informe final pasantÍa microorganismos promisorios

INFORME FINAL PASANTÍA

MICROORGANISMOS PROMISORIOS FIJADORES DE NITRÓGENO,

MOVILIZADORES DE FOSFORO Y POTASIO PARA LA FORMULACIÓN DE

UN BIOINSUMO DE USO AGRÍCOLA

Presentado por:

DANIELA ALEJANDRA FARFÁN RAMOS COD: 20132085291

Presentado a:

ANGELA MARIA WILCHES FLOREZ

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

TECNOLOGÍA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL

BOGOTÁ D.C

2017

2

Contenido.

Resumen .............................................................................................................................................. 3

Introducción. ....................................................................................................................................... 4

1. Objetivos. .................................................................................................................................... 5

1.1. Objetivo general. ................................................................................................................. 5

1.2. Objetivos específicos. .......................................................................................................... 5

2. Contextualización de la empresa. ............................................................................................... 6

3. Actividades ejecutadas. ............................................................................................................... 6

3.1. Fase 1. Aislamiento de las bacterias nativas de las muestras del suelo. ............................ 6

3.2. Fase 2. Diseño experimental in vitro. .................................................................................. 7

3.2.1. Modelo experimental Diseño Completamente Aleatorizado DCA. ............................ 7

3.2.2. Prueba de hipótesis. .................................................................................................... 8

4. Resultados. .................................................................................................................................. 9

4.1. Fase 1................................................................................................................................... 9

4.1.1. Siembra en placa superficial, agar NFB (Nitrogen Free Broth) y agar SPS. ................. 9

4.1.2. Identificación preliminar (pruebas bioquímicas kit BBL Crystal®)............................. 10

4.1.3. Selección y repique de las UFC, siembra por agotamiento en Agar sangre, Agar

MacConkey y Agar King A. ......................................................................................................... 10

4.2. Fase 2................................................................................................................................. 12

4.2.1. Ejecución de la fase experimental. ............................................................................ 12

4.2.2. Métodos analíticos. ................................................................................................... 12

4.2.3. Prueba de hipótesis. .................................................................................................. 13

5. Conclusiones.............................................................................................................................. 15

6. Evaluación de la pasantía y recomendaciones. ......................................................................... 16

ANEXOS. ............................................................................................................................................ 17

BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................................... 26

3

RESUMEN

TITULO: Microorganismos promisorios fijadores de nitrógeno, movilizadores de

fosforo y potasio para la formulación de un bioinsumo de uso agrícola.

RESUMEN: El uso de insumos químicos sintéticos como fertilizantes y plaguicidas

son importantes para el incremento de la productividad agrícola, sin embargo su

empleo excesivo puede afectar negativamente el ambiente. Una alternativa

favorable son los bioinsumos formulados a partir de microrganismos o extractos

vegetales. Con el objetivo de identificar posibles microorganismos viables en la

formulación de un bioinsumo fertilizante, se aislaron bacterias nativas no patógenas

de los suelos de cultivo con capacidad fijadora de nitrógeno N, y movilizadora de

fósforo P y potasio K; tres cepas seleccionadas se emplearon en experimentación

in vitro basada en el Diseño estadístico Completamente Aleatorizado DCA con

seguimiento semanal durante dos meses, midiendo las concentraciones de N, P, y

K en los suelos inoculados. Para determinar estadísticamente la fijación /

movilización de los nutrientes a los suelos por parte de las bacterias se implementó

un Análisis de Varianza ANOVA empleando el paquete estadístico IBM SPS

Statistics ®.

PALABRAS CLAVE: Bioinsumo, bacterias, nutrientes, suelo.

ABSTRACT: The use of synthetic-chemical compounds such as fertilizers and

pesticides are important to crop productivity increment, however its excessive use

will affect the soil and water environments negatively. A favorable alternative are the

use of microorganisms or plan extracts also known as bioinputs. In order to identify

viable microorganisms in the formulation of a biofertilizer, nitrogen-fixing,

phosphorus mobilization and potassium solubilization bacteria were isolated from

cropland soil with. From the pool of isolated bacteria, three strains were selected

and tested in vitro, based on the Fully Randomized Statistical Design RSD. Weekly

monitoring was performed during two months, measuring the concentrations of N,

P, and K in the inoculated soils. To determine the amount of nutrients bounded to

the soil by the bacteria`s metabolism, a variance analysis (ANOVA) was

implemented using the IBM SPS Statistics ® package.

KEY WORDS: Bioinput, bacteria, nutrients, soil.

4

INTRODUCCIÓN.

Los microorganismos han sido utilizados en la solución de varios problemas

agrícolas con un éxito considerable, sin embargo es necesario que éstos cumplan

con ciertas características como la no patogenicidad o fitotoxicidad para que puedan

ser usados en la agricultura como sustitutos de fertilizantes y pesticidas sintéticos.

Los bioinsumos ofrecen una alternativa a los agroquímicos que pueden afectar

negativamente el ambiente. Para el desarrollo de bioinsumos se parte de la

identificación del problema a solucionar, para posteriormente plantear posibles

alternativas a nivel de laboratorio y finalmente, extrapolar los resultados del

laboratorio a campo.

La microbiota edáfica interactúa en la calidad del suelo, el crecimiento y la

productividad de las plantas. Algunos microorganismos benéficos son fijadores y

movilizadores de nutrientes (nitrógeno, fósforo y potasio), y antagonistas de

fitopatógenos en plantas y en suelos, características que los hacen promisorios

como principio activo en la formulación de bioinsumos (Higa, 2013).

Según la NTC 1927 (2001) existen tres tipos de producción de bioinsumos: (i)

Entomopatógenos, microorganismos utilizados para controlar insectos-plaga en los

cultivos como los hongos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, (ii)

fertilizantes como las micorrizas, y (iii) biocontroladores, bacterias u hongos

utilizados para el control de microorganismos que causan enfermedades en cultivos

como por ejemplo el hongo Trichoderma harzianum.

5

1. OBJETIVOS.

1.1. Objetivo general.

Identificar bacterias nativas de suelos de cultivo fijadoras de nitrógeno,

movilizadoras de fósforo y potasio promisorias para su uso en bioinsumos agrícolas.

1.2. Objetivos específicos.

1. Recuperar y aislar bacterias nativas a partir de suelos de cultivo de papa, que

presenten características de fijación / movilización de nutrientes (nitrógeno, fósforo

y potasio).

2. Determinar la fijación / movilización de nitrógeno, fósforo y potasio, por parte

de tres cepas seleccionadas, mediante la implementación de un diseño

experimental in vitro.

6

2. CONTEXTUALIZACIÓN DE LA EMPRESA.

Maquisapa SAS., es una empresa que busca soluciones a problemas ambientales,

sociales y económicos, por medio de la investigación aplicada y el desarrollo

experimental. Otras actividades anexas comprenden procesos de saneamiento

básico rural, diseño y construcción de plantas de tratamiento de agua residuales

para pequeños núcleos descentralizados, formulación de bioinsumos para uso

agrícola empleando microorganismos autóctonos de alta eficiencia. También

desarrollan protocolos y asesorías en la transición de cultivos convencionales hacia

la agricultura orgánica.

3. ACTIVIDADES EJECUTADAS.

3.1. Fase 1. Aislamiento de las bacterias nativas de las muestras del suelo.

Las muestras de las cuales se aislaron las bacterias fueron proporcionadas por el

equipo técnico de investigación de MAQUISAPA SAS, obtenidas de suelos de

cultivo convencional de papa ubicados en la Vereda El Curubital perteneciente a la

localidad 20 – Sumapaz, D.C.

Las actividades específicas ejecutadas en esta fase fueron:

Preparación de agares selectivos y el material necesario para el

aislamiento de las bacterias. Medios selectivos empleados: NFB (Nitrogen

Free Broth) y Agar SPS CONDA para el aislamiento de bacterias

solubilizadoras de fosfato inorgánico

Dilución en serie y siembra en placa superficial en los medios selectivos.

(Anexo 1)

Lectura Macroscópica de las Unidades Formadoras de Colonia UFC.

Tinción de Gram y observación microscópica. (Anexo 2)

Identificación preliminar con pruebas bioquímicas kit BBL Crystal®.

Selección y repique de las UFC, siembra por agotamiento, en Agar sangre,

Agar MacConkey y Agar King A (Anexo 3)

Tinción de Gram. Verificación aislamiento.

El procedimiento de repique de las UFC y tinción de Gram se repitió hasta

verificar que las bacterias estuvieran completamente aisladas y puras.

Una vez aisladas las bacterias, fueron identificadas molecularmente en

laboratorio externo. (Actividades no correspondientes a la pasantía).

7

Repique en tubo con caldo nutritivo de las UFC aisladas e identificadas

para su conservación.

3.2. Fase 2. Diseño experimental in vitro.

3.2.1. Modelo experimental Diseño Completamente Aleatorizado DCA.

Este diseño consiste en la asignación de los tratamientos de forma aleatoria a las

unidades experimentales, siendo estas lo más homogéneas posibles, minimizando

así la magnitud del error experimental (Díaz, 2009). En la tabla 1 se encuentran las

variables empleadas en el modelo experimental.

Tabla 1. Variables modelo experimental DCA.

Variable Descripción

Unidades experimentales Cajas plásticas de 20 x 15 cm, cada una

con 500 g de suelo estéril

Tratamientos. 4 Pseudomonas fluorescens (A)

Bacillus subtilis (B)

Pseudomonas aeruginosa (C)

Testigo o control (D)

Repeticiones 3 por cada tratamiento

Duración del ensayo 2 meses

Fuente: Autor.

Actividades específicas:

Inoculación de las cepas en las unidades experimentales, concentraciones

según evaluación del equipo de investigación técnico. (Anexo 4)

Toma de muestras de suelo semanales (seis en total), de cada unidad

experimental, 5 gramos aproximadamente. (Anexo 5)

Pre tratamiento de las muestras de suelo. (Anexo 5)

Métodos analíticos empleados:

o Nitrógeno amoniacal - Kjeldahl procedimiento de Bremner (1965) (Anexo

6)

o Fósforo real - Bray II (Boschetti, 2003)– lectura por espectrofotometría UV

(Anexo 7)

o Potasio en suelo, extracción Bray II, cuantificación por espectrofotometría

de absorción atómica. (Campos, 1994) (Anexo 8)

8

3.2.2. Prueba de hipótesis.

Para la obtención del Análisis de Varianza ANOVA y poder comprobar las hipótesis

experimentales propuestas (tabla 2) se utilizó el Software IBM SPSS Statistics ®.

Tabla 2. Hipótesis experimentales planteadas.

H0 No hay fijación – movilización de N, P, K por parte de los tratamientos (Pseudomonas

fluorescens, P aeruginosa, Bacillus subtilis)

H1 Hay fijación – movilización de N, P, K por parte de al menos uno de los tratamientos (Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa, Bacillus subtilis)

Fuente: Maquisapa SAS

El ANOVA se usó para la comparación del conjunto de resultados obtenidos durante

las mediciones de las concentraciones del N, P y K en los suelos de las unidades

experimentales, y probar las hipótesis usando un nivel de significancia α = 0,05 -

confianza del 95%.

Adicionalmente se realizó la prueba Tukey para la comparación estadística entre las

medias de las varianzas de los tratamientos (cepas bacterianas empleadas) y

determinar cuál o cuáles de los tratamientos presentan mejor fijación – movilización

de los nutrientes.

9

4. RESULTADOS.

4.1. Fase 1.

4.1.1. Siembra en placa superficial, agar NFB (Nitrogen Free Broth) y agar SPS.

Se observó crecimiento de 2 UFC en el agar NFB identificadas con los números 1 y

2, y en el agar SPS 5 UFC identificadas con los números del 3 al 7. Las

características macroscópicas y microscópicas de estos microorganismos se

muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Características macroscópicas y microscópicas de los microorganismos.

ID - Colonia Morfología Macroscópica Morfología Microscópica

(1 )Agar NFB Colonias de medianas a grandes

y convexas, forma circular y

aspecto granular

Gram (+). Forma de bacilo

medianos, forman cadenas

por pares.

(2) Agar NFB Colonias grandes y planas, forma

irregular, bordes lobulados, color

blancuzco.

Gram (+). Forma de bacilo

grande y grueso forman

cadenas, presentan

esporas centrales.

(3) Agar SPS colonias medianas y brillantes,

borde continuo y ondulado con un

centro opaco

Gram (-). Forma de bacilo

corto, sueltos, no forman

esporas.

(4) Agar SPS Colonias medianas, forma

circular, borde un poco ondulado,



esporas.

(5) Agar SPS Colonias pequeñas a medianas,

forma circular con borde liso,

blanco cremosas

Forma de bacilo corto,

Gram (-), sueltos, no

forman esporas.

(6) Agar SPS Colonias medianas y brillantes,

con forma irregular , bordes

ondulados



esporas.

(7) Agar SPS Colonias grandes, con forma

irregular , bordes ondulados, con

brillo un poco metálico


pequeño, sueltos, no

forman esporas.

Fuente: Autor.

10

4.1.2. Identificación preliminar (pruebas bioquímicas kit BBL Crystal®).

En las pruebas bioquímicas realizadas con el kit BBL Crystal® se obtuvo como

resultado la identificación de los siete microorganismos previamente aislados los

cuales se relacionan en la tabla 4.

Tabla 4. Identificación pruebas bioquímicas kit BBL Crystal

ID Nombre %

Probabilidad ID Nombre

%

Probabilidad

1 Bacillus brevis 94,5 5 Pseudomonas putida 99,5

2 Bacillus subtilis 93,9 6 Erwinia sp 95,6

3 Pseudomonas

fluorescens 99,0 7

Pseudomonas

aeruginosa 94,8

4 Aeromonas spp 98,5

Fuente: Autor.

4.1.3. Selección y repique de las UFC, siembra por agotamiento en Agar sangre,

Agar MacConkey y Agar King A.

De los anteriores microorganismos se seleccionaron tres los cuales corresponden

a los ID 2, 3 y 7 por presentar características de fijación – movilización de nutrientes

(nitrógeno, fósforo y potasio) según bibliografía. Estos fueron sembrados en Agar

sangre, Agar MacConkey y Agar King A, para corroborar su tipificación antes de

enviar las muestras al laboratorio externo para identificación molecular. Los

resultados de los crecimientos se resumen en la tabla 5.

11

Tabla 5. Característica de las cepas en Agar sangre, Agar MacConkey y Agar King A

Medio De Cultivo Bacillus subtilis Pseudomonas

aeruginosa

Pseudomonas

fluorescens

Agar sangre Colonias grandes

planas, con

pigmentación

amarilla, beta-

hemolíticas.

Colonias

esparcidas y

planas con brillo

metálico,

pigmentación

verde azulada

beta – hemolíticas.

Colonias

pequeñas y

esparcidas con

brillo metálico

verdoso. Beta-

hemolíticas.

Agar MacConKey

No presenta

crecimiento.

Crecimiento. No

fermentadoras de

lactosa.

Crecimiento. No

fermentadoras de

lactosa.

Agar King A No presenta

crecimiento.

Crecimiento.

Pigmentación

verde - azulado en

luz UV.

Crecimiento.

Pigmentación

verde en luz UV.

Fuente: Autor.

En la identificación molecular se comprobó el género y especie de las tres bacterias

seleccionadas, las cuales correspondientes a Pseudomonas fluorescens, Bacillus

subtilis, y Pseudomonas aeruginosa; presentadas en la figura 1.

Figura 1. Crecimiento en agar tripticasa de soya TSA, previo inoculación en unidades

experimentales.

A - Pseudomonas fluorescens; B Bacillus subtilis; C – Pseudomonas aeruginosa. Fuente: Autor.

12

4.2. Fase 2.

4.2.1. Ejecución de la fase experimental.

Se realizó la implementación del diseño experimental in vitro DCA donde se

inocularon las tres cepas seleccionadas. De las 12 unidades experimentales se

tomaron muestras de suelo semanalmente (figura 2), para los posteriores análisis

químicos en donde se determinó la fijación de nitrógeno, movilización de fósforo y

potasio.

Figura 2. Muestreos de las unidades experimentales

Fuente: Autor

4.2.2. Métodos analíticos.

Resultado de la determinación semanal de N, P y K se obtuvieron los resultados

paramétricos presentados en el anexo 9. Teniendo en cuenta que no fue posible

concluir con la totalidad de los análisis de N y P, faltando los análisis de las últimas

muestras, se realizó un arreglo estadístico según el método de valores faltantes

(Gómez et al, 2006) con el que se solucionó el problema de la carencia de datos

sustituyéndolos por los valores estimados a partir de la información suministrada

por la muestra. Con lo anterior se completó la base de datos (anexo 9), insumo para

el ANOVA.

13

4.2.3. Prueba de hipótesis.

Los resultados del ANOVA para un nivel de significancia α=0.05 y confianza del

95%, se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Análisis de varianza ANOVA para la base de datos.

Tratamientos

Suma De

Cuadrados Gl

Media

Cuadrática F P Valor

Potasio Entre grupos 17,187 3 5,729 6,100 ,004

Dentro de

grupos 18,785 20 ,939

Total 35,972 23

Fosforo Entre grupos 31,553 3 10,518 5,584 ,006

Dentro de

grupos 37,671 20 1,884

Total 69,223 23

Nitrógeno Entre grupos ,315 3 ,105 11,903 ,000

Dentro de

grupos ,176 20 ,009

Total ,491 23

Salida Software IBM SPSS ®. Fuente: Autor

Según la sentencia: P valor ≤ α; se rechaza H0. En todos los casos se rechaza la Ho,

encontrando que hay evidencia estadística para concluir que hay fijación -

movilización de los nutrientes nitrógeno, fósforo y potasio por parte de al menos un

tratamiento implementado (Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa, Bacillus

subtilis).

Para realizar la comparación estadística entre tratamientos se utilizó la prueba de

Tukey. La tabla 7 presenta los resultados del (los) tratamiento(s) que presentó o

presentaron mejor fijación - movilización de nutriente(s) con respecto a los

tratamientos restantes.

14

Tabla 7. Comparaciones múltiples por medo del método Tukey

Variable

Dependiente

Tratamiento P Valor

Potasio (1)

P fluorescens

(2) P aeruginosa ,033

(3) B subtilis ,507

(2)

P aeruginosa

(1) P fluorescens ,033

(3) B subtilis ,411

(3)

B subtilis



Fosforo (1)

P fluorescens


(3) B subtilis ,018

(2)

P aeruginosa


(3) B subtilis ,990

(3)

B subtilis



Nitrógeno (1)

P fluorescens

(2) P aeruginosa 1,000

(3) B subtilis ,001

(2)

P aeruginosa

(1) P fluorescens 1,000

(3) B subtilis ,000

(3)

B subtilis



Fuente: Autor

Se encontró evidencia estadística que verifica que las cepas P. fluorescens y P.

aeruginosa movilizan potasio en suelos; siendo P. fluorescens la cepa que presentó

mayor capacidad de movilización de este nutriente. Las cepas Pseudomonas spp y

B. subtilis demostraron capacidad de movilizar fósforo, siendo la cepa P. fluorescens

la que presentó mayor capacidad de movilización de ese nutriente. Por último las

cepas Pseudomonas spp y B. subtilis presentaron fijación de nitrógeno, siendo B.

subtilis la cepa con mayor capacidad de fijación de este nutriente.

Lo anterior se corrobora con Velázquez & Ramos (2015) quienes afirman que

Pseudomonas spp solubilizan fósforo y potasio, y las cepas Bacillus sp, son

fijadoras de nitrógeno.

15

5. CONCLUSIONES.

Se recuperaron siete cepas bacterianas a partir de las muestras de suelo de cultivo

de papa. De las anteriores se aislaron e identificaron tres bacterias nativas

correspondientes a Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas

aeruginosa, promisorias en el uso para la formulación de un bioinsumo de uso

agrícola empleado como fertilizante de suelos.

De las cepas empleadas en la experimentación se encontraron evidencias

estadísticas para concluir que hay mayor incremento de nitrógeno en suelos por

parte de la bacteria Bacillus subtilis, en tanto Pseudomonas fluorescens presentó

mayor movilización - solubilización de potasio y fósforo en suelos.

Con los resultados obtenidos durante la fase de recuperación e identificación (fase

1) y la fase 2 netamente experimental, se demuestra que es posible obtener

microrganismos con capacidad de fijación - movilización de nutrientes como

nitrógeno, fosforo y potasio, viables en la formulación de un bioinsumo para uso

agrícola.

16

6. EVALUACIÓN DE LA PASANTÍA Y RECOMENDACIONES.

Teniendo en cuenta el cumplimiento de los objetivos planteados, a pesar de los

inconvenientes ocurridos por el cierre del laboratorio a final de año, se logró la

culminación total de los objetivos propuestos de manera satisfactoria.

Resultado de la pasantía se puede destacar:

Adquisición de nuevos conocimientos de carácter técnico en laboratorio de

microbiología y química.

Sincronía entre el pasante y el director interno durante las diferentes fases

del proyecto.

Cumplimiento de la pasante frente las responsabilidades asignadas por la

empresa.

La empresa Maquisapa SAS., acompañó el proceso y suministró los

elementos necesarios para llevar a cabo la pasantía.

Se recomienda plantear el cronograma con margen de tiempo, previendo posibles

percances logísticos como el cierre temporal del laboratorio en donde se ejecutaron

la mayoría de las actividades planteadas en la pasantía.

17

ANEXOS.

ANEXO 1

Dilución en serie - Siembra en placa superficial en los medios selectivos. (Camacho,

2009)

DILUCIÓN EN SERIE Y

SIEMBRA EN PLACA

Preparar la muestra y 4 tubos con

9mL de la solución diluyente.

Homogeneizar un ped (aproximadamente

un gramo de suelo) de la muestra en 9mL

de la solución diluyente.

Homogeneizar un mL de la dilución

anterior en 9mL de la dilución diluyente

Repetir el procedimiento hasta completar 4 diluciones

(siempre tomado un mL de la dilución anterior

Preparar las cajas de Petri con los medios selectivos, dos cajas

con agar NBF (Nitrogen Free Broth) y dos cajas con agar SPS

Verter 0,5 mL de la última dilución en cada una de las cajas,

homogeneizar con asa drigalski hasta que la superficie este seca

Incubar las cajas en posición invertida a 30°C

durante 24 horas

Solución diluyente, Agua peptonada:

Disolver 10g de peptona y 5g de cloruro

de sodio en un litro de agua destilada,

esterilizar en autoclave a 121°C durante

15 minutos.

18

ANEXO 2

Tinción de Gram (Rodríguez, 2005).

19

ANEXO 3

Siembra por agotamiento, en NFB y SPS (Negroni, M. 2000).

Se toma el inóculo que se desea sembrar en el medio de cultivo selectivo, con el

asa microbiológica este se esparce en forma de estría, a medida que se realizan

estas estrías las bacterias pasan del asa al medio en un número menor, como se

muestra en la figura 3. Se incuban a 30°C durante 24 h

Figura 1. Siembra por agotamiento.

Fuente: Negroni, M. 2000.

20

ANEXO 4

Preparación del biológico para la inoculación. (Burguet, 2012)

PREPARACIÓN DEL BIOLÓGICO

PARA LA INOCULACIÓN

Preparación medios de cultivo: Caldo Triptona de

Soya (CTS) y Agar triptona de soya (TSA)

Inocular 1 o 2 UFC en el CTS y agitar en Vortex durante 45

segundos

Tomar 20 uL del CTS y distribuir en la superficie del TSA

Incubar a 35°C durante 24 horas

Colectar ¼ del crecimiento de la placa con un asa estéril en un

Erlenmeyer con 100 mililitros de CTS

Incubar a 37°C, 170 rpm durante 2 horas

Con un atomizador estéril esparcir el contenido del

Erlenmeyer en las unidades experimentales

Las concentraciones son de

acuerdo a la evaluación del

equipo de investigación

técnico.

21

ANEXO 5

Toma de muestras de suelo para los análisis químicos, 5 gramos aproximadamente.

(NTC, 3656)

Pre tratamiento del suelo. Para los análisis químicos (NTC – ISO, 11464)

22

ANEXO 6

Análisis químico, Nitrógeno amoniacal - Kjeldahl (Bremner, 1965)

DIGESTIÓN

Pesar 0.25 g de suelo pre tratado / poner en matraz

Kjeldahl

Adicionar 2 g de mezcla catalizadores (3)

Adicionar 5 mL H2SO4 concentrado

Calentar a temperatura media hasta que la mezcla

se torne clara. Regular temperatura para que los

vapores se condensen.

SOLUCIONES

SL- (1) ACIDO BORICO + INDICADOR:20 g H2BO3 en 750 mL agua.

Calentar para completa disoluciónDejar enfriar y adicionar 20 mL de

mezcla indicadores

* el pH debe ser 5, corregir con NaOH 0.1 N (sl. 2) hasta obtener color púrpura

Completar el volumen a 1L agua destilada

MEZCLA DE INDICADORES:* 0.099 g verde bromocresol

* 0.066 g rojo metiloEn 100 mL alcohol etílico al 96%

SL- (2) HIDRÓXIDO DE SODIO 0.1 N :4 g de NaOH en agua destilada hasta 1 L

(3) MEZCLA CATALIZADORES:62.5 Sulfato de potasio (KSO4) y 6.25 g

sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4*5H2O)

Homogenizar con mortero

SL- (4) HIDRÓXIDO DE SODIO 10 N:200 g de NaOH en agua previamente

hervida y fría, aforar a 500 mL

SL- (5) ACIDO SULFÚRICO 0.01 N:0.28 mL de H2SO4 en 1 L

*Concentración estandarizada con la solución valorada de Carbonato de sodio

SL- (6) SL. VALORADA DE CARBONATO DE SODIO:

0.25 g NaCO3 (seco a 105°C / 2H) disolver y aforar a 50 mL

SL- (7) NARANJA DE METILO:0.1 g naranja de metilo en 100 mL de

agua

VALORACIÓN NORMALIDAD ACIDO SULFÚRICO 0.01 N

* Tomar 3 alícuotas de 10 mL de la sl. (6)

* Agregar 5 o 6 gotas de la sl. (7)* Titular con la sl. (5)

* Calcular la normalidad real sustituyendo:

N H2SO4 = (0.050 g / 53) * (1/ ẋ mL gastados en las 3 alícuotas)

Hervir la muestra por una hora / apagar / dejar

enfriar

DESTILACIÓN

Añadir al digerido frio 25 mL agua destilada /

mezclar vigorosamente

Transferir a Erlenmeyer de 500 mL. Poner 6 perlas

ebullición

Adicionar 3 granallas de zinc y 15 mL Sl. (4)

sosteniendo el Erlenmeyer inclinado para que el NaOH vaya al fondo

Poner a la salida del destilador un vaso de 50 mL con 10 mL de la sl. (1)

Destilar hasta obtener 20 mL en el vaso de 50 mL

TITULACION

Titular con la sl. (5) hasta que vire de verde a rosado

fuerte

Blanco: ídem pero sin muestra de suelo.

23

ANEXO 7

Análisis químico fósforo real - Bray II (Boschetti, 2003), lectura por

espectrofotometría UV

Sl. Oxidante de Molibdato (3):

100 mL Sl. Molibdato (1)150 mL Sl. HsSO4 5 M (2)

Completar a 500 mL

Sl. Molibdato de amonio (1).

12.5 g Molibdato de amonio en 100 mL

agua destilada.

Sol. Ácido sulfúrico 5 M (2)

49.04 mL H2SO4 completar a 100 mL con agua destilada

Conservar en frasco ámbar cerrado

Sl. Reductora (4):1 gr ácido ascórbico

100 mL agua destilada

Sl. Patrón Fosfato de sodio dihidrogeno (5):

1 gr NaHaPO4En 100 mL agua destilada

Soluciones patrón (6):2 ppm = 2 mL Sl. (5)

1.5 ppm = 1.5 mL Sl. (5) 1 ppm = 1 mL Sl. (5)

0.5 ppm = 0.5 mL Sl. (5)0.2 ppm = 0.2 mL Sl. (5)0.1 ppm = 0.1 mL Sl. (5)

Completar 100 mL agua destilada.

LECTURA:Absorbancia 660 nm

VER PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE SUELO.

1.425 g de suelo10 mL Sl. (3)

Agitar durante 40´´

ANALITO:9 mL de sl. patrón (6) ó agua destilada (blanco)

5 mL Sl. (4)3 mL Sl. (5)

Filtrar inmediatamente a través papel filtro

Tomar 1 mL del extractoMezclar con 9 mL Sl. (4)

Esperar 15 ´

DETERMINACIÓN FOSFORO EN SUELOS

(McKean, 1993)

24

ANEXO 8

Análisis químico potasio en suelo, extracción Bray II, cuantificación

espectrofotometría de absorción atómica. (Campos, 1994)

EXTRACCIÓN

2.85 g de suelo pretratadoadicionar 20 mL sl. (1)

Agitar durante 40 segundos

SOLUCIONES

Sl. (1) Bray II:* 1.11 g NH4F en 16.64 mL de HCl 6 M* Completar a 1 L con agua destilada

Sl.HCl 6 M:218.7 mL HCl completando a 1 L

con agua destilada

Filtrar inmediatamente con papel filtro

Determinación de potasio en el extracto por EMISIÓN

LECTURA

(2) SOLUCIÓN ESTÁNDAR 100 ppm K:0.1907 g KCl (seco a 105°C / 2 h)

Aforar a 1 L con Sl NaHCO3 pH 8.5

Sl NaHCO3 0.5 M pH 8.5:* 42.04 g NaHCO3 en 800 mL agua

destilada* Mezclar hasta disolución

completa* Ajustar pH a 8.5 con NaOH 1 M

* Aforar a 1 L(almacenar en polietileno)

Sl NaOH 1 M: 40.816 g NaOH en 1 litro agua

destilada; sí la pureza es del 98% (40g/0.98)

Espectrofotómetro de Absorción Atómica:

* 766.5 longitud de onda * SLIT: 2.0

* Llama: aire acetileno* Tiempo de lectura 1 segundo

Lectura en meq 100 g-1

SOLUCIONES DE TRABAJO (curva)A partir de la Sl. (2) tomar alícuotas de

0, 1 , 2, 5, 10 y 20 mL y completar a 250 mL de agua

(quedarán estándares de 0, 2, 4, 10, 20 y 40 ppm)

25

ANEXO 9

Base de datos análisis químicos, con arreglo estadístico valores faltantes.

Tratamiento Muestreo Análisis Químicos (ppm)

Potasio (K) Fosforo (P) Nitrógeno (N)

Pseudomonas fluorescens(1)

1

13,59 10,87 0,078

Pseudomonas aeruginosa(2) 13,26 11,07 0,079

Bacillus subtilis(3) 14,01 10,35 0,079

Testigos(4) 12,98 10,38 0,078


2

13,69 11,98 0,078



Testigos(4) 12,83 10,65 0,080


3

13,39 11,89 0,080



Testigos(4) 12,56 10,58 0,080


4

14,58 12,06 0,089



Testigos(4) 12,03 10,33 0,079


5

15,98 13,58 0,076



Testigos(4) 11,53 11,01 0,078


6

15,04 18,01 0,075



Testigos(4) 11,03 10,95 0,075

Fuente: Autor

26

BIBLIOGRAFÍA.

Boschetti, G., Quintero, C., Diaz-Zorita, M., & Barraco, M. (2003). Determinación del

fósforo disponible en el suelo por el método de Bray. Informaciones agronómicas

del cono sur. 17(1): 6-9.

Bremner, J., & Edwards, A. (1965). Determination and isotope-ratio analysis of

different forms of nitrogen in soils: I. Apparatus and procedure for distillation and

determination of ammonium. Soil Science Society of America Journal. 29(5): 504-

507.

Burguet, L., Sierra, P., Brito, G. (2012) Conservación de cepas microbianas por el

método de liofilización para el control microbiológico en laboratorios Liorad. Revista

CENIC Ciencias biológicas. 43(3): 1 – 4.

Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., Palao, M., Serrano, B., & Velázquez, O. (2009).

Técnicas para el Análisis. Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química,

UNAM. México. Recuperado de

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-

placa_6527.pdf

Campos, E. (1994). Control de calidad de insumos y dietas acuícolas. Fundación

Chile. Recuperado de http://www.fao.org/docrep/field/003/ab482s/ab482s04.htm

Díaz, A. (2009). Diseño estadístico de experimentos Segunda edición. Universidad

de Antioquia. 265 p.

García, J., Albaladejo, J., & Fernández, J. (2006). Métodos de inferencia estadística

con datos faltantes. Estudio de simulación sobre los efectos en las estimaciones.

Estadística española. 48(162): 241-270.

Higa, T., & Parr, J. (2013). Microorganismos Benéficos y efectivos para una

agricultura y medio ambiente sostenibles. Maryland (USA) Centro internacional de

Investigación de Agricultura Natural, Departamento de Agricultura de los Estados

Unidos. 13 p.

Icontec. (2004). Norma Técnica Colombiana 3656. Gestión ambiental. Suelo. Toma

de muestras de suelo para determinar contaminación. Bogotá: Icontec

Negroni, M. (2000). Microbiología estomatológica. Ed. Médica Panamericana. 1(1):

556- 557.

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf

http://www.fao.org/docrep/field/003/ab482s/ab482s04.htm

27

Norma Técnica Colombiana NTC 1927. (2001) Fertilizantes y Acondicionadores De

Suelos. Definiciones, Clasificación Y Fuentes De Materias Primas.

Norma Técnica Colombiana NTC-ISO 11464. (2002). Gestión ambiental. Calidad

del suelo. Pretratamiento de las muestras de suelo para análisis fisicoquímicos.

Bogotá: Icontec.

Rodríguez, E., Gamboa, M., Hernández, F., & García, J. (2005). Bacteriología

general: Principios y prácticas de laboratorio. Costa Rica: Editorial Universidad de

Costa Rica. 1(1): 63 -65.

Velázquez, A., & Ramos, M. (2015). VIII Congreso Mundial de la Palta. Perú.

Beneficios de microorganismos solubilizadores de P y K en la recuperación y

mantenimiento de suelos agrícolas. Recuperado de

http://www.avocadosource.com/WAC8/Section_07/VelazquezGurrolaA2015.pdf

http://www.avocadosource.com/WAC8/Section_07/VelazquezGurrolaA2015.pdf

informe final pasantÍa microorganismos promisorios

Documents