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Protocolos de Ralstonia solanacearum

Liliam Gutarra y Juan Herrera

Procedimiento Página

1. Colección de muestras de tallos de papa con síntomas de marchitez ……… 2 para aislamiento de Ralstonia solanacearum

2. Aislamiento y mantenimiento de las colecciones de R. solanacearum………. 3

3. Prueba de patogenicidad …………………………………………………………. 6

4. Extracción de ADN de R. solanacearum ………………………………………. 7

5. Identificación molecular de R. solanacearum por PCR ………………………… 10 6. Determinacion de biovares ………………………………………………………... 12

7. Determinación de filotipos de cepas de R. solanacearum ……………………… 15

8. Amplificación del gen endogluconasa de cepas de R. solanacearum

para determinación de secuevares ………………………………………………. 19

Apéndice

1. Preparación del tampón de extracción o tampón citrato pH 5.6 (1000 ml) …. 24

2. Preparación del medio Kelman con TZC ………………………………………… 24

3. Preparación del medio para diferenciación de biovares………………………. 25 4. Preparación del TE-1………………………………………………………………. 26 5. Preparación del TBE 10X (pH 8)………………………………………………… 26 6. Preparación del GEL red 1/10 (proteger de la luz)……………………………. 26

Referencias

Contenido

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1. COLECCIÓN DE MUESTRAS DE TALLOS DE PAPA CON SÍNTOMAS DE MARCHITEZ PARA AISLAMIENTO DE RALSTONIA SOLANACEARUM

1.1. Materiales

Papel toalla y bolsas de papel

Un marcador para identificar las muestras en las bolsas,

Tijeras de podar

Hipoclorito de sodio (NaOCl)

Plantas de papa de aproximadamente 40 días después del brotamiento

1.2. Procedimiento

Colectar uno de los tallos principales de la planta con síntomas de marchitez.

Para ello cortar un fragmento de aproximadamente 15 cm de longitud de la

base de la planta, con una tijera de podar. Desinfectar la tijera entre muestras

de tallos con una solución de hipoclorito de sodio al 1% de producto activo.

Limpiar el fragmento de tallo con papel toalla.

Envolver cada muestra en una hoja de papel toalla y guardar dentro de una

bolsa de papel.

Colocar las muestras de tallos en una caja de cartón, tecnopor o cooler.

Analizar el mismo día o guardar dos días como máximo en un lugar fresco

(alrededor de 15°C) pero no en la refrigeradora.

Figura 1. Colecta de plantas con síntomas de marchitez

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2. AISLAMIENTO Y MANTENIMIENTO DE LAS COLECCIONES DE (RS)

2.1. Materiales

Bolsas de plástico para lavar, desinfectar y macerar las muestras de plantas

Hipoclorito de sodio (NaOCl)

Un mechero Bunsen para desinfectar las herramientas

Tijeras de podar

Un martillo o un rodillo de madera para moler los fragmentos de tallo

Una probeta graduada de 1000 ml y dos Erlenmeyers o botellas de 1 litro para

preparar el tampón de extracción y el medio Kelman

Placas Petri

Tubos de prueba con tapas de rosca

Agua destilada

Un ph metro

Una incubadora

2.2. Procedimiento de lavado y desinfección

Lavar individualmente los fragmentos de tallos con agua de caño y dejarlos

secar sobre papel toalla limpio.

Eliminar los extremos de los trozos de tallos dejando aproximadamente de 5cm

de tejido con ayuda de una tijera de podar. Desinfectar la tijera con alcohol y

flamearlo entre cada muestra.

Desinfectar cada muestra en una solución de hipoclorito de sodio al 0.5 % de

producto activo contenido en un vaso de precipitación o bolsa de plástico

durante 1 minuto; eliminar la lejía y enjuagar una vez con agua destilada y a

continuación añadir alcohol al 70%, y enjuagar nuevamente dos veces con

agua destilada estéril o agua hervida.

Procedimiento de preparación del extracto de tallo.

Eliminar nuevamente los extremos del trozo de tallo (de aproximadamente 5cm)

dejando aproximadamente 3cm de tejido de cada uno. Desinfectar la tijera de

podar con alcohol y flamearlo entre cada muestra de tallos.

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Colocar el fragmento de tallo en una bolsa de plástico nueva y pesarlo.

Agregar 3ml de tampón citrato (ver en el Apéndice 1) por gramo de tejido.

Macerar con un martillo o rodillo de madera.

Colocar la bolsa de plástico en forma vertical sobre hielo picado (no más de

una hora) para evitar la oxidación de los fenoles.

2.3 . Aislamiento de R.solanacerum en medio Kelman con TZC

Poner 20 ul de la suspensión de cada muestra en placas conteniendo medio

Kelman con TZC (la composición del medio se describe en el Apéndice 2) y

sembrar por estriado.

Incubar las placas a 30 ° C durante 48 h.

Después de 48 h, las colonias de R. solanacearum tipo silvestre son de forma

irregular, fluida y de color blanco cremoso con los centros rosados.

2.4. Almacenamiento de Rs en agua

Coger una colonia de la bacteria del medio Kelman con TZC y sembrar en medio

Kelman sin TZC. Incubar la placa a 30oC durante 48 h.

Coger dos ansadas de bacterias de un compuesto de alrededor de seis colonias

individuales.

Poner las bacterias en 10 ml de agua destilada estéril contenida en tubos con

tapa de rosca. Chequear las bacterias cada seis meses sembrándolas

nuevamente en medio Kelman con TZC. Volver a purificar si hay presencia

de mutantes (Colonias redondas de color guinda con borde transparente).

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Figura 2. Aislamiento y mantenimiento de Ralstonia solanacearum.

Lavado y desinfección de muestras

Prueba de flujo

Colonias típicas de R. solanacearum

Aislamiento de R. solanacearum en medio Kelman (K) con TZC

Selección de colonias de R. solanacearum crecidas en K sin TZC

R. solanacearum en agua destilada estéril

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3. Prueba de patogenicidad Coger una colonia de la bacteria del medio Kelman con TZC (French et al., 1995)

y sembrar en medio Kelman sin TZC. Incubar la placa a 30oC durante 48 h.

Preparar una suspensión de R. solanacearum de aproximadamente 108

células/ml.

Inocular plántulas de papa (cualquier variedad susceptible a la marchitez

bacteriana) de 10 a 15 cm de altura, inyectando 20 µl de la una suspensión en

la axila de la tercera hoja superior, con ayuda de una jeringa hipodérmica.

Mantener las plantas bien regadas en un ambiente con temperaturas entre 25 a

30oC durante un mes con 80-90% de humedad relativa y con luz natural del día.

Si el aislamiento inoculado es una cepa virulenta de R. solanacearum los

síntomas aparecerán a partir de los cinco días.

Realizar la prueba del flujo vascular del tallo de la planta con síntomas de

marchitez y re-aislar la bacteria de la suspensión obtenida.

Figura 3. Prueba de patogenicidad: A) Inoculación de la bacteria R. solanacearum; B) Síntomas de marchitez 7 días después de la inoculación.

Control CIP-571

7

4. EXTRACCIÓN DE ADN DE R. SOLANACEARUM

4.1. Extracción de ADN a partir de un cultivo puro

A partir de un cultivo de la bacteria R. solanacearum en medio Kelman sin TZC,

coger de 1 a 2 colonias con un ansa de siembra estéril o un tip.

Resuspender las colonias en 100 µL de agua libre de nucleasas (NFW) estéril

contenido en un tubo eppendorf de 1.5 ml y homogenizar en un vortex.

Colocar el tubo eppendorf conteniendo la suspensión de ADN en baño María

(aproximadamente 95oC) durante 10 minutos.

Dejar el tubo eppendorf en hielo durante 3 minutos.

Almacenar las suspensiones de ADN a -20oC si no van a ser usadas de

inmediato.

4.2. Extracción de ADN mediante las tarjetas de FTA, a partir de tallos de papa con síntomas de marchitez

4.2.1. Colecta de muestras de tallos

Colectar uno de los tallos principales de la planta con síntomas de marchitez.

Para ello cortar un fragmento de aproximadamente 10-15cm de longitud de la

base de la planta, con una tijera de podar. Desinfectar la tijera entre muestras

de tallos con una solución de hipoclorito de sodio al 1% de producto activo.

Limpiar el fragmento de tallo con papel toalla, luego desinfectar uno de los

extremos con alcohol al 96% y enjuagar varias veces con agua destilada.

4.2.2. Colocación de la muestra en la tarjeta de FTA

Eliminar 2cm del extremo del fragmento de tallo desinfectado.

Cortar aproximadamente 2-5mm de longitud del fragmento de tallo y colocar

éste en la tarjeta de FTA.

Machacar la muestra presionando el tejido sobre la tarjeta con la ayuda de un

mango de mortero o la base de un tubo de vidrio.

Dejar secar la muestra durante 30 minutos.

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4.2.3. Remoción del disco

Extraer un disco (1mm) de la mancha seca de la muestra con ayuda de un micro

perforador (previamente desinfectado con alcohol) y colocarla en un tubo de

PCR.

4.2.4. Lavado del disco con reactivo de purificación de FTA

Añadir 200 μl del reactivo de purificación al tubo eppendorf que contiene el disco

e incubar a medio ambiente (MA) bajo agitación invirtiendo el tubo suavemente.

También puede ser a 50 rpm durante 5 minutos, descartar el reactivo después

de cada lavado con la ayuda de un micropipetor de 200 μl. Repetir el proceso 2

veces.

4.2.5. Enjuague del disco con TE-1, pH 8.0

Usar el buffer TE-1 (ver apéndice 3) para enjuagar el disco, para ello adicionar

200 µL de buffer TE-1 e incubar como en el caso anterior; descartar el reactivo

después de cada lavado con ayuda de un micropipetor de 200 µL. Repetir este

proceso 3 veces.

4.2.6. Secado de disco

Dejar que el disco se seque completamente a MA.

4.2.7. PCR

Adicionar el master mix de la PCR al tubo que contiene el disco y continuar con

la PCR.

Nota. Se recomienda que la PCR se realice dentro de las tres horas después del

lavado del disco; si no es posible, guardar el disco a 4oC o‘-20oC en oscuridad hasta

una semana.

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Figura 4. Extracción de ADN de Ralstonia solanacearum mediante tarjetas de FTA

4. Identificación molecular de R. solanacearum:

La técnica PCR se utiliza para confirmar la identidad taxonómica de R. solanacecarum usando los primers especie-específico 759/760 (Opina et al, 1997). Esta técnica se basa en la amplificación específica de una secuencia en particular del ADN de R. solanacearum.

1. Aplicar la muestra y dejarla secar completamente.

2. Remover el disco del centro de la muestra seca.

3. Colocar el disco en un tubo de PCR y lavar el disco con el reactivo de purificación FTA 3 veces.

4. Enjuagar el disco con TE-1 2 veces. Descartar el TE-1 despues de cada enjuague.

5. Dejar que el disco se seque completamente

6. Adicionar el master mix directamente al tubo que contiene el disco y continuar con

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Primers:

PRIMER SECUENCIA REFERENCIA 759 5' GTC GCC GTC AAC TCA CTT TCC 3'

Opina et al. (1997) 760 5' GTC GCC GTC AGC AAT GCG GAA TCG 3'

PROCEDIMIENTO:

4.1 Extracción de ADN

La extracción de ADN a partir de un cultivo puro (como lo indicado anteriormente).

4.2 Amplificación por PCR

Preparar del Master Mix de PCR (usando GoTaq® de PROMEGA) de acuerdo

al siguiente cuadro.

Componentes con [ ] inicial Volumen final en µl [ ] final Agua NFW 8.54 Buffer PCR (5 x) 3 1x

Cl2Mg (25 mM) 1.5 2.5 mM

d NTP 10 mM de cada uno 0.3 0.2 mM

Primer 759 (10 µM=) 0.3 0.2 uM

Primer 760 (10 µM) 0.3 0.2 uM

GoTaq flexi polimerasa (5U/µl) 0.06 0.3U

14

ADN 1

15

Dispensar 14 µl del master mix en los tubos de PCR.

Adicionar 1ul de la suspensión de ADN (10 ng/ul) de la muestra,

Colocar los tubos de PCR dentro del termociclador, cerrar y Continuar con el

proceso de amplificación.

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Condiciones de Amplificación:

Pasos Temperatura (oC) Tiempo Numero de ciclos

Desnaturalización inicial 94°C 2 min 1 ciclo

Desnaturalización 94°C 30s

30 ciclos T de anneling 59°C 30s

Extensión 72°C 17s

Extensión final 72°C 5min 1 ciclo

4°C ∞ 1 ciclo

4.3 Electroforesis (Ver protocolo de electroforesis en la página No 22.

Figura 5. Un gel de PCR. Carril 1 marcador de peso molecular (1000 pb); carril 2 al 16 son cepas de María-Amazonas; carril 17 control positivo (cepa CIP-255); carril 18 control negativo; Carril 19 marcador de peso molecular (1000 pb).

282 bp

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6. Determinación de biovares (Bv) y fenotipos del Bv 2 (Hayward, 1964, 1976):

La determinación de Bvs de R.solanacearum está basada en la utilización de los

disacáridos celobiosa, lactosa y maltosa, y la oxidación de los alcoholes hexosa dulcitol,

manitol y sorbitol.

Diferenciación de Ralstonia solanacearum en biovares

(Hayward et al., 1964,1989)

Procedimiento

6.1. Preparación del medio basal

Preparar 200 ml de medio basal (apéndice No 3)

Disolver todos los reactivos a excepción del agar, ajustar el pH del medio a 7,0

(color verde oliváceo) con una solución de NaOH al 40%.

Añadir el agar y autoclavar a 121oC durante 20 minutos.

Después de autoclavar, distribuir alícuotas de 18 ml en tubos de ensayo.

Almacenar el medio basal a 4oC, luego disolver cuando sea necesario

6.2 Preparar soluciones al 10 % de los hidratos de carbono (disacáridos o alcoholes hexosa)

según se necesite. Luego esterilizar todas las soluciones por filtración (membrana de 0,22

micras).

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6.3. Preparación de las placas de poliestireno de microtitulación

Disolver el medio basal en baño María y añadir 2ml de la solución del hidrato de

carbono.

Dispensar 0.170ml del medio en cada pocillo de la placa de poliestireno de

microtitulación.

6.2. Preparación de la suspensión de inóculo

Utilizar cultivos de la bacteria desarrollados en medio Kelman sin TZC durante dos

días.

Preparar 5ml de suspensión de inóculo (aproximadamente a una concentración

de 2x107 ufc/ml) en agua destilada estéril.

6.3. Inoculación del medio e incubación

Añadir 40µl de la suspensión de inóculo a cada hoyo de la placa de

microtitulación.

Cubrir las placas con sus respectivas tapas, sellarlas con Sran Wrap, luego

colocarlas dentro de una bolsa de plástico.

Incubar las placas a 30oC durante seis a siete días.

Examinar para ver producción de acidez (utilización de los disacáridos u oxidación

de los hexosa alcoholes) o cambio de color del medio de verde a amarillo (Figura

6).

Diferenciación del biovar 2 de R. solanacearum en fenotipos 2A y 2T Utilizando

de D(-) ribosa o de D(+) trealosa y L(+) tartrato de sodio

Preparar 120 ml de medio basal sin agar. Dispensar 27 ml del caldo en Erlenmeyer

de 50 ml de capacidad. Autoclavar a 121oC durante 20 minutos.

Preparar una solución al 10% de cada reactivo, disolver y esterilizar por filtración

(membrana de 0,22 micras).

Añadir 3ml de cada solución a los Erlenmeyers que contienen el medio basal y

lego dispensar 3 ml del medio basal que contiene la solución del reactivo en

tubos de ensayo previamente esterilizados.

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Adicionar 100µl de la suspensión de inóculo a cada tubo e incubar a 30oC durante

7 días y examinar para ver si hay cambio de color del medio de verde al azul (Fig

7).

Nota: Se puede usar las placas de microtitulación para D (-) ribosa y de D(+)

trealosa y el procedimiento es igual como lo indicado para la determinación de

biovares

Figura 6. Pruebas bioquímicas para diferenciación de biovares de Ralstonia solanacearum en placas de microtitulación (color verde = negativo; color Amarillo = Positivo)

Controles negativos

Controles negativos

15

Figura 7. Determinación de los fenotipos 2A y 2T utilizando D(+) Trealose y L (+) tartrato de sodio. D(+) Trealosa positiva (cambio de color del medio de verde al amarillo) y L (+) tartrato de sodio positivo (cambio de color del medio del verde al azul) corresponden al filotipo 2T y reacción negativa con no cambio de color del medio (verde) corresponden al filotipo 2 A.

7. DETERMINACION DE FILOTIPOS DE CEPAS DE Ralstonia solanacearum

OBJETIVO:

Determinación de Filotipos de R. solanacearum (Rs) mediante un PCR múltiple basado en la

información de la secuencia de la región del espacio transcrito interno o región ITS (Internal

transcribed Spacer) del 16S-23S del ARNr.

FUNDAMENTO:

Este método está basado en una reacción de PCR múltiple, usando cuatro primers forward

(Nmult:21:1F, Nmult:21:2F, Nmult:22: InF, Nmult:23:AF) específicos para cada filotipo y un solo

primer reverse (Nmult21:RR) que es específico para las especies (Fegan y Prior 2005). De esta

manera, se amplifican simultáneamente dos o más locus en una misma reacción. En este caso,

se obtiene un producto de amplificación específico para cada uno de los filotipos (figuras 8 y 9).

Trealosa Tartrato de sodio

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Lista de los primers para la determinación de filotipos

Nombre del primer

Secuencia

Especificidad

Producto

Nmult21:1F 5′-CGTTGATGAGGCGCGCAATTT-3′ Filotipo I 144pb

Nmult21:2F 5′-AAGTTATGGACGGTGGAAGTC-3′ Filotipo II 372 bp

Nmult23AF 5′-ATTACGAGAGCAATCGAAAGATT-3′

Filotipo III 91 bp

Nmult22:InF 5′-ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA-3′ Filotipo IV 213 bp

Nmult22:RR 5′-TCGCTTGACCCTATAACGAGTA-3′

Para todos los filotipos

Figua 8. Ejemplo de un gel PCR múltiple. Carril 1 marcador de peso molecular (1 Kb plus); carril 2 control negativo; carril 3 una cepa representativa del Filotipo II; carril 4 ACHO 732; carril 5 una cepa representativa del Filotipo IV; carril 6 una cepa representativa del Filotipo I; carril

Fegan y Prior, 2005

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PROCEDIMIENTO:

7.1 Extracción de ADN

La extracción de ADN a partir de un cultivo puro (como lo indicado anteriormente).

7.2 Amplificación por PCR múltiple de la región ITS

Para la amplificación utilizar los primers indicados en el cuadro 1

Preparar el Master Mix de PCR (usando GoTaq® de PROMEGA) de acuerdo al

siguiente cuadro.

Componentes Concentración Volumen final en µl Concentración inicial final

Buffer G2 GoTaq Flexi PCR 5X 3 1X

MgCl2 25mM 1.5 2.5mM

dNTPs 10mM 0.3 0.2mM

Nmult21:1F 10µM 0.3 0.2µM

Nmult21:2F 10µM 0.3 0.2µM

Nmult23AF 10µM 0.3 0.2µM

Nmult22:InF 10µM 0.3 0.2µM

Nmult22:RR 10µM 0.3 0.2µM

GoTaq G2 Flexi DNA plimerasa 5U/µl 0.06 0.03U

NFW agua 7.64

14

ADN 1

Volumen final 15 µl

Dispensar 14 µl del master mix en los tubos de PCR.

Adicionar 1 µl de la suspensión de ADN (10 ng/ µl) de la muestra.

Colocar los tubos de PCR dentro del termociclador.

Continuar con el proceso de amplificación.

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Condiciones de Amplificación:

Pasos Temperatura (oC)

Tiempo Número de ciclos

Desnaturalización inicial 94°C 2 min 1 ciclo

Desnaturalización 94°C 30s

30 ciclos T de anneling 59°C 30s

Extensión 72°C 23s

Extensión final 72°C 5min 1 ciclo

4°C ∞ 1 ciclo

7.2. Electroforesis

Ver protocolo de electroforesis en la página No 22

Figura 9. Un gel PCR múltiple con cepas de Chota, Cajamarca. Carril 1 marcador de peso molecular (1000 pb); carril 2,3, 4 controles de filotipo I, II y, III; carriles del 5 al 18 son cepas de Chota- Cajamarca, corresponden al filotipo II; carril 19 control negativo; carril 20 marcador de peso molecular (1000 pb).

372 pb

Controles

19

8. AMPLIFICACIÓN DEL GEN ENDOGLUCONASA DE CEPAS DE Ralstonia solanacearum PARA DETERMINACIÓN DE SECUEVARES

OBJETIVO:

Amplificación del gen endogluconasa de R. solanacearum mediante PCR.

FUNDAMENTO:

Este procedimiento se basa en la amplificación por PCR de un fragmento de 750 pb del gen de

endogluconasa (egl) usando un par de primers Endo-F y Endo-R (Fegan et al., 1998). El protocolo

de PCR y condiciones fueron previamente descritos (Wicker et al., 2007)

Secuencia de los primers:

Nombre Secuencia

Endo-F 5′- ATGCATGCCGCTGGTCGCCGC-3′ Endo-R 5′-GCGTTGCCCGGCACGAACACC-3′

PROCEDIMIENTO:

8.1. Extracción de ADN

La extracción de ADN se realiza a partir de cultivo puro (ver extracción de ADN a partir

de cultivo puro).

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8.2. Amplificación por PCR del gen de endogluconasa

Preparar el master Mix de PCR (usando GoTaq® de PROMEGA) de acuerdo al

siguiente cuadro:

Componentes [ ] inicial Volumen Final en µL [ ] final

5X Green or colorless GoTaq® Flexi 5X 15 1X MgCl2 Solución 25mM 3.75 1.25mM dNTPs 10mM 1.5 0.2mM Cebador Endo-F 10µM 1.5 0.2µM Cebador Endo-R 10µM 1.5 0.2µM GoTaq® G2 Flexi DNA polymerase 5U/µL 0.3 1.5U Nuclease free wáter (NFW) 48.45 72 ADN template 10ng/µL 3 Volumen Total 75

Dispensar 72µL del master mix en los tubos de PCR.

Adicionar 3µL de suspensión de ADN (~10 ng/µL) de la muestra.

Colocar los tubos de PCR dentro del termociclador, cerrar.

Continuar con el proceso de amplificación.

Condiciones de Amplificación:

Pasos Temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95oC 2min x1

Desnaturalización 95oC 30s

x28 T de anneling 70oC 30s

Extensión 72oC 50s

Extensión final 72oC 5min x1

Fin 4oC ∞

21

8.3 Electroforesis

Realizar una corrida electroforética para verificar la cantidad y calidad de producto de PCR,

usar 5µL del producto de PCR con 1µL Gel red 1:10. Protocolo de electroforesis se encuentra

en la página No 22.)

Figura 10. Un gel de amplificación por PCR de una región de 750 pb del gen de endogluconasa usando los primers Endo-F y Endo- R (Poussier et al., 2000)

Nota: Los 70 µL de producto de PCR restante, son enviados a Macrogen para su purificación

y secuenciamiento.

758pb

22

Consideraciones para el envío del producto de PCR a Macrogen Los productos de PCR serán purificados y secuenciados por Macrogen services

(Kumchunku, Korea del sur) usando los primers Endo-F and Endo-R.

Para el envío de muestras, además de los primers, se deben cumplir con ciertos requisitos

para un correcto secuenciamiento, como se puede observar en el siguiente cuadro:

Nota: Para mayores detalles de los requisitos que se deben de cumplir para el envío de

las muestras a secuenciar entrar a la página de macrogen.

http://dna.macrogen.com/eng/support/ces/guide/ces_sample_submission.jsp

PROTOCOLO PARA LA ELECTROFORESIS

8.3.1. Preparación del gel

Agregar 1g de agarosa para 100 ml de TBE 1X (Ver apéndice 1) y disolver en un

horno de microondas.

Añadir 1µl de Gel Red por cada 100 ml de gel. Mezclar suavemente.

Plantilla Tipo / Formato

PCR producto - 50 ng / μL

(purificado) - Volumen mínimo de 20μl

PCR del producto - 100 ng /μL

(sin purificar) - Volumen mínimo de 30μl

Requisitos de las muestras observaciones

Para re-secuenciamiento, esnecesario 5μL

N / A

23

Vaciar el gel en un molde y poner el peine apropiado cerca de uno de los extremos

del molde.

Asegúrese de que no haya burbujas o impurezas se quedan en el camino del

ADN.

Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta que solidifique (aproximadamente 30

minutos).

Colocar el gel en una cámara electroforética y añadir el TBE 1X (ver Apéndice

No.1) hasta que cubra el gel.

8.3.2 Preparación de la muestra para la corrida

Agregar a cada muestra (10µl) y al marcador de peso molecular (5µl) 1ul de

GELRED (diluido 1/10) y 3µl del loading buffer 10 X.

Colocar cada muestra en los pocillos del gel y el ladder (marcador de peso

molecular) al final y/o comienzo del gel.

Ejecutar en el voltaje adecuado (130V por 40 minutos).

Transcurrido el tiempo visualizar las bandas, colocando el gel bajo luz ultravioleta

en un transiluminador o en el Sistema de foto-documentación Chemidoc™ MP.

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APÉNDICE

1. Preparación del tampón de extracción (1000 ml): tampón de citrato pH 5,6

Composición

Ácido cítrico 1.995g

Citrato de sodio 11.907g

Agua destilada 1L

Preparación

1.1. Disolver el ácido cítrico en un litro de agua destilada y luego agregar lentamente

el citrato de sodio, mientras se agita; ajustar el pH a 5.6.

1.2. Esterilizar en autoclave a 120oC durante 20 minutos.

2. Medio Kelman con TZC (French et al., 1995)

2.1. Medio basal:

Composición:

D (+)-glucose (Merk) 2.4g

Bacto Peptone (BD) 10g

Casamino acids (Difco) 1g

Agar (SIGMA ALDRICH) 15g

Agua destilada 1 000ml

Preparación

Disolver todos los reactivos en un litro de agua destilada, a excepción del agar. Una vez

disueltos, agregar el agar y esterilizar en autoclave a 120oC durante 20 minutos; luego

enfriar a 50°C y añadir 5 ml de la solución de TZC antes del plaqueado.

25

2.3. Solución TZC al 1%

Composición:

Cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio (TZC o TTC) 1g

Agua destilada

100ml

Preparación

Disolver el cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio (TZC o TTC) en 100 ml de agua destilada,

colocar en un frasco a prueba de luz y autoclavar por sólo 8 minutos o esterilizar por

filtración. Guardar bajo refrigeración.

3. Preparación del medio para diferenciación de biovares

3.1. Medio basal:

Composición:

Medio basal:

Fosfato monobásico de amonio (NH4H2PO4) “MERK” 1.0 g

Cloruro de potasio (KCI) “Riel- de Haen” 0.2 g

Sulfato de magnesio MgSO47H2O) “MERK” 0.2 g

Peptona “BD” 1.0 g

Azul de bromotimol (bromothymol blue) “MERK” 0.03 g

Agar “SIMA ALDRICH” 3.0 g

Agua destilada 1 000 ml

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4. Tampón TE-1

Compuesto

Cantidad Concentración final

Tris-HCl 1M pH8.0 10 ml 10 mM

EDTA 0.5 M pH8.o 0.2 ml 0.1 mM

Agua destilada

estéril 1000 ml

Ajustar el pH a 8 y autoclavar a 120oC por 20 minutos.

5. Preparación del TBE 10X (pH 8) Composición:

Trizma base

108g

Ácido bórico 55g

EDTA 0.5M pH 8 40ml

Agua destilada 1000ml

Ajustar el pH y autoclavar a 120oC por 20 minutos.

6. Preparación del GEL red 1/10 (proteger de la luz)

Composición:

Gel red puro (10000X)

1.8µl

Nuclease free water (NFW) 16.2µl

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REFERENCIAS

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