INFORME N° 5

INTRODUCCION

Los hongos se encuentran distribuidos ampliamente en la naturaleza, muchas de sus especies son cosmopolitas, esto se debe entre otros factores a su propiedad de colonizar diferentes sustratos y principalmente a su forma de reproducción por esporas, las que son fácilmente transportadas por los animales, el agua o el aire contribuyendo a su dispersión.

Un alto número de esporas que son liberadas de diversas fuentes están suspendidas en el aire atmosférico donde su diversidad y número varían con las condiciones atmosféricas, ubicación geográfica, condiciones climáticas, tipo de ambiente y actividad.

En esta forma, la atmosfera posee una carga micótica de hongos saprobios que pueden dar origen a importantes problemas de salud publica en individuos susceptibles, convirtiéndose en patógenos y parásitos una vez que se introducen por inhalación, o invasores secundarios en individuos que tienen su sistema inmunológico disminuido por diversas causas, o tener acción toxicogénica debido a la producción potencial debido a la producción potencial de toxinas de algunas especies, o provocar reacciones alérgicas en respuesta a los antígenos fúngicos, en los individuos, dependiendo de la sensibilización, predisposición y exposición.

Actualmente el estudio de la diversidad de las esporas fúngicas suspendidas en el aire de ambientes internos se ha extendido extraordinariamente debido a la potencial contaminación, alteración por procesos industriales y otros, que estas esporas puedan ser alergógenas y causar enfermedades de tipo respiratorias al ser inhaladas en bioaerosoles y polvo producido en actividades humanas.

REVISION LITERARIA

Ciertas esporas de hongos presentes en el aire pertenecen a géneros cosmopolitas que se han registrado como predominantes de la acción alérgica, cuyo término es aplicado generalmente al tipo I de hipersensibilidad.

Su presencia, concentración y diversidad estarían relacionadas con la polución ambiental externa, la prevalencia estacional de estas especies, las fuentes de dispersión y las condiciones del ambiente interno laboral o habitacional.

Las alergias del tipo I desencadenan reacciones agudas en individuos genéticamente susceptibles a los alérgenos cuando estos entran en contacto con las vías respiratorias produciendo síntomas de asma, rinitis o afecciones broncopulmonares alérgicas.

La inhalación de antígenos fúngicos y de actinomycetes causaría respuestas de hipersensibilidad tales como sinusitis, o desordenes inmunológicos al pulmón (pneumonitis) alveolitis alérgica extrínseca.

En los estudios relativos a la presencia de esporas de hongos en el aire exterior, como en el interior por su importancia en la acción alergógena se citan a nivel mundial, por su presencia relativa y concentración los siguientes géneros: Cladosporium, Alternaria, Epicocum, Rhodothorula, Penicillium, Aspergillus y Aureobasidium.

La manifestación alérgica corresponde a la hipersensibilidad del sistema inmunológico debido a la sobreproducción de los anticuerpos y componentes celulares como una respuesta a la exposición a un alérgeno (causante de alergia).

Se describen también reacciones de hipersensibilidad, de alergias tipo III correspondientes a inflamaciones locales debido a cambios de permeabilidad vascular provocando alteraciones serológicas y neumonitis, donde serian agentes potenciales la inhalación de esporas de hongos, especialmente: Cladosporium sp., Acremonium sp., Alternaria sp., Mucor sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma sp., Aureobasidium sp., actinomycetes, polvo organico y algunos compuestos inorgánicos.

La calidad del aire interior llega a ser de esta forma una importante causa de riesgo en salud cuando en este ambiente se encuentra estimaciones significativas de esporas fúngicas pudiendo ser estas de origen interno y/o del medio exterior.

El aire interior es considerado como el espacio cerrado laboral o doméstico con diferencias importantes de las situaciones externas ambientales, en la cual la situación externa es valorada como una caja móvil de aire por efectos de la temperatura, viento, precipitaciones, que producen una condición homogénea de concentraciones características de un sitio a otro y de una estación a otra.

El ambiente interno por el contrario se menciona como una caja negra inmóvil, donde el aire se mueve de acuerdo a influencias externas especificas y acumula contaminantes por la acción antrópica, creando una situación heterogénea.

Al respecto se han encontrado correlaciones significativas entre los ambientes externos e internos, altitud, humedad, circuitos de ventilación, etc.

También numerosos hongos provenientes de fuentes interiores siendo de especial interés las especies de predominio anual y principalmente saprobias que se adaptan ecológicamente y constituyen áreas de dispersión interna gracias a factores como la calefacción, aire acondicionado y falta de limpieza.

El reconocimiento del número de unidades formadoras de colonias por m3 (ufc/m3) y la exhaustiva identificación de los tipos de propágulos permiten estimar los riesgos de salud en la calidad del aire frente a la acción de los hongos.

Dentro de los grupos fúngicos suspendidos en la atmósfera se señalan como responsables del efecto alergénico a: Cladosporium spp., Alternaria alternata, en las manifestaciones aeroalergógenas de rinitis, traqueítis, conjuntivitis y asma, problemas internos de mayor seriedad que afectan más profundamente al sistema respiratorio alveolar e intersticial del pulmón; y a Aspergillus sp. y Penicillium sp.; en micotoxicosis.

Los géneros Alternaria y Cladosporium junto con Aspergillus y Penicillium se han descrito como los más abundantes y frecuentemente asociados a factores de correlacion en hogares, como ventilación, humedad, deterioro de superficies y en ambientes industriales asociados a la dispersión de la contaminación industrial junto con Acremonium, Fusarium y Aureobasidium.

PARTE EXPERIMENTAL

Ejercicio 1.

IDENTIFICACIÓN DE HONGOS MEDIO AMBIENTALES

Materiales

- Aislamientos de hongos medio ambientales en placas de agar sabouraud.

Luego de:

1. Elegir un punto determinado en el ambiente que se quiera evaluar.

2. Destapar la placa petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume que

las esporas de hongos se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición

puede ser de 5 a 10 minutos. Vuelva a tapar la placa, identifiquela con nombre

y lugar muestreado.

3. Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.

4. En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30º C por 4 ó 5 días.

5. Transcurrido el tiempo, examine las placas y realice una descripción detallada

de las mismas.

Después seguir el siguiente procedimiento:

Observación macroscópica

1. Observe el típico desarrollo de los hongos en medio de cultivo. Cada una de

las masas de forma definida que puede observar constituye una colonia.

2. Cuente el número total de colonias que aparece en la placa. Se asume que

cada colonia desarrollada proviene de una espora captada del aire.

3. Establezca los tipos morfológicos más saltantes entre las colonias presentes.

Obténgalos de acuerdo a la observación de las características externas en

ellas (color, forma y aspecto de la colonia en el haz y envés de la placa).

4. Determine la frecuencia de cada tipo morfológico con respecto al número total

de colonias.

5. Describa cada tipo morfológico detallando diámetro promedio, color, forma,

aspecto y cualquier característica saltante que observe.

Observación microscópica

1. Observe al microscopio compuesto en pequeño y mediano aumento las

características de cada tipo morfológico.

2. Determine en detalles los tipos de hifas presentes y las diferenciaciones de

hifas en estructuras nutricionales, estructuras de reproducción, de resistencia,

etc.

3. Con ayuda de un manual de identificación de hongos haga una aproximación

válida para determinar los géneros aislados.

4. Elabore con detalle los esquemas correspondientes.

Ejercicio 2.

CULTIVO DE CÁMARA HÚMEDA

Materiales

- Placas petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente.

- Agua destilada estéril

- Dispositivo para cultivo en Cámara Húmeda

- Mechero de alcohol

Procedimiento

1. Utilizando aguja de kölle o estilete, pique una colonia y extraiga una fracción

mínima de esporas o micelio.

2. En forma aséptica deposite esta fracción sobre la porción de agar dispuesta en

el portaobjeto de la cámara húmeda.

3. Con ayuda de una pinza estéril cubra cuidadosamente la preparación con la

lámina cubre objetos.

4. Humedezca el papel filtro de la placa con agua destilada estéril.

5. Incube la placa a temperatura ambiente (20 – 25º C).

6. Examine diariamente al microscopio la lámina sembrada hasta verificar el

completo desarrollo del hongo. Retire cada vez la lámina del cultivo de la

cámara húmeda y una vez realizada la observación vuélvala a su lugar

cuidando de mantener la humedad constante, si es necesario añada más agua

al sistema.

7. Observe la germinación de las esporas, el crecimiento y ramificación del

micelio, la aparición de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de

reproducción.

8. Con ayuda de un manual de identificación de hongos determine el género

correspondiente.

9. Elabore en detalles los esquemas de cada etapa de desarrollo.

RESULTADOS

Ejercicio 1.

Observación macroscópica

Ambiente de exposición: Sala

En la placa de la izquierda se observan 2 colonia mientras que la de la dercha se

aprecian 16, de distintos colores, formas, aspectos y diámetros.

Color de las colonias: Generalmente verdes, habían de tonos verde claro y verde

oscuro (o verde olivo). Además había una de color anaranjado metálico.

Forma de las colonias: La mayoría tenían forma circular y las demás forma irregular

(ovalada).

Aspecto de las colonias: Aspecto agamuzado y algodonado, lo cual indica que son

hongos filamentosos. Se aprecia una colonia de aspecto mucoso y brillo metálico que

indica que se trata de una levadura, siendo un hongo unicelular más no una colonia.

Diámetro de las colonias: Se observaron colonias de diámetros grandes, medianos y

pequeños.

Frecuencia: Las colonias más frecuentes fueron las de diámetro pequeño y color verde

oscuro.

Observación microscópica

En la práctica se observaron los siguientes hongos:

1º G.A.: 100X

Tipo de hifa: septada

Esporas asexuales: Conidiosporas

Género: Aspergillus sp

G.A.: 400X

Tipo de hifa: septada (conidióforo aseptado)

Esporas asexuales: Conidiosporas

Género: Aspergillus sp

2º G.A.: 400X

Tipo de hifa: septada

Esporas asexuales: Conidias

Género: bipolaris sp

3º G.A.: 400X

Tipo de hifa: septada

Esporas asexuales: conidias

Género: Cladosporium sp

Ejercicio 2.

Tomando muestras de las colonias de la placa petri que fue expuesta al medio ambiente se realizó el cultivo en cámara húmeda.

Muestra A

Día 1

Sólo se pueden distinguir hifas septadas. Aún no se distingue el género.

G.A.: 40X

G.A.: 100X

Día 4

Se determinó comparando con un manual de identificación de hongos que se trata del género Alternaria sp

G.A.: 40X

G.A.: 100X

Muestra B

Día 1

No hubo crecimiento

Día 4

No se pudo apreciar el crecimiento de ningún hongo

IV. DISCUSIONES

En ésta práctica de laboratorio; el tiempo de exposición de la placa petri fue el

adecuado, siendo establecido en 15 minutos lo que permitió que varios hongos

crecieran en las placas

La humedad es un factor de crecimiento del hongo ya que con la actividad de

agua (ej. Aspergillus Aw= 0.8) aumenta su cinética de crecimiento.

Según Prescott (pág. 132-133), la temperatura afecta intensamente a los

microorganismos. La temperatura de la célula microbiana se refleja

directamente con la de su ambiente. La temperatura de un microorganismo

determinado abarca normalmente un margen de temperatura de 30ºC. En

identificación de hongos al medio ambiente y cultivo en cámara húmeda se

trabajo a 30ºC y 25ºC respectivamente, que son temperaturas óptimas para

medios húmedos.

Al observar hongos medio ambientales se observa que las esporas están

volando por todo el ambiente. Así pudimos encontrar hongos de todo tipo como

Aspergillus, Bipolaris, Cladosporium,

Diferentes tipos de hongos a un mismo tiempo de crecimiento, desarrollaron

diferentes tamaños.

Es posible que la segunda muestra en la cámara húmeda no hubiese crecido

debido el hongo no fue correctamente sembrado o que no logro fijarse al agar

Bipolarias presenta esporas alargada y recubiertas, al no ser esperada su

aparición en las placas este puede ser confundido con alternaría

V. CONCLUSIONES

Cuando no se puede determinar el género de una colonia de hongos, se

recurre al cultivo en cámara húmeda. Ya que esta nos brinda resultados que

proporcionan información suficiente para identificar el género al que pertenece

el hongo estudiado.

Mediante el cultivo en cámara húmeda se puede observar el desarrollo de las

estructuras reproductoras de los hongos. Este método nos permite una buena

manipulación y observación sin alterar el crecimiento ni modificar la estructura

y organización y sin la interferencia de otros hongos.

Los hongos necesitan humedad para desarrollarse completamente.

Los hongos crecen en forma radial y apical en todo el sustrato o hasta que se

topan con otra colonia, es entonces que entre ellos determinan sus límites.

La temperatura afecta mucho la presencia o ausencia de algunos géneros.

Cladosporium tiene un rango amplio de temperatura.

Encontramos algunas diferencias en la rapidez de crecimiento de algunos

hongos, estos crecen más rápido que otros debido a hifas diferenciadas lo que

constituye una ventaja.

Vi. CUESTIONARIOEjercicio 1

1. Haga una descripción morfológica de 5 géneros de hongos del medio ambiente considerando las características de desarrollo en medio de cultivo y las características observadas al microscopio.

Penicillium es un género del reino Fungi. Tiene entre 100 y 150 especies.

Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras del espora-cojinete. Los conidióforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fialides en forma de botella. Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora más joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes. La ramificación es una característica importante para identificar especie del Penicillium. Algunos no son ramificados y llevan simplemente un racimo de fialides en la tapa del estípite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.

El Penicillium es un género grande y encontrado casi por todas partes, y siendo comúnmente el género de hongos más abundante en suelos. La fácil proliferación de los Penicillium en los alimentos es un problema. Algunas especies producen toxinas y pueden hacer el alimento no comestible o aún peligroso. Es una buena práctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier moho. Por otra parte otras especies de Penicillium son beneficiosas para los seres humanos. Los quesos tales como el roquefort, brie, camembert, stilton, etc. se crean a partir de su interacción con algunos Penicillium y son absolutamente seguros de comer. La penicilina es producida por el hongo Penicillium chrysogenum, un moho ambiental.

El Aspergillus es un género de alrededor de 200 hongos (mohos), y es ubicuo. Los hongos se pueden clasificar en dos formas morfológicas básicas: las levaduras y las hifas. El Aspergillus es un hongo filamentoso (compuesto de cadenas de células, llamadas hifas), el tipo de hongos opuesto a las levaduras, éstas últimas compuestas de una sola célula redondeada. El hábitat natural del Aspergillus son el heno y el compostaje.

La estructura microscópica del Aspergillus es única. Tienen hifas tabiculares y conidioforas cuya cabeza está localizada en el extremo de un hifa, compuesta por una vesícula rodeada por una corona de fiálides en forma de botella directamente insertadas sobre la vesícula.8 De las fiálides se desprenden las esporas (conidios). Otras estructuras se encuentran en ciertas especies y no en otras, por ejemplo, las células de Hüle.

Rhizopus es un genus de mohos que incluyen especies cosmopolitas de hongos filamentosos hallados en el suelo, degradando frutos y vegetales, heces animales, y residuos.

Las especies de Rhizopus producen esporos asexuales y sexuales. Los esporangiosporos asexuales se producen dentro de una estructura aguzada, el esporangium, y son genéticamente idénticos a su padre. En Rhizopus, el esporangio es soportado por una gran columela apofisada, y el esporangióforo asoma entre rizpodes distintivos. Cigosporos negros se producen después de dos fusiones compatibles de micelios durante la reproducción sexual. Y hacen colonias que pueden ser genéticamente diferentes de sus padres.

Algunas spp. de Rhizopus son agentes oportunistas de cigomicosis humana. Pueden causar serias (y con frecuencia fatales) infecciones en humanos y en animales debido a su rápido crecimiento a relativamente altas temperaturas. Algunas especies son patógenos vegetales. Dos son usados en fermentación: Rhizopus oligosporus, en la producción de tempeh, un alimento fermentado derivado de grano de soja; R. oryzae se usa en la producción de bebidas alcohólicas, en partes de Asia y de África.

Cladosporium es un hongo filamentoso con conidióforos con cadenas ramificadas de conidios elipsoides o cilíndricos de extremos redondeados, formados por gemación sucesiva del conidio anterior.

Colonias de crecimiento lento, planas, finamente vellosas, aterciopeladas o lampiñas, de color verde oliva a pardo oliva. Reverso negro oliva.

El género Alternaria contiene especies cosmopolitas que se encuentran en un amplio rango de materiales y productos. Como saprobias pueden deteriorar alimentos y forrajes, produciendo compuestos biológicamente activos tal como micotoxinas. Como patógenas reducen el rendimiento de las cosechas o afectan a los vegetales almacenados.

Los conidios de Alternaria tienen septos transversales y longitudinales y se los conoce como dictiosporas, además son pardos y picudos. Nacen por la brotación apical de una célula conidiógena o de la espora anterior, dando lugar en este último caso a una cadena que suele ramificarse si una espora produce más de un brote.

Es común observar en los hongos una plasticidad morfológica. Cuando las especies de Alternaria crecen en medios ricos y en la obscuridad bajo condiciones ambientales no controladas, se forma un exceso de micelio aéreo que afecta al desarrollo tridimensional de la esporulación. Al hacer las preparaciones húmedas se destruyen las estructuras y como resultado solo se observan conidios.

2. Los nombres genéricos de muchos hongos son derivados de características morfológicas. De cuales derivaran los nombres Penicillium, Aspergillus y Rhizopus?

Penicillium: palabra derivada del latín penicillus, diminutivo de peniculus que significa “pincel” (a su vez diminutivo de penis, plumero, cepillo), esto debido a que sus conidióforos se ramifican formando dicha forma.

Aspergillus: palabra derivada del latín que significa “Hisopo o Apersorio” (que servía para rociar agua antiguamente) y provienen del parecido de su conidióforo maduro con tal aparato.

Rhizopus: palabra derivada del griego rhiza que significa “raíz” y pous (pie) y se le dio a los hongos que forman estructuras de sujección de apariencia radicular denominada rizoides.

3. ¿Por qué razón algunas colonias aisladas del medio ambiente no desarrollan esporas en el medio de cultivo utilizado?

Algunas colonias no desarrollan esporas en el medio de cultivo porque la formación de esporas está estrechamente relacionada con las necesidades específicas de los distintos hongos para dispersarse a nuevos ambientes apropiados. Así podemos concluir las siguientes razones: Medio de cultivo adecuado para el desarrollo de las bacterias

Temperatura ambiente Temperatura de incubación

Ejercicio 21. ¿Cuál es la ventaja del empleo de la cámara húmeda en el estudio de los hongos?

La cámara húmeda tiene el propósito de crear condiciones favorables de humedad para el rápido desarrollo de hongos que pueden estar involucrados en la producción de síntomas de enfermedad, pero cuya presencia no es detectada en el momento de la primera observación. Como los saprófitos pueden ser favorecidos por las condiciones creadas, debe procederse con cautela al interpretar los resultados. La cámara húmeda se prepara en un recipiente con tapa, que permita un grado de aireación adecuada para la respiración. Además, proporciona al hongo un ambiente más adecuado para su crecimiento y proliferación, pudiendo aislarlo de la muestra o de su medio para un estudio más profundo de sus características y de las medidas que se tomarán para la detención de su propagación, especialmente en caso de ser patógenos.

2. ¿Existen diferencias entre los hongos a nivel del crecimiento y diferenciación del micelio?, ¿Por qué?

Existen diferencias tanto macroscópicas como microscópicas, esto se puede observar al realizar un cultivo en cámara húmeda ya que de esta manera se lleva a cabo el seguimiento del desarrollo de un hongo (desde su inicio).

A nivel macroscópico: la única diferencia es que las colonias poseen diferentes colores, con esto se puede separar por especies de hongos. Fuera de esto, a este nivel su crecimiento es aparentemente igual.A nivel microscópico: es aquí donde se observan mayores diferencias, como tamaño y forma. Se observa el crecimiento desde la formación de micelios, los cuales inicialmente parecen poseer la misma estructura pero al continuar el desarrollo se observa que son diferentes porque ya van tomando una forma característica de cada especie. Es en este nivel donde se puede realizar una diferenciación de hongos de

acuerdo a su especie, ya que se pueden observar las características físicas propias de cada una. Las diferencias de hongos a nivel de crecimiento se da porque cada especie necesita condiciones específicas para su desarrollo; estas pueden ser temperatura, luz, aire, humedad, entre otras. Las cuales son fundamentales para un buen desarrollo y proliferación de hongos.

BIBLIOGRAFIA

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España.

Llop, Valdez-Dapena, Zuazo. Microbiología y Parasitología médicas. Tomo I.

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Prescott, L.M; J. P. Harley 1999.Microbiología. Cuarta edición. Mc Graw Hill-

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Tórtora, Funke y Case. 2007. Introducción a la microbiología. Editorial Ed.

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