ACTIVACIÓN DE NF-B EN MACRÓFAGOS INFECTADOS CON Brucella abortus

Clave 20082270

INFORME FINAL

INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una enfermedad infecciosa, causada por bacterias del

género Brucella, que está documentada en América Latina desde la década de

1900. Los miembros de la familia Brucellae son cocobacilos Gram negativos,

inmóviles, que no forman esporas ni tienen cápsula. El género Brucella está

constituido por 6 especies, cada una de las cuales infecta preferentemente a una

especie animal determinada. B. melitensis se aísla más frecuentemente de

ganado caprino, B. abortus de ganado vacuno, B. suis de ganado porcino, B. canis

de caninos, B. ovis de ganado ovino, y B. neotomae de ratas salvajes. Sin

embargo, cada especie de Brucella se ha aislado de muy diversas especies

animales (Corbel, M. M. J., 1991). Las cinco primeras especies de Brucella están

documentadas como patógenas para el humano, por lo que a esta infección se le

ubica entre las zoonosis (Fekete, A., 1992; Smith, R. III., 1990; Young, E. J., 1983;

Young, E. J., 1995). En la infección natural en el humano y en las demás especies

animales, la bacteria penetra por las mucosas del huésped (Akhtat, M., 1989).

Brucella invade órganos y tejidos del sistema fagocítico mononuclear, como el

bazo, el hígado y la médula ósea, donde queda secuestrada intracelularmente,

inaccesible al efecto de los antibióticos (Campbell, G. A., 1994; Corbel, M. J.,

1984).

Durante el curso de la infección, los fagocitos profesionales son los

primeros en ser infectados por Brucella, y la bacteria puede sobrevivir dentro de

esas células. Las cepas lisas virulentas de B. abortus, como la cepa 2308, se

replican intracelularmente con más eficiencia que B. abortus 19 (atenuada lisa) o

las cepas rugosas. Se ha propuesto que la inhibición de la fusión fagosoma

lisosoma es un mecanismo utilizado por B. abortus para la supervivencia

intracelular (Pizarro-Cerdá, J., 1998A).

La resistencia a patógenos intracelulares como Listeria monocytogenes,

Mycobacterium tuberculosis y Brucella abortus depende grandemente de la

inmunidad mediada por células T CD4+, que a través de mediadores como el IFN-

logran la activación de los macrófagos (Flynn, J. L., 2001; Jouanguy, E., 1999;

Stenger, S., 1999; Yang, J., 1997; Zhan, Y., 1993; Oliveira, S. C., 1998). La

activación de los macrófagos es un elemento esencial para evitar que la infección

causada por Brucella se haga crónica (Pizarro-Cerdá, J.,1998B; Delrue, R. M.,

2001; Samartino, L. E., 1994). Las citocinas producidas durante las fases

tempranas de la inducción de la respuesta inmunológica son esenciales para

definir el tipo de respuesta que se va a desarrollar, ya sea de tipo celular que

conlleva a la activación de los macrófagos infectados, o a una respuesta de

anticuerpos (Trinchieri, G., 1998).

Los macrófagos pueden ser activados por LPS, lo que resulta en un

aumento en su habilidad para matar microorganismos y células tumorales. Esta

activación está acompañada por una rápida inducción de genes que están directa

o indirectamente involucrados en la función antimicrobiana o antitumoral de los

macrófagos (TNF-, IL-1 y , IL-8 e iNOS). Una característica común de todos

estos genes inducibles por LPS es que cada uno de ellos contiene al menos un

motivo consenso decamérico para el factor nuclear B (NF-B) en su región

promotora/aumentadora (Ding, A., 1995).

La expresión de los genes es controlada por la frecuencia de la iniciación

transcripcional del promotor. En muchos casos la velocidad a la cual inicia la

transcripción está limitada por la disponibilidad o actividad de unión al DNA por los

activadores en la región promotora. Uno de tales activadores es el factor de

transcripción NF-B, mientras que la actividad de unión al DNA y la distribución

celular están controladas por las proteínas inhibidoras IB (Hay, R. T., 1999).

El NF-B es inducible en muchos tipos de células. En células pre-B, el NF-

B es inducible por LPS y ésteres de forbol. También se ha demostrado la

activación del NF-B en líneas de células T, células HeLa, macrófagos y en

monocitos durante su diferenciación (Vicente, M. P., 1992). El NF-B es, por sí

mismo, un activador transcripcional de citocinas crítico involucrado en la respuesta

inmune innata, incluyendo la producción de TNF- e IL-1 (Hatada, E. N., 2000).

El NF-B se encuentra en el citosol de muchos tipos de células como un

heterodímero inactivo compuesto de las subunidades de 50 kd (p50) y 65 kd (p65).

Este heterodímero está unido a una proteína, IB (Schütze, S., 1992). La

activación involucra la liberación de los dímeros del NF-B de la proteína IB por

la fosforilación de dicha proteína por las cinasas IB, IKK y , la ubiquitinación de

IBs por un complejo ligasa ubiquitina y la degradación por el proteasoma 26S

(Hatada, E. N., 2000). Una vez liberado, el NF-B se transloca hacia el núcleo

donde se asocia con las secuencias aumentadoras de transcripción apropiadas

(Vicente, M. P., 1992). Las cinasas que fosforilan a IBs en los residuos de serina

(Ser32 y Ser36 para IB, Ser19 y Ser23 para IB) en respuesta a LPS, TNF-,

IL-1 ó PMA fueron identificadas como IKK e IKK. IKK e IKK contienen

dominios de cinasa estrechamente relacionados, “zippers” de leucina y regiones

hélice-“loops”-hélice, y forman heterodímeros los cuales son parte de un gran

complejo de aproximadamente 800 kDa. Experimentos bioquímicos y de

transfección sugieren que las funciones de IKK e IKK no son equivalentes. IKK

es un activador del NF-B más potente y tiene mayor actividad de cinasa que

IKK (Hatada, E. N., 2000).

Los activadores más importantes del NF-B son las citocinas

proinflamatorias IL-1 y TNF- que son producidas en respuesta a una infección. El

papel del NF-B en la transmisión de señales desde el ambiente extracelular hacia

el núcleo de las células es para iniciar un nuevo programa de la expresión de

genes en la célula estimulada. Los genes activados por el NF-B incluyen

interferones y otras citocinas, proteínas de fase aguda, moléculas de adhesión,

receptores de citocinas y moléculas de histocompatibilidad (Hay, R. T., 1999).

Murphy y colaboradores han encontrado que algunas citocinas,

principalmente IFN- e IL-10, pueden ejercer su efecto sobre la respuesta de las

células T por el aumento o inhibición de la producción de IL-12 por el macrófago

respectivamente. También han demostrado la unión del factor nuclear NF-B a la

secuencia promotora del gen de IL-12 en macrófagos activados y que el IFN-

aumenta la transcripción de IL-12 p40 incrementando la unión del NF-B al sitio

promotor (Murphy, T. L., 1995).

Se ha demostrado que la combinación de IFN- e IL-2 induce o promociona

la transcripción de genes de citocinas inflamatorias en monocitos y en macrófagos,

incluyendo el TNF- y la IL-1 (Namuri, S., 1992). Namuri y col. evaluaron la

actividad del IFN- y de la IL-2 para activar proteínas nucleares en macrófagos

peritoneales, que sean capaces de unirse específicamente a las secuencias

consenso del NF-B, presentes en la región 5´ del sitio de inicio de la transcripción

de muchos genes de citocinas. Observaron que los macrófagos estimulados con

IFN- o IL-2 causaron poca activación de NF-B, la cual se evidenció por la

aparición de un complejo DNA-proteína característico en ensayos de retardo de la

movilidad electroforética; IFN- e IL-2 en combinación cooperaron para

incrementar la actividad de unión del NF-B al DNA, a un nivel equivalente que el

observado en los macrófagos estimulados con LPS, otro potente estimulador de la

expresión de genes de citocinas en los macrófagos (Namuri, S., 1992).

El TNF- es producido primariamente por macrófagos y funciona

inmunológicamente a través de la regulación transcripcional de los genes que

codifican moléculas de adhesión celular requeridas para el reclutamiento de

células inflamatorias y genes que codifican citocinas inflamatorias tales como IFN-

. El TNF- regula la expresión de genes que tienen un papel crítico durante la

respuesta inflamatoria mediada inmunológicamente. La activación del NF-B por

TNF- es esencial para montar una respuesta efectiva; desde luego muchos de

los genes regulados por TNF- contienen sitios de unión para NF-B (Cheshire, J.

L., 1997).

Datos de experimentos in vivo demuestran que se requiere de TNF- e IFN-

para la resistencia efectiva a la infección bacteriana. También se ha mostrado

que el TNF- y el IFN- juegan un papel crucial en la progresión de la respuesta

inflamatoria asociada con el choque séptico inducido por el LPS (Cheshire, J. L.,

1997). Cheshire y Baldwin demostraron que el IFN- aumenta la translocación

nuclear de NF-B inducida por TNF- en líneas celulares de endotelio vascular.

Los mecanismos involucran la degradación de novo de IB, conduciendo a la

activación persistente de NF-B y aumenta la respuesta transcripcional

dependiente de B. La activación sinérgica de NF-B por dos citocinas

proinflamatorias representa un mecanismo por el cual la expresión de genes

inducida por NF-B podría aumentar bajo condiciones inflamatorias y pueden

explicar un aspecto crítico del sinergismo entre TNF- e IFN- durante una

respuesta inmune efectiva (Cheshire, J. L., 1997).

OBJETIVO

Por todo lo anterior, los objetivos del presente proyecto fueron determinar el

papel del factor de transcripción NF-kB en la infección de macrófagos con dos

cepas de Brucella abortus de diferente virulencia y determinar la vía de activación

que ocurre en cuando los macrófagos son infectados con la cepa virulenta y la

cepa vacunal de Brucella abortus.

El esquema general de trabajo que se siguió en el presente estudio se ilustra en la

siguiente figura.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y línea celular.

Para el trabajo se utilizaron la cepa vacunal B. abortus RB51 y la cepa

virulenta B. abortus 2308, ambas donadas amablemente por Gerhardt Schurig

(Virginia Tech, E.U.A.). Las cepas se crecieron y mantuvieron en agar de soya y

tripticaseína. Para su crecimiento se incubaron a 37°C. Previamente a su uso para

infectar a los macrófagos se cosecharon con PBS y se lavaron y resuspendieron

con medio RPMI suplementado.

Los macrófagos de la línea celular J774A.1, donada amablemente por Gerhardt

Schurig, se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con L-

glutamina 2 mM (Sigma Chemical) y suero de caballo al 7% (Gibco BRL), y

adicionado con antibióticos (100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina) y

250 ng/ml de anfotericina B.

Infección de macrófagos con B. abortus.

Se distribuyeron 2.4 x 107 macrófagos J774A.1 en cada caja de petri para

cultivo celular (Nunc) de 144 x 21 mm, se infectaron con 2.4 x 109 ufc de B.

abortus RB51 ó de B. abortus 2308, y se incubaron durante diferentes tiempos a

370C en atmósfera de CO2. Para los tiempos mayores a media hora se incubó a

los macrófagos con las bacterias durante media hora, después se lavaron con

RPMI precalentado a 37°C, y se les agregó medio RPMI suplementado y sin

antibióticos. Las células se lavaron 3 veces con PBS y se extrajeron las proteínas

nucleares y citoplásmicas. Para el análisis de los genes expresados mediante RT-

PCR, se utilizaron 4x106 células que se infectaron con 4x108 ufc de B. abortus

RB51 ó 2308. Los tiempos de infección para esta evaluación fueron de 30 min,

1.5, 3, 6 y 24 h.

Estimulación de macrófagos con B. abortus RB51 ó 2308 inactivadas por

calentamiento.

Se colocaron 2.4 x 107 macrófagos J774A.1 en cajas de petri para cultivo

celular y se les agregaron 2.4 x 109 ufc de B. abortus RB51 ó de la cepa 2308,

inactivadas por calentamiento a 70oC durante 30 min; las células se incubaron a

diferentes tiempos a 370C en atmósfera de CO2. Para los tiempos mayores a

media hora los macrófagos se incubaron con las bacterias muertas durante media

hora, después se lavaron y se les agregó medio RPMI suplementado, sin

antibióticos, y se incubó el tiempo restante. Las células se lavaron 3 veces con

PBS y se extrajeron las proteínas nucleares y citoplásmicas. Para el análisis de los

genes expresados mediante RT-PCR, se utilizaron 4x106 células a las que se les

agregaron 8x108 ufc de B. abortus RB51 ó 2308, los tiempos de incubación

utilizados para esta evaluación fueron de 30 min, 1.5, 3, 6 y 24 h.

Preparación de extractos citoplásmicos y nucleares de macrófagos.

Los macrófagos lavados con PBS frío, se desprendieron con un raspador

de células, y se centrifugaron durante 5 min a 1500 x g a 8oC (Eppendorf,

Westbury, NY). Las células se resuspendieron en el amortiguador A (HEPES 10

mM, KCl 10 mM, MgCl2 1.5 mM, DTT 1 mM, pH 7.9), y se congelaron en un baño

de hielo seco-acetona. Posteriormente, se descongelaron en baño de hielo, y se

centrifugaron a 1200 x g, a 4oC, durante 10 min. Se recolectaron los

sobrenadantes como extractos citoplásmicos, y la pastilla conteniendo a los

núcleos se resuspendió en el amortiguador C (HEPES 20 mM, NaCl 0.4 M, MgCl2

1.5 mM, 25% de glicerol, EDTA 0.2 mM, DTT 1mM, pH 7.9), adicionado con el

inhibidor de proteasas PMSF 0.5 mM. Esta mezcla se incubó a 4oC durante 30 min

con agitación suave en una plataforma angular, y se centrifugó a 20,000 x g a 4oC

por 20 min. El sobrenadante se recolectó como el extracto nuclear. A los extractos

citoplásmicos y nucleares se les agregó el amortiguador D (HEPES 20 mM, KCl 50

mM, 25% de glicerol, EDTA 0.2 mM, DTT 1 mM, inhibidor de proteasas PMSF 0.5

mM, pH 7.9), para su almacenamiento a –70oC. La concentración de proteínas se

midió mediante la reacción con el ácido bicinconínico (Pierce), utilizando albúmina

sérica bovina como estándar.

Análisis de las proteínas MyD88, pNIK, pIB, NF-B y pStat1 por

Inmunoblot.

Los extractos de proteínas citoplásmicas y nucleares fueron sujetos a

electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%, con dodecil sulfato de sodio (SDS-

PAGE), y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, que se bloqueó

durante 1 h a temperatura ambiente con 3% de leche descremada en

amortiguador de TBS (Tris 20mM, NaCl 0.14M, pH 7.6) adicionado de 0.05% de

Tween 20 (TBS-T),. Las membranas se lavaron con TBS-T y se incubaron durante

toda la noche a 4°C con los anticuerpos de conejo específicos para las proteínas

MyD88, pNIK, pIB, NF-B y pStat1 (Santa Cruz Biotechnology, INC., Santa

Cruz, California) diluidos 1:1000 en el amortiguador TBS con 3% de leche.

Después de lavar con TBS-T, las membranas se incubaron con el anticuerpo

secundario IgG de cabra anti IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano

(HRP, Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h a temperatura ambiente. Se agregó

el sustrato Luminigen PS-3 (Amersham, Biosciences, Buckinghamshire, England),

preparado de acuerdo a las indicaciones del fabricante, sobre la membrana

dejando actuar durante 5 min. Se eliminó el exceso de reactivo y la membrana se

envolvió en plástico autoadherente y se puso en contacto con una placa

radiográfica, exponiendo durante 5 min. La placa se reveló y se fijó.

Ensayo de retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA).

Las proteínas citoplásmicas o nucleares se incubaron con un

oligonucleótido de doble cadena marcado con [-32P] ATP. Para marcar el

oligonucleótido, se colocaron en un tubo de microcentrífuga 2 l (1 g) del

oligonucleótido de doble cadena, 1 l del amortiguador de la enzima T4

polinucleotidilcinasa (Gibco BRL), 1 l de la enzima T4 (Gibco BRL), 1 l de [-32P]

ATP (Amersham Biosciences) y 6 l de agua inyectable; se incubó 1 h a

temperatura ambiente y se llevó a un volumen final de 100 l, para almacenar a –

20oC. El oligonucleótido marcado se incubó con el extracto citoplásmico o el

extracto nuclear, colocando 5 g de proteína con 0.05 g/l de poli (dI-dC), se

incubó durante 15 min en hielo y se agregaron 2 l del oligonucleótido marcado

con[-32P] ATP. La mezcla se incubó 30 min a temperatura ambiente. Los

oligonucleótidos (BioSynthesis) contenían las siguientes secuencias: para unión

de NF-B: 5´-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3´; para unión de pSTAT1:

5´- GTG CAT TTC CCG TAA ATC TTG TCT ACA-3´; y para unión de AP1: 5´-

CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA-3´. Los complejos DNA-proteína se corrieron

electroforéticamente en un gel de poliacrilamida (29:1) al 6% en amortiguador de

TBE 0.5x (Tris 40 mM, ácido bórico 40 mM, EDTA 1 mM).

Aislamiento de RNA celular total y RT-PCR.

La evaluación del mRNA de TLR2 y TLR4 se realizó mediante RT-PCR

semicuantitativo. A 2 g del RNA celular total extraído de los cultivos de

macrófagos infectados o estimulados con la bacteria inactivada por calentamiento,

se les realizó la transcripción inversa. Las amplificaciones mediante PCR se

realizaron utilizando los iniciadores sentido y antisentido para los mRNA de cada

TLR.

I. OBTENCIÓN DE RNA TOTAL. Los macrófagos infectados o estimulados se

colocaron en tubos de microcentrífuga (6 x 106 células), a los que se les

adicionaron 2 ml de Trizol (Gibco), después se distribuyeron en dos tubos de

microcentrífuga, y se agitaron en agitador Vortex durante 30 s. Las muestras de

cada uno de los tiempos de incubación se guardaron a –20ºC para procesarlas

simultáneamente. A cada tubo se le agregaron 200 l de cloroformo, se agitó en

agitador Vortex 15 s y se centrifugó en frío a 11,300 x g durante 15min. Se separó

la fase acuosa colocándola en otro tubo de microcentrífuga al cual se le agregaron

500 l de alcohol isopropílico incubándose 10 min a temperatura ambiente; se

centrifugó a 11,300 x g durante 15 min y se eliminó el sobrenadante; al RNA

precipitado se le adicionó 1 ml de etanol al 80% y se centrifugó a 7,060 x g

durante 5 min. Se retiró el sobrenadante, y el líquido remanente se secó durante

6-10 min.

II. RETROTRANSCRIPCIÓN (OBTENCIÓN DE cDNA). El RNA de cada muestra

se resuspendió en 15 l de agua-DEPC, y se tomaron 2 l que se diluyeron 1:200

para determinar la concentración de RNA. A 2 g de RNA, se le agregaron 11 l

de agua inyectable y 2 l de la solución concentrada de oligo-dT (0.5 g/l, Gibco),

y se incubó a 65ºC durante 10 min en el termociclador (Perkin Elmer, London).

Después se adicionaron 15 l de la mezcla de reacción para obtener el cDNA

(volumen final de 30 l), que consistió en lo siguiente:

Volumen Concentración final

Agua-DEPC 3.8 l

5x-StBuffer 6.0 l 1x

dNTP´s 10 mM 1.2 l 400 M

MMLV-RT 200 U/ml 1.0 l 0.2 U/l

DTT 100 mM 3.0 l 10 M

La reacción continuó en el termociclador a 37ºC durante 1h, y 5min a 95ºC. Una

vez terminada la reacción, se agregaron 70l de agua-DEPC para tener un

volumen final de 100 l.

III. PCR. En la última etapa del proceso, se determinó la presencia del cDNA para

TLR2 y tlr4, y para la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogensa (G3PDH).

Para ello se preparó la mezcla de reacción que consistió en lo siguiente:

Volumen

Agua-DEPC 35.3 l

Regulador PCR 10x 5.0 l

MgCl2 50 mM 2.5 l

dNTP´s 10 mM 1.0 l

Iniciador 5´ 20 mM 0.5 l

Iniciador 3´ 20 mM 0.5 l

Taq polimerasa 5 U/ml 0.2 l

cDNA 5.0 l

Volumen final de reacción 50.0 l

Los iniciadores utilizados tenían la siguiente secuencia de bases:

Iniciador Secuencia Tamaño

(pb)

G3PDH 5´Primer: 5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’ 452

3’ antisense: 5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG T-3’

TLR2 5´Primer: 5´-TCT AAA GTC GAT CCG CGA CAT-3´ 343

3´Primer: 5´-TAC CCA GCT CGC TCA CTA CGT-3´

TLR4 5´Primer:´5´-CAA GAA CAT AGA TCT GAG CTT CAA-3´ 277

3´Primer: ´5´-GCT GTC CAA TAG GGA AGC TTT CTA GAG-3´

La PCR se efectuó en el termociclador, con los siguientes ciclos:

Temperatura Tiempo

30 ciclos: 94oC 45 s

60oC 45 s

72oC 90 s

1 ciclo: 72oC 7 min.

Análisis estadístico.

Se emplearon las pruebas de análisis de varianza (ANOVA) unifactorial y

ANOVA bifactorial, utilizando comparaciones con la prueba de Tukey para

determinar la significancia estadística, según se indica en cada experimento. Para

los ensayos de TLR, se utilizó la prueba de t de Student para analizar los dos

grupos (B. abortus RB51 y 2308) en cada uno de los tiempos estudiados.

RESULTADOS

B. abortus RB51 y B. abortus 2308 inducen la activación del factor nuclear

NF-B mediante la vía dependiente de MyD88.

Para determinar el efecto de la infección con B. abortus sobre la

señalización que lleva a la activación del factor NF-B se infectaron macrófagos

de la línea celular J774A.1 con B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 y se

determinó la activación de las proteínas MyD88, NIK y IB, así como la

translocación nuclear de NF-B. Aunque la infección con ambas cepas

bacterianas indujo la activación de MyD88, pNIK y pIB, los tiempos en que esto

ocurrió fueron diferentes (Fig 1). En las células infectadas con B. abortus RB51 las

proteínas activadas se detectaron a los 5 min postinfección (p.i.), mientras que las

células infectadas con B. abortus 2308 mostraron un retraso en la activación de

estas proteínas. MyD88 y pNIK se detectaron hasta los 30 min p.i., y pIB se

detectó a los 15 min. Debido a que NF-B debe translocarse hacia el núcleo para

activar la transcripción génica de las citocinas pro-inflamatorias, se investigó el

efecto de la infección por B. abortus sobre la translocación de este factor. Como

se muestra en la Fig. 1, el NF-B se translocó al núcleo de las células infectadas

con B. abortus RB51, desde los 5 min p.i., y es detectable hasta los 30 min (Fig. 1,

NF-B (EN)).

Se observó una segunda fase de liberación y translocación de NF-B a los

90 min, y una tercera fase de respuesta a las 6 h. En las células infectadas con B.

abortus 2308 se observó translocación nuclear del NF-B a partir de los 5 min,

manteniéndose hasta los 90 min, y una segunda fase de respuesta de las 2 a las 6

h p.i. Estos resultados indican que las dos cepas de B. abortus indujeron la

liberación y translocación nuclear del NF-B.

FIGURA 1. Señalización a través de la vía dependiente de MyD88 en macrófagos infectados con

B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 y translocación nuclear del factor NF-B. Las proteínas

totales citoplásmicas o nucleares (60 g) se separaron electroforéticamente en SDS-PAGE y se

transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo

específico para las proteínas MyD88, pNIK, pIB y NF-B y el anticuerpo unido fue visualizado

por quimioluminiscencia. Los resultados muestran uno de tres experimentos, con resultados

similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.

B. abortus RB51 y 2308 inactivadas por calentamiento activan NF-B.

La estimulación con B. abortus RB51 inactivada por calentamiento activó al

NF-B así como la translocación de este factor hacia el núcleo (Fig. 2). El mismo

comportamiento se observó en células estimuladas con la cepa 2308 inactivada

por calentamiento. En ningún caso se detectó la proteína pNIK lo que indica que

tal vez esté involucrada otra vía en la activación del factor NF-B.

FIGURA 2. Señalización a través de la vía dependiente de MyD88 y translocación nuclear del

factor NF-B en macrófagos estimulados con B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 inactivadas

por calentamiento. Las proteínas totales citoplásmicas o nucleares (60 g) se separaron

electroforéticamente en SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las

membranas se incubaron con el anticuerpo específico para las proteínas MyD88, pNIK, pIB y

NF-B y el anticuerpo unido fue visualizado por quimioluminiscencia. Los resultados muestran uno

de tres experimentos, con resultados similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.

B. abortus RB51 y 2308 inducen la translocación nuclear de STAT1.

Para caracterizar el efecto de la infección con las dos cepas de B. abortus

sobre la señalización mediada por JAK-STAT, se examinó la fosforilación de

STAT1, y, debido a que STAT1 fosforilada debe dimerizarse y translocarse desde

el citoplasma hacia el núcleo para activar la transcripción, se investigó el efecto de

la infección con las cepas de B. abortus sobre la translocación hacia el núcleo de

STAT1. Como muestra la figura 3, B. abortus RB51 indujo la fosforilación intensa

de STAT1 desde los 5 min. p.i. en el extracto citoplásmico A partir de este tiempo

la activación de STAT1 fue disminuyendo hasta desaparecer a los 90 min. Una

segunda fase de respuesta se observó a las 2 h p.i. La translocación de pSTAT1

hacia el núcleo fue aparente a los 45 min p.i., con un máximo a las 2 h. En las

células infectadas con la cepa 2308 no se observó fosforilación de STAT1. A pesar

de ello se observó translocación de pSTAT1 hacia el núcleo en menor cantidad a

partir de los 105 min.

FIGURA 3. Fosforilación de STAT1 en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 o B.

abortus 2308. Las proteínas totales citoplásmicas y nucleares (60 g) se separaron

electroforéticamente por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las

membranas se incubaron con el anticuerpo específico para pSTAT1 y el anticuerpo unido fue

visualizado por quimioluminiscencia. Los resultados muestran uno de tres experimentos, con

resultados similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear

B. abortus RB51 inactivada por calentamiento induce la fosforilación de

STAT1 pero no su translocación hacia el núcleo.

La estimulación con la cepa B. abortus RB51 inactivada por calentamiento

indujo la fosforilación de STAT1 (Fig. 4). La proteína activada se observó en el

citoplasma a partir de los 30 min y hasta las 6 h p.i., pero no se observó

B. abortus 2308

0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24

min h

B. abortus RB51

pSTAT1 (EC)

pSTAT1 (EN)

0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24

min h Tiempo

translocación nuclear. En las células estimuladas con la cepa 2308 inactivada por

calentamiento no se observó fosforilación de STAT1 y por tanto no translocó hacia

el núcleo (Fig. 4). El hecho de haber observado que la estimulación con cualquiera

de las cepas de B. abortus inactivadas por calentamiento no conlleva a la

activación y translocación nuclear del STAT1, sugiere que la respuesta vía STAT1

de las células requiere de una participación activa de la bacteria.

FIGURA 4. Fosforilación de STAT1 en macrófagos J774A.1 estimulados con B. abortus RB51 ó

con B. abortus 2308, inactivadas por calentamiento. Las proteínas totales citoplásmicas y

nucleares (60g) se separaron electroforéticamente por SDS-PAGE y se transfirieron a

membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con el anticuerpo específico para

pSTAT1 y el anticuerpo unido fue visualizado por quimioluminiscencia. Los resultados muestran

uno de tres experimentos, con resultados similares. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear

B. abortus RB51 induce la translocación del NF-B hacia el núcleo y no

afecta su unión al DNA.

Debido a que el NF-B se activa y se transloca hacia el núcleo para activar

la transcripción, nosotros investigamos el efecto de la infección por las cepas

RB51 y 2308 de B. abortus sobre la translocación nuclear de NF-B. Como

muestra la figura 5, el NF-B libre está presente en el citoplasma y el núcleo de los

macrófagos infectados con B. abortus RB51, indicando que esta cepa induce la

activación y translocación del NF-B hacia el núcleo. Esos resultados demuestran

que la infección con B. abortus RB51 no afecta la habilidad de NF-B de

pStat1 (EC)

pStat1 (EN)

B. abortus RB51 B. abortus 2308

0 0.5 1.5 3 6 24

Tiempo (h)

0 0.5 1.5 3 6 24

translocarse al núcleo y unirse a las secuencias específicas de DNA. En el caso

de la cepa virulenta 2308 de B. abortus (Fig. 5) se observaron dos bandas en las

muestras de extracto citoplásmico, lo que indica que se presentan dos dímeros del

factor NF-B que por su peso molecular corresponderían a los dímeros p50-p50 y

p65-p50. Sin embargo en las muestras de extracto nuclear se observó solamente

una banda que corresponde al dímero p65-p50. La banda observada en las

muestras citoplásmicas y nucleares de los macrófagos infectados con la cepa

RB51 corresponde al peso molecular del heterodímero p65-p50.

FIGURA 5. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la liberación y

translocación nuclear del factor NF-B en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 ó

con B. abortus 2308. Después de cada tiempo de infección se extrajeron las proteínas

citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por EMSA

utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el

retardamiento. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.

Actividad de unión al DNA inducida en macrófagos estimulados con B.

abortus RB51 ó con B. abortus 2308 inactivadas por calentamiento.

La estimulación de los macrófagos con B. abortus RB51 inactivada por

calentamiento indujo un aumento en la formación de complejos de NF-B en los

extractos citoplásmicos y nucleares (Fig. 6). Estos resultados demuestran que la

estimulación con la cepa RB51 inactivada por calentamiento induce la activación,

translocación y la unión al DNA del NF-B. En las células estimuladas con la cepa

2308 inactivada por calentamiento el NF-B se translocó al núcleo, aunque no se

logró detectar en el citoplasma (Fig. 6).

FIGURA 6. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la liberación y

translocación nuclear del factor NF-B en macrófagos J774A.1 inoculados con B. abortus RB51 ó

con B. abortus 2308, inactivadas por calentamiento. Después de cada tiempo de infección se

extrajeron las proteínas citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se

analizaron por EMSA utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción

del gel con el retardamiento. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.

La actividad de unión al DNA de STAT1 se incrementa en los macrófagos

infectados con las cepas RB51 ó 2308 de B. abortus.

Debido a que la infección con las cepas RB51 ó 2308 de B. abortus no

inhibieron la fosforilación y la translocación de STAT1 hacia el núcleo, se examinó

el efecto de la infección por las dos cepas sobre la actividad de unión al DNA de

STAT1 mediante EMSA. El tratamiento de los macrófagos con ambas cepas

bacterianas indujo la formación de los complejos de STAT1 en el citoplasma, y por

tanto su translocación al núcleo (Fig. 7). La infección de los macrófagos con

cualquiera de las cepas de B. abortus resultó en un aumento en la formación del

complejo DNA-proteína, reflejando un incremento en la cantidad de STAT1

citoplásmica y nuclear. La cepa 2308 indujo una mayor translocación de STAT1

que la cepa RB51.

FIGURA 7. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y

translocación nuclear de pSTAT1 en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 ó con B.

abortus 2308. Después de cada tiempo de infección se extrajeron las proteínas citoplásmicas y las

nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por EMSA utilizando un

oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el retardamiento. EC:

extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.

Actividad de unión al DNA de pSTAT1 en macrófagos estimulados con B.

abortus RB51 ó 2308 inactivadas por calentamiento.

B. abortus RB51 y 2308 inactivadas por calentamiento incrementaron la

actividad de unión de STAT1 al DNA (Fig. 8). En el caso de las células

estimuladas con B. abortus RB51 muertas, el incremento se observó a partir de los

30 min post-infección, manteniendose así hasta las 3h, posteriormente disminuyó

a las 6h y después desapareció totalmente la unión al DNA. En los macrófagos

estimulados con B. abortus 2308 inactivada por calentamiento se observó la

translocación al núcleo así como la actividad de unión de STAT1 al DNA a partir

de las 3h aumentando con respecto al tiempo de estimulación (Fig. 8).

pSTAT1 (EC)

pSTAT1 (EN)

B. abortus RB51

0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24

min hTiempo

B. abortus 2308

0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24

min h

FIGURA 8. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y

translocación nuclear de pSTAT1 en macrófagos J774A.1 estimulados con B. abortus RB51 ó con

B. abortus 2308 inactivadas por calentamiento. Después de cada tiempo de infección se extrajeron

las proteínas citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por

EMSA utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el

retardamiento. EC: extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.

Las cepas RB51 y 2308 de B. abortus inducen la activación del factor AP1.

El factor AP1 es activado a través de la vía de las MAPK, que es una de las

vías que se activa a través de los TLR, además de que participa en la activación

del gen de IL-6 junto con el factor NF-B. En este estudio se demostró que la

infección con B. abortus RB51 ó con B. abortus 2308 indujo la activación del factor

AP1, y por consiguiente su unión a la secuencia de DNA específica. La cantidad

de AP1 activo en macrófagos infectados con B. abortus RB51 incrementó desde

los 5 minutos p.i., y alcanzó un máximo de respuesta a las 2 h. Si bien en los

macrófagos infectados con B. abortus 2308 se vio activación de AP1, la

concentración aparente no se modificó a lo largo del tiempo analizado (Fig. 9).

pSTAT1 (EC)

pSTAT1 (EN)

B. abortus RB51 B. abortus 2308

0 0.5 3 6 12 24

Tiempo (h)

0 0.5 3 6 12 24

Figura 9. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y

translocación nuclear de AP1 en macrófagos J774A.1 infectados con B. abortus RB51 ó con B.

abortus 2308. Después de cada tiempo de infección se extrajeron las proteínas citoplásmicas y las

nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por EMSA utilizando un

oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el retardamiento. EC:

extracto citoplásmico, EN: extracto nuclear.

Las cepas RB51 y 2308 de B. abortus inactivadas por calentamiento no

inducen la activación del factor AP1.

La estimulación de los macrófagos con ambas cepas de B. abortus

inactivadas por calentamiento no indujeron la activación del factor AP1 ya que no

se observó retardamiento del movimiento electroforético al unirse a su secuencia

específica de DNA (Fig. 10). Comparando estos resultados con los obtenidos con

las bacterias vivas es posible concluir que debe existir un elemento producido por

la bacteria viva durante la infección el cual induce la activación del factor AP1.

AP1 (EN)

B. abortus RB51

0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12 24

min. hTiempo

B. abortus 2308

0 5 15 30 45 60 75 90 105 2 3 6 12

min. h

Figura 10. Análisis por retardamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de la activación y

translocación nuclear de AP1 en macrófagos J774A.1 estimulados con B. abortus RB51 ó con B.

abortus 2308 inactivadas por calentamiento. Después de cada tiempo de infección se extrajeron

las proteínas citoplásmicas y las nucleares a partir de igual número de células y se analizaron por

EMSA utilizando un oligonucleótido marcado con [-32P] ATP. Se muestra la porción del gel con el

retardamiento. EN: extracto nuclear.

IMPACTO.

Por lo que podemos concluir que B. abortus RB51 indujo la formación de

heterodímeros p65-p50 del factor NF-B que se unió al DNA; en cambio, B.

abortus 2308 indujo preferentemente la formación del homodímero p50-p50 en

mayor proporción que el heterodímero p65-p50, por lo que compitió en la unión de

la secuencia del DNA. Ambas cepas de B. abortus indujeron la fosforilación de

STAT1 y su unión al DNA, pero la cepa 2308 ejerció un mecanismo regulador

sobre STAT1, ya que no indujo la expresión del gen de IFN-.

Por otro lado, B. abortus RB51 inactivada por calentamiento indujo la

expresión de TLR4, no así la cepa 2308, aunque ésta cepa (B. abortus 2308) viva

e inactivada por calentamiento no fue reconocida por TLR2 ni por TLR4, y por

tanto hay otro tipo de TLR involucrado en su reconocimiento por la célula huésped.

AP1 (EN)

B. abortus RB51 B. abortus 2308

0 0.5 3 6 12 24

Tiempo (h)

0 0.5 3 6 12 24