INFORME N7: TECNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION En todos los ambientes naturales habitan mltiples microorganismos de diversos tipos que tienen distintas necesidades nutritivas basadas en mecanismos de sntesis propios y rutas metablicas. Los fottrofos usan la luz mientras que los quimitrofos usan compuestos qumicos.Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario separarlo de la poblacin mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean tcnicas de aislamiento que conduzcan a la obtencin de un cultivo puro.Los dos mtodos de aislamiento fsico de los microorganismos ms comunes son: por diluciones seriadas y siembra por vertido en placa, y siembra por agotamiento. Otros mtodos son la utilizacin de medios de cultivos selectivos y diferenciales basndose en el aprovechamiento de caractersticas particulares de los microorganismos, tales como la formacin de esporas, el metabolismo anaerobio y/o facultativo, la capacidad para utilizar sustratos poco comunes, etc.Estos mtodos pueden combinarse dependiendo de los microorganismos que se puedan encontrar en el ambiente y del microorganismo que se quiera separar por medio de sus necesidades nutritivas y de su medio ptimo de crecimiento.

II. OBJETIVOS

Observar las caractersticas de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo lquidos y slidos. Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos, utilizando tcnicas de aislamiento.

III. MATERIALES Y METODOS EJERCICO N1: Tcnicas de cultivo de microorganismos: Caractersticas de crecimiento en medio de cultivo. Materiales: Cultivo de microorganismos (muestra de E.coli) Asa de klle Mechero Tubos de agar nutritivo inclinado Tubos de agar nutritivo vertical Tubos con caldo nutritivo Procedimiento:1. Se Esteriliz el asa de klle por flameo a la llama.2. Se tom el tubo con el cultivo de 18 horas, se retir el tapn, se flame la boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequea porcin del cultivo con ayuda del asa de klle. Se flame la boca del tubo antes de volver a taparlo.3. Se tom el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores se introduzco el asa en el lquido para dejar el inculo. Se Homogeniz la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano.4. Se repiti el procedimiento 1 para obtener ms inculo, pero usando esta vez aguja de klle.5. Se tom el tubo con agar inclinado y se realiz la siembra depositando el inculo a lo largo de una sola lnea descrita desde la base de la inclinacin hasta el extremo.6. Se repiti el procedimiento1 para obtener inculo, usando nuevamente aguja de klle.7. Se tom el tubo con agar vertical y se realiz la siembra por picadura profunda del medio.8. Se rotul los datos sembrados y se puso a incubar a 37C por 24horas.

EJERCICO N2: Tcnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento de placas. Materiales: Tubos con caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Bacillus sp, Escherichia coli, Staphylococcus sp) Asa de klle, aguja de klle Mechero Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50 C Placas petri esteriles Placas con agar nutritivo Placas con agar Mc Conckey Procedimiento:A) Aislamiento por estras o por agotamiento en superficie

1. Se tom de la mezcla de caldo (caldo de microorganismos), con la ayuda del asa de klle/ aguja de klle un inculo. (para este paso se consider todas las condiciones de trabajo en asepsia)2. Se tom la placa de agar nutritivo con la mano izquierda y con la ayuda de los dedos pulgar e ndice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. Con el asa cargada de inculo, se hizo estras sobre toda la superficie del medio. Se cerr la tapa.3. Se esteriliz el asa a la llama nuevamente.4. Se repiti los pasos para el medio agar Mc Conckey5. Colocar las placas en incubacin a 37C por 24 horas.6. Se observ el desarrollo de colonias individuales y se describi las caractersticas.B) Aislamiento por diluciones sucesivas o siembra por incorporacin

1. Se tom el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con la ayuda del asa de klle retirar un inoculo.2. Se tom el primer tubo de agar licuado y se mantuvo la temperatura a 50C y se transfiri aspticamente el inoculo. Se esteriliz el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado se mezclo el inoculo con el medio, hacindolo girar entre las palmas de las manos.3. Se transfiri una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de agar licuado. Se repiti la operacin anterior para obtener una mezcla homognea.4. Se verti el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri estriles y se rotaron lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Se Identific cada dilucin.5. Se Incub las placas a 37C por 24 horas.Se Examin el crecimiento de las colonias en las placas. Se hizo un recuento de las colonias, se describi las caractersticas diferenciales de las colonias observadas

IV. MARCO TERICOCultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un microorganismo en un medio slido o lquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido. Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar. El are y todas las superficies estn densamente pobladas por microorganismos, por lo tanto en la transferencia de una muestra microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como: 1. La contaminacin y prdida del cultivo en estudio 1. La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.

Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una transferencia exitosa. Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para uso microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodn), pipeta Pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, esptula y/o gancho. En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos, pipetas o pipetas Pasteur que debern esterilizarse previamente. La utilizacin de estos dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tiene aplicaciones especficas. 1. Un cultivo lquido puede ser transferido mediante un asa microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta Pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y es fcil homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentracin del inculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difcil detectar contaminacin a simple vista. 1. Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta Pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno. 1. Los medios slidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despus de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de Petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan caractersticas que varan con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.

Siembra del Inoculo en Tubo1. Siembra por estra en tubos con medio solido inclinado: Se toma con asa de siembra previamente esterilizado por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo es utilizado para conservar cepas durante largos periodos, as como para la realizacin de ciertas bioqumicas, como, por ejemplo, la prueba de la ureasa.

1. Siembra por picadura: Se suele tomar con hilo de siembra aunque en ocasiones tambin pueden hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo semislidos como por ejemplo, el medio de oxidacin fermentacin de Hugh-Leiffson.

Siembra del Inoculo en Placa1. Aislamiento en estra: Se tomar con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir de aqu se realizaran movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no tomndose en ningn momento nuevo inoculo y no levantndose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa.

1. Tcnica de siembra por dilucin: Se dispondr de una batera de tubos con medio de cultivo especfico o agua estril segn los casos. Se adicionara una cantidad de muestra solida o liquida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inoculo que se aade en el tubo inicial. Se agitara hasta homogenizacin. Con pipeta estril se tomara una cantidad especfica o exacta y se adicionara al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta obtener la dilucin deseada. Con la dilucin esperada, por ejemplo, 10-3 y 10-4, inocular en placas de cultivo una cantidad de inoculo exacta y extender con un asa ce Digrasky previamente estril. Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aun cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la incubacin se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las veces estn relacionadas con la de su hbitat natural. Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiolgica o un bao de agua a temperatura constante, en tanto que para los microorganismos que presentan su crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C se pueden incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperatura ambiente. En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por ms de nueve das. Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de are se llaman aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno se denominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias que requieren oxgeno, pero slo lo utilizan cuando ste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaeroflicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitacin de los cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales. Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parsitos, comensales o mutualistas. Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas muy variables, hay bacterias mviles e inmviles fotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la tincin de Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y caractersticas culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamao, elevacin y color de las colonias.

V. RESULTADOS Y DISCUSIN

Crecimiento filiformeConsistencia de crecimiento viscosoCantidad: moderadaDistribucin en la superficie: Uniforme

Crecimiento superficial y en profundidad (ambas a la vez)

Color de la pelcula: amarillentoColor del precipitado blanquecinoFormacin de pelcula, masa de clulas en la superficie del caldo, turbidez (opacidad), depsito de clulas en el fondo del tubo (si se agita, se re suspenden en el caldo).

Imagen n1: de izquierda a derecha, resultados de la siembra en caldo nutritivo, agar vertical y agar inclinado. Vase el crecimiento de microorganismos en cada una de las muestras.

1. En los experimentos de crecimiento en caldo, crecimiento en agar vertical y en agar vertical con picadura profunda, se observa el desarrollo de la E. coli tanto dentro del medio (agar) como en la superficie de este. Esto queda explicado por Behrman etal. (2004) quien dice que la E. coli es un microorganismo anaerobio facultativo, es decir, puede desarrollarse tanto con presencia de oxigeno como sin l, pero con mejor crecimiento en presencia de este. Asi en el experimento se not que las capas superficiales eran ms gruesas mientras las que estaban dentro del agar eran dispersas y de menor cantidad.1. Con respecto al desarrollo en agar inclinado se observ un crecimiento filiforme.

Se observ crecimiento de microorganismos, colonias muy juntas y mal esparcidas, de coloracin rojiza con un halo de color rojo ms intenso.

Se observ el crecimiento de microorganismos, colonias circulares de un tono perla

Imagen n2: de izquierda a derecha, agar manitol salado, agar Mc conkey1. En el Agar Mac Conkey se observo varias colonias teidas de un color rojo intenso. Ya que este medio es selectivo y diferenciado para enterobacterias fermentadoras de lactosa podemos afirmar que en la muestra problema (mezcla) haban bacterias Escherichia coli, pues esta tal como lo refiere Madigan (2006)es una enterobacteria fermentadora de lactosa, la cual se tie de rojo porque al fermentar la lactosa deja residuos cidos que cambian el pH del medio, haciendo que el rojo neutro (indicador) vire y se intensifique. El halo que presentan se debe a la precipitacin de las sales biliares, ingredientes del agar Mac Conkey. 1. En el Agar Manitol salado se pudo observar la presencia de unidades formadores de colonias (UFC), cabe resaltar que cada UFC puede proceder tanto de una sola clula como de un grupo de clulas del mismo tipo de microorganismo. Las UFC eran de color blanquecino, circulares y con un halo amarillento. El agar manitol salado es un medio selectivo y diferenciado para Staphylococcus aureus, por ello se puede inferir que se trataba de esta bacteria. Las colonias estaban distribuidas en toda la placa, siguiendo la estra dibujada, pero en diferentes densidades, observndose una mayor descarga del inoculo en el inicio de la estra y UFC individuales en el final.

Se observ el crecimiento de microorganismos, pero en mucha menor densidad que la placa anterior. Se pudieron diferenciar algunas colonias, unas ms grandes de un color lechoso y otras ms pequeas de color amarillento

Se observ gran cantidad de puntos amarillentos

Imagen n3: resultados de diluciones sucesivas. De izquierda a derecha, primera dilucion y segunda dilucion.

Se realizaron solo dos diluciones utilizando como muestra una mezcla de microorganismos. Luego del periodo de incubacin se observ en las placas Petri lo siguiente:1. En la primera placa con la primera dilucin se observ una gran cantidad de UFC circulares, muy pequeas y de color amarillento.1. En la segunda placa con la segunda dilucin se observ una cantidad mucho menor de UFC, las cuales eran circulares, algunas de mayor tamao que otras y con un color amarillento y crema ms acentuado. Tambin se observa una mayor separacin entra las UFC.La diferencia de tamao entre unas colonias con otras se debe a que se trata de un medio de cultivo comn (agar nutritivo), el cual permite el crecimiento de diversos microorganismos. Segn un anlisis cualitativo se observa claramente que las diluciones permiten obtener cada vez menos colonias y ms separadas unas de otras.

VI. CUESTIONARIOEJERCICIO N11. Por qu algunos microorganismos desarrollan en caldo un caracterstico crecimiento tipo pelcula? Qu factores ambientales podran alterar la formacin de una pelcula superficial?Segn Koneman et al (2008) los microorganismos mviles muestran un crecimiento difuso lejos de la lnea de inoculacin, mientras que los inmviles slo muestran crecimiento a lo largo de la lnea de corte. Adems nos dice que para el establecimiento de la movilidad de microorganismos se utilizan medios semislidos para permitir que el microorganismo se expanda. Si combinamos esto con el hecho de la existencia de microorganismos que necesita la presencia de oxgeno para su crecimiento podemos encontrar una razn para el crecimiento tipo pelcula en el caldo (Cultivo no slido). MAD (2002, editor) confirma esto al mencionarnos al V. cholerae cuyo aislamiento se basa en el rpido crecimiento de este microorganismo sobre agua de peptona alcalina (Caldo de cultivo) en condiciones de aerobiosis y nos recalca que el crecimiento de este microorganismo se manifiesta con la formacin de una pelcula en la superficie del medio luego de pocas horas de incubacin. Forbes (2009) nos pone otros ejemplos al mencionarnos al Proteus mirabilis, P. penneri y P. vulgaris, quienes presentan un crecimiento tipo enjambre en agar sangre y agar chocolate, cuya diseminacin da como resultado una superficie delgada de crecimiento sobre la superficie del agar.Por dicha razn uno de los factores ambientales ms importantes para el desarrollo de dicha pelcula es la composicin del aire, especialmente la proporcin de oxgeno presente en este ya que debe ser suficiente para el crecimiento de microorganismos. Por otro lado se deben tener condiciones que permitan dicho desarrollo como una temperatura apropiada, pH del medio, niveles de radiacin escasos. Segn vayan variando estos factores se limitar la presencia de ciertos microorganismos en el cultivo y, si son extremos, no habr ningn microorganismo salvo los extremfilos que sean capaces de habitarlo.

1. Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las caractersticas de crecimiento es preferible inocular con aguja de klle y no con asa. Por qu?Para observar las caractersticas de crecimiento en agar inclinado es importante el uso de aguja de klle pues se desea realizar una puncin profunda para observar cmo se extienden los microorganismos al crecer. Por este propsito es aconsejable el uso de una aguja de kller al representar un punto de inoculacin estrecho que permita observar los ligeros cambios en la expansin del cultivo, si se utilizara el asa de klle se tendra una zona y no un punto de inoculacin dando como resultado un posible error al observar el crecimiento dado que no se posee una lnea inicial de aplicacin de microorganismos, sino un rea. Mac Faddin (2003) nos dice esto y afirma que en un medio de agar inclinado el proceso de inoculacin debe hacerse primero realizando una estra en el pico de flauta y luego una puncin en el fondo del tubo.

1. Qu factores influenciarn en la abundancia del crecimiento en caldo, agar inclinado y agar vertical?De la Rosa y Prieto (2003) nos dicen que entre los principales factores que determinan el crecimiento microbiano podemos encontrar los siguientes:2. Agua: Requerimiento absoluto para el crecimiento bacteriano debido a que al menos el 80% de la masa de estas es agua, por lo que la disponibilidad de esta condiciona el tamao de las poblaciones bacterianas.2. Oxgeno: Las bacterias difieren en sus necesidades de oxgeno. As se pueden separar en aerobias (Crecen en una atmsfera con presencia de 21% de oxgeno), anaerobias (Crecen en ausencia de oxgeno), aerobias estrictas (No pueden crecer en anaerobiosis), anaerobias estrictas (No crecen en aerobiosis) y facultativas (Crecen en aerobiosis y anaerobiosis), finalmente las que son incapaces de utilizar oxgeno como aceptor final en su respiracin pero pueden crecer en presencia de oxgeno se llaman aerotolerantes. As el tipo de bacteria determina la composicin del aire del medio de cultivo. Adems esta necesidad influye, en ciertas ocasiones, en la virulencia de las bacterias y en las enfermedades que producen.2. Anhdrido carbnico: Muchas bacterias patgenas, como los meningococos, requieren un contenido de 5 a 10% de CO2 en la atmsfera.2. Temperatura: Las bacterias tambin difieren en su temperatura ptima de crecimiento. As tenemos psicrfilas (Debajo de 20C), mesfilas (Entre 20 y 40C) y termfilas (Entre 55 y 80C), siendo la mayora de bacterias patgenas mesfilas y crecen mejor a temperaturas alrededor de 37C (Temperatura del cuerpo humano)2. pH: El pH afecta mucho el desarrollo ptimo de las bacterias. En el caso de las que producen enfermedades en el hombre ste punto est en el pH fisiolgico (7,2)2. Productos metablicos bacterianos: Las bacterias sintetizan estructuras y las transportan a donde corresponda, algunas de las cuales son de gran inters.Por otro lado, Tortora et al (2007) nos menciona los parmetros que deben tenerse en cuenta en los medios de cultivo para el desarrollo adecuado de los microorganismos. Entre estos est la presencia de una fuente de energa, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y cualquier otro factor de crecimiento que el organismo no pueda sintetizar. EJERCICIO N21. Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollado en estos ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? Cmo podramos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias aisladas?Luego de los mtodos de aislamiento se obtienen colonias diferenciadas e individuales de diferentes tipos de microorganismos. Estas pueden ser purificadas.Para esto se selecciona la colonia cuya cepa se desee obtener en estado puro. Esta es trasplantada a otra placa de agar mediante el mtodo de agotamiento de superficie y el uso de la aguja de klle. En este medio se le darn las condiciones de cultivo indicadas para la proliferacin de microorganismos (37C por 24 horas). Tiempo despus se volver a obtener una placa petri con presencia de microorganismos y colonias individuales, pero en esta placa se presentar una mayor presencia de la colonia seleccionada si la inoculacin se realiz de la forma correcta. Este proceso se ha de repetir hasta obtener la totalidad de colonias de la especie deseada y puede realizarse para todas los cultivos cuyas cepas se deseen obtener.Para comprobar que estas cepas provienen de las colonias aisladas se realizara un anlisis y comparacin macroscpica y luego microscpica de un cultivo proveniente de la cepa pura y de las colonias originales presentes en el primer agar Mac Conkey. As se comprueba gracias a las caractersticas, microscpicas principalmente, si son o no de la misma especie y, por lo tanto, de las colonias aisladas del inicio.

1. Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo?Alarcn (2004) nos dice que existen ciertos factores limitantes del crecimiento microbiano cuyo conocimiento es importante para su control, entre estos estn:1. Temperatura ptima de crecimiento de algunas bacterias: La temperatura ambiental afecta directamente el funcionamiento de las enzimas bacterianas siendo la temperatura ptima de crecimiento aquella en la cual el microorganismo se multiplica a su mxima velocidad.1. Influencia de la presin osmtica: El crecimiento bacteriano es afectado grandemente por la cantidad de agua que entra o sale de la clula, especialmente cuando se encuentra la bacteria en una solucin hipertnica debido a que se inhibe su crecimiento. Este grado de inhibicin depende del tipo de soluto y de la naturaleza del organismo.1. pH1. Luz ultravioletaPor su parte, Pumarola y Pumarola (1995) nos dicen que cuando se utilizan como inculo clulas en estado metablico latente, son factores de importancia crtica para iniciar el crecimiento el pH, la temperatura, la presencia de concentraciones adecuadas de oxgeno (Potencial de oxidacin-reduccin) y concentraciones favorable de CO2, adems de ciertas sustancias nutritivas, en especial las que se producen lentamente o con dificultad por s mismas.

1. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el nmero total de colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver el problema.En primer lugar se alistaran 10 tubos con 9 mL de agar licuado, mantenindolos en este estado mediante calor. Posteriormente en un dcimo tuvo se realizara la disolucin de 1 gramo de muestra en 9 mL de agua destilada de alta pureza. Se homogeniza y posteriormente se extrae una alcuota de 1 mL y se agrega al primer tubo de agar licuado. Luego se homogeniza y se extrae una alcuota de 1 mL de este para agregarlo al siguiente y as sucesivamente.Posteriormente se vacan los contenidos de los tubos, cada uno a una placa petri y se llevan a incubar a 37C por 24 horas. Tiempo luego del cual se procede al recuento de colonias al microscopio tomndose como valor aceptable aquel que oscile entre 30 y 300. Luego de esto se extrapola este nmero hasta llegar a la concentracin de bacterias en el gramo de muestra utilizado y ya se tendra el nmero de colonias por gramo de la muestra de leche en polvo.

1. En qu consiste la tcnica del nmero ms probable? Qu usos tiene?MAD (Editor, 2006) nos dice que la tcnica del nmero ms probable (NMP) es un mtodo estadstico basado en la dispersin aleatoria de los microorganismos en un volumen de agua determinado, es decir, muestras repetidas del mismo tamao de un mismo producto, por lo que cabe esperar que contengan el mismo nmero de microorganismos como promedio. Esta cifra media estimada es el Nmero Ms Probable. De esta forma, si un lquido posee 100 microorganismos en 100 mL, cada muestra de 10 mL debera contener 10 microorganismos; la de 1 mL, 1 microorganismo y la de 0,1 mL solo 1 microorganismo cada 10 muestras.Por dicha razn si se siembran varios tubos de medio con muestras de distinto volumen es posible calcular el NMO de microorganismos en 100 mL de medio con cualquier combinacin de resultados obtenidos de las muestras. La siembra se realiza por triplicado o quintuplicado. Tras incubar se observa turbidez, cambio de color o produccin de gas, segn los casos, obtenindose un valor numrico que, a travs de las tablas, indica la cifra ms probable de microorganismos en la muestra, sobre la base del nmero de tubos que manifiestan resultado positivo. Existen tablas para muestras de 10 mL, 1 mL y 0,1 mL. En la determinacin existen tres fases: Presuntiva, confirmativa y de anlisis completo. Adems permite el procesamiento de muestras claras o turbias. Sin embargo, existen ciertos inconvenientes como no proporcionar un recuento preciso, sino una estimacin estadstica de la presencia de un determinado microorganismo; la necesidad de mltiples tubos de fermentacin y el tiempo de espera entre 5 y 7 das.

1. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?Se puede proveer al medio de un ambiente externo estril, colocar a las cepas puras en un cultivo dentro de una placa petri o tubo, este cerrado y colocarlo en una cmara estril o donde se realice vaco. IICA (1985) nos dice que otra forma de conservacin del material biolgico, ya sea en tubos o cajas de petri conteniendo medio de cultivo slido, para que la clula no sufra cambios por deterioro, puede darse por un sistema de perlas, que consiste en adherir a perlas de vidrio suspensin de bacterias, o conservarlas en forma liofilizada (Actividad de agua baja)

1. Qu tcnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaerbicos?Koneman et al (2008) nos dice que antes del aislamiento de cultivos es necesario un reconocimiento de posibles especies presentes. Esto se realiza mediante el uso de distintos cultivos, como el agar sangre, en el cual crecen muy bien los anaerobios estrictos como Clostridium novyi y Clostridium haemolyticum. Menciona adems la tcnica de seleccin de esporas como mtodo de aislamiento para Clostridium sp. y cultivos anaerobios en general. Luego menciona mtodos con fines especiales para el aislamiento primario de anaerobios en la flora normal descritos en el Manual Madsworth, medios selectivos y una tcnica de enriquecimiento en fro para ayudar al aislamiento de especies de Mobiluncus sp. en muestras vaginales por Smith y Moore, un medio diferencial y selectivo para el aislamiento de Bacteroides ureolyticus. Por Eley y cols, un medio selectivo para Bacteroides gracilis realizado por Lee y cols, un medio selectivo para el aislamiento de especies de Anaerobiospirillum sp. proveniente de heces, realizado por Malnick y cols; adems menciona medios selectivos adicionales con fines especiales y procedimientos para el aislamiento y la cuantificacin de Clostridium difficile, c. perfringens y C.botulinum de heces o muestras de alimentos.

VII. CONCLUSIONES

Se puede hacer una distincin de la presencia de microorganismos en un medio lquido por la turbidez que presenta este una vez contaminada. En este medio existe una numerosa cantidad de gneros y especies de microorganismos ya que el caldo nutritivo es un medio no discriminativo.

En la aislacin de microorganismos en el agar manitol salado podemos concluir que hubo proliferacin exitosa de bacterias del genero Staphylococcus ya que este medio es diferencial porque esta compuesto por nutrientes especficos para ese genero de bacterias adems de tener una alta conc. salina.

La aislacin de bacterias en agar Mac Conkey se realiz con xito. Este medio es selectivo y diferencial que se emplea ms a menudo para la aislacin de enterobacterias siendo el ms comn E-coli; contiene violeta cristal para inhibir el crecimiento de cocos gran positivos y rojo neutro como indicador de pH, que le otorga propiedades diferenciales. Los fermentadores de lactosa producen cidos orgnicos que disminuyen el pH de medio prximo a la colonia. En esa zona el rojo neutro vira al rojo o rosado. Los no fermentadores de lactosa permanecen incoloros y translcidos. Se puede concluir que el microorganismo aislado es Escherichia coli. En un aislamiento por diluciones se obtiene el recuento de las colonias, las cuales permitirn conocer el nmero de clulas existentes en el cultivo original.

VIII. BIBLIOGRAFA

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