpóforos
en tiempos muy similares. El gráfico 7 muestra una similitud en los tratamientos de
0.1 y 0.2 g de triptamina debido a que se presentaron carpóforos en todas las
réplicas realizadas mientras que los tratamientos testigo y 0.4 g de triptamina no
presentaron carpóforos en todas sus réplicas (tabla 9). También se evidenció que
la colonización completa del micelio en el sustrato se presentó 30 días después de
la inoculación de la semilla. Este período de tiempo es mucho mayor comparado
con el reportado en la literatura por Stamets y Chilton (1983), en el cual los
resultados se dan a los 15 días de haber inoculado la semilla lo que retardó aun
más la aparición de los primeros carpóforos. Finalmente la precocidad de
colonización de los tratamientos en este trabajo tuvo una duración alrededor de 40
días. Este retraso se debe a que la triptamina actúa como inhibidor, prolongando
el crecimiento del micelio y la formación de los cuerpos fructíferos.
61
Gráfico 3. Tiempo promedio de precocidad de colonización para los
tratamientos
En el gráfico 3 se observa que el promedio de los tratamientos de 0.1 y 0.2 g de
triptamina presentan un comportamiento similar, esto se debe a que todas las
réplicas de ambos tratamientos mostraron aparición de carpóforos en periodos de
tiempos similares. Se observa un comportamiento diferente en el promedio de los
tratamientos testigo y 0.4 g de triptamina debido a que no todas las réplicas
exhibieron aparición de carpóforos por lo que se observa una diferencia
significativa entre los tratamientos de testigo-0.4 g y 0.1-0.2 g de triptamina.
4.2.3.3. Rendimiento
Para la variable rendimiento se encuentran algunas diferencias en los resultados
obtenidos (tabla 9). Los rendimientos de los tratamientos testigo (anexo 5) se
observan que solamente se obtuvo cosecha de hongos en una caja (réplica 2)
dando como resultado 0.10 g de hongos frescos cosechados/cm2 de área ocupada
por el sustrato húmedo, así mismo en el tratamiento de 0.1 g de triptamina se
obtuvieron cuerpos fructíferos en todas las cajas experimentales dando como
resultados 0.11 (réplica 1), 0.05 (réplica 2), 0.03 (réplica 3) g de hongos frescos
cosechados/cm2 de área ocupada por el sustrato húmedo (anexo 6), de igual
forma en el tratamiento de 0.2 g de triptamina (anexo 7) se obtuvieron cosechas
en todas las cajas con resultados de rendimiento de 0.11 (réplica 1), 0.07 (réplica
2) y 0.16 (réplica 3) g de hongos frescos cosechados/cm2 de área ocupada por el
0
10
20
30
40
50
Testigo 0.1 g de Triptamina
0.2 g de Triptamina
0.4 g de Triptamina
día
s
Cantidad de precursor
Tiempo promedio de precocidad de colonización
62
sustrato húmedo y en el tratamiento de 0.4 g de triptamina (anexo 8) solamente se
obtuvieron cosechas en dos réplicas presentando un rendimiento igual de 0.05 g
de hongos frescos cosechados/cm2 de área ocupada por el sustrato húmedo en
cada una de las réplicas. Los tratamientos que reportaron los rendimientos más
altos son aquellos que presentaron una mayor cantidad de cuerpos fructíferos en
el área ocupada por el sustrato húmedo, esto confirma que los mejores
tratamientos por replica en rendimiento son los que utilizaron 0.1 y 0.2 g de
triptamina (gráfico 4).
Gráfico 4. Rendimiento promedio para los tratamientos
En el gráfico 4 no existen diferencias significativas entre los tratamientos del
testigo y 0.4 g de triptamina debido a que en éstos no se presentaron cuerpos
fructíferos en algunas de sus réplicas; ocurre lo contrario con los tratamientos de
0.2 y 0.4 g de triptamina porque éstos si presentaron un crecimiento micelial y
aparición de cuerpos fructíferos en todas sus réplicas, por lo cual se confirma el
estudio realizado previamente donde los tratamientos de 0.1 y 0.2 g de triptamina
muestran un mayor rendimiento comparado con los demás.
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
Testigo 0.1 g de Triptamina
0.2 g de Triptamina
0.4 g de Triptamina
g h
on
gos
cose
chad
os/
cm
2
Cantidad de precursor (g)
Promedio de rendimiento
63
4.2.3.4. Eficiencia biológica
Para la eficiencia biológica los mejores resultados obtenidos, igualmente que para
el rendimiento, fueron los de los tratamientos de 0.1 y 0.2 g de triptamina, con 4.50
y 8.22% respectivamente (tabla 10), ya que esta variable (eficiencia biológica)
constituye la base para establecer el rendimiento y por ende conocer cuál es la
cantidad de triptamina más adecuada que favorezca el crecimiento del hongo.
Igual que en el estudio realizado en el promedio del rendimiento del tratamiento de
testigo, este presenta un resultado poco preciso debido a que solo se obtuvieron
resultados en una de las tres réplicas.
Para las variables rendimiento y eficiencia biológica, no se encuentra una
diferencia significativa (anexos 9 y 11). Los valores que se sobreponen logran que
el valor P arrojado (0.1713 y 0.1853) permita asegurar con un 95% de
confiabilidad que los tratamientos no influyen en el rendimiento ni en la eficiencia
biológica.
4.3. ESTUDIO CUALITATIVO DE LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
Posterior a la recolección de los hongos se realizó el procedimiento de extracción
del alcaloide por medio del ultrasonido de la Universidad EAFIT. A las muestras
obtenidas de la extracción se les realizó el análisis cualitativo de presencia de
alcaloide con el reactivo de Dragendorff que reaccionó y tomó una coloración
marrón-naranja al entrar en contacto con las muestras (anexo 13 y 14).
4.4. ESTUDIO CUANTITATIVO DE LA PRESENCIA DE PSILOCIBINA
Una vez detectada la presencia de Psilocibina, gracias a la coloración naranja
presentada en las muestras analizadas, se procedió a realizar la técnica de
Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) con el fin de hallar la cantidad del
compuesto de interés basado en las áreas obtenidas de los cromatogramas y la
concentración utilizada en el estándar interno lo que corresponde al estudio
cuantitativo de cantidad de Psilocibina presente en las muestras.
El estándar interno que se utilizó para realizar la cuantificación del alcaloide
Psilocibina fue cafeína (trimetil 1,3,7 xantina) (figura 27) , en proporciones de 25
64
ppm y se adicionó en una relación 1:1 con la muestra de interés para el análisis en
el HPLC.
Figura 27. Estructura química de la cafeína (Arango, 2002).
Para el estándar interno de cafeína pura se realizó una corrida en el HPLC con las
mismas condiciones y características con las que se evaluaron las muestras de
extracción de los diferentes tratamientos. Esta corrida se realizó con el objetivo de
observar el tiempo de retención y el área presentada por la muestra de cafeína
(anexo 16), obteniéndose un tiempo de retención de 12.828 min con un área de
1239.9 mm2.
Los tratamientos de testigo, 0.1, 0.2 y 0.4 g de triptamina se sometieron a un
análisis de HPLC utilizando el método descrito por Musshoff, F. et al., (2000). Los
resultados obtenidos fueron satisfactorios ya que el tiempo de retención del
alcaloide Psilocibina se dio de 4 a 6 minutos (tabla 11) tal y como se muestra en el
Cromatograma (figura 25) planteado por el autor.
65
Tabla 11. Áreas y tiempos de retención obtenidos de los cromatogramas por
tratamiento
Tratamientos
Área de
Psilocibina
(mm2)
Tiempo de
retención (min)
Testigo 497.30 4.726
0.1 g de
triptamina 550.20 5.198
0.2 g de
triptamina 1316.70 4.792
0.4 g de
triptamina 1381.00 4.769
Los resultados de los cromatogramas (anexos 17, 18, 19, 20) muestran una
diferencia en sus áreas, esto se debe a que los tratamientos fueron sometidos a
diferentes cantidades de precursor químico, lo cual se puede observar en los
cromatogramas donde hubo un aumento de los picos de las áreas
correspondientes al alcaloide Psilocibina.
El precursor químico utilizado (triptamina) arrojó el resultado esperado, puesto que
al realizar la cuantificación del alcaloide Psilocibina en los tratamientos por medio
del estándar interno (cafeína), se obtuvo un aumento en su concentración. Los
resultados confirman lo reportado en la literatura por Gartz (1989) ya que a mayor
cantidad de triptamina utilizada mayor cantidad de alcaloide presente en el hongo.
A pesar de no conocer el procerdimiento del autor (Gartz) de la adición del
precursor químico en los tratamientos, la técnica utilizada en el desarrollo, que
consistió en mezclar el precursor químico con el sustrato, fue la más adecuada
(tabla 12).
66
Tabla 12. Concentración de Psilocibina (%)
Variables de
Respuesta Testigo
0,1 g de
triptamina
0,2 g de
triptamina
0,4 g de
triptamina
Área de
Psilocibina
(mm2)
497.30 550.20 1316.70 1381.00
Área de Cafeína
(mm2) 629.10 684.40 708.80 668.50
Concentración
Cafeína (ppm) 25.00 25.00 25.00 25.00
Concentración
Psilocibina
(ppm)
19.76 20.10 46.44 51.65
% de Psilocibina 0.0353 0.0359 0.0829 0.0922
Para calcular el porcentaje de Psilocibina obtenido en la extracción se procedió a
realizar el siguiente cálculo:
035.01008.2
000988.0%
000988.01000
105.0
76.19% tan
tan
g
aPsilocibingaPsilocibin
aPsilocibingmg
LtLt
aPsilocibinmgaPsilocibin olme
olme
67
Gráfico 5. Concentración de Psilocibina (ppm)
En el gráfico 5 se puede observar una diferencia significativa entre la
concentración obtenida del alcaloide en el tratamiento de 0.1 y 0.2 g de triptamina
por lo que se puede decir que a cantidades mayores de 0.2 g de triptamina en los
tratamientos no se presenta una tendencia a incrementarse la concentración de
Psilocibina por lo tanto no es recomendable realizar análisis con cantidades
mayores a las 0.2 g de triptamina debido a que cantidades mayores de 0.4 g de
triptamina se da un retraso en el crecimiento micelial del hongo y puede llegar a no
presentarse la aparición de carpóforos. Además el costo del precursor químico es
considerablemente elevado y tarda mucho tiempo en su importación.
Estadísticamente no existen diferencias significativas en cuanto a los resultados
arrojados por el software Statgraphics con un valor P de 0.8905 (p>0.05) y un
valor F de 0.20, puesto que al momento de realizar la extracción del alcaloide
Psilocibina se realizó por tratamiento y no por réplica, debido a que no se contaba
con la suficiente cantidad de hongos secos para realizar el análisis por réplica
(anexo 21). Aun así la gráfica Box and Whisker Plot (anexo 22) muestra una
diferencia significativa entre la cantidad de alcaloide (Psilocibina) y la
concentración de precursor (triptamina) utilizada, confirmando los análisis
realizados previamente.
0
10
20
30
40
50
60
0 0,1 0,2 0,4
Co
nce
ntr
ació
n (
pp
m)
Triptamina (g)/(g) de sustrato
Concentración de Psilocibina
68
CONCLUSIONES
Sobre el compost de champiñón se presentó una adecuada propagación y
crecimiento del micelio y se observó la presencia de cuerpos fructíferos del
hongo P. cubensis, debido a sus propiedades nutricionales y a su alta
resistencia contra diferentes contaminantes. Por ello se comprueba que
este sustrato es el medio de cultivo más propicio para el desarrollo del P.
cubensis.
El sustrato de trigo a pesar de tener un alto contenido nutricional, no es un
sustrato adecuado para la obtención de cuerpos fructíferos del hongo P.
cubensis debido a que es muy propenso a presentar contaminación en las
etapas tempranas de la siembra.
Las diferentes concentraciones de triptamina utilizadas en el diseño de
experimentos, influyen significativamente en el crecimiento micelial del P.
cubensis debido a que la triptamina en altas concentraciones actúa como
inhibidor del crecimiento y retrasando la aparición de los carpóforos.
Los tratamientos que menor tiempo de colonización presentaron fueron el
testigo (30 días) y 0.1 g de triptamina (36 días), debido a que la
concentración de triptamina de 0.1 g fue muy baja comparada con lo
reportado en la literatura y el tratamiento de los testigos no presentabá
concentración del precursor triptamina por lo que la propagación del micelio
fue más rápida.
El tamaño del píleo o sombrerillo y la precocidad de colonización obtenidas
en los tratamientos no presentan diferencias significativas en cuanto al
análisis estadístico. Por ende las diferentes concentraciones de triptamina
utilizadas en el compost de champiñón no proporcionan elementos que
diferencien estas dos variables de respuesta.
Los tratamientos que arrojaron rendimientos más altos, son aquellos que
presentaron una mayor cantidad de cuerpos fructíferos por el área ocupada
en el sustrato húmedo, en donde los tratamientos de 0.1 y 0.2 g de
triptamina tuvieron un comportamiento mayor en cuanto a la cantidad de
69
hongos cosechados comparados con los tratamientos de testigo y 0.4 g de
triptamina.
Los mejores tratamientos en cuanto a la eficiencia biológica son igualmente
los tratamientos de 0.1 y 0.2 g de triptamina, esto se debe a que esta
variable constituye la base para establecer el rendimiento, lo que significa
que estadísticamente no existen diferencias significativas entre estas dos
variables de respuesta.
La resolución de los picos obtenidos por HPLC del extracto del P. cubensis
fue mayor a medida que la concentración de triptamina aumentaba en los
tratamientos, lo que cuantitativamente se pudo comprobar por medio de la
utilización de un estándar interno.
Después de realizado el análisis de HPLC en cuanto a la producción de
Psilocibina presente en un tiempo de retención de 4-6 min para cada uno
de los ensayos, no se evidenció diferencia significativas entre las demás
concentraciones de triptamina utilizadas.
Los resultados obtenidos en los cromatogramas del extracto de Psilocibina
son confiables, ya que en el momento de realizar la prueba HPLC no se
identificaron interferencias de ruido y presión.
El comportamiento del estándar interno (cafeína) fue estable, debido a que
el tiempo de retención en los diferentes cromatogramas se presentó
alrededor de los 12 minutos y la concentración utilizada fue adecuada
puesto que la resolución del pico del SI (estándar interno) comparada con la
resolución del pico de la Psilocibina fue similar, lo que evita la presencia de
errores significativos al momento de realizar la cuantificación del alcaloide.
El precursor químico utilizado en el desarrollo de los tratamientos fue
adecuado, puesto que este aumentó en forma gradual la cantidad del
alcaloide producido intracelularmente por el hongo. Se evidenció que a una
cantidad de 0.4 g de triptamina se obtuvo un porcentaje de Psilocibina de
0.0922 % (51.65 ppm), mientras que el porcentaje obtenido en el extracto
del testigo para la Psilocibina fue 0.0353 % (19.76 ppm).
70
RECOMENDACIONES
Para obtener resultados satisfactorios en la producción del P. cubensis, es
necesario proporcionarle las condiciones adecuadas para su crecimiento y
fructificación. Esto se refiere a sustratos que contengan los nutrientes
básicos para su crecimiento, además del control de las condiciones
ambientales como la temperatura, humedad, incidencia de la luz, asepsia y
concentración de oxigeno (Yang y Johg, 1987).
Para evitar la contaminación en el sustrato de trigo, se recomienda dejarlo
sumergido en agua por dos horas antes de ser esterilizado ya que el trigo
contiene muchos contaminantes que pueden afectar los ensayos.
Gracias a los efectos benéficos de la Psilocibina a nivel médico y
psiquiátrico, se recomienda realizar investigaciones que profundicen en
torno al uso de este alcaloide que permita fomentar su utilización legal en
Colombia.
Debido a que se realizaron análisis sobre el crecimiento del P. cubensis en
dos tipos de sustratos sólidos, se recomienda realizar estudios con otros
tipos de sustratos que proporcionen los nutrientes necesarios para el
desarrollo y el crecimiento de este.
Se recomienda no utilizar cantidades mayores de 0.4 g de triptamina en
futuras investigaciones, ya que una cantidad mayor a esta puede conllevar
un crecimiento lento de los cuerpos fructiferos y la no aparición de cuerpos
fructíferos, debido a que en el estudio realizado se noto una inhibición de
desarrollo del micelio en el primer diseño de experimentos realizado.
Se recomienda evaluar otros tipos de precursores en diferentes
concentraciones para analizar la incidencia de este en el desarrollo del
hongo y la producción del alcaloide. Se recomienda evaluar el precursor
químico Valina.
71
BIBLIOGRAFIA
ANASTOS, N.; BARNETT, N.; PFEFFER. F. (2005). Investigation into the
temporal stability of aqueous standard solutions of Psilocin and Psilocybin
using high performance liquid chromatography. Science and justice, 46: 91-
96.
ARANGO, J. (2002). Alcaloides y compuestos nitrogenados. Facultad de
química farmacéutica. Universidad de Antioquia, 6-13.
AULTA, A. (1998). Techniques and experiments for organic chemistry.
University Science books, 113-121
BERKELEY, M. (1854). Indian Fungi. Hooker’s J Bot Kew Garden Misc J, 6:
129–143
BRAILOSKY, S. (2002). Los neurotrasmisores: Serotinina, en las sustancias
de los sueños. Neuropsicofarmacología. 3a edición fondo de cultura
económica.
CASTILLO, J. (2003). Aplicación del método de estándar interno a la
cromatografía de gases. Laboratorio de análisis instrumental. Otoño 2000.
CHACON, R.; MOLANO, F. (2005) Reportes nuevos de agaricales para
Panamá. Universidad Autonoma de Chiriquí, 15-17.
DELLACASSA, E. (2002). Laboratorio de farmacognosia y productos
naturales. Departamento de Química orgánica. Universidad Nacional.
DOELLE, H. y MITCHELL, D. (1992). Solid substrate cultivation. Elsevier
Applied Science, New York, 3: 35.
ENE, (1986). Estatuto nacional de estupefacientes. Webside:
http://www.cnrr.org.co/interior_otros/pdf/ley_30_1986.
FLEGG, P.; SPENCER, D.; WOOD, D. (1987). The biology and technology
of the cultivated mushroom. Editorial Wiley & Son, 5: 54:55.
72
GARCÍA, M. (1991). Cultivo de setas y trufas. Editorial Multipernsa.
GARTZ, J. (1989). Biotransformation of tryptamine in fruiting mycelia of
Psilocybe cubensis. Planta Medica, 55: 249-250.
GANONG, W. (1994). Transmisión química de la actividad sináptica.
Fisiología Médica, Editorial Manual Moderno, 99-118.
GARY, F. (1997). Treatment of childhood Schizophrenia Utilizing LSD and
Psilocybin. Multidiciplinary Association for Psychedelic Studies, 7: 18-25.
GOODMAN, G. (1996). Histamina y 5-hidroxitriptamina (serotonina) y
antagonistas. Bases farmacológicas de la terapéutica, 7: 598-606.
GOTTLIEB, A. (1997). Psilocybin Production. 2a Edition Ilustrated
GRIFFITHS, R.; RICHARDS, W.; JOHNSON, M.; MCCANN, U.; JESSE, R.
(2008) Mystical-type experiences occasioned by psilocybin mediate the
attribution of personal meaning and spiritual significance 14 months later.
Journal of Psychopharmacology, 20:1-12.
GUZMÁN, G.; ALLEN, J.; GARRTZ, J. (2000). A worldwide geographical
distribution of the neurotropic fungi, an analysis and discussion, Annali del
Museo Civico di Rovereto, Italia, 14: 189-280.
HANES, K. (1996). Serotonin, Psilocybin and body dysmorphic disorder.
Journal of clinical psychopharmacology, 16: 188-191.
HASLER, F. y BOURQUIN, D. (2002). Renal excretion profiles of psilocin
following oral administration of psilocybin: a controlled study in man. Journal
of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 30: 331-339.
HESSELIENE, C. (1983). Solid-state (solid-substrate) food/beverage
fermentations involving fungi. Acta Biotecnológica, 4: 83-88.
73
JONES, R. (1982). Tryptamine: a neuromodulator or neurotransmitter in
mammalian brain. Progress in neurobiology, 19: 117-139.
KASUYA, T. y GUZMAN, G. (2004). The know species of Psilocybe
(Basidiomycotina, Agaricales, Strophariaceae) in Nepal. The Mycological
Society of Japan and Springer-Verlag Tokyo, 45: 295-297.
LEARY, T. (1969). The effects consciousness-expanding drugs on prisoner
rehabilitation. Psychedelic Review, 10: 29-44.
LEATHAM, G. y STALHAM, R. (1987). Growth parameters for gourment and
medicinal mushrooms species, 21: 78-81.
LEE, B.; BAE, J.; PYO, B.; CHOE, B.; KIM, W.; HWANG, J.; YUN, W.
(2004). Submerged cultural conditions for the production of micelial biomass
and exopolysaccharides. The edible Basidiomycete Grifola frondosa
Enzyme and Microbial Technology, 35: 369–376.
MARTINEZ, D.; PORFIRIO, M.; MERCEDES, S. (1991). Historia del cultivo
comercial de hongos comestibles en México. Conacyt, 16:33-34.
MILES, P. y CHANG, S. (1999). ―Biología de las setas‖ . 1: 65-82.
MONTGOMERY, D. (1991). Desing and analysis of experiments. Editorial
New York: John Wiley and Sons. Edición 5
MORENO, F. y DELGADO, P. (1997). Hallucinogen-indeced relief of
obsessions and compulsions. The American Journal of Psychiatry, 154 (7):
1037-1038.
MUSSHOFF, F.; MADEA, B.; BEIKE,J. (2000). Hallucinogenic mushrooms
on the German market-simple instructions for the examination and
identification. Forensic Science International, 113: 389-395.
PACIONI G. (1990). Cultivo moderno del champiñón. Editorial De Vecchi
S.A, 3: 80-95.
74
PARIS, M. y HURABIELLE, M. (1981). Abrégé de Matière Médicale -
Pharmacognosie. Masson, 2: 128-154.
PERRINI, D. (1999). Hallucinogens and Obsessive-compulsive disorder.
The American Journal of Psychiatry 156: 1123.
SAVOIE, M.; MATA, G.; BILLETE, C.; DELPECH, P. (2000). Inoculum
adaptation changes the outcome of the competition between Lentunula
edodes and Trichoderma spp. During shiitake cultivation on pasteurized
wheat staw. Science and Cultivation of Edible fungi, 48: 667-674.
SHOJI, O. (1998). Effect of water potential on fruit body formation of
Lentinula edodes in sawdust-based substrate. En: J Wood Sci (1999), 45:
337-342.
STAMETS, P. y CHILTON, J. (1983). The mushroom cultivator; a practical
guide to growing mushrooms at home. Editorial Agarikon press.
Washington.
STAMETS, P. (1996). Psilocybin Mushrooms of the World. Editorial Ten
speed press. Washington.
STAMETS, P. (2000). Growing Gourmet and Medicinal Mushrooms.
Editorial Ten speed press. Washington.
STEINECK H. (1987). Cultivo comercial del Champiñón. Editorial Acribia
S.A, 7: 110-115.
STOFELLA, P. y KAHN, B. (2005). Utilización de compost en los sistemas
de cultivo hortícola. Editorial Mundi-prensa. España.
TSUJIKAWA, K.; KANAMORI, T.; IWATA, Y.; OHMAE, Y.; SUGITA, R.;
INOUE,H.; KISHI, T. (2003). Morphological and chemical analysis of magic
mushrooms in Japan. Forensic Science International, 138: 85-90.
TÉLLEZ, J. (2005). Yajé y Hongos Alucinógenos, Aspectos Relacionados
con su Toxicidad. Avances en Enfermería, 22: 92-102.
75
WANG, M.; LIU, J.; CHEN, H.; LIN, J.; LIN, C. (2007). Comparison of the
separation of nine tryptamine standards based on gas chromatography, high
performance liquid chromatography and capillary electrophoresis metods.
Journal of Chromatrography A, 1181: 131-136.
WRUST, M.; SEMERDZIEVA, M.; VOKOUN, J. (1984). Analysis of
psychotropic compounds in fungi of genus Psilocybe by reversed-phase
high performance liquid chromatography. Journal Chromatography, 286:
229-235
YANG, Q. y JONG, S. (1987). A quick and efficient method of making
mushroom spawn. Science mushrooms XII, 317-324.
76
ANEXOS
Anexo 1.Tabla ANOVA para tamaño de píleo por tratamiento
Tabla 13. Análisis de varianza para el tamaño de píleo por tartamiento
Anexo 2. Intervalos LSD para tamaño de píleo por tratamiento
Gráfico 6. LSD para tamaño de píleo por tratamiento
Fuentes de
Variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Media de
cuadrados F
Valor
P
Entre grupos 46,7733 3 15,5911 1,74 0,2355
Dentro de
grupos 71,5667 8 8,94583
Total (Corr.) 118,34 11
0 0,1 0,2 0,4
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
Triptamina
-1
1
3
5
7
9
11
Ta
ma
ño
d
e p
íle
o
77
Anexo 3. Tabla ANOVA para precocidad de colonización por tratamiento.
Tabla 14. Análisis de varianza para la precocidad de colonización por
tratamiento
Fuentes de
Variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Media de
cuadrados F
Valor
P
Entre grupos 1415,33 3 471,778 1,78 0,2279
Dentro de
grupos 2115,33 8 264,417
Total (Corr.) 3530,67 11
Anexo 4. Intervalo LSD para precocidad de colonización por tratamiento
Gráfico 7. LSD para la precocidad de colonización por tratamiento
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
TriptaminaPre
co
cid
ad
de
Co
lon
iza
ció
n
0 0,1 0,2 0,4-2
8
18
28
38
48
78
Anexo 5. Gráfico de rendimiento en tratamiento de testigo
Gráfico 8. Rendimiento en tratamiento de testigo
Anexo 6. Gráfico de rendimiento en tratamiento de 0,1 g de triptamina
Gráfico 9. Rendimiento en tratamiento de 0,1 g de triptamina
0
0,05
0,1
0,15
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Re
nd
imie
nto
(g/
cm2
)
Réplicas
Rendimiento (0.1 g de Triptamina)
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Re
nd
imie
nto
(g/
cm2
)
Réplicas
Rendimiento Testigo
79
Anexo 7. Gráfico de rendimiento en tratamiento de 0,2 g de triptamina
Gráfico 10. Rendimiento en tratamiento de 0,2 g de triptamina
Anexo 8. Gráfico de rendimiento en tratamiento de 0,4 g de triptamina
Gráfico 11. Rendimiento en tratamiento de 0,4 g de triptamina
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Re
nd
imie
nto
(g/
cm2 )
Réplicas
Rendimiento (0.2 g de Triptamina)
0
0,02
0,04
0,06
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Re
nd
imie
nto
(g/
cm2
)
Réplicas
Rendimiento (0.4 g de Triptamina)
80
Anexo 9. Tabla ANOVA para el rendimiento por tratamiento
Tabla 15. Análisis de varianza para el rendimiento por tratamiento
Fuentes de
Variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Media de
cuadrados F
Valor
P
Entre grupos 0,012825 3 0,004275 2,16 0,1713
Dentro de
grupos 0,0158657 8 0,00198333
Total (Corr.) 0,0286917 11
Anexo 10. Intervalo LSD para el rendimiento por tratamiento
Gráfico 12. LSD para el rendimiento por tratamiento
Anexo 11. Tabla ANOVA para Eficiencia biológica por tratamiento
Tabla 16. Análisis de varianza para Eficiencia biológica por tratamiento
Fuentes de
Variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Media de
cuadrados F
Valor
P
Entre grupos 67,1705 3 22,3902 2,05 0,1853
Dentro de
grupos 87,3314 8 10,9164
Total (Corr.) 154,502 11
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
Triptamina
Re
nd
imie
nto
0 0,1 0,2 0,4-0,01
0,02
0,05
0,08
0,11
0,14
0,17
81
Anexo 12. Intervalo LSD para Eficiencia biológica por tratamiento
Gráfico 13. LSD para Eficiencia biológica por tratamiento
Anexo 13. Prueba de reactivo Dragendorff
Se prepara mezclando 8 g de nitrato de bismuto pentahidratado en 20 ml de ácido
nítrico al 30% con una solución de 27.2 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua.
Se deja en reposo por 24 horas, se decanta y se afora a 100 ml. La presencia de
alcaloides se detecta por la formación de un precipitado naranja rojizo cuando se
le adiciona está reactivo a una solución ácida de alcaloides. De los precipitados
lavados se pueden recuperar los alcaloides con una solución saturada de
Carbonato de Sodio (Arango, 2002). A las muestras obtenidas por tratamiento de
la extracción se les realizó la prueba cualitativa de reactivo de Dragendorff. Esta
prueba consiste en colocar una pequeña cantidad del líquido de interés en un tubo
de ensayo y se adiciona una gota del reactivo. La figura 28 muestra la presencia
de alcaloide debido a la coloración naranja que se observó.
Means and 95,0 Percent LSD Intervals
Triptamina
EB
0 0,1 0,2 0,4-1
2
5
8
11
14
82
Figura 28. Muestra analizada mediante el reactivo de dragendorff
Anexo 14. Prueba de reactivo de dragendorff en presencia de cromatografía
de capa fina
También se utilizó la prueba cualitativa de reactivo de Dragendorff en presencia de
cromatografía de capa fina. Esta técnica se basa en colocar una gota de la
muestra sobre una lámina especial de aluminio, el disolvente de la muestra
utilizado debe tener un punto de ebullición bajo que pueda evaporarse fácilmente
después de la aplicación de la muestra en la placa. La placa se deja reposar al
aire libre para que el disolvente se vaya evaporando y transcurridos unos minutos
aparece una coloración naranja que indica la aparición de alcaloide en la muestra
(Aulta, 1998). En nuestro caso el disolvente utilizado fue metanol que se utilizo
desde la etapa de extracción del alcaloide.
Figura 29. Muestra analizada mediante la cromatografía de capa fina y el
reactivo de Dragendorff
83
Anexo 15. Identificación de la presencia de Psilocibina por medio de HPLC
Igualmente para la realización del análisis cualitativo de presencia de Psilocibina
en los cuerpos fructíferos obtenidos por medio del diseño de experimentos, se
realizó una prueba con hongos recolectados a campo abierto en el municipio de
Santa Elena (Antioquia). Este prueva se efectuó con el fin de reafirmar que el
método de extracción utilizado en el artículo reportado por Musshoff, F. et al., 2000
es correcto
Figura 30. Cromatografía de extracción del hongo P. cubensis de hongos
recolectados en campo abierto
El Cromatograma arrojado por el HPLC de la Universidad EAFIT de los hongos
recolectados en el sector de Santa Elena se comparo con el cromatograma
mostrado en el artículo, con lo que se demuestra que el método empleado de
identificación cualitativa es exacto y confiable debido a la similitud de los picos en
ambos espectros y la presencia del alcaloide en los tiempos de retención de los
tratamientos realizados en el desarrollo del proyecto.
84
Anexo 16. Cromatograma estándar interno (Cafeína)
Figura 31. Estándar interno de la cafeína
Anexo 17. Cromatograma tratamiento testigo
Figura 32. Cromatograma tratamiento testigo
85
Anexo 18. Cromatograma tratamiento 0.1 g de triptamina
Figura 33. Cromatograma tratamiento 0.1 g de triptamina
Anexo 19. Cromatograma tratamiento 0.2 g de triptamina
Figura 34. Cromatograma tratamiento 0.2 g de triptamina
86
Anexo 20. Cromatograma tratamiento 0.4 g de triptamina
Figura 35. Cromatograma tratamiento 0.4 g de triptamina
Anexo 21. Tabal ANOVA para la cantidad de alcaloide Psilocibina
Tabla 17. Análisis de varianza para la cantidad de alcaloide Psilocibina
Fuentes de
Variación
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Media de
cuadrados F Valor P
Entre grupos 287.059 3 95,6863 0.20 0,8905
Dentro de
grupos 3745.68 8 468,21
Total (Corr.) 4032.74 11
87
Anexo 22. Gráfico Box and Whisker plot para la cantidad de alcaloide
Psilocibina
Grafico 14. Box and Whisker plot para la cantidad de alcaloide Psilocibina
0
0,1
0,2
0,4
Box-and-Whisker Plot
0 10 20 30 40 50 60
Cantidad de Alcaloide
Tripta
min
a