informe final estudio de la presencia de ralstonia...
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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA- CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –FONACYT-
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE AGRONOMÍA
INFORME FINAL
ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE Ralstonia solanacearum E.F Smith EN AGUAS DE RIOS UTILIZADOS PARA IRRIGACION EN GUATEMALA
PROYECTO FODECYT No. 05-2007
Gregorio Amílcar Sánchez Pérez Investigador Principal
Ramiro López Pineda Investigador asociado
GUATEMALA, JULIO DE 2010
CONTENIDO
RESUMEN 2
ABSTRACT 3
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 5
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 7
1.2.1 Antecedente 7
1.2.2 Justificación del trabajo de investigación 8
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 9
I.3.1 Objetivos 9
I.3.1.1 Objetivo General 9
I.3.1.2 Objetivos Específicos 9
I.3.1.3 Hipótesis 9
I.4 METODOLOGIA 10
I.4.1 Localización 10
1.4.2 Estrategía metodológica…………………………………………………… 10
I.4.2.1 Población y Muestra 10
I.4.3 El Método 11
I.4.3.1 Colectas de muestras de agua y planta para aislamiento de Ralstonia
solanacearum 11
I.4.3.2 Aislamiento del la bacteria fitopatógena 11
I.4.3.3 Identificación de la bacteria en base a su morfología sobre el medio de
Cultivo SMSA o CPG 11
I.4.3.4 Identificación de las especies de plantas hospederas de Ralstonia
solanacearum 12
I.4.3.5 Aislamiento de ADN de las bacterias aisladas de R. solanacearum 12
I.4.3.6 Determinación de la presencia de Ralstonia solanacearum a usando la
técnica de PCR con cebadores generales 13
I.4.3.7 Análisis de PCR para identificación de raza 3 de R. Solanacearum 13
I.4.3.8 PCR múltiple para la caracterización de filotipo 13
I.4.3.9 Caracterización de Biovar 14
I.4.3.10 PCR para amplificación de un fragmento del gen de Endoglucanas 14
I.4.3.11 Clonación de los fragmentos de los genes Endoglucanasa 15
I.4.3.12 Transformación de células de Escherichia coli con el gen
Endoglucanasa de Ralstonia solanacearum 15
I.4.3.13 Extracción de ADN de plásmido de células de E. coli transformadas16
I.4.3.14 Procedimiento de secuenciación del gen Endoglucanasa de los aislados
de Ralstonia solanacearum 16
I.4.3.15 Patogenicidad de las cepas de Ralstonia solanacearum colectadas,
en áreas de producción de papa 17
PARTE II
MARCO TEÓRICO 18
II.1 La marchitez causada por Ralstonia solanacearum E. F. Smith 18
II.1.2 Clasificación taxonómica de Ralstonia solanacearum 18
II.1.3 Características de Ralstonia solanacearum 18
II.1.4 Ecología y dispersión de Ralstonia solanacearum 18
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SENACYT 2
II:1.5 Diversidad genética de Ralstonia solanacearum 19
II.1.6 Ralstonia solanacearum como patógeno de plantas 20
II.1.7 Síntomas de la enfermedad del moco de la papa causada por Ralstonia
solanacearum 20 II.1.8 Síntomas de la enfermedad de la marchitez bacteriana del tomate causada por
Ralstonia solanacearum. 21
II.1.9 Presencia de Ralstonia solanacearum en Guatemala 22
II.1.10 Presencia de Ralstonia solanacearum en aguas de ríos en Europa 23
II.1.11 Control de Ralstonia solanacearum en cultivo de tomate y papa 24
PARTE III
RESULTADOS 25
III.1 Muestras colectadas e identificación de plantas hospederas 25
III.2 Aislamiento del patógeno en base a su morfología 29
III.3 Identificación molecular de Ralstonia solanacearum usando la técnica
de PCR con cebadores generales 30
III.4 Identificación de Ralstonia solanacearum raza 3, mediante prueba de PCR usando
cebados específicos 31
III.5 Determinación de la densidad poblacional de Ralstonia solanacearum en aguas de
ríos 32
III.6 Caracterización bioquímica de biovares de Ralstonia solanacearum 33
III.7 Determinación del filotipo mediante la técnica de PCR múltiple 34
III.8 Determinación del sequevar de Ralstonia solanacearum por medio de la
secuenciación del gen de la Endoglucanasa 35
III.9 Patogenicidad de los filotipos y secuevares de Ralstonia solanacearum colectadas,
en áreas de producción de papa y tomate en Guatemala 36
III.10 Discusión de resultados 38
PARTE IV.
IV.1 CONCLUSIONES 41
IV.2 RECOMENDACIONES 42
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 43
IV.4 ANEXOS 46
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO 56
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SENACYT 3
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fotografía de una gel de agarosa donde se observa el tamaño de la banda de ADN
amplificadas para cada uno de los filotipos de Ralstonia solanacearum, tambien
se está presente la banda de 280 pares de bases obtenido con el cebador general de
R. solanacearum. Las marcas rojas representa la posición aproximada de los
cebadores en la Región Espaciadora Transcrita (ITS) entre los genes ribosomales
16S y 23S. (Fegan y Prior, 2005) 19
Figura 2. Tubérculos de papa con el moco de la papa causada por Ralstonia solanacearum,
se observa un exudado cremoso a partir del anillo vascular 21
Figura 3. Planta adulta de tomate mostrando síntomas de marchitez bacteriana causada por
Ralstonia solanacearum, (C. Allen) 22
Figura 4. Realización de la prueba ELISA a nivel de campo en una plantación de tomate en
el municipio de Monjas, Jalapa. Se observan las plantas de tomate mostrando
síntomas de la enfermedad de marchitez bacteriana causada por Ralstonia
solanacearum 25
Figura 5. Prueba con immunostrip ELISA, la presencia de una sola banda (tira superior)
resultado negativo para la presencia de Ralstonia solanacearum, la presencia de
dos bandas es un resultado positivo, indica la presencia de Ralstonia
solanacearum 25
Figura 6. Resultado de la prueba ELISA realizado en el campo, la aparición de dos bandas
en las tiras indican un resultado positivo (izquierda) para la presencia de
Ralstonia solanacearum, una sola banda indica un resultado negativo (derecha)
26
Figura 7. Planta de Solanum americanum, (quilete) con síntomas de marchitez bacteriana,
a orillas de una plantación de tomate 26
Figura 8. Plantación de tomate en Salamá Baja Verapaz, plantas sin síntomas de la
enfermedad de marchitez bacteriana 27
Figura 9. Plantación de berenjena con síntomas de la enfermedad de la marchitez
bacteriana, en Estanzuela, Zacapa 27
Figura 10. Colonias aisladas y en cultivo puro con la características morfológicas de
Ralstonia solanacearum creciendo sobre medio de cultivo CPG 29
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SENACYT 4
Figura 11. Colonias con la morfología típica de Ralstonia solanacearum sobre medio de
cultivo SMSA 30
Figura 12. Fotografía de una gel de agarosa después de tinción con bromuro de etidio,
seobservan las bandas de 280 pares de bases obtenida con PCR en las muestras
que dieron positivo para presencia de la bacteria Ralstonia solanacearum,
muestras en los carriles 2 a 10 y 13 a 15. Las muestras en los carriles 11 y 12
dieron un resultado negativo. En el carril 16 está el control negativo, y en el
carril 17 el control positivo 31
Figura 13. Fotografía de una gel de agarosa con productos de PCR en la identificación de
Ralstonia solanacearum raza 3, mediante la técnica de PCR usando cebadores
específicos para la raza 3 de dicha especie. En el carril 1 se observa el marcador
de peso molecular, en los carriles 2 a 7 y 10 a 12 se observa la banda de 304
pares de bases para la raza 3. En el carril 14 se observa la banda de 304 pares de
bases obtenida con el control positivo. Carril 13 control negativo 31
Figura 14. Fotografía de una placa multiwell, donde se observa el cambio de coloración de
verde a amarillo que ha desarrollo el medio de cultivo Hayward, producto de la
oxidación de fuentes de carbono por la bacteria Ralstonia solanacearum. El
color original era verde, algunas muestras tiene una coloración amarilla, indica
una reacción positiva 33
Figura 15. Fotografía de una gel de agarosa, en los carriles de 1 a 9, y carril 13 se observa la
banda de 372 pares de bases amplificada en las muestras de Ralstonia
solanacearum colectadas en las áreas de producción de papa, corresponden al
filotipo II; en los carriles del 10 al 12 y del 14 al 17 la banda de 144 pares de
bases amplificada en las muestras de Ralstonia solanacearum colectadas en las
áreas de producción de tomate, la cual corresponde al filotipo I. La banda de 280
pares de bases corresponde a la amplificación con el par de cebadores generales,
el cual es común para todas las cepas de Ralstonia solanacearum. En los
carriles, 18 al 21 están los bandas obtenidas con los controles positivos para el
filotipo II, IV, I y III respectivamente 34
Figura 16. Árbol filogenético basado en la secuencia parcial del gen de la Endoglucanasa
de cepas colectadas en Guatemala y cepas de referencia de Ralstonia
solanacearum. Las cepas colectadas en Guatemala en areas cercanas a las
plantaciones de tomate están representadas por GT5 y las cepas colectadas en
áreas cercanas a la plantaciones de papa están representadas por GT10 36
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SENACYT 5
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Nombre de las áreas donde fueron colectadas las muestras, así como algunas
características climáticas 10
Cuadro 2. Nombre de las plantas hospderas, fecha de colecta, nombre de las áreas de colecta
plantas y código de almacenamineto que fueron positivas para la presencia de
Ralstonia solanacearum 28
Cuadro 3. Nombre de los ríos y lugares donde se colectaron muestras de agua que fueron
positivas para la presencia de Ralstonia solanacearum 32
Cuadro 4. Resumen del resultado de las lecturas de la oxidación de carbohidratosen el medio
de cultivo Hayward por Ralstonia solanacearum, tres semanas después de la
inoculación 34
Cuadro 5. Promedio del porcentaje de marchitez de las plantas de tomate variedad Bonny
Best, a los 6, 8 y 10 días después de la inoculación con cada una de las cepas
aisladas de R. solanacearum 37
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RESUMEN
La bacteria Ralstonia solanacearum es un patógeno de importancia
económica por los daños que causa en la agricultura en varios países, y Guatemala.
Este patógeno es el agente causal de la enfermedad denominada marchitez del tomate
y también la enfermedad del moco de la papa. Estudios realizados en Estados
Unidos de America y varios países de Europa han demostrado que dicha bacteria
puede ser aislado de agua colectada de ríos cercanos a plantaciones infectadas por
dicho patógeno, lo cual presenta un potencial problema ya que muchos agricultores
utilizan agua de río para irrigación de campos de cultivo.
Durante los meses de junio de 2007 a mayo de 2008, se realizó un estudio para
determinar la presencia de Ralstonia solanacearum en varios ríos cercanos a
plantaciones de papa en los departamentos de Quetzaltenango, Sololá, y Baja
Verapaz; y en varios ríos cercanos a plantaciones de tomate en los departamentos de
Zacapa, Chiquimula, Jalapa, Jutiapa y El Progreso.
Se colectaron 200 muestras de agua de ríos, tanto en época de lluvia como en
época seca. Utilizando el medio SMSA y CPG, se aisló el patógeno de 13 muestras
colectadas en época de lluvia, tanto en ríos cercanos a plantaciones de tomate como
en ríos cercanos a plantaciones de papa. De las muestras colectas en época seca
ninguna resulto positiva para la presencia de la bacteria. En las muestras que
resultaron positivas la densidad poblacional de dicha bacteria varió 10 a 30 unidades
formadoras de colonia por litro de agua colectada.
Se colectaron 24 plantas que en campo resultaron positivas para la presencia
de Ralstonia solanacearum mediante la prueba ELISA con immunostrip, 6 plantas
eran de la especia Solanum americanum, 7 plantas voluntarias de tomate que crecían
a orillas de un campo infestado por la bacteria y cerca de la orilla de ríos, 2 plantas de
la especie Oxalis latifolium, 3 plantas de la especie Zingiber officinalis. En ríos en
las áreas de producción de papa, se colectaron 5 plantas de papa que crecían como
voluntarias a la orilla de ríos ubicados cerca de plantaciones de papa, asimismo se
colectó 1 planta de crisantemo Chrysanthemum morifolium. Las cepas de Ralstonia
solanacearum colectadas fueron confirmadas mediante la prueba de PCR usando un
par de cebadores generales para dicha especie. En todas las muestras colectadas cerca
de las plantaciones de papa se aisló Ralstonia solanacearum raza 3. Todas las cepas
de Ralstonia solanacearum colectadas en las áreas de producción de tomate
corresponden al biovar 3 y todas las cepas de Ralstonia solanacearum colectadas en
las áreas de producción de papa corresponden al biovar 2.
Por análisis de un fragmento del gen de la Endoglucanasa se determinó que las
cepas colectadas en las zonas de producción de papa pertenecen al filotipo II,
específicamente al secuevar 1; mientras que las cepas colectadas en los ríos cercanos
a plantaciones de tomate en el oriente de Guatemala pertenecen al filotipo I, secuevar
14.
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SENACYT 7
ABSTRACT
Ralstonia solanacerum causes bacterial wilt of tomato and brown rot in potato
tubers; this pathogen can produce severe economic losses worldwide. Studies in the
United States of America and European countries have shown that the pathogen can
be isolated from water collected from rivers near plantations infected with this
pathogen, which presents a potential problem since many farmers use water from
rivers for irrigation.
During period from June 2007 to May 2008, a study was performed to determine the
presence of Ralstonia solanacerum in rivers near potato fields in Quetzaltenango,
Sololá, and Baja Verapaz, and rivers near plantations tomato in the East site of
Guatemala in Zacapa, Chiquimula, Jalapa, Jutiapa and El Progreso.
200 samples of water from rivers were collected, during the rainy season and in dry
season. Using SMSA medium and CPG, pathogen was isolated from 13 samples
collected in the rainy season, in rivers near tomato fields as well in rivers near potato
fields. Population density of the bacteria varied from 10 to the 30 colony forming
units per liter of collected water.
24 plants that were collected in the field were positive for the presence of Ralstonia
solanacerum by ELISA ImmunoStrip, 6 plants of Solanum americanum, 2 plants of
Oxalis latifolium, 3 plants of Zingiber officinalis, and 1 Chrysanthemum
morifolium. Outside of field production 7 plants of tomato were collected and 5
plants of potato near rivers.
Ralstonia solanacearum strains collected were confirmed PCR using a pair primer
for that specie. Strains collected near potato crops were positive in PCR for race 3.
Biovar characterization indicated that all strains collected in tomato area production
are biovar 3 and all strains collected in potato area production are biovar 2
Analyzing a partial sequence of the Endoglucanase gene indicated that Ralstonia
solanacearum strains collected in potato area production belong to phylotype II,
specifically sequevar 1; and strains collected in rivers near tomato fields in eastern
Guatemala belong the phylotype I, sequevar 14.
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SENACYT 8
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaria
Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología – CONCYT-.
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SENACYT 9
PARTE I
I.1 INTROUDUCCION
Ralstonia solanacearum es una bacteria fitopatógena que infecta alrededor de
450 especies de plantas que pertenecen a mas de 50 familias botánicas.
Genotípicamente este patógeno es muy diverso y existen muchas cepas que afectan
diferentes cultivos alrededor del mundo incluyendo banano, tabaco, tomate,
berenjena, papa, geranio, chile pimiento y maní son los cultivos mas afectados. En el
cultivo del tomate causa la enfermedad denominada marchitez bacteriana, y en el
cultivo de papa causa la enfermedad denominada moco de la papa. Ralstonia
solanacearum es un patógeno que se disemina muy fácilmente por medio de material
vegetal de propagación tales como tubérculos, rizomas, esquejes, pero también se
disemina por herramientas agrícolas, maquinaria, insectos, por humanos y por aguas
de ríos. Los síntomas que presentan las cultivos infectados por este patógeno son
marchitamiento de las hojas debido a que el patógeno ingresa a los tejidos del xilema
donde se multiplica en grandes cantidades y produce exopolisacaridos que en
conjunto obstruyen el paso del agua; llegando la planta a tener difícil de agua al no
existir un balance entre el agua que transpira y el agua que es conducida en los vasos
del xilema, la planta infectada puede morir.
Ralstonia solanacearum es capaz de sobrevivir periodos de hasta 10 años en
el suelo en ausencia de su planta hospedera, y también es capaz de infectar varias
especies de malezas que no manifiestan síntomas de marchitez, pero que son
portadoras de la bacteria. Otros factores que contribuyen a la diseminación de la
enfermedad son el suelo infestado que se adhiere a los zapatos y el agua de riego
contaminada. En Guatemala Ralstonia solanacearum ha sido detectado afectando
las plantaciones de banano, papa y tomate. En el cultivo de banano, causa la
enfermedad denominada moco del banano y se ha reportado esta enfermedad tanto en
la costa del Atlántico así como en plantaciones en la costa del Pacifico, un monitoreo
constante por personal de campo es requerido para poder evitar los severos daños
económicos que podría causar esta enfermedad. En la producción de tomate el cual
es desarrollada principalmente por pequeños productores esta enfermedad esta
causando serios daños, ya que el patógeno esta siendo dispersado principalmente por
maquinaria agrícola, ya que es común que un solo tractor es arrendado por varios
agricultores una determinada área. En el cultivo de papa, el cual es propagado por
métodos vegetativos mediante el uso de tubérculos, muchos productores no utilizan
semilla certificada, que garantice la inocuidad de los tubérculos. Actualmente existen
reportes de la presencia del patógeno en varias áreas de producción de papa y tomate,
debido a la falta de asistencia técnica muchos agricultores no saben como manejar la
enfermedad.
Teniendo estos antecedentes se realizo la presente investigación con el
objetivo de poder determinar la presencia de Ralstonia solanacearum en plantas
fuera de campos de cultivo y en aguas de ríos que existen cerca de plantaciones de
tomate en los departamentos de El Progreso, Jalapa, Zacapa, Chiquimula, Jutiapa, y
en ríos cerca de plantaciones de papa en Quetzaltenango, Sololá y Baja Verapaz. Se
colectaron muestras de aguas de ríos en época lluviosa y en época seca, y se
realizaron pruebas ELISA en el campo para determinar la presencia del patógeno en
diferentes especies de plantas que mostraban marchitez. En el laboratorio se aisló el
patógeno y luego se procedió a la caracterización morfológica, serológica y
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SENACYT 10
molecular. Se confirmo la patogenicidad de los aislados a través de la inoculación de
los mismos a plantas de tomate de la variedad Bonny Best. Las cepas de Ralstonia
solanacearum colectadas en aguas de ríos y en plantas en las áreas de producción de
tomate en El Progreso, Chiquimula, Zacapa, Jalapa, Zacapa y Jutiapa pertenecen
bioquímicamente al biovar 3, y filogenéticamente al filotipo I, secuevar 14 cuyo
origen es Asia. Las cepas de Ralstonia solanacearum colectadas en aguas de ríos y
en plantas en las áreas de producción de tomate en Quetzaltenango, Sololá y Baja
Verapaz, pertenecen bioquímicamente al biovar 3, y filogenéticamente al filotipo II,
secuevar 1 cuyo origen es el continente americano
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SENACYT 11
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.2.1 Antecedentes
En Guatemala Ralstonia solanacearum es un patógeno que causa serias
pérdidas económicas en los cultivos de papa, tomate y banano. En Guatemala los
primeros reportes del patógeno fueron realizados por las compañías bananeras en
1950, tiempo en el cual causaba grandes problemas en las plantaciones de banano ya
que el patógeno se disemina fácilmente por las herramientas que utilizan los
trabajadores de campo en las practicas agrícolas como la poda y el deshoje del
cultivo. En el cultivo de papa existen varios reportes desde los años 1960s, acerca la
infección del cultivo de papa por la bacteria. En el año 1996 agricultores de Aldea El
Tempisque reportaron la presencia de un problema de marchitez que estaba afectando
sus cultivos, fue en el año 2002 que investigadores de la Universidad de San Carlos
confirmaron la presencia del patógeno en dicha área.
En enero de 2003, los laboratorios de diagnostico fitopatologico del
Departamento de Agricultura de Estados Unidos, identificaron la presencia de R.
Solanacearum pertenecientes al grupo raza 3-biovar 2, en esquejes de geranio
importados de Guatemala, por la empresa Esquejes, S.A. ubicada en Jalapa,
Guatemala. En el año 2002 R. Solanacearum Raza 3 biovar 2, fue puesto en la lista
de agentes seleccionados que pueden ser utilizados como bioterrorismo. En
Guatemala el patógeno se ha venido dispersando por diferentes medios tales como
herramientas, maquinaria agrícola, material vegetal de propagación, en los cultivos
de papa, tomate esto a obligado a los agricultores a movilizarse hacia nuevas áreas
de cultivo. Una de los probables métodos de dispersión de la enfermedad es
relacionado al uso de agua de río, ya que la muchos de agricultores utilizan agua de
los ríos para irrigar sus plantaciones de tomate. El problema es muy serio si se
considera que las plantaciones de papa se encuentran en la parte alta de las cuencas, y
muchos agricultores productores de papa, dejan abandonado tubérculos enfermos no
comerciales en los campos de cultivo. Debido a lo anteriormente expuesto se realizó
la presente investigación FODECYT O5-2007 “Estudio de la presencia de R. Solanacearum en aguas de ríos utilizados para irrigación en Guatemala” con el
objetivo de determinar si el patógeno se esta dispersando en las aguas de ríos y si
otras especies de plantas pueden servir de hospedero de la bacteria.
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SENACYT 12
1.2.2 Justificación del trabajo de investigación
La enfermedad denominada marchitez bacteriana del tomate y moco de la papa
es causada por la bacteria Ralstonia solanacearum, en Guatemala este patógeno se
ha estado dispersando a áreas donde previamente no se había reportado, obligando a
muchos agricultores a abandonar las áreas con donde está dicha enfermedad y
movilizarse a nuevas áreas donde no se tiene dicho patógeno, lo cual implica mayores
gastos ya que tienen que arrendar terrenos para producción agrícola y movilización
de su equipo hacia áreas más lejanas.
La dispersión del patógeno de las áreas contaminadas hacia otras áreas se está
dando debido al uso de herramientas, maquinaria contaminadas que previamente
fueron utilizados en plantaciones con síntomas causados por Ralstonia
solanacearum. Uno de los aspectos importantes en el manejo integrado de una
enfermedad en un cultivo agrícola es el entendimiento de la ecología del organismo
patogénico en el ambiente. La habilidad de Ralstonia solanacearum para sobrevivir
en suelo y en agua bajo condiciones naturales es poco entendido. Previamente a la
presente investigación no se tenía reporte de la presencia del patógeno en agua de río
en Guatemala. En el presente estudio se planteó el diagnostico de la presencia de
Ralstonia solanacearum en aguas de ríos utilizados para irrigación, ya que se pretende
determinar que ríos están contaminados con la bacteria, esto permitirá dar mejores
recomendaciones para el manejo integral de la marchitez bacteriana. Es importante
que los productores de tomate y papa sepan la bacteria Ralstonia solanacearum está
siendo dispersado de los campos de cultivos hacia los ríos y que antes de utilizar el
agua de un río para riego de campos agrícolas es importante poder determinar si en el
área de existe la presencia de Ralstonia solanacearum.
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SENACYT 13
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
Determinar la presencia de Ralstonia solanacearum en aguas
de ríos utilizados para irrigación en Guatemala.
I.3.1.2 Específicos
I.3.1.2.1 Implementar un método de diagnóstico que pueda ser
utilizado para determinar la presencia de Ralstonia
solanacearum en aguas utilizadas para irrigación en
Guatemala.
I.3.1.2.2 Determinar la especies de plantas acuáticas de la
familia solanaceae, que puedan servir de hospedante de la
bacteria Ralstonia solanacearum .
I.3.1.2.3 Determinar la densidad poblacional de Ralstonia
solanacearum en aguas de ríos contaminados.
I.3.1.2.4 Caracterizar por métodos bioquímicos las cepas
Ralstonia solanacearum , colectadas.
I.3.1.2.5 Determinar el filotipo y sequevar de las cepas de
Ralstonia solanacearum colectadas, por medio de la
secuenciación del gen de la Endoglucanasa.
1.3.1.2.6 Comprobar la patogenicidad de las cepas de Ralstonia
solanacearum colectadas.
I.3.1.3 Hipótesis
A. Ralstonia solanacearum tiene la habilidad de poder dispersarse de los
campos infestados hacia los ríos cercanos a las plantaciones infectadas y poder
desplazarse río abajo.
B. Las cepas de Ralstonia solanacearum que se encuentran infectando las
plantaciones de papa en las áreas de producción de papa son genéticamente
identificas a las cepas que afectan las plantaciones de tomate.
ID-D-0005
SENACYT 14
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización:
Las muestras de material vegetal infectados con Ralstonia solanacearum
fueron colectados en diferentes regiones productoras de papa y tomate en Guatemala,
En el cuadro 1 se presentan los datos de temperaturas media, altitud sobre el nivel del
mar y precipitación pluvial promedio de cada una de las regiones muestreadas. La
fase de laboratorio de la presente investigación se realizó en el laboratorio de
Biotecnología de la Facultad de Agronomía, de la Universidad de San Carlos de
Guatemala, la secuenciación de ADN del gen de la Endoglucanasa se realizó la
Universidad de Wisconsin-Madison, Estados Unidos de América
I.4.2 Estrategia Metodológica
I.4.2.1 Población y Muestra
A. Población: plantas o fragmentos de plantes de papas (Solanum tuberosum),
tomate (Solanum lycopersicum) infectadas con el patógeno Ralstonia solanacearum
y otras plantas que crecían cerca de los ríos donde hayan plantaciones de papa y
tomate con síntomas de la enfermedad de marchitamiento. Las colectas se hicieron en
los departamentos de Quetzaltenango, Sololá, Baja Verapaz, El Progreso, Jutiapa,
Jalapa, Zacapa y Chiquimula.
Cuadro 1. Nombre de las áreas donde fueron colectadas las muestras, asi como
algunas características climáticas.
Área de cultivo
Departamento Municipio Temperatura
media en ºC Precip.Pluvial
mm
Metros s. el nivel del mar
papa Quetzaltenango Concepcion
Chiquirichapa 17 1400 2470
papa Quetzaltenango Zunil y Almolonga
15 950 2602
papa Sololá Sololá 17 1200 2060
papa Baja Verapaz Purulhá 18 900 1584
Tomate El Progreso Sanarate y Sansare
25 700 815
Tomate Zacapa Zacapa,
Estanzuela 28 600 200
Tomate Jalapa Monjas Jalapa 22 1242 950
Tomate Jutiapa Agua Blanca 25 1203 880
Tomate Chiquimula Ipala 24 900 830
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SENACYT 15
B. Muestra: Plantas con síntomas de marchitamiento causado por Ralstonia
solanacearum, y agua de ríos ubicados cerca de plantaciones de papa con síntomas
de moco de la papa y plantaciones de tomate con síntomas de marchites bacteriana.
I.4.3 El Método
I.4.3.1 Colectas de muestras de agua y planta para aislamiento de Ralstonia
solanacearum
Se realizaron colectas de agua y plantas que estén cercanas a los ríos, donde se tenía
historial de la presencia de Ralstonia solanacearum, para ellos nos basamos en el
historial que se tiene en el centro de diagnóstico fitopatológico de la Facultad de
Agronomía USAC. Se colectaron 1000 ml de agua en recipientes plásticos estériles.
Las muestras fueron tomadas río arriba y río abajo de las plantaciones donde se
presenten problemas de marchitez bacteria en tomate o la enfermedad del moco de la
papa, estos causadas por R. solanacearum. A las muestras de planta se realizó una
prueba ELISA de campo, para ellos se usó el kit de ELISA Agdia.
Los muestreos se hicieron en la época seca, como en la época lluviosa, esto
con el objetivo de monitorear las fluctuaciones poblaciones de la bacteria en un año.
Las muestras se transportaron en cajas de madera a manera de mantener las
muestras a temperatura ambiente, ya que el exceso de calor puede matar la bacteria.
I.4.3.2 Aislamiento del la bacteria fitopatógena
De cada una de las muestras de agua colectadas se utilizaron 100 ml los cuales
tenían diferentes tipos de microbios en suspensión. Se centrifugaron con el objetivo
de precipitar las bacterias, seguidamente se descartó un volumen de 95 ml del
sobrenadante, evitando no tomar el material precipitado. Los restantes 5 ml se que
contenían el precipitado se agregaron a los medios de cultivos (SMSA), tanto líquido
como medio sólidos, este medio de cultivo tiene una serie de antibióticos y fungicidas
a los cuales R. solanacearum es resistente, esto permitió eliminar algunos de los
organismos saprofitos y facilitó el crecimiento de R. solanacearum.
En el caso de las muestras de plantas colectadas, un gramo de tejido vegetal se
homogenizó en un mortero estéril, conteniendo un ml de agua estéril. Seguidamente
se colocó sobre el medio de cultivo CPG o SMSA.
Los medios de cultivo de tejido conteniendo tanto las muestras de agua como
las muestras de tejido vegetal, se incubaron a 28 ºC, durante 72 horas.
I.4.3.3 Identificación de la bacteria en base a su morfología sobre el medio SMSA
o CPG
Las colonias que presentaban las características fenotípicas de R.
solanacearum sobre los medio de SMSA o CPG, fueron preservadas en agua estéril a
temperatura ambiente para su posterior caracterización bioquímica y molecular.
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SENACYT 16
I.4.3.4 Identificación de las especies de plantas hospederas de R. solanacearum
Las muestras de plantas de las cuales se aisló el patógeno y por lo tanto se
consideraron como hospederas de R. solanacearum fueron identificadas, utilizando
las claves que existen en los tomos de la Flora de Guatemala, en el herbario de la
Facultad de Agronomía.
I.4.3.5 Aislamiento de ADN de las bacterias aisladas de Ralstonia solanacearum
El ADN genómico de la bacteria Ralstonia solanacearum fue aislado de
cultivos frescos del patógeno cultivados en medio líquido de CPG, para ello se utilizó
el kit de extracción de ADN de Epicentre, para ello se siguió el protocolo propuesto
por la empresa proveedora, el cual se resume a continuación:
Se cultivó la bacteria en medio CPG líquido durante 24 horas a temperatura de
28º C en una incubadora con agitación constante de 150 revoluciones por
minuto (rpm)
A un tubo eppendorf de 1.5 ml se agregó 1.5 ml de cultivo bacteriano y se
procedió a centrifugar a 8,000 rpm durante 3 minutos.
Seguidamente se descartó el sobrenadante, el precipitado resuspendido en 600
µl de solución para el lisado de las células (Celle Lysis Solution, Tris
(hydroxymethyl Aminomethane ethylenediamintraacectic acid & sodium
dodecyl sulfate)
Se incubó durante una hora a 65 ºC..
Luego se agregaron 3 µl de ARNsa, se mezcló agitándolo durante 20
segundos.
Los tubos conteniendo la muestra se incubaron a 37 ºC. durante 20 minutos.
Después del periodo de incubación se dejaron a temperatura ambiente durante
10 minutos.
Se agregaron 200 µl de reactivo de precipitación de proteínas (acetato de
amonio)
Se mezclaron agitando los tubos durante 2 minutos.
Se colocaron en el congelador durante 20 minutos.
Seguidamente se centrifugaron a 12,000 rpm por 6 minutos.
El sobrenadante se trasladó a otro tubo nuevo de 1.5 ml.
Se agregaron 600 µl de isopropanol (para precipitación del ADN)
Los tubos con las muestras se centrifugaron a 12,000 rpm durante 5 minutos.
Se eliminó el sobrenadante (teniendo precaución para no eliminar el
precipitado que se encontraba en el fondo del tubo).
Se agregaron 600 µl de etanol al 70%.
Se centrifugó a 12,000 rpm durante 5 minutos.
Se eliminó el sobrenadante (teniendo precaución para no eliminar el
precipitado que se encontraba en el fondo del tubo).
Los tubos se colocaron en forma invertida sobre papel mayordomo durante 20
minutos, para secar el ADN extraído y eliminar completamente el alcohol.
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SENACYT 17
Se agregaron 50 µl de solución de hidratación de ADN, y se incubaron a 65
ºC. durante una hora con el objetivo de facilitar la resuspensión del ADN
Las muestras de ADN extraído se almacenaron a -20 ºC., para su posterior uso
durante el proceso de caracterización molecular.
I.4.3.6 Determinación de la presencia de Ralstonia solanacearum a usando la
técnica de PCR con cebadores generales.
El ADN aislado de todas las cepas aisladas de R. solanacearum fueron
evaluadas mediante la técnica de PCR usando el par de cebadores generales (Opina,
1997) cuya secuencia es la siguiente:
759 (5-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3’) y
760 (5’-GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3’).
Las reacciones fueron realizadas en tubos de 250 µl, la mezcla de reacción (25 µl
volumen total) contenía, 30 ng de ADN geonómico como molde 1X PCR buffer sin
magnesio, 2.5 mM Mg++, 0.25 mM de cada nucleotido (ATP, CTP, GTP y TTP, 20
picomol de cada cebador, 1µl de Taq ADN polimerasa. Las reacciones de PCR
fueron amplificadas en un termociclador Biorad (MJ research 2000), bajo las
siguientes condiciones: un inicio en caliente 96ºC durante 3 minutos, seguidos de 30
ciclos de 15 segundos a 94 ºC , 30 segundos a 58 ºC
y 30 segundos a 72 ºC. Las
reacciones fueron completada con 5 minutos a 72 ºC. Los productos de PCR fueron
corridos en un gel de agarosa a 1.5% por electroforesis, posteriormente la gel fue
sumergida en bromuro de etidio para su tinción, las bandas fueron visualizadas con
luz UV, y fotografiadas para su posterior análisis.
I.4.3.7 Análisis de PCR para identificación de raza 3 de Ralstonia
solanacearum: Las reacciones fueron realizadas usando un termociclador Biorad (MJ research
2000). Las reacciones se realizaron en tubos de 250 µl, usando un par de cebadores
específicos para raza 3 (Danial, 2006), cuyas secuencias son las siguientes 630 (5’-
ATACAGAATTCGACCGGCAC-3') y 631 (5’AATCACATCCAATTCGCCTACG-
3’), la mezcla de reacción (25 µl total volumen) contenía 30 ng de ADN genómico
como molde,1X PCR buffer sin magnesio, 2.5 mM Mg++, 0.25 mM de cada
nucleótido (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 20 picomol de cada cebador, 2.5 U de Taq
polimerasa. Las condiciones en el programa de PCR fueron las siguientes: un inicio
a alta temperatura a 96ºC durante 3 minutos, seguido por 30 ciclos de 15 segundos a
94ºC, 30 segundos a 58ºC y 30 segundos a 72ºC. La reacción fue completada con 5
minutos a 72ºC. Los productos de PCR fueron corridos en una gel de agarosa de
1.5% por electroforesis; las bandas fueron visualizadas con luz UV después de su
tinción con bromuro de etidio.
I.4.3.8 PCR múltiple para la caracterización de filotipo:
Las reacciones se realizaron en un volumen total de 25 µl, el cual contenía 30
ng de ADN geonómico, 1x PCR buffer sin magnesio, 2.5 mM Mg++, 0.25 mM de
cada nucleótido de ATP, CTP, GTP y TTP, 2.5 U de Taq ADN polimerasa, La
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secuencia de los cebadores y la cantidad utilizada de cada uno de ellos en la reacción
fueron las siguientes: 7 pmol del cebador Nmult:21:1F (5’-CGTTGATGAGGCGCGCAATTT-3’),
7 pmol del cebador Nmult:21:2F (5’-AAGTTATGGACGGTGGAAGTC-3’)
18 pmol del cebador Nmult:23:AF (5’-ATTACSAGAGCAATCGAAAGATT-3’)
7 pmol del cebador Nmult:22:InF (5’-ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA-3’)
10 pmol del cebador Nmult:22:RR (5’-TCGCTTGACCCTATAACGAGTA-3’)
6 pmol del cebador 759 (5-GTCGCCGTCAACTCACTTTCC-3’),
6 pmol del cebador 760 (GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG-3’).
Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador MJ research 200, bajo las
siguientes condiciones: un inicio a alta temperatura 96ºC durante 3 minutos, seguido
de 30 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC y 30 segundos a 72ºC. La
reacción fue completada con 5 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se corrieron
en geles de agarosa de 1.5% por electroforesis, seguidamente las geles se sumergieron
en bromuro de etidio, posteriormente las bandas fueron visualizadas con luz UV. Las
siguientes cepas de Ralstonia solanacearum fueron utilizadas como controles
positivo para los cuatro filotipos: UW363 para filotipo I; K60 para filotipo II;
UW386 para filotipo III; y UW443 para el filotipo IV, los cuales fueron obtenidos de
la colección de R. solanacearum de la Universidad de Wisconsin-Madison. En la
figura 1, se observa el patrón de bandas que se obtiene con los controles positivos
para cada una de los filotipos.
I.4.3.9 Caracterización de Biovar
Con el objetivo de poder clasificar las cepas aisladas en biovar, es decir,
determinar la habilidad de la bacteria de poder utilizar u oxidar determinados
carbohidratos, una serie de experimentos fueron realizados. 20 ml de cada una de
los siguientes soluciones (10 % peso/vol) como fuente de carbohidratos fueron
utilizado, Dextrosa, Lactosa, Dulcitol y D-mannitol; las soluciones se esterilizaron a
través de filtración y se agregaron a 200 ml del medio de Hayward, seguidamente un
volumen 2 ml del medio resultante se agregaron en cada celda de una placa con
múltiples celdas (Multiwell ™ Tissue Culture Plate 24 well). El medio de Hayward
sin ningún carbohidrato se utilizó como control negativo. Una suspensión a una
concentración de 1x108 CFU/ml se preparó de cada una de las cepas. Como control
positivo se utilizaron las siguientes cepas de Ralstonia solanacearum que fueron
obtenidas de la colección de bacterias de la Universidad de Wisconsin-Madison, para
biovar 1 (K60), para biovar 2 (UW 551), para biovar 3 (GMI 1000), para biovar 4
(UW 151) y para biovar 5 (UW 373). El presente trabajo se realizó con 3
repeticiones.
Cada celda fue inoculada con 3 µl de la suspensión de bacterias preparadas y
posteriormente incubada a 28ºC durante 3 semanas. Se tomaron datos a cada 2 días
I.4.3.10 PCR para la amplificación de un fragmento del gen de Endoglucanasa : Amplificación de un fragmento de 750 pares de bases del gen de
Endoglucanasa se obtuvieron usando el siguiente par de cebadores:
Endo-F (5’-ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3’)
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SENACYT 19
y Endo-R (5’-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3’),
los demás componentes de la reacción fueron 1X buffer de pfu Polimerasa, 0.25 mM
de cada dNTP; 6% DMSO, 20 pmol de cada cebador; 100 ng de ADN como molde y
5U de Pfu High fidelity ADN Polimerasa (Poussier, 2000)
Las reacciones de PCR fueron realizadas en un termociclador MJ research
200, bajo las siguientes condiciones 3 minutos de inicio a temperatura de 96ºC, luego
30 ciclos de 30 segundos a 95 ºC , 45 segundos a 70ºC, 1.5 minutos a 72ºC, con un
paso de extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Los productos de PCR fueron
examinados por electroforesis usando una gel de agarosa a una concentración de 1.5%
y las bandas fueron visualizadas con luz ultravioleta después de haber sido teñida con
bromuro de etidio.
I.4.3.11 Clonación de los fragmentos de los genes Endoglucanasa
Los productos de PCR obtenidos fueron clonados en el vector pCR® Blunt II-
TOPO (invitrogen™) de acuerdo a las instrucciones de la compañía productora.
Después el vector será introducido en células competentes de DHα5 de E. coli, y
sembrado sobre el medio sólido de Luria Bertani conteniendo el antibiótico
Kanamicina a una concentración 25 µg/ml, posteriormente fueron incubado durante
la noche a 37ºC.
I.4.3.12 Transformación de células de Escherichia coli con el gen Endoglucanasa
de Ralstonia solanacearum
- En la reacción de transformación se agregaron 2 μl del producto de la ligación
y 50 μl de células competentes de Escherichia coli. Utilizando un
electroporador se realizó el proceso de transformación
- Las células de E. coli transformadas se sembraron en medio de cultivo SOC
por 1 hora a 37 °C en constante agitación.
- Después de transcurrida la hora se tomó el medio SOC con las bacterias
transformadas y se colocó en un medio LB suplementado con Kanamicina ya
que el plásmido incorporado a las mismas contenía un gen de resistencia a
Kanamicina por cual confiere resistencia a dicho antibiótico.
- Las colonias de E. coli que potencialmente poseían el gen Endoglucanasa
presentaban una coloración blanca y las no transformadas presentaban una
coloración azul. Se escogieron 12 colonias de cada muestra transformada y se
realizó un PCR. Las condiciones de PCR fueron las mismas que se
describieron amplificar el fragmento del gen endoglucanasa.
- Los productos de PCR fueron examinados por electroforesis y las bandas se
visualizaron con luz ultravioleta, previa tinción con bromuro de etidio. Se
seleccionaron las colonias que contengan el tamaño adecuado de la banda, y se
cultivaron a 37ºC en el medio líquido de Luria Bertani conteniendo 25 µg/ml
de Kanamicina durante 16 horas. Seguidamente se extrajo el ADN de
plásmido.
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SENACYT 20
I.4.3.13 Extracción de ADN de plásmido de las células de E. coli transformadas
Después de confirmar por medio del PCR la presencia del gen Endoglucanasa en
las células de E. coli transformadas, se procedió a tomar 6 de las colonias positivas y
se sembraron en un medio LB liquido con Kanamicina, y se incubaron a 37 °C
durante toda 16 horas. Luego se procedió a realizar la extracción del plásmido, para
ello se utilizó el kit denominado Fermentas Miniprep, el cual en resumen es el
siguiente:
- El medio de cultivo líquido LB con las bacterias de E. coli que se incubó
durante 16 horas, se centrifugo a 12,000 rpm por 1 min, se descartó el
sobrenadante.
- Se resuspendieron las células precipitadas en 250 μl de solución de
resuspensión, hasta obtener una solución homogénea.
- Lisis de las células. Se realizó el lisado de las células resuspendidas por la
adición de 250 μl de Lysis solution. Inmediatamente se mezcló
cuidadosamente el contenido por inversión (6 a 8 veces) hasta que la mezcla
se vuelva clara y viscosa. Se incubó a temperatura ambiente durante 5
minutos.
- Neutralización. Se precipitó los restos de las células por la adición de 350 μl
de la solución de neutralización. Se mezcló cuidadosamente el tubo
conteniendo la mezcla, durante 6 segundos. Se centrifugó a una velocidad de
12,000 rpm durante 5 minutos.
- Se transfirió el lisado clarificado del paso anterior a un tubo de 2 ml el cual
contenía una columna con filtro de purificación. Se centrifugó a 12,000 rpm
durante 1 min. Se descartó el líquido que paso por el filtro. Seguidamente se
agregaron 500 μl de la solución de lavado (wash solution) a cada una de las
columnas. Se centrifugaron a 12,000 rpm por 1 minuto. Se descartó el líquido
que paso a través la columna y se reinsertó nuevamente la columna en el tubo
colector.
- A la columna se le agregó nuevamente 500 μl de la solución de lavado. Se
centrifugo nuevamente y se descartó el líquido obtenido en el tubo colector.
Se centrifugó de nuevo con la columna vacía por 1 minuto.
- Se transfirió la columna a un tubo estéril de 1.5 ml. Se agregaron 50 μl de
agua desionizada a la columna. Se incubaron 2 minutos. Y por último se
centrifugaron a 12,000 rpm por 2 minutos, la solución obtenida, el cual
contenía el ADN del plásmido, fue almacenada en el congelador.
I.4.3.14 Procedimiento de secuenciación del gen Endoglucanasa de los aislados
de Ralstonia solanacearum
Con el objetivo de poder determinar la secuencia de los nucleótidos que
contiene el gen Endoglucanasa de los aislados de Ralstonia solanacearum, se
procedió a realizar la técnica de PCR para secuenciación, la cual se resumen a
continuación:
Cada reacción se realizó en un volumen de 10 μl, el cual contenía: 0.7 μl de Big
Dye, 1.5 μl de Big Dye buffer, 1 μl de los cebadores T7 y SP6 (5 pmol/μl), 1 μl de
plásmido y agua pura hasta ajustar un volumen de 10 μl. La reacción se realizó en
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SENACYT 21
un termociclador JM Reseach PCT200, con las siguientes condiciones: 35 ciclos de
96°C por 10 segundos, 50°C por 15 segundos, 60°C por 3 minutos.
Previamente al proceso de secuenciación las muestras se limpiaron siguiendo el
procedimiento den Clean SEQ Vedas: el cual se resume a continuación:
Se agregaron 10 μl de agua destilada a cada uno de los tubos con las
muestras.
- 10 μl de reactivo Clean SEQ Beads
- 80 μl de etanol al 80% y se mezcló cuidadosamente con la pipeta.
- Se colocó en una gradilla magnética durante 2-3 minutos
- Se eliminó todo el liquido y seguidamente agregaron 200 μl de etanol al 80%.
- Se eliminó la mayor cantidad de líquido posible
- Los tubos fueron removidos de la gradilla magnética y se agregaron 25 μl de
agua.
- Se colocó de nuevo en la gradilla magnética y se transfirieron 10 μl a un
nuevo tubo.
- Por último las muestras se llevaron al Centro de Biotecnología de la
Universidad de Wisconsin-Madison, para su secuenciación.
- El análisis se realizará usando el programa ARB (http://www.arb-home.de) .
- Las secuencias obtenidas combinadas con otras secuencias almacenadas del
banco de genes, permitió construir un árbol filogenético.
I.4.3.15 Patogenicidad de las cepas de Ralstonia solanacearum colectadas, en
áreas de producción de papa y tomate
Para determinar la patogenicidad de las cepas de Ralstonia solanacearum
aisladas de las áreas de producción de papa y tomate, se utilizó la variedad de tomate
Bonny Best, la cual es una variedad de tomate muy susceptible a R. Solanacearum.
Las semilla de tomate fueron esterilizados con etanol al 70% durante 1 minuto, y
luego se sembraron en bandejas. Cuando las plántulas tenía 7 días de germinados se
transplantaron individualmente a macetas conteniendo 400 gramos de suelo. Dos
semanas después del transplante se inoculó con 50 mililitros de suspensión bacteriana
con una concentración de 4 × 1010
unidades formadoras de colonias/ml. Se
inocularon cuatro plantas de tomate por cada cepa aislada del patógeno. Las plantas
fueron mantenidas en un ambiente con temperatura de 28°C, y radiación solar natural.
La evaluación se realizó a los 5, 8 y 10 y días después de la inoculación, realizando
un evaluación visual del porcentaje de marchitez que mostraba cada una de las
plantas.
ID-D-0005
SENACYT 22
PARTE II. MARCO TEÓRICO
II.1 La marchitez causada por Ralstonia solanacearum E. F. Smith
En el año 1896 Erwin F. Smith, describió la marchitez bacteriana causada por
Ralstonia solanacearum. Actualmente más de 4000 documentos han sido publicados
acerca de esta devastadora enfermedad. Debido a su extensivo rango de infección de
plantas, ya que es capaz de afectar más de 250 especies y más de 50 familias
botánicas de plantas (Hayward, 1991), la marchitez bacteriana puede ser catalogada
como la enfermedad bacteriana más importante en las plantas.
II.1.2 Clasificación taxonómica de Ralstonia solanacearum
Pertenece a la subdivisión ß-proteobacteria, al grupo II en base a su homología
del rARN (grupo no fluorescente). Entre las pseudomonas, Ralstonia pickelii
(bacteria saprófita o patógeno humano facultativo) y Ralstonia syzygii (el agente
causal de la enfermedad denominada enfermedad de sangre en banano, en Indonesia)
estas especies están cercanamente emparentadas a Ralstonia solanacearum y pueden
causar una reacción cruzada en pruebas serológicas e incluso en métodos de detección
basados en amplificación de algunas bandas de un segmento de ADN (Danial, 2006).
II.1.3 Características de Ralstonia solanacearum
Ralstonia solanacearum es una bacteria Gram negativa, con forma de bastón
de 0.5 a 0.7 µm de diámetro x 1.5 a 2.5 µm de largo, aeróbica, móvil, no forma
esporas ni cápsulas, provoca reducción de nitratos y formación de amoniaco
(Buddenhagen, 1964).
La marchitez causada por la bacteria Ralstonia solanacearum es una de las
enfermedades que afecta la producción de muchos cultivos de importancia
económica incluyendo papa, tomate, bananos, tabaco, en varios países alrededor del
mundo (Buddenhagen, 1964; Elphinstone, 1998; Fegan, 2005 y Hayward 1991).
II.1.4 Ecología y dispersión de Ralstonia solanacearum
Ralstonia solanacearum es un habitante natural del suelo, puede sobrevivir
en residuos de cosechas, en malezas y en agua estancada. La bacteria se dispersa
fácilmente por medio de material vegetal de propagación con infección latente, por
herramientas de labranza, insectos polinizadores en banano, suelos infestados, agua de
riego, por frutos infectados (Hayward, 1964; Janse, 1996 y 1998; Kelman 1953; Kim,
2003; Sánchez, 2008; y Williamson, 2002). Esta bacteria tiene varios depredadores
naturales en aguas de ríos, los cuales incluyen bacteriófagos, protozoos y otras
bacterias (Alvarez, 2007), lo cual reduce drásticamente su población en condiciones
naturales.
La sobrevivencia de la bacteria en el suelo está afectad por factores abióticos
tales como la temperatura, la humedad del suelo, factores físicos y químicos; siendo la
temperatura más favorable las que oscilan entre 25 °C a 33 °C. En clima frío
menores a 18 °C, como en altitudes superiores a 2,500 metros sobre el nivel del mar,
ID-D-0005
SENACYT 23
la bacteria crece lentamente y convive con el cultivo, infección latente, sin causar
daños aparentes ni presentar síntomas visibles. En este caso, los restos de plantas,
material vegetativo de propagación, se convierten en portadores de la bacteria que al
ser sembrados en lugares calurosos, desarrollan la enfermedad en el cultivo.
II:1.5 Diversidad genética de Ralstonia solanacearum
R. solanacearum es genotípicamente muy diversos, recientes estudios
moleculares han revelado una alta diversidad genética de la bacteria, razón por la
cual se le considerada como un complejo de especies. (Fegan, 1998).La bacteria ha
sido clasificada en 5 razas basado vagamente según el rango de plantas hospederas;
también ha sido clasificada en 5 biovares basado en la habilidad de utilizar u oxidar
una serie de carbohidratos (Hayward, 1964). Recientes estudios moleculares ha
permitido proponer un sistema de clasificación filogenético basado en la comparación
de la secuencia de la región íntergénica de los genes ribosomales 16S-23S, la
determinación de filotipo puede ser determinado a través de técnica de PCR, al
amplificar determinado segmento específico de cada filotipo, figura 1 (Fegan, 2005).
Figura 1. Fotografía de una gel de agarosa donde se observa el tamaño de la banda
de ADN amplificadas para cada uno de los filotipos de Ralstonia solanacearum,
tambien se está presente la banda de 280 pares de bases obtenido con el cebador
general de R. solanacearum. Las marcas rojas representan la posición aproximada de
los cebadores en la Región Espaciadora Transcrita (ITS) entre los genes ribosomales
16S y 23S. ( Fegan y Prior, 2005)
ID-D-0005
SENACYT 24
Otra metodología que es complementaria a la previamente descrita es comparando la
secuencia de los genes de endoglucanasa, hrpB y mutS de Ralstonia solanacearum,
permite clasificarla en 4 filotipos; estos grupos filogenéticos están basados en el
origen geográfico de la bacteria, así en el filotipo I se encuentran las cepas aisladas en
Asia; en el filotipo II se encuentran las cepas aisladas en América; en el filotipo III se
encuentran las cepas aisladas en África y en el filotipo IV las aisladas en Indonesia.
(Denny, 2001; Elphinstone, 2005; y Poussier, 2000). Al analizar la secuencia de
ADN del fragmento del gen de la Endoglucanasa, estos 4 filotipos pueden ser
subagrupados en 23 sequevares
II.1.6 Ralstonia solanacearum como patógeno de plantas
Ralstonia solanacearum invade el tejido vascular de la planta hospedera
entrando a través de heridas o aberturas naturales en la raíz, colonizando el xilema e
interrumpiendo el flujo de agua. Los síntomas de la marchitez bacteriana incluyen
amarillamiento, necrosis de los haces vasculares, seguida inmediatamente de la
marchitez completa de la planta. Signos de la enfermedad son fluido bacterial a partir
del tallo cortado (Kelman, 1953). El control de la marchitez bacteriana es muy difícil,
por lo que el manejo de la enfermedad debe ser integrado. La resistencia genética es
la mejor estrategia para su manejo, el cual es a mediado plazo. (Hanson, 1996; y
Wang 1998).
En 2002, el subgrupo de R. solanacearum denominado raza 3 biovar 2, fue
colocado por el gobierno de Estados Unidos en la lista de agentes seleccionados que
pueden ser utilizado como bioterrorismo (Lambert, 2002). Este subgrupo es mejor
conocido como una enfermedad de la papa, el cual también puede infectar geranio y
tomate (Hanson, 1996; y Kim, 2003). Se considera que este grupo (raza3-biovar 2) es
originario de Los Andes y ha coevolucionado junto con la papa, y de Los Andes se ha
dispersado a varias partes del mundo junto con semilla de la papa.
II.1.7 Síntomas de la enfermedad del moco de la papa causada por Ralstonia
solanacearum
Los principales síntomas en el follaje incluyen una marchitez de las hojas y
tallos, usualmente estos síntomas son visibles en horas calurosas del día. Si el
periodo caluroso es por un tiempo prolongado la planta no puede recuperarse y
empieza a mostrar síntomas de amarillamiento, necrosamiento y finalmente muere.
Un método de diagnóstico de la enfermedad a nivel de campo es cortar el tallo de la
planta y colocar el tallo cortado en un recipiente con agua, se espera ver un flujo
bacteriano en forma de hilo a partir del tallo cortado, este tipo de flujo bacteriano no
es formado por otras bacterias patógenas de la papa.
En los tubérculos, pueden o no pueden ser visibles dependiendo del estado de
desarrollo de la enfermedad. Síntomas pueden ser confundidos con los de la
pudrición anillada provocada por Clavibacter michiganensis subespecie sepedonicus.
Ralstonia solanacearum puede ser distinguida por el flujo que emerge de las yemas u
“ojos” que tienen los tubérculos, en donde el suelo puede adherirse a dicho fluido
bacteriano. Al realizar un corte transversal de los tubérculos enfermos se puede ver
ID-D-0005
SENACYT 25
un leve necrosamiento en el anillo vascular, un exudado cremoso usualmente aparece
minutos después de hacer el corte. Plantas con el patógeno pueden no mostrar
síntomas visibles en días con temperatura templada.
Figura 2. Tubérculos de papa con el moco de la papa causada por Ralstonia
solanacearum, se observa un exudado cremoso a partir del anillo vascular.
II.1.8 Síntomas de la enfermedad de la marchitez bacteriana del tomate causada
por Ralstonia solanacearum
La bacteria usualmente infecta las plantas de tomate entrando por las raíces, a
través de heridas o puntos de emergencia de las raíces laterales, heridas causadas por
nemátodos fitopatógenos. El patógeno también puede ingresar a través de heridas
causadas por prácticas agrícolas en el cultivo por heridas causadas por insectos. Al
colonizar el sistema vascular de las plantas de tomate, el sistema de transporte de agua
por el xilema es obstruido y la planta empieza a manifestar los primeros síntomas.
Las hojas jóvenes son las primeras en manifestar síntomas de marchitez, tienen una
apariencia flácida, usualmente en las horas más calurosas del día. Si las horas
calurosas son muy prolongadas durante el días, la marchitez de toda la planta puede
observarse. Bajo condiciones menos favorables, la enfermedad se desarrolla
lentamente y un gran número de raíces adventicias pueden producirse en el tallo. Al
hacer un corte transversal del tallo el tejido vascular muestra un leve necrosamiento
(Sequeira, 1961).
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Figura 3. Planta adulta de tomate mostrando síntomas de marchitez bacteriana
causada por Ralstonia solanacearum, (C. Allen)
II.1.9 Presencia de Ralstonia solanacearum en Guatemala
En Guatemala se ha reportado la presencia de 3 diferentes grupos clonales los
cuales se encuentran infectados 3 importantes cultivos, asi: filotipo I, sequevar 14 se
encuentra disperso en las zonas productoras de tomate en altitudes que van de 250
msnm a 900 msnm; el filotipo II, sequevar 6, se encuentra disperso en las zonas
productoras de banano en altitudes entre 0 a 100 msnm, y el filotipo II, sequevar 1,
(también denominado raza3-biovar 2), en las zonas productoras de papa y tomate a
altitudes mayores a 1400 msn.(Sánchez, 2008)
En enero de 2003, los laboratorios de diagnostico fitopatológico del
Departamento de Agricultura de Estados Unidos, identificaron la presencia de R.
Solanacearum pertenecientes al grupo raza 3-biovar 2, (filotipo II, sequevar 1) en
esquejes de geranio importados de Guatemala, que habían sido exportados por
empresa exportadora ubicada en Jalapa, Guatemala. Como resultado de esto mas de 3
millones de plantas fueron destruidos a un costo de US $6 millones; en diciembre de
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2003 nuevamente fueron encontrados geranios infectados con R. Solanacearum
teniendo como consecuencia la destrucción de 458 invernaderos en 41 estados de la
unión americana, que cultivaban geranio esto como medida para evitar la dispersión
de dicho patógeno, ya que la raza 3-biovar 2 aun no ha sido reportado en campos
abiertos en Estados Unidos, y es un patógeno cuarentenado. Y como resultado en
Guatemala, la empresa exportadora de esquejes, (una subsidiaria de la transnacional
Goldsmith), fue obligada a cerrar operaciones en lo que es la produccion de esquejes
de geranio, trayendo como consecuencia que mas de 1000 personas que trabajaban
directamente para la empresa perdieran su empleo.
En Guatemala R. Solanacearum, ha venido dispersándose hacia nuevas áreas
de cultivo, en la unidad de riego San Sirisay, Sanarate, el área dedicada a la
produccion de tomate en el año 2000 era de 300 manzanas, y actualmente el área
dedicada a produccion de tomate es nula, esto como producto de la infestación de los
suelos con dicha bacteria. En Agua Blanca, en Ipala y Monjas Jalapa, el área de
produccion de tomate bajo de 500 manzana a 150 manzanas, debido a la infestación
de los suelos con R. Solanacearum; Esto a obligado a los agricultores a movilizarse
hacia nuevas áreas de cultivo, a pesar de que los agricultores tratan de manejar
integralmente el problema de la marchitez bacteriana, tratando de no ingresar material
infectado, desinfección de maquinaria y herramienta, aproximadamente después de 2
años de cultivo aparece nuevamente el problema de la marchitez bacteriana. Por lo
que el problema probablemente este relacionado al uso de agua de río, ya que la
mayoría de agricultores utilizan agua de los ríos para irrigar sus plantaciones de
tomate.
II.1.10 Presencia de Ralstonia solanacearum en aguas de ríos en Europa
En Europa, existen varios reportes de la presencia de R. solanacearum (raza
3-biovar 2), tiene la habilidad de sobrevivir en aguas de ríos incluso a las bajas
temperaturas que se registran en el invierno en el Reino Unido (Elphinstone, 1998) y
Holanda (Janse, 1998).
El primer reporte de la detección de R. solanacearum in ríos fue en Suecia
(Olson, 1976), seguido de reporte de diferentes brotes en Inglaterra en 1996
(Elphinstone 1998), Holanda (Janse, 1998), Bélgica y Francia en 1995 (Janse, 1996;
y Janse 1998), más recientemente la bacteria fue aislado en España (Palomo, 2000) y
Escocia (Woods, 2002). En casi todos países, los síntomas de la marchitez bacteriana
fueron observados en plantas susceptibles después del riego con aguas de ríos
contaminadas con R. solanacearum. Es más casi todos estos ríos se encontró las
plantas solanum dulcamara y Urtica dioica, los cuales fueron encontrados ser
hospedantes del patógeno de la marchitez bacteriana.
El éxito en el manejo integrado de una enfermedad depende en un
entendimiento de la ecología del organismo patogénico en el ambiente. La habilidad
de Ralstonia solanacearum para sobrevivir en suelo y en agua bajo condiciones
naturales es poco entendido, esto debido a que se carece de un método sensitivo de
detección, ya es muy difícil separar R. Solanacearum de el gran numero de bacterias
saprofitas del suelo o agua. En 2006, investigadores del Centro Internacional de la
Papa, publicaron un método muy sensitivo que permite detectar la presencia de unas
pocas células de R. solanacearum en 1 gramo de muestra de suelo, o 1 ml de muestra
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SENACYT 28
de agua colectada en ambientes naturales. Elphinstone ( 1994) sugirió que la
utilización de la planta Solanum dulcamara, era un hospedero natural de R.
Solanacearum y que puede ser utilizado para atrapar la bacteria y diagnosticar la
presencia de la bacteria raza3-biovar 2, en varios ríos de Europa.
II.1.11 Control de Ralstonia solanacearum en cultivo de tomate y papa
Utilizando variedades resistentes se puede lograr cierto nivel de control de
marchitez bacteriana en el cultivo de tomate y moco papa. Sin embargo, la resistencia
en estas plantas cultivadas puede variar según el filotipo y secuevar de Ralstonia
solanacearum presente en el área de cultivo, algunos cultivares que han mostrado
resistencia a determinado secuevar, son muy susceptibles al ser expuestos a otro
secuevar del patógeno. Asimismo, el uso de antibióticos tales como la estreptomicina,
ampicilina, tetraciclina y penicilina, y el uso de fumigantes en el suelo han mostrado
eficacia muy reducida en el control de R. solanacearum.
En las regiones donde la enfermedad es endémica y los métodos de control
cultural parecen ser efectivo en algunas condiciones para reducir poblaciones
bacterianas de R. solanacearum e incidencia de la enfermedad durante los siguientes
ciclos de cultivo. Periodos de rotación de cultivos de 6 años pueden ayudar a reducir
la población del patógeno en el suelo, para ello se puede hacer rotación con cualquier
cultivo de gramíneas o leguminosas. Eliminación de malezas que tienen el potencial
para servir como hospederos del patógeno. En áreas de producción de tomate se
recomienda no utilizar las estacas (tutores) que fueron utilizados en ciclo de cultivo
anterior donde hubo presencia de Ralstonia solanacearum, ya que el patógeno puede
sobrevivir en fase latente en residuos de suelo adheridos a la madera. Desinfectar con
hipoclorito de sodio (cloro) a una concentración de 0.5% todas las herramientas y
equipo agrícola utilizada en áreas donde previamente se reportó la presencia del
patógeno. Drenar todas las áreas donde hay encharcamiento, ya que el patógeno
puede sobrevivir en áreas húmedas. El tratamiento térmico del suelo por medio de la
técnica de solarizado puede ayudar a reducir las poblaciones en terrenos infestados,
para área soleadas y con temperatura promedio arriba de 25 C, se recomienda
solarizar durante 6 semanas. La eficacia de tratamiento térmico en el control de la
bacteria puede variar según el contenido de la humedad en el suelo, temperatura
ambiente y la duración de aplicación de calor. Los productores de papa, deben de
utilizar semilla certificada, ya que es común observar a los agricultores usar
tubérculos de papa provenientes de campos que no han sido inspeccionados y muy
probablemente algunos de estos tubérculos estén infectados por la bacteria.
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SENACYT 29
PARTE III
III. RESULTADOS
III.1 Muestras colectadas e identificación de plantas hospederas
Se colectaron un total de 200 muestras de agua y 24 muestras de plantas en los
departamentos de Chiquimula, Zacapa, Jutiapa, Jalapa, El Progreso, Quetzaltenango,
Chimaltenango, Sololá y Baja Verapaz.
Figura 4. Realización de la prueba ELISA a nivel de campo en una plantación de
tomate en el municipio de Monjas, Jalapa. Se observan las plantas de tomate
mostrando síntomas de la enfermedad de marchitez bacteriana causada por Ralstonia
solanacearum.
Figura 5. Prueba ELISA, la presencia de una sola banda (tira superior) resultado
negativo para la presencia de Ralstonia solanacearum, la presencia de dos bandas es
un resultado positivo, indica la presencia de Ralstonia solanacearum.
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Figura 6. Resultado de la prueba ELISA realizado en el campo, la aparición de dos
bandas en las tiras indican un resultado positivo (izquierda) para la presencia de
Ralstonia solanacearum, una sola banda indica un resultado negativo (derecha).
Figura 7. Planta de Solanum americanum, (quilete) con síntomas de marchitez
bacteriana, a orillas de una plantación de tomate.
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Figura 8. Plantación de tomate en Salamá Baja Verapaz, plantas sin síntomas de la
enfermedad de marchitez bacteriana.
Figura 9. Plantación de berenjena con síntomas de la enfermedad de la marchitez
bacteriana, en Estanzuela, Zacapa.
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De las muestras de plantas colectadas en las orillas de ríos cercanos a las áreas de
producción de tomate en los departamentos de la región oriental del país se determino
que 6 plantas corresponden a la especie Solanum Americanum conocido por los
agricultores como con los nombres comunes: quilete, macuy, o hierba mora. Todas
las plantas colectadas mostraban síntomas de marchitez, y el resultado de la prueba
ELISA realizada a nivel de campo fue positiva para cada una de estas. Asimismo en
la misma región se colectaron 7 plantas de tomate fuera de los campos de cultivo,
dichas plantas crecían como plantas voluntarias cerca de ríos, se colectaron 3 plantas
de la especie Oxalis latifolia y 2 plantas de la especie Zingiber officinale. A orillas
de ríos de bajo caudal ubicados cerca de áreas de producción de papa, en los
departamentos de Quetzaltenango, Sololá, Chimaltenango, se colectaron 5 plantas de
papa que crecían como plantas voluntarias, probablemente algunos tubérculos habían
sido abandonados por los agricultores después de haber lavado los tubérculos y
brotaron en el área. Se colectó una planta de crisantemo Crisantemuñm morifolium
que crecía a orilla del río Xibalbay cerca a una plantación de papa en el municipio de
Sololá, Sololá. Las plantas antes citadas eran hospederos de la bacteria Ralstonia
solanacearum y el resultado de la prueba ELISA a nivel de campo fue positiva. En
Estanzuela Zacapa, se encontró una plantación de berenjena con síntomas severos de
la marchitez bacteriana, resultó positiva en la prueba ELISA, aunque no se colectó
ninguna muestra ya que no estaba localizado cerca un río. En el cuadro 2 se presenta
un resumen de los resultados con el nombre de las plantas hospederas.
Cuadro 2. Nombre de las plantas hospderas, fecha de colecta, nombre de las áreas de
colecta plantas y codigo de almacenamineto que fueron positivas para la presencia de
Ralstonia solanacearum
No. nombre de la planta hospedera Fecha de colecta Lugar de colecta Código
1 Tomate, Solanum lycopersicum Junio, 2007 Los Llanos, Sanarate, El
Progreso
GT1
2 Tomate, Solanum lycopersicum Junio, 2007 Monjas, Jalapa GT2
3 Tomate, Solanum lycopersicum Julio, 2007 Monjas, Jalapa GT3
4 Tomate, Solanum lycopersicum Julio, 2007 Ipala Chiquimula GT4
5 Tomate, Solanum lycopersicum Julio, 2007 Monjas, Jalapa GT5
6 Tomate, Solanum lycopersicum Junio, 2007 Los Llanos, Sanarate, El
Progreso
GT6
7 Tomate, Solanum lycopersicum Junio, 2007 Aldea El Palmar, Zacapa GT7
8 papa Solanum tuberosum Agosto, 2007 Zunil, Quetzalteango GT8
9 papa Solanum tuberosum Agosto de 2007 Concepción Chiquirichapa,
Quetzaltenan.
GT9
10 papa Solanum tuberosum Agosto 2007 Concepción Chiquirichapa,
Quetzaltenan.
GT10
11 papa Solanum tuberosum Agosto 2007 Zunil Quetzaltenango GT11
12 papa Solanum tuberosum Septiembre 2007 El Tablón, Sololá GT12
13 Quilete, Solanum americanum Septiembre 2007 Ipala, Chiquimula GT13
14 Quilete, Solanum americanum Septiembre 2007 Ipala, Chiquimula GT14
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15 Quilete, Solanum americanum Septiembre 2007 Agua Blanca, Jutiapa GT15
16 Quilete, Solanum americanum Septiembre 2007 Agua Blanca, Jutiapa GT16
17 Quilete, Solanum americanum Septiembre, 2007 Los Llanos, Sanarate, El
Progreso
GT17
18 Quilete, Solanum americanum Septiembre 2007 Los Llanos, Sanarate, El
Progreso
GT18
19 Trebolillo, Oxalis latifolium Septiembre 2007 La fragua, Zacapa GT19
20 Trebolillo, Oxalis latifolium Septiembre 2007 Los Llanos, Sanarate, El
Progreso
GT20
21 Trebolillo, Oxalis latifolium Septiembre 2007 Ipala, Chiquimula GT21
22 Gengibre, Zingiber officinalis Octubre 2007 Ipala Chiquimula GT22
23 Gengibre, Zingiber officinalis Octubre 2007 El Palmar, Zacapa GT23
24 Crisantemo, Chrysanthemum morifolium Noviembre 2007 El Tablón, Sololá GT24
III.2 Aislamiento del patógeno en base a su morfología
De 24 muestras de planta y 13 muestras de agua de río se logró aislar varias
colonias que presentaban las características morfológicas de Ralstonia solanacearum
sobre los medios de cultivo CPG y SMSA
Figura 10. Colonias aisladas y en cultivo puro con la características morfológicas de
Ralstonia solanacearum creciendo sobre medio de cultivo CPG.
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Figura 11. Colonias con la morfología típica de Ralstonia solanacearum sobre
medio de cultivo SMSA.
Las muestras de agua de las que se logró aislar Ralstonia solanacearum, fueron
colectados en ríos en Ipala Chiquimula, Monjas Jalapa, Río Grande de Zacapa,
Sanarate El Progreso, Almolonga, Concepción Chiquirichapa en Quetzaltenango,
Purulhá Baja Verapaz y en el municipio de Sololá en Sololá, ver cuadro 3.
Después de 24 horas de incubación de Ralstonia solanacearum en medio
líquido se procedió a extraer el ADN para su identificación molecular mediante la
prueba de PCR, utilizando cebadores universales para dicha especie.
III.3 Identificación molecular de Ralstonia solanacearum usando la técnica de
PCR con cebadores generales
Utilizando el ADN extraído de las cepas aisladas de las muestras de agua y
planta, se procedió a realizar la prueba de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR por sus siglas en inglés), de las colonias aisladas de las muestras de agua, 13
muestras amplificaron el fragmento correspondiente a Ralstonia solanacearum y de
las muestras de plantas, las 24 muestras que inicialmente dieron resultado positivo en
el campo mediante la prueba ELISA, también dieron resultado positivo usando los
cebadores universales con la prueba de PCR. Esta técnica quedó estandarizada en el
laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Agronomía.
En la figura 12, se presenta una fotografía de una gel después de la corrida de
electroforesis donde se observa la banda de 280 pares de bases, producto de la
amplificación con cebadores generales, mediante esta prueba de ADN se confirmó la
presencia de la bacteria fitopatógena en las muestras colectadas
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Figura 12. Fotografía de una gel de agarosa después de tinción con bromuro de
etidio, se observan las bandas de 280 pares de bases obtenida con PCR en las
muestras que dieron positivo para presencia de la bacteria Ralstonia solanacearum,
muestras en los carriles 2 a 10 y 13 a 15. Las muestras en los carriles 11 y 12 dieron
un resultado negativo. En el carril 16 está el control negativo, y en el carril 17 el
control positivo.
III.4 Identificación de Ralstonia solanacearum raza 3, mediante prueba de PCR
usando cebados específicos
Las cepas que dieron positivo en la prueba de PCR con cebadores universales
para Ralstonia solanacearum fueron sometidos a un análisis de PCR usando
cebadores específicos para la raza 3. De este análisis se obtuvieron resultados
positivos en las muestras colectadas en las áreas cercanas a las plantaciones de papa
en los municipio de Quetzaltenango, Sololá y Purulhá Baja Verapaz. Mientras que
las muestras colectads en las zonas productoras de tomate en Zacapa, Chiquimula,
Jalapa, Jutiapa y El Progreso fueron negativas para la raza 3 de Ralstonia
solanacearum. En la figura 13 se observa la banda de 304 pares de bases que se
obtiene al utilizar los cebadores específicos para la raza 3 de Ralstonia solanacearum
Figura 13. Fotografía de una gel de agarosa con productos de PCR en la identificación
de Ralstonia solanacearum raza 3, mediante la técnica de PCR usando cebadores
específicos para la raza 3 de dicha especie. En el carril 1 se observa el marcador de
peso molecular, en los carriles 2 a 7 y 10 a 12 se observa la banda de 304 pares de
bases para la raza 3. En el carril 14 se observa la banda de 304 pares de bases
obtenida con el control positivo. Carril 13 control negativo.
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III.5 Determinación de la densidad poblacional de Ralstonia solanacearum en
aguas de ríos
Con el objetivo de poder determinar si la presencia de otros microbios y suelo
pueden inhibir la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, se
realizaron varias pruebas agregando una cantidad conocida de células bacterianas de
Ralstonia solanacearum a muestras de agua con suelo, el resultado que se obtuvo
indica que dicha técnica es capaz de detectar como mínimo 100 células bacterianas en
un litro de agua. Una concentración menor no fue posible detectar debido
posiblemente a que los componentes del suelo y otros microbios presentes inhibieron
la acción de la ADN polimerasa, que es la enzima que se encarga de la síntesis de
nuevos hebras de ADN. Sin embargo, la técnica de cultivo de de bacterias sobre
medio CPG con antibióticos o el medio SMSA con antibióticos y fungicidas, los
cuales son métodos más directos y menos laboriosos fueron más sensibles en la
detección de la bacteria fitopatógena. Sobre dichos medios también crecieron un gran
número de bacterias contaminantes, pero se logró contar y distinguir las bacterias de
Ralstonia solanacearum, siendo 10 unidades formadores de colonias por 1 litro de
agua. Por lo que para poder determinar la densidad poblacional del patógeno en las
muestras de agua colectadas, se procedio a realizar siembras sobre medio sólido CPG
con antibióticos o sobre medio SMSA con antibióticos y fungicidas, ya que resultó ser
un método sencillo, barato, y muy sensitivo, comparado con el método de PCR en
tiempo real.
De las muestras de agua colectadas en la principales zonas productoras de tomate y
papa, se logró determinar que en las muestras que resultaron positivas, las
concentraciones de bacteria variaron desde 10 unidades formadoras de colonias hasta
60 unidades formadoras de colonias por litro de agua colectada, durante la época
lluviosa. En las muestras colectadas durante la época seca, los resultados fueron
negativos para la presencia del patógeno. En el cuadro 3, se presentan los nombres
de los ríos y lugares donde se colectaron muestras de agua que poseían la bacteria.
Cuadro 3. Nombre de los ríos y lugares donde se colectaron muestras de agua que
fueron positivas para la presencia de Ralstonia solanacearum
No. Nombre del río Fecha de colecta Concentración de bacterias
en unidades formadoras de
colonias/1000 ml
Código
1 Río Grande de Zacapa,
Aldea El Palmar, Zacapa
Junio, 2007 20 UFC/1000 ml GT25
2 Río Los Plátanos, Sanarate, El Progreso Junio, 2007 10 UFC/1000 ml GT26
3 Río Samalá, Zunil, Quetzalteango Junio, 2007 15 UFC/1000 ml GT27
4 Río León, Ipala Chiquimula Julio, 2007 18 UFC/1000 ml GT28
5 Río Ostúa, Monjas, Jalapa Julio, 2007 15 UFC/1000 ml GT29
6 Río Grande de Zacapa, Aldea El Palmar,
Zacapa
Agosto 2007 20 UFC/1000 ml GT30
7 Río Samalá, Zunil, Quetzalteango Septiembre 2007 30 UFC/1000 ml GT31
8 Río San Carlos, Concepción Chiquirichapa, Septiembre 2007 15 UFC/1000 ml GT32
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Quetzaltenango
9 Río Los Plátanos, Sanarate, El Progreso Septiembre 2007 20 UFC/1000 ml GT33
10 Río San Carlos, Concepción Chiquirichapa,
Quetzaltenango
Noviembre 2007 20 UFC/1000 ml GT34
11 Río Ostúa, Monjas, Jalapa Noviembre 2007 15 UFC/1000 ml GT35
12 Río Xibalbay, El Tablón, Sololá Noviembre 2007 20 UFC/1000 ml GT36
13 Río El Silencio, Purulhá, Baja Verapaz Agosto, 2007 20 UFC/1000 ml GT37
III.6 Caracterización bioquímica de biovares de Ralstonia solanacearum
Los resultados de la caracterización de biovar muestran que todas las cepas
aisladas en las áreas cercas a la zonas de producción de papa en Quetzaltenango,
Sololá, Baja Verapaz, corresponden al biovar 2, mientras que las cepas aisladas de las
áreas cercanas a las zonas de producción de tomate corresponden al biovar 3. En la
figura 14, se observa una placa con medio de cultivo en el cual los carbohidratos han
sido hidrolisados y se manifiesta en un cambio de coloración de verde a amarillo. En
el cuadro 4, se presenta un resumen de los resultados de la oxidación de carbohidratos
por la cepas colectadas.
Figura 14. Fotografía de una placa multiwell, donde se observa el cambio de
coloración de verde a amarillo que ha desarrollo el medio de cultivo Hayward,
producto de la oxidación de fuentes de carbono por la bacteria Ralstonia
solanacearum. El color original era verde, algunas muestras tiene una coloración
amarilla, indica una reacción positiva.
Cuadro 4. Resumen del resultado de las lecturas de la oxidación de carbohidratos en
el medio de cultivo Hayward por Ralstonia solanacearum, tres semanas después de
la inoculación.
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R.solanacearum colectada en Lactosa Manitol Sorbitol Dulcitol Biovar
Areas de producción de papa + - - - 2
Areas de producción de tomate + + + + 3
III.7 Determinación del filotipo mediante la técnica de PCR múltiple
Mediante una simple reacción usando la técnica de PCR con una serie de
cebadores que amplifican regiones específicas de la región ITS de cada filotipo, se
determinó el grupo al que pertenece cada una de las muestras de Ralstonia
solanacearum colectadas. Las cepas colectadas en las regiones productoras de papa
pertenecen al filotipo II, cuyo origen es el continente americano. El segmento de
ADN amplificado a partir de dichas muestras es de 372 pares de bases, similar al
segmento obtenido con la cepa K60, el cual fue utilizado como control positivo para
el filotipo II, figura 15. Mientras que de las cepas colectadas en los departamentos de
Jutiapa, Jalapa, Chiquimula, Zacapa, y El Progreso se amplificó un fragmento de
ADN de 213 pares de bases similar al que se obtuvo con el control positivo del
filotipo I, cuyo origen es el continente asiático, el cual de alguna manera se ha logrado
dispersarse desde Asia hacia Guatemala. En la figura 15, se observa que también se
amplificó una banda de 280 pares de bases, el cual corresponde a la amplificación con
los cebadores generales, de esta manera se confirmó que dichas muestras
corresponden a Ralstonia solanacearum.
Figura 15. Fotografía de una gel de agarosa, en los carriles de 1 a 9, y carril 13 se
observa la banda de 372 pares de bases amplificada en las muestras de Ralstonia
solanacearum colectadas en las áreas de producción de papa, corresponden al filotipo
II; en los carriles del 10 al 12 y del 14 al 17 la banda de 144 pares de bases
amplificada en las muestras de Ralstonia solanacearum colectadas en las áreas de
producción de tomate, la cual corresponde al filotipo I. La banda de 280 pares de
bases corresponde a la amplificación con el par de cebadores generales, el cual es
común para todas las cepas de Ralstonia solanacearum. En los carriles, 18 al 21
372 bp
280 bp
144 pb
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están los bandas obtenidas con los controles positivos para el filotipo II, IV, I y III
respectivamente.
III.8 Determinación del sequevar de Ralstonia solanacearum por medio de la
secuenciación del gen de la Endoglucanasa
El centro de biotecnología de la Universidad de Wisconsin realizó la
secuenciación del ADN del gen de la Endoglucanasa, dichas secuencias consistían de
un fragmento de 750 pares de bases. Las secuencias obtenidas fueron almacenadas y
analizadas con el programa Biology Workbench (http://workbench.sdsc.edu). Al
comparar las secuencias de ADN obtenidas de las muestras colectadas en el presente
estudio, permitio distinguir dos grupos claramente definidos, un primer grupo con
todas las secuencias obtenidas de las muestras colectadas en la zona de producción de
tomate, es decir, en los departamentos de Jalapa, Jutiapa, Zacapa, Chiquimula y El
Progreso, dichas secuencias eran 100% idénticas. Un segundo grupo se observó con
las secuencias obtenidas de las muestras colectadas en las zonas de producción de
papa, ya que las secuencias eran 100% idénticas.
Para el análisis y clasificación de sequevar se utilizó una serie de secuencias
de ADN del gen de la Endoglucanasa de Ralstonia solanacearum que se encuentran
almacenados en el banco de genes del National Center for Biotechnology
Information. Con todas las secuencias que se analizaron se construyó un árbol
filogenético figura 16, en dicha figura las muestras colectadas en aguas, y plantas en
los departamentos de Quetzaltenango, Sololá y Baja Verapaz, es decir, en la zonas de
producción de papa, están representadas por la cepa GT10, pertenecen al sequevar 1,
el cual esta agrupado en el filotipo II, cuyo origen es el contienente americano.
Mientras que todas las muestras colectadas en los departamentos de El Progreso,
Jalapa, Jutiapa, Zacapa y Chiquimula, es decir, en las zonas de producción de tomate,
tienen un 100% de similtiud, lo que indica una sola cepa está distribuido en esa región
y pertenecen al sequevar 14, el cual es parte del filotipo I; dicha cepa tiene un 100%
de similitud con la cepa ICMP8229 aislada de la planta de gengibre en Costa Rica
hace 20 años. Al comparar las secuencias obtenidas en el presente estudio se pudo
observar que el aislado GT10, el cual se aisló de plantas voluntarias de papa en
Sololá, tiene un 100% de similitud con la cepa UW551, la cual fue aislada en Estados
Unidos de esquejes de geranio importados desde Kenia. Dicho aislamiento fue
realizado en uno de los laboratorio del Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos (USDA). La cepa GT10 tambien tiene 100% de similitud con la cepa JT516,
la cual fue aislada de tubérculos de papa en las Islas Reunion. Las secuencias de
ADN de las muestras de las áreas de producción de papa, son completamente
idénticas con otras secuencias de ADN del gen de la Endoglucanasa de muestras de
papa colectadas por otros investigdores en otras partes del mundo.
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Figura 16. Árbol filogenético basado en la secuencia parcial del gen de la
Endoglucanasa de cepas colectadas en Guatemala y cepas de referencia de Ralstonia
solanacearum. Las cepas colectadas en Guatemala en areas cercanas a las
plantaciones de tomate están representadas por GT5 y las cepas colectadas en áreas
cercanas a la plantaciones de papa están representadas por GT10.
III.9 Patogenicidad de los filotipos y secuevares de Ralstonia solanacearum
colectadas, en áreas de producción de papa y tomate en Guatemala
La inoculación de plantas de tomate de la variedad Bonny Best con cada una
de las cepas aisladas de Ralstonia solanacearum causó severa marchitez de cada una
de las plantas. A los 4 días después de la inoculación las plantas mostraban las
primeras hojas marchitez, a los 8 días después de la inoculación las plantas
mostraban entre un 75% a 85% de marchitez y a los 10 días mostraban un 100% de
marchitez ver cuadro 5.
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Cuadro 5. Promedio del porcentaje de marchitez de las plantas de tomate variedad
Bonny Best, a los 6, 8 y 10 días después de la inoculación con cada una de las cepas
aisladas de Ralstonia solanacearum.
Código Filotipo/secuevar de la
cepa de R.
solanacearum
% de marchitez, 6
días después de la
incoulación
% de marchitez, 8
días después de la
incoulación
% de marchitez,
10 después de la
incoulación
GT1 Filotipo I, secuevar 14 25 75 100
GT2 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT3 Filotipo I, secuevar 14 30 85 100
GT4 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT5 Filotipo I, secuevar 14 30 75 100
GT6 Filotipo I, secuevar 14 30 75 100
GT7 Filotipo I, secuevar 14 30 80 100
GT8 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT9 Filotipo II, secuevar 1 30 80 100
GT10 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT11 Filotipo II, secuevar 1 25 80 100
GT12 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT13 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT14 Filotipo I, secuevar 14 30 75 100
GT15 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT16 Filotipo I, secuevar 14 25 75 100
GT17 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT18 Filotipo I, secuevar 14 30 80 100
GT19 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT20 Filotipo I, secuevar 14 25 75 100
GT21 Filotipo I, secuevar 14 30 80 100
GT22 Filotipo I, secuevar 14 30 80 100
GT23 Filotipo I, secuevar 14 30 80 100
GT24 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT25 Filotipo I, secuevar 14 30 80 100
GT26 Filotipo I, secuevar 14 25 75 100
ID-D-0005
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GT27 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT28 Filotipo I, secuevar 14 30 75 100
GT29 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT30 Filotipo I, secuevar 14 25 75 100
GT31 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT32 Filotipo II, secuevar 1 25 80 100
GT33 Filotipo I, secuevar 14 25 80 100
GT34 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT35 Filotipo I, secuevar 14 25 75 100
GT36 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
GT37 Filotipo II, secuevar 1 30 85 100
III.10 Discusión de resultados
En este estudio se logró determinar que Ralstonia solanacearum el agente
causal de la enfermedad conocida como marchitez bacteriana del tomate y también
causante de la enfermedad del moco de la papa, puede estar presente en las aguas de
ríos cercanos a la plantaciones de tomate y papa infectadas por dicho patógeno. La
densidad población de Ralstonia solanacearum en las muestras de aguas colectadas
variaron de 10 unidades formadoras de colonias por litro de agua a 30 unidades
formadoras de colonias por litro de agua. Es importante mencionar que se logró aislar
el patógeno únicamente en las muestras de agua tomadas durante la época lluviosa, y
cercanos a las plantaciones, lo cual podría deberse principalmente a que las bacterias
son arrastradas de los campos de cultivo por la escorrentía que se forma durante las
lluvias. Durante la época lluviosa la mayoría de agricultores está cultivando el cual es
un factor muy importante para la diseminación de la bacteria en los ríos e influye en
la fluctuación población en las dos épocas (época de lluvia y época seca). No se logró
aislar la bacteria en las muestras colectadas durante la época seca.
En las áreas de producción de papa un factor que podría estar influyendo a la
diseminación de la bacteria en los ríos es la mayoría de agricultores productores de
papa después de cosechar los tubérculos, lavan los tubérculos previo a llevarlos al
mercado. Si existe un río cercano al área de cosecha, ellos optan por lavarlo en el río.
ID-D-0005
SENACYT 43
En el proceso de lavado si existieran tubérculos infectados con la enfermedad del
moco de la papa causada por Ralstonia solanacearum, el fluido bacteriano en las
yemas latentes de los tubérculos se liberaran en el agua. Después del lavado y previo
a llevarlo al mercado, los agricultores usualmente clasifican los tubérculos de papa de
acuerdo a su tamaño, y a veces dejan abandonado los tubérculos enfermos, o los
tubérculos que no llenan los requisitos para el mercado. Siendo estos tubérculos
abandonados hospederos de la bacteria que pueden contaminar las aguas de los ríos, y
también pueden ser fuente de inóculo para la Próxima época de siembra.
La no detección de la bacteria en la época seca podría deberse a que el cauce
de los baja y muchos arroyos no tienen caudal en las áreas de producción de tomate y
papa, durante esa época del año, siendo más difícil la dispersión del patógeno por
medio del agua. La sobrevivencia de Ralstonia solanacearum en agua de ríos tiende
a ser afectado por la presencia de bacteriófagos líticos, otras bacterias y protozoos,
especialmente a temperatura promedio de 24º C, temperatura a la cual existe una gran
interacción de R. Solanacearum con sus depredadores naturales (Alvarez, 2007).
Este patógeno bajo las condiciones naturales es un débil competidor, y su población
es afectada por la actividad depredadora o lítica de la flora microbiana acuática de los
ríos. Pero tiene la habilidad de poder colonizar el sistema vascular de más de 450
especies de plantas que pertenecen a 54 diferentes familias botánicas de plantas. En
la presente investigación la bacteria fitopatógena bajo estudio fue encontrada en
plantas voluntarias de tomate y papa, y además en plantas de Solanum americanum,
Oxalis latifolium, Zingiber officinalis y Chrysanthemum morifolium. Siendo dichas
plantas importantes reservorios de fuente de inóculo primario para las próximas
temporadas de cosechas. Cuando se tenga un campo de cultivo infestado por la
bacteria es importante la eliminación de las malezas ya el patógeno puede interactuar
con la rizosfera de las plantas y poder sobrevivir en la ausencia de su hospedero
principal.
La detección Ralstonia solanacearum en aguas en condiciones naturales en
ríos en Guatemala, está en concordancia con investigaciones realizadas en otros
países tales como Suecia, Inglaterra y Holanda, donde reportan la presencia de dicha
patógeno en aguas de ríos (Olson, 1976, Elphinstone 1998 y Janse, 1998). Existen
claramente dos biovares caracterizados bioquímicamente, siendo biovar 2, para las
cepas aisladas en las áreas de producción de papa, y biovar 3 para las cepas aisladas
ID-D-0005
SENACYT 44
en las áreas de producción de tomate. Interesante es que este patógeno se ha
concentrado en determinadas áreas y determinados cultivos, a pesar de que ambos
biovares tienen la capacidad de poder infectar tomate y papa, pero no se encontraron
poblaciones mixtas en ninguna de las áreas muestreadas. Esto probablemente se
deba a que existen pocos agricultores se dedican a cultivar ambas plantas, asi
encontramos que la gran mayoría agricultores del oriente de Guatemala cultivan
tomate y otro tipo de cultivos pero no cultivan papa en las partes altas, mientras que
los cultivadores de papa no se movilizan hacia las áreas de producción de tomate,
limitando de esta manera la dispersión del patógeno por medios de herramientas y
maquinaria. En el oriente del país uno de los factores que ha facilitado la dispersión
del patógeno es la maquinaría que es utilizada para mecanizar el suelo, ya que es
común ver que un solo tractor es arrendado por varios productores para preparar el
suelo; esta práctica aunada a el uso de agua de ríos para riegos, que podrían están
contaminados con Ralstonia solanacearum ha facilitado la dispersión del patógeno
en varios campos de cultivos en varias áreas en dicha región.
Los resultados de las secuencias del fragmento de ADN de la Endoglucanasa,
reveló la existencia de dos filotipos y dos secuevares, siendo el filotipo II secuevar I,
el grupo que se aisló en las áreas de producción de papa, mientras que las cepas de
Ralstonia solanacearum que fueron aislados en los departamentos de Zacapa,
Chiquimula, Jalapa, Jutiapa y El Progreso pertenecen al filotipo I secuevar 14.
ID-D-0005
SENACYT 45
PARTE IV
IV. 1 CONCLUSIONES
Luego de analizar las muestras de agua de río colectadas muy cerca de plantaciones
de papa y tomate con síntomas de marchitez bacteriana se logró determinar la
presencia de la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum en los siguientes ríos:
Río Grande, en El Palmar, Zacapa; Río los Plátano, Sanarate, El Progreso, Río
Samalá en Zunil Quetzaltenango, Río León en Ipala Chiquimula, y el Río Ostúa en
Monjas Jalapa.
Se logró implementar un método de diagnóstico morfológico, y molecular que pueda
ser utilizado para determinar la presencia de Ralstonia solanacearum en muestras de
aguas de ríos, dicho método puede ser utilizado también para aislar el patógeno de
muestras de plantas y muestras de suelo.
Se determinó que las especies Solanum americanum, Oxalis latifolium, Zingiber
officinalis y Chrysanthemum morifolium, y plantas voluntarias de papa y tomate
pueden ser hospederas de Ralstonia solanacearum.
El uso del medio de cultivo SMSA (Medio Semiselectivo Sur África), permitió aislar
el patógeno de muestras de agua de ríos que se ubicaban muy cerca a plantaciones de
tomate y papa infectadas por la bacteria Ralstonia solanacearum.
Utilizando técnicas de bioquímica y técnicas moleculares de PCR y secuenciación de
un fragmento del gen de la Endoglucanasa se determinó la presencia de Ralstonia
solanacearum biovar 2, filotipo II secuevar 1 en las zonas de producción de papa en
los departamentos de Quetzaltenango, Sololá y Alta Verapaz, mientras que biovar 3,
filotipo I, secuevar 14, en los departamentos de Jutiapa, Jalapa, Zacapa, Chiquimula y
El Progreso.
Mediante inoculación de plántulas de tomate de la variedad Bonny Best, se confirmó
que las cepas colectadas de Ralstonia solanacearum eran virulentas, ya que el 100%
de las plantas inoculadas mostraron síntomas de marchitez y murieron a los 10 días
después de la inoculación.
ID-D-0005
SENACYT 46
IV.2 RECOMENDACIONES
Para evitar epidemias causadas por Ralstonia solanacearum en plantaciones de papa
y tomate se recomienda que en las áreas donde previamente ha sido detectada la
enfermedad, no utilizar el agua de río para irrigar los campos de cultivo de papa y
tomate, ya que dicha bacteria tiene la habilidad de poder infectar ambos cultivos. En
dichas áreas, en la medida de lo posible utilizar agua subterránea de pozos para irrigar
los campos de cultivo.
En las zonas de producción de papa, se recomienda a los agricultores no dejar
abandonados cerca de los ríos o en campos de cultivos, los tubérculos de papa
infectados con la enfermedad del moco de la papa. Tubérculos infectados con el moco
de la papa son fuente de inóculo de la enfermedad para las próximas temporadas de
cultivo.
Se recomienda realizar un monitoreo constante de la situación de esta enfermedad ya
que el patógeno se dispersa fácilmente por herramientas y maquinaria agrícola e
informar a los agricultores productores de papa y tomate acerca de la importancia de
evitar la dispersión de la enfermedad. El manejo de la enfermedad se logrará a través
de la implementación de un programa de manejo integrado.
ID-D-0005
SENACYT 47
IV.3 REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
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SENACYT 50
IV.4 ANEXOS
ID-D-0005
SENACYT 51
Secuencias de ADN del gen de la Endoglucanasa utilizadas para la construcción del
árbol filogenético.
GT10, cepa aislada de papa colectada en Concepción Chirirchapa, Quetzaltenango,
Guatemala, en el presente estudio. Debido a que la secuencia de ADN es idéntica
con las otras cepas colectadas en las areas de producción de papa, aqui se presenta
únicamente GT10 la cual representará a las otras idénticas para el análisis
filogenético.
AGCCTGAGCACGGCAAGCGCGTCCGACACGGACACCACGACTCTGAAGCCCGCCGCCACC
TCGACGACCTCATCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCCGCGTTTACGGTGAGC
GGCACACGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGAAAAGAGCGTGAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAGGGACCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGT
GTGCCAACTGCTGCAGGGTACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGATAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGTCGTTCCGGTG
CGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGG
GT5, cepa aislada de planta de tomate colectada en Monjas Jalapa, Guatemala, en el
presente estudio. Debido a que la secuencia de ADN es idéntica con las otras cepas
colectadas en las areas de producción de tomate, aqui se presenta únicamente GT15 la
cual representará a las otras idénticas para el análisis filogenético.
GCCCTCAGCACGGCGGCCGCTACCGACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACCACCTCG
ATCTCGCCGTTGTGGCTCACCGTCGCCAAGGACAGCGCGGCGTTCACGGTGAGCGGCACG
CGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGCGAAGAGCATGTCCGGCACAGG
CCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGTGTGCCA
AGTGGCGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGCCGAGTT
CGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGAGCAACTACATCTATCCGTCCGCCGACAG
CGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTGGGAGCG
GCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGACCGGGTT
CGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTACGCGCG
CTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGATTTCTG
GCGGCGCGTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATGAACGA
GCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
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Secuencias de ADN del gen de la Endoglucanasa que fueron utilizados como
referencia para el análisis filogenético
UW20 Cepa aislada de planta de banano, en Venezuela.
GATCCCAGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCGGCCACCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCC
GCCACCTCGACCACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCAGCGTTCACG
GTGAGCGGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGAAAAGAGCGT
GAGCGGTTCCGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCCGCGGCCGGCGTCGC
CAAGGTGTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGC
CGGCGCGGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCC
GTCCGCCGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTT
CCGGTGGGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGACGCGAACGAGCTGTCGCG
CCTGACCGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCA
CAACTATGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTA
CGCCGATTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGG
CTGATGAACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGGCTGTCCGGTGCCAACGCCGCG
CTGGCC
UW21. Cepa aislada de planta de banano, en Honduras.
GATCCCAGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCGGCCACCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCC
GCCACCTCGACCACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCAGCGTTCACG
GTGAGCGGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGAAAAGAGCGT
GAGCGGTTCCGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCCGCGGCCGGCGTCGC
CAAGGTGTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGC
CGGCGCGGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCC
GTCCGCCGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTT
CCGGTGGGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGACGCGAACGAGCTGTCGCG
CCTGACCGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCA
CAACTATGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTA
CGCCGATTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGG
CTGATGAACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGGCTGTCCGGTGCCAACGCCGCG
CTGGCC
CFBP2957. Cepa aislada de planta de tomate en Islas Guadalupe.
AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCGGCCACCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCCGCCACC
TCGACCACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCAGCGTTCACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGAAAAGAGCGTAAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCCGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAATTACATCTATCCGTCCGC
CGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
ID-D-0005
SENACYT 53
CFBP2958. Cepa aislada de planta de tomate en Islas Guadalupe.
AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCGGCCACCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCCGCCACC
TCGACCACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCAGCGTTCACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGAAAAGAGCGTAAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCCGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAATTACATCTATCCGTCCGC
CGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
UW469. Cepa aislada de planta de papa en Brazil. AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCGGCCACCGACACCACGACCCTGAAACCCGCCGCCACC
TCGACCACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCAGCGTTCACGGTGAGC
GGCGCGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGAAAAGAGCGTAAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCCGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCCCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCATCCAGTTCAAAGGCAATCCCCGTGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
K60. Cepa aislada de planta de tomate en Carolina del Norte Estados Unidos.
AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCGGCCACCGACACCACGACCCTGAAACCCGCTGCCACC
TCGACGACCTCGTCCGTGTGGCTCACCCTCGCCAAGGACAGTGCGGCGTTCACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGTTACGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGAAAAGAGCGTGAGTGG
TTCCGGCCGGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAATTACATCTACCCGTCGGC
CGACAGCGTGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCCTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGG
Rs116. Cepa aislada de planta de Hydrangea en Florida, Estados Unidos.
AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCGGCCACCGACACCACGACCCTGAAACCCGCTGCCACC
TCGACGACCTCGTCCGTGTGGCTCACCCTCGCCAAGGACAGTGCGGCGTTCACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGTTACGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGAAAAGAGCGTGAGTGG
TTCCGGCCGGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAATTACATCTACCCGTCGGC
CGACAGCGTGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
ID-D-0005
SENACYT 54
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCCTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGG
UW9. Cepa aislada de planta de Heliconia en Costa Rica
AGCCTGAGCACGGCAAGCGCGTCCGACACGGACACCACGACTCTGAAGCCCGCCGCCACC
TCGACGACCTCATCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCCGCGTTTACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGAAAAGAGCGTGAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAAGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGTAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
UW2. Cepa aislada de planta de banano en Costa Rica
AGCCTGAGCACGGCAAGCGCGTCCGACACGGACACCACGACTCTGAAGCCCGCCGCCACC
TCGACGACCTCATCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCCGCGTTTACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGAAAAGAGCGTGAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAAGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGTAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
GMI 1000. Cepa aislada de planta de tomate en Guyana Francesa
ACCCTCAGCACGGCGGCCGCTACCGACACCATGACCCTGAAGACGGCCGCCACCACCTCG
ATCTCGCCGTTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGCGCGGCGTTCACGGTGAGCGGCACG
CGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGCGAAGAGCATGTCCGGCACAGG
CCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGTATGCCA
GGTGGCGCAGGGCACGGGCACCTTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGCCGAGTT
CGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGAGCAACTACATCTATCCGTCCGCCGACAG
CGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGCTGGGAGCG
GCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGACCGGGTT
CGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTACGCGCG
CTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGATTTCTG
GCGGCGCGTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATGAACGA
GCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
NCPPB332. Cepa aislada de planta de papa en Zimbawe
AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCCGACACCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCCGCCACC
GCGTCGACCTCGTCCGTGTGGCTCACCGTCGCCCGGGACAGTGCCGCGTTCACGGTAAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTACGGCGCGGGCAGCGCGTGGGTGCAGAAGAGCGTGTCCGG
ID-D-0005
SENACYT 55
CACCGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACCTTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
CGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGACCAACTACATCTATCCGTCCGC
CAGCAGCGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTCGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCGTGGCGACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGAT
GAACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGGGCAGTGGC
J25. Cepa aislada de planta de papa en Kenia
AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCCAACACCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCCGCCACC
GCGTCGACCTCGTCCGTGTGGCTCACCGTCGCCCAGGGCAGTGCCGCGTTCACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTACGGCGCGGGCAGCGCGTGGGTGCAGAAGAGCGTGTCCGG
CACAGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
CGAGTTCGGGGAGGGGAGCCTGCCGGGCACCTACGGGACCAACTACATCTATCCGTCCGC
CAGCAGCGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTCGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
CGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCGTGGCGACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGAT
GAACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
NCPPB3059. Cepa aislada de planta de papa en Burkina Faso
ACCTTGAGCACCGCAAGCGTGTCCGACGCCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCCGCCACC
GCGGCGACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCCAGGACAGTGCCGCGTTCACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTACGGCGCCGGCAGCACATGGGTGCAGAAGAGCGTGTCCGG
CACCGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGCTGCTGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
CGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGACCAACTACATCTATCCGACCGC
CAGCAGCGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACACGAACGAGCTGGCGCGCCTGA
CCGGGTTCGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGTCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACT
ATGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCG
ATTTCTGGCGGCGCGTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGAT
GAACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGG
JT525. Cepa aislada de planta de geranio egipcio en Islas Reunión.
AGCCTGAGCACCGCAAGCGTGTCCGACACCGACACCACGACCCTGAAGCCCGCCGCCACC
GCGTCGACCTCGTTCGTGTGGCTCACCGTCGCCCGAGACAGTGCCGCGTTCACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTACGGCGCGGGCAGCGCGTGGGTGCAGAAGAGCGTGTCCGG
CACAGGCCAGTGCACCAGCGCCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCCGGCGTCGCCAAGGT
GTGCCAGTTGCTGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
CGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGACCAACTACATCTATCCGTCCGC
CAGCAGCGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTCGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGTCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCGTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATTTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
ID-D-0005
SENACYT 56
R292. Cepa aislada de planta de morera en China.
ACCCTGAGCACGGCGGCCGCCACCGACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACCACCTCG
ATCTCGCCGTTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGCGCGGCGTTCACGGTGAGCGGCACG
CGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGCGAAGAGCATGTCCGGCACAGG
CCGGTGCACCGCCGCCTTCTTTGGCAAGGATCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGTGTGCCA
AGTGGCGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGCCGAGTT
CGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGAGCAACTACATCTATCCGTCCGCCGACAG
CGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGCCGTTCCGCTGGGAGCG
GCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGACCGGGTT
CGTCAACGCCGTGACGGCGGCTGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTACGCGCG
CTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGATTTCTG
GCGGCGCGTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATGAACGA
GCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
PSI 7. Cepa aislada de planta de tomate en Indonesia.
ACGGCGATACCAGTTTGAGCACCGCGAGCGCTTCCGGCACCGACACCACGACCCTGAAGA
CGGCCGCCACCACCTCGATCTCGCCGTTGTGGCTCACCGTCGCCAACGACGGCGCGGCGT
TTACGGTGAGCGGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCACCGGCACCACGTGGGTAGGAAAG
AGCATGTCCGGCACAGGCCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCCGCGGCCGGT
GTCGCCAAGGTATGCCAGGTGGCGCAGGCCAAGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGC
CTGGCCGGCGCCGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGGACCTATGGCAGCAACTACATC
TATCCGTCCGCCGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTG
CCGTTCCGGTGGGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGCCGTTCGATCCGAACGAACTG
TTGCGCCTGACCGGGTTTGTCGACACGGTGACGGCCGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGAT
CCGCACAATTACGCGCGCTATTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGC
GCGTACGCGGATTTCTGGCGGCGCCTGGCGACCCAGTTCAAGGGCAATGCGCGCGTCATC
TTCGGGCTGATGAACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGG
R230. Cepa aislada de planta de banano en Indonesia
AGTTTGAGCACCGCGAGCGCTTCCGGCACCGACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACC
ACCTCGATCTCGCCGTTGTGGCTCACCGTCGCCAACGACGGCGCGGCGTTTACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCACCGGCACCACGTGGGTAGGAAAGAGCATGTCCGG
CACAGGCCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCCGCGGCCGGTGTCGCCAAGGT
ATGCCAGGTGGCGCAGGCCAAGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
CGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGGACCTATGGCAGCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGCCGTTCGATCCGAACGAACTGTTGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCGACACGGTGACGGCCGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAATTA
CGCGCGCTATTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCGGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCGACCCAGTTCAAGGGCAATGCGCGCGTCATCTTCGGGCTGAT
GAACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
R28 Cepa aislada de planta de hierba de clavo en Indonesia.
GCCGGTTGCGGCGGCGGNGACGGCGATACCAGTTTGAGCACCGCGAGCGCTTCCGGCACC
GACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACCACCCCGATCTCGCCGTTGTGGCTCACCATC
GCCAAGGACAGCGCGGCGTTTACGGTGAGCGGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGG
CAGCACGTGGGTGGGAAAGAGCATGTCCGGCACAGGCCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGG
CAAGGATCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGTCTGCCAGGTGGCGCAGGGCACGGGCACCCT
GCTGTGGCGTGGTGTCAGCCTGGCCGGCGCCGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCAC
CTACGGCACCAACTACATCTATCCGTCCGCCGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGG
CATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGGTGGGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGC
GTTCGATCCAAACGAACTGTTGCGCCTGACCGGGTTTGTCGACGCCGTGACGGCGGCCGG
ID-D-0005
SENACYT 57
CCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTACGCGCGCTATTACGGCAACGTGATCGGCTC
GGGCGCGGTGCCCAACACCGCGTACGCGGATTTCTGGCGGCGCCTGGCGACCCAGTTCAA
GGGTAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATGAACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCA
ATGGCTGTCCGGTGCCAACGCCGCGCTGGC
MAFF301558 Cepa aislada de planta de papa en Japón.
AGTTTGAGCACCGCGAGCGCTTCCGGCACCGACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACC
ACCCCGATCTCGCCGTTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGCGCGGCGTTTACGGTGAGC
GGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGGAAAGAGCATGTCCGG
CACAGGCCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCGGCGGTCGGTGTCGCCAAGGT
CTGCCAGGTGGCGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGTGTCAGCCTGGCCGGCGC
CGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCACCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGACAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGGTG
GGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGTTCGACGCGAACGAACTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTCGTGAACGCCGTGACGGCGGTCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
CGCGCGCTATTACGGCAACGTGATCGGCTCGGGCGCGGTGCCCAACACCGCGTACGCGGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCGACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAATGGC
JT516. Cepa aislada de planta de papa en Islas Reunión.
AGCCTGAGCACGGCAAGCGCGTCCGACACGGACACCACGACTCTGAAGCCCGCCGCCACC
TCGACGACCTCATCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCCGCGTTTACGGTGAGC
GGCACACGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGAAAAGAGCGTGAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAGGGACCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGT
GTGCCAACTGCTGCAGGGTACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGATAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGTCGTTCCGGTG
CGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
UW551. Cepa aislada de planta de geranio en Kenia
AGCCTGAGCACGGCAAGCGCGTCCGACACGGACACCACGACTCTGAAGCCCGCCGCCACC
TCGACGACCTCATCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCCGCGTTTACGGTGAGC
GGCACACGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGAAAAGAGCGTGAGCGG
TTCCGGCCAGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAGGGACCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGT
GTGCCAACTGCTGCAGGGTACGGGCACGCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGC
GGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTACATCTATCCGTCCGC
CGATAGCGCGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCGCCTGTCGTTCCGGTG
CGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGAC
CGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTA
TGCGCGCTACTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGA
TTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATG
AACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGAGCAGTGG
CIP65
GCCCTCAGCACGGCGGCCGCTACCGACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACCACCTCG
ATCTCGCCGTTGTGGCTCACCGTCGCCAAGGACAGCGCGGCGTTCACGGTGAGCGGCACG
ID-D-0005
SENACYT 58
CGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGCGAAGAGCATGTCCGGCACAGG
CCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGTGTGCCA
AGTGGCGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGCCGAGTT
CGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGAGCAACTACATCTATCCGTCCGCCGACAG
CGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTGGGAGCG
GCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGACCGGGTT
CGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTACGCGCG
CTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGATTTCTG
GCGGCGCGTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATGAACGA
GCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
UW 129. Cepa aislada de planta de banano en Peru.
ACGGCGGTACCGCCAGCCTGAGCACGGCAAGCGCGTCCGACACGGACACCACGACTCTG
AAGCCCGCCGCCACCTCGACGACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCC
GCGTTTACGGTGAGCGGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGAA
AAGAGCGTGAGCGGTTCCGGCCAGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCC
GGTGTTGCCAAGGTGTGCCAGTTGCTGCAGGGCACGGGTACCCTGCTGTGGCGCGGTGTC
AGCCTGGCCGGCGCGGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTA
CATCTATCCGTCCGCCGACAGCGTGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCG
CCTGCCGTTCAGGTGGGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGA
GCTGTCGCGCCTGACCGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCT
CGATCCGCACAACTATGCGCGCTATTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAA
CAGCGCGTACGCCGATTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGTGT
CATCTTCGGGCTGATGAACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGA GCAGTGG
UW 70. Cepa aislada de planta de banano en Peru.
ACGGCGGTACCGCCAGCCTGAGCACGGCAAGCGCGTCCGACACGGACACCACGACTCTG
AAGCCCGCCGCCACCTCGACGACCTCGTCCGTGTGGCTCACCATCGCCAAGGACAGTGCC
GCGTTTACGGTGAGCGGCACGCGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCACGTGGGTGGAA
AAGAGCGTGAGCGGTTCCGGCCAGTGCACCAGCACCTTCTTCGGCAAGGACCCGGCGGCC
GGTGTTGCCAAGGTGTGCCAGTTGCTGCAGGGCACGGGTACCCTGCTGTGGCGCGGTGTC
AGCCTGGCCGGCGCGGAGTTCGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGCAGCAACTA
CATCTATCCGTCCGCCGACAGCGTGACGTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTCGTGCG
CCTGCCGTTCAGGTGGGAGCGGCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGTGTTCGATGCGAACGA
GCTGTCGCGCCTGACCGGGTTTGTCAACGCCGTGACGGCGACCGGCCAGACGGTGCTGCT
CGATCCGCACAACTATGCGCGCTATTACGGCAACGTGATCGGGTCGAGCGCGGTGCCCAA
CAGCGCGTACGCCGATTTCTGGCGGCGCCTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATCCCCGTGT
CATCTTCGGGCTGATGAACGAGCCCAACTCGATGCCGACCGA GCAGTGG
ICMP8229 Cepa aislada de planta de gengibre en Costa Rica.
GCCCTCAGCACGGCGGCCGCTACCGACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACCACCTCG
ATCTCGCCGTTGTGGCTCACCGTCGCCAAGGACAGCGCGGCGTTCACGGTGAGCGGCACG
CGCACGGTGCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGCGAAGAGCATGTCCGGCACAGG
CCAGTGCACCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGTGTGCCA
AGTGGCGCAGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGCCGAGTT
CGGGGAGGGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGAGCAACTACATCTATCCGTCCGCCGACAG
CGCGACCTACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTGGGAGCG
GCTGCAGCCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGACCGGGTT
CGTCAACGCCGTGACGGCGGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTACGCGCG
CTACTACGGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGATTTCTG
GCGGCGCGTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATGAACGA
GCCCAATTCGATGCCGACCGAGCAGTGGC
ID-D-0005
SENACYT 59
MAFF301560
TTCGATGGCGGCCCTCATGCTAGCCGGTTGCGGTGGCGGCGACGGTGACACCGCCCTCAG
CACGGCGGCCGCTACCGACACCACGACCCTGAAGACGGCCGCCACCACCTCGATCTCGCC
GTTGTGGCTCACCGTCGCCAAGGACAGCGCGGCGTTCACGGTGAGCGGCACGCGCACGGT
GCGCTATGGCGCCGGCAGCGCGTGGGTGGCGAAGAGCATGTCCGGCACAGGCCAGTGCA
CCGCCGCCTTCTTCGGCAAGGATCCGGCGGCCGGTGTCGCCAAGGTGTGCCAAGTGGCGC
AGGGCACGGGCACCCTGCTGTGGCGCGGCGTCAGCCTGGCCGGCGCCGAGTTCGGGGAG
GGCAGCCTGCCGGGCACCTACGGGAGCAACTACATCTATCCGTCCGCCGACAGCGCGACC
TACTACAAGAACAAGGGCATGAACCTGGTGCGCCTGCCGTTCCGCTGGGAGCGGCTGCAG
CCCACGCTCAACCAGGCGCTCGACGCGAACGAGCTGTCGCGCCTGACCGGGTTCGTCAAC
GCCGTGACGGCGGCCGGCCAGACGGTGCTGCTCGATCCGCACAACTACGCGCGCTACTAC
GGCAACGTGATCGGCTCGAGCGCGGTGCCCAACAGCGCGTACGCCGATTTCTGGCGGCGC
GTGGCCACCCAGTTCAAGGGCAATGCCCGCGTCATCTTCGGGCTGATGAACGAGCCCAAT
TCGATGCCGACCGAGCAGTGGCTGTCCGGCGCCAACGCCGCGCTGGCCGCAATCCGCTCG
GCCAATGCGAGCAACGT
ID-D-0005
SENACYT 60
PARTE V.
V.1 INFORME FINANCIERO
CATORCEAVA CONVOCATORIA
LINEA FODECYT
Nombre del Proyecto: Estudio de la presencia de Ralstonia solanacearum en aguas de ríos utilizados para irrigación en Guatemala.
Numero del Proyecto: 005-2007
Investigador Principal: Lic. Amilcar Sánchez Pérez
Monto Autorizado: Q286,550.00
Fecha de Inicio y Finalización: 01/05/2007 al 30/08/2008 16 MESES
Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion
Presupuestaria
TRANSFERENCIA En Ejecuciòn
Menos (-) Mas (+) Ejecutado Pendiente de Ejecutar
1 Servicios No Personales
122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 2,000.00 Q 2,000.00
131 Viáticos en el exterior Q 7,865.00 Q 7,864.50 Q 0.50
133 Viáticos en el interior Q 29,000.00 Q 22,865.00 Q 3,840.00 Q 2,295.00
141 Transporte de personas Q 6,000.00 Q 640.00 Q 3,712.76 Q 1,647.24
181 Estudios,investigacionesy proyectos de factibilidad Q 64,000.00 Q 56,000.00 Q 8,000.00
195 Impuestos, derechos y tasas Q 640.00 Q 637.50 Q 2.50
2 Materiales y Suministros
261 Elementos y compuestos químicos Q 55,000.00 Q 39,364.99 Q 15,635.01
262 Combustibles y Lubricantes Q 12,000.00 Q 12,000.00
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc Q 9,000.00 Q 1,160.00 Q 7,840.00
291 Útiles de oficina Q 2,000.00 Q 2,000.00
295
Útiles menores, médico quirúrgicos y de
laboratorio Q 1,500.00 Q 1,500.00
3 Propiedad, planta y equipo
323 Equipo médico, sanitario y de laboratorio Q 80,000.00 Q 15,000.00 Q 95,000.00 Q -
9 Asignaciones Globales
(-) Gastos Administrativos (10%) Q 26,050.00 Q 26,050.00 Q -
TOTAL Q286,550.00 Q 23,505.00 Q23,505.00 Q 233,629.75 Q 52,920.25
Monto Autorizado Q 286,550.00
Disponibilidad: Q 52,920.25
( -) Ejecutado Q 233,629.75
Sub-total Q 52,920.25
( -) Apertura de Caja Chica
Total por Ejecutar Q 52,920.25