Influencia del pH y temperatura en la produccin de galacturonasas por Aspergillus fumigatus

ResumenLa produccin de poligalacturonasas (PG) por Aspergillus fumigatus LB-01-AP fue evaluada en procesos sumergidos a diferentes a diferentes concentraciones de pectina, glucosa y valores iniciales de pH del medio. Las mayores actividades de endo- y exo-poligalacturonasas fueron reportadas en medio sin glucosa y con 20 gL-1 de pectina ctrica, a un pH inicial de 4.0. En cuanto al efecto de la temperatura sobre la accin enzimtica, se encontr que el intervalo entre 40 y 60C es el ideal para la endo-PG, mientras que para la exo-PG la mayor actividad fue medida a 60C. Cuando las enzimas experimentales crudas fueron expuestas a distintas temperaturas por ms de 150 min, se observ que alrededor del 70% de la actividad de endo-PG a 50C se conserv. Ambas poligalacturonasas mostraron mayor termoestabilidad que la descrita usualmente en la literatura para enzimas producidas por otras especies del gnero Aspergillus.Adems, las preparaciones enzimticas obtenidas probaron ser libres de micotoxinas, evidenciando un uso potencial de estas enzimas en aplicaciones industriales.

1. IntroduccinLa importancia de enzimas microbianas en aplicaciones biotecnolgicas ha crecido significantemente en las ltimas dos dcadas. Enzimas de hongos pueden ser industrialmente producidas mediante cultivos sumergidos y en estado slido. A pesar de que ambos procesos han cobrado mritos, cerca del 90% de todas las enzimas industriales son producidas en medio lquido debido a varias ventajas durante el proceso, sobre el cultivo slido (Holker, Hofer y Lenz, 2004). Las mayores ventajas encontradas en cultivos sumergidos son las facilidades en aumentar proporcionalmente y controlar parmetros como pH, temperatura, transferencia de oxgeno y humedad (Couto y Sanroman, 2006).Poligalacturonasas fngicas (PG) son particularmente importantes para la industria alimentaria, principalmente en la clarificacin de jugos frutales (Sandri,Fontana, Barfknecht, y Silveira, 2011) y vinos (Mojsov, Ziberoski, Bozinovic, y Petreska, 2011).La produccin de galacturonasas es usualmente realizada por hongos pertenecientes al gnero Aspergillus. Los miembros de ste gnero presentan como caracterstica general alta actividad del complejo pectinoltico, con varias especies referenciadas como productores enzimticos: Aspergillus japonicus (Teixeira, Lima-Filho, y Durn, 2000), Aspergillus awamori (Blandino, Iqbalsyah, Pandiella, Cantero, y Webb, 2002), Aspergillus nidulans (Maccabbe, Orejas, Tamayo, Villanueva, y Ramn, 2002), Aspergillus oryzae (Fontana y Silveira, 2012), Aspergillus niger (Sandri, Lorenzoni, Fontana, y Silveira, 2013), Aspergillus sojae (Tari, Dogan, y Gogus, 2008), y Aspergillus fumigatus (Baffi, Romo-Snchez, beda-Iranz, y Briones-P+erez, 2012) han sido usados en la produccin de enzimas pectinolticas.En general, la produccin fermentativa de estas enzimas requiere especial atencin en la composicin del medio de cultivo, ya que puede contener compuestos involucrados en la induccin, represin o inhibicin de la formacin enzimtica y secresin de todas las cepas de inters (Tari et al., 2008).De acuerdo con Fontana y Silveira (2012b), la produccin de PG por A. oryzae es especialmente dependiente de la composicin del medio de cultivo (glucosa y pectina) y de la variacin de pH durante el proceso. Solis-Pereyra, Favela-Torres, Vienegra-Gonzlez, y Gutirrez-Rojas (1993) y Acua-Arguelles, Gutirrez-Rojas, Vienegra-Gonzlez, y Favela-Torres (1995) tambin reportaron que un exceso de glucosa en medio de cultivo slido redujo la formacin de pectinasas por A. niger. Estos autores sostuvieron que ste resultado fue debido a una fuerte baja en el pH del medio en lugar de una represin catablica o inhibicin del crecimiento. Texeira et al. (2000) describieron el efecto represivo de altas concentraciones de glucosa, pectina y sacarosa en todas las enzimas evaluadas en cultivo de A. japonicus. Las condiciones del cultivo tales como fuente de carbono y pH estn relacionadas con la expresin de genes codificantes de enzimas pectinolticas (Bazolli, Ribon, Queiroz, y Arajo, 2006; Trigu-Lahiani y Gargouri, 2007). Considerando las oportunidades prometedoras que las especies de Aspergillus pueden ofrecer a la industria alimentaria, el presente estudio se llev a cabo para evaluar la produccin de endo- y exo-PG, dos enzimas del grupo poligalacturonasa, mediante una cepa de A. fumigatus en experimentos realizados a diferentes concentraciones de pectina y glucosa y valores de pH. En la interpretacin de los resultados, la sntesis de PG, consumo de carbohidratos, crecimiento de la biomasa, y la presencia de micotoxinas fueron considerados. Adems, el pH ideal, temperatura y termoestabilidad para la endo- y exo-PG producidas fueron evaluados.

2. Materiales y mtodos2.1. MicroorganismosA. fumigatus LB-01-AP de la coleccin de cultivos del Instituto de Tecnologa de la Universidad de Caxias du Sul (Brasil) fue empleado en los experimentos. La cepa fue propagada en medio agar glicerina, incubada a 30C por cinco das. Luego de este perodo, los cultivos esporulados fueron almacenados a 4C o usados para la inoculacin de los medios de cultivo.2.2. Medios de cultivoEl medio de produccin bsico (WBE) para la endo- y exo-poligalacturonasa (PG) fue el descrito por Fontana, Polidoro, y Silveira (2009). El medio fue preparado de la siguiente manera: 500 mL de extracto acuoso de 80 g de salvado de trigo, 20 g de pectina ctrica (Eskisa S.A., Brasil), 22 g de glucosa, 0,05 g de extracto de levadura, 5,0 g de (NH4)2SO4, 0,5 g de MgSO4, 2,5 g de KH2PO4, 6,3x10-4 g de FeSO4 7H2O, 6,2x10-4 g de ZnSO4, 1x10-5 g de MnSO4, y agua destilada QS 1 L [18]. El extracto de salvado de trigo fue preparado moliendo finamente (malla 80) 80 g de salvado de trigo (Moinho Nordeste, Antonio Prado, Brasil) y mezclando el polvo obtenido en 500 mL de agua destilada. La mezcla fue autoclavada a 1 atm por 1 min. Luego de enfriar, la mezcla se filtr y el extracto fue usado para preparar el medio WBE. Este medio y sus variaciones fueron autoclavadas a 1 atm por 20 min antes de la inoculacin.Los efectos de las variaciones en la composicin del medio de cultivo en la produccin de galacturonasas fueron evaluados en pruebas con matraz de agitacin. La evaluacin de las distintas concentraciones de glucosa (0,5, 10, 15, 20, 25 y 30 g L-1) as como la fuente de carbono fue realizada con una concentracin de pectina inicial de 20 g L-1, mientras que las pruebas sobre la influencia de la concentracin de pectina (0, 5, 10, 15, y 20 g L-1) en el proceso fueron llevadas a cabo en medio sin glucosa. En estas pruebas, el pH inicial del medio fue ajustado a 4,0 con la adicin de HCl 2N o NaOH 3M.2.3. Condiciones de cultivoLas pruebas con matraz de agitacin para evaluar la composicin del medio y pH fueron llevadas a cabo en matraces Erlenmeyer de 500 mL que contenan 100 mL de medio y cubiertos con una fina capa de algodn y gasa. Los medios fueron inoculados con una suspensin de esporas de A. fumigatus LB-01-AP, para obtener una concentracin inicial de 106 esporas L-1, y los matraces fueron incubados a 28C y a 200 rpm en un agitador recproco (B. BRAUN BIOTECH modelo CERTOMAT, Alemania). A partir de la definicin de la composicin del medio de cultivo, diferentes valores de pH (3,0; 4,0; 5,0; 6,0; y 7,0) fueron examinados. Los resultados fueron comparados en trminos de actividad enzimtica promedio obtenidos en cuatro pruebas.En experimentos con bioreactor, un equipo B. BRAUN BIOTECH, modelo BIOSTAT B (Alemania), con un volumen total de 5 L y un volumen de trabajo de 3,2 L, fue utilizado. El sistema est equipado con tres turbinas con seis cuchillas planas de 6 cm de dimetro. Durante los cultivos, la velocidad de agitacin vari de 200 a 700 rpm y el flujo de aire especfico vari entre 0,2 y 2,5 volumen de aire por volumen de medio por minuto (vvm) a fin de mantener disuelta la concentracin de oxgeno sobre el mnimo de 30% de saturacin en los medios. Los medios para el cultivo en bioreactor fueron inoculados segn lo descrito para pruebas de matraz de agitacin. La temperatura se mantuvo a 28C durante los cultivos. En el bioreactor fueron evaluadas tres condiciones de pH en los medios de cultivo; C1, pH inicial de 3,0 y sin control durante el proceso; C2, pH incial de 4,0 y sin control durante el proceso; C3, pH inicial de 4,0, sin controlarlo hasta que alcance el valor mnimo y despus el pH fue controlado hasta un mximo de 3,5. Alcuotas fueron colectadas perodicamente, centrifugadas por 10 min a 10000 rpm. El pellet fue usado para determinar la biomasa y el supernadante fue almacenado a 4C para anlisis subsecuentes de la actividad de endo- y exo- PG.

2.4. Pruebas enzimticasEl pH y temperatura ideal para PG fueron determinados en las enzimas experimentales. El pH de reaccin fue ensayado usando distintas soluciones buffer: biftalato de potasio (pH 2,5; 3,0; 4,0 y 5,0) y fosfato de potasio (pH 6,0 y 7,0), especificando otras condiciones estndar. La temperatura de reaccin fue ensayada usando diferentes temperaturas (20-80C), especificando otras condiciones estndar.La termoestabilidad de ambas enzimas fue evaluada variando la temperatura de 20 a 70C. En las pruebas de termoestabilidad, el tiempo mximo de exposicin enzimtica para cada temperatura evaluada fue de 150 min, siendo sacadas cada 15 minutos las muestras durante la primera hora de prueba y luego cada 30 min. La actividad residual de la endo y exo-PG es expresada en porcentaje.2.5. Mtodos analticosLa concentracin de azcares reductoras en los medios de cultivo fue determinada por el mtodo DNS (cido 3,5 di-nitro-saliclico) (Miller, 1959).La actividad de endo-PG fue determinada midiendo el decrecimiento de la viscosidad de una solucin estndar de pectina ctrica (ESKISA S.A.) al 0,63% (p/v), en 0,05 M de buffer acetato pH 4,0. El anlisis fue llevado a cabo usando 3,2 mL de muestra diluda en 14,8 mL de solucin de pectina ctrica, y la reaccin se realiz a 30C por 30 min. Luego del tiempo de reaccin, la viscosidad de la mezcla de reaccin fue medida usando un viscosmetro (BROOKFIELD ENGINEERING, USA) modelo DV-II+. Una unidad endo-PG fue definida como la cantidad de enzima que causa una disminucin del 50% de la viscosidad de la solucin, bajo las condiciones de la reaccin (Gainvors et al., 2000). La actividad endo-PG es expresada en unidades por mL de medio (U mL-1).La actividad exo-PG fue medida en una mezcla de reaccin que contena 50 L de muestra apropiadamente diluda y 2 mL de cido poligalacturnico (SIGMA, USA) en 0,1 M de buffer acetato (pH 4), siendo llevada a cabo la reaccin a 35C por 30 min. El cido galacturnico liberado en la reaccin fue cuantificado por el mtodo Somogyi (1952). Una unidad de exo-PG fue definida como la cantidad de enzima que lleva a la liberacin de 1 mol de cido galacturnico por minuto por mL de enzima experimental, bajo las condiciones de reaccin (Couri y Farias, 1995). La acividad exo-PG es expresada en unidades por mL (U mL-1).Las esporas a ser usadas para la inoculacin de los medios de cultivo fueron enumeradas por conteo directo utilizando una cmara de Neubauer, como lo previamente descrito po Solis-Pereyra et al. (1993). La biomasa fue determinada gravimtricamente filtrando un volumen conocido de medio de cultivo a travs de una membrana de celulosa con tamao de poro de 0,45-m (MILLIPORE, USA) y secada a 90C por 24 h. La biomasa es expresada en gramos de masa seca por litro (g L-1).La presencia potencial de aflatoxinas totales (B1, B2, G1, G2) en la enzima experimental (EE) fue evaluada mediante inmunoensayo enzimtico utilizando anticuerpos monoclonales- ELISA (NEOGEN) (Newsome, 1996).

2.6. Anlisis estadsticosTodas las pruebas estadsticas fueron realizadas mediante anlisis de la varianza (ANOVA unidireccional) y prueba post-hoc de Turqua, usando un nivel de probabilidad bajo 5% (p< 0,05).

3. Resultados y discusin3.1. Efecto de la glucosa y pectina, y pH inicial en el cultivo de A. fumigatus LB-01-APInicialmente, los efectos de aadir distintas cantidad de glucosa al medio WBE fueron evaluados en experimentos con matraz de agitacin, cuyos resultados son mostrados en la Tabla 1. Como lo sealado en la Tabla 1, la adicin de ms de 15 g L-1 de glucosa al medio favoreci el crecimiento de A. fumigatus LB-01-AP, el cual alcanz 13,3 g L-1. Por otra parte, bajo la presencia de glucosa, la sntesis de la enzima disminuy y mostr actividades cada vez ms pequeas de endo- y exo-PG a medida que la concentracin de glucosa aadida al medio aumentaba, y mayores actividades enzimticas (40 y 32 U mL-1) fueron obtenidas en ausencia de este carbohidrato. Resultados similares fueron observados por Fawole y Odunfa (2003) quienes concluyeron que un incremento en la concentracin de azcar del medio de cultivo promueve el crecimiento celulares pero inhibive la produccin de PG. Por otra parte, Fontana y Silveira (2012b), mientras evaluaban la produccin de endo- y exo-PG por A. oryzae IPT 301 a diferentes concentraciones de glucosa (0-30 g L-1), encontraron que concentraciones por sobre los 10 g L-1 de este carbohidrato resultaron en un incremento substancial en la actividad enzimtica comparada con el control (sin glucosa). En la Tabla 1, se puede observar que en la condicin G0 se determin una concentracin de 3,7 g L-1 de azcares reductoras las cuales son derivadas a partir de la degradacin de almidn presente en el salvado de trigo.El proceso fue luego evaluado en matraces de agitacin en medio WBE que contenan diferentes concentraciones de pectina sin adicin de glucosa (Tabla 2). En el medio sin pectina, la produccin de las PGs estudiadas fue menor (endo-PG 0,7 U mL-1, exo-PG 6,0 U mL-1). Al usar 20 g L-1 de pectina, se obtuvieron mayores actividades de endo- (42 U mL-1) y exo-PG (36 U mL-1), indicando que la produccin enzimtica por este microorganismo es fuertemente afectada por la presencia de este inductor. Fontana y Silveira (2012b) ya haban reportado que un incremento de la pectina en el medio de cultivo para producir endo- y exo-PGs de A. oryzae IPT 301 result en un aumento de la actividad enzimtica.Los datos tambin indicaban que la pectina no solo induce la produccin enzimtica, sino que tambin estimulaba la produccin enzimtica, ya que a mayor concentracin de pectina en el medio, mayor la biomasa. Fontana, Salvador, y Silveira (2005) observaron en cultivos slidos de A. niger que un incremento de hasta 16% de pectina en el medio de cultivo resultaba en un aumento de biomasa cuando era comparada con el medio sin el inductor y en medio con altas concentraciones como en este estudio. Quizs un incremento pequeo en la concentracin de pectina podra resultar en mayores actividades enzimticas. Sin embargo, a mayor concentracin del inductor en el medio de cultivo, menor la transferencia de oxgeno de la fase gaseosa a la fase lquida debido al significante incremento en la viscosidad, la cual hace ms difcil controlar el proceso de fermentacin.Menores actividades enzimticas en presencia de glucosa y el efecto positivo de la presencia de pectina pueden ser asociados con la expresin de genes codificantes de enzimas pectinolticas. Whitehead, Shieh, Cleveland, Cary, y Dean (1995) ya han mostrado la regulacin de dos genes codificantes de endopoligalacturonasas, pecA y pecB, de Apergillus flavus.Los autores observaron que la expresin era mayor cuando el micelio creca en pectina comparado con la expresin en glucosa y concluyeron que los genes pecA y pecB son controlados por el mecanismo inductivo de la pectina.Es posible que los resultados discutidos hasta el momento, especialmente aquellos mostrados en la Tabla 1, han sido tambin muy afectados por los perfiles de variacin de pH de cada prueba. Por otra parte, una disminucin demasiado grande en el pH puede producir un ambiente inadecuado para la produccin enzimtica por el microorganismo- como pudo haber sido el caso en el presente estudio- en el medio de cultivo con glucosa (Tabla 1). Por lo tanto, pruebas adicionales fueron llevadas a cabo en matraces con agitacin sin adicin de glucosa en los medios y con 20 g L-1 de pectina, donde pH inciales entre 3,0 y 7,0 fueron evaluados. Como lo sealado en la Tabla 3, valores de pH ms altos incrementaron moderadamente la biomasa de A. fumigatus, pero no promovieron la produccin enzimtica. Con un pH inicial en el rango 5,0-7,0, hubo un efecto claramente negativo en la sntesis de PG, especialmente en la formacin de endo-PG. Por otra parte, valores iniciales bajos de pH (3,0 y 4,0) resultaron en actividades mayores de endo y exo-PG, mostrando que para A. fumigatus LB39 la produccin de biomasa y de enzimas ocurren a distintos valores de pH. Los datos en este estudio corroboran aquellos reportados por Malvessi y Silveira (2004) y Fontana y Silveira (2012) en estudios con A. oryzae , donde encontraron que la sntesis de estas enzimas es mayor a pH cercano a 3,0, mientras que el crecimiento ocurra preferentemente a un pH sobre 4,0.Las pruebas subsecuentes fueron realizadas en un bioreactor de mezcla completa, y en un medio con 20 g L-1 de pectina, bajo distintas condiciones de pH (pruebas C1, C2, y C3 detallas en la seccin materiales y mtodos). Fig. 1 muestra las variaciones en la biomasa durante estos cultivos.Como lo observado en la Fig. 1, durante las primeras 24 h de cultivo, los perfiles de biomasa en relacin al tiempo oscil de lineal a exponencial, seguido por un perodo de disminucin de la velocidad de crecimiento, coincidiendo con una disminucin en el pH, y cerca de las 44-48 h, comenz la fase estacionaria de los cultivos. Durante las horas finales del proceso (ms de 60 h de cultivo), la biomasa disminuy con el tiempo, probablemente debido a la lisis celular producida por la falta de algunos nutrientes. La mxima biomasa registrada bajo las condiciones C1, C2, y C3 fueron 12,8; 13,5; y 13,5 g L-1, respectivamente, las cuales son consistentes con los valores encontrados en los ensayos con matraces.Fig. 2 muestras las actividades de endo y exo-PG y la variacin de pH durante el cultivo a distintos pHs. Se puede observar que las mayores actividades de endo-PG (81 U mL-1) se obtuvo en la condicin C3, seguida por las condiciones C1 (74 U mL-1) y C2 (58 U mL-1).En cuanto a exo-PG, la mejor condicin de crecimiento fue tambin C3 (49 U mL-1), con menores valores en las condiciones restantes (Fig. 2A y B).Los valores de pH disminuyeron significantemente luego de 24 h del proceso, seguido por un intenso crecimiento celular, y mayores valores a partir de aproximadamente 60 h de proceso. En la condicin C1, la tendencia del aumento de pH durante las horas finales de cultivo fue mucho menos intensa, alcanzando 2,5, mientras que en las pruebas con pH inicial 4,0 (C2 y C3) se observ lo opuesto, con un pH mximo de 4,9 en C2, y pH 3,5 (automticamente controlado) en C3 (Fig. 2C). De acuerdo con Bailey y Tahtiharju (2003), durante el crecimiento de hongos filamentosos ocurre un decrecimiento de pH y consumo de carbohidratos, y luego de finalizar la fuente de carbono se observa un incremento en el pH.Los resultados del cultivo en bioreactor confirmaron aquello, de manera similar a otras especies del gnero Aspergillus, la produccin de PG por A. fumigatus LB-01-AP depende del perfil de variacin de pH durante el cultivo. En las tres condiciones probadas, valores de pH suficientemente bajos (menores que 3,0) fueron determinados para que exista una formacin significantes de poligalacturonasas y, por ende, actividades similares de endo- y exo-PGs fueron determinadas entre 48 y 60h, durante las cuales ocurrieron los menores valores de pH y las fases estacionarias de crecimiento.Las diferencias ms significantes en la actividad enzimtica ocurrieron a partir de las 60 h, cuando la ya mencionada tendencia de aumentar el pH tambin tom lugar. De acuerdo con Chung, Lee, y Li (1992), los cambios de pH en los medios de cultivo son resultado del consumo de sustrato. Cuando los iones amonio son usados por los microorganismos, los medios son acidificados y cuando el nitrgeno orgnico (aminocidos y pptidos) es asimilado, los medios son alcalinizados. Al comparar las tres condiciones testeadas, observamos que para la endo-PG los mayores valores se obtuvieron en los experimentos C1 y C3, a menores valores de pH como en la condicin C2, mientras que para la exo-PG la condicin C3 condujo a la mayor actividad. Estudios previos nos permiti proponer hiptesis para explicar la relacin entre la actividad de poligalacturonasas, especialmente endo-PG, y el pH en las etapas finales del proceso. En cultivos de A. oryzae con y sin control de pH durante la etapa final del proceso, Malvessi y Silveira (2004) encontraron que las actividades de las poligalacturonasas fueron preservadas cuando el incremento de pH estaba limitado a valores cercanos a 3,0, mientras que en el proceso sin control de pH los valores enzimticos disminuyeron significantemente. Los autores sugirieron que esta disminucin de las actividades estaba relacionada con el incremento de los valores de pH, lo cual pudo haber favorecido la actividad de proteasas, las cuales podran haber sido liberadas al medio, con la capacidad de degradar pectinasas presentes en los cultivos. Otra posibilidad sera el decrecimiento en la estabilidad de estas enzimas al incrementar los valores de pH. En cuanto a esto ltimo, Mohsen, Bazaraa, y Doukani (2009) determinaron actividades significativamente disminuidas para pectinasas purificadas de A. niger en pruebas en las cuales las enzimas han sido previamente expuestas a valores de pH entre 3,0 y 8,0 hasta un mximo de 3,5 h. Martnez-vila, Wicke, Aguilar, Rodrguez-Herrera, y Contreras-Esquivel (2009) evaluaron la produccin de poligalacturonasas por Aspergillus kawachii en cultivos en estado slido y obtuvieron alta produccin de PG cidas en pH 4,3.3.2. Influencia del pH y temperatura en las actividades de poligalacturonasas producidas por A. fumigatus LB-01-APFig. 3 muestra las variaciones de endo y exo-PG de acuerdo al pH del medio de reaccin. No se puede observar diferencia significante en la actividad de endo-PG cuando la reaccin es llevada a cabo a pH 4,0 o 5,0, siendo estos los mejores valores para la actividad de endo-PG producida por A. fumigatus LB-01-AP. Comparado con lo observado para endo-PG, la respuesta de la actividad enzimtica de exo-PG ante la variacin de pH mostr un rango relativamente amplio, entre 4,0 y 6,0, con un pick de actividad a 5,0. Este resultado es similar al descrito por Sandri et al. (2013) quien observ que el pH ptimo para la actividad de pectinasas de A. niger LB23 fue 4,0.El efecto de la temperatura (20-80C) sobre las poligalacturonasas se muestra en la Fig. 4. Para la endo-PG, las mayores actividades fueron determinadas entre 40 y 60C, con valores cerca de un 40% mayor que aquellos observados a 30C, una temperatura normalmente utilizada para evaluar la actividad de esta enzima. Con respecto a exo-PG, la actividad enzimtica mejor a una temperatura de 60C. Sandri et al. (2013) concluyeron que temperaturas cercanas a 50C fueron las mejores para la actividad de enzimas pectinolticas presentes en la enzima experimental de A. niger LB23.Las pruebas indican que temperaturas de 50C resultaron en altas actividades de poligalacturonasas especialmente endo-PG, una enzima que tiene un rol ms importante que la exo-PG en reducir la viscosidad de los jugos de fruta-, lo cual es interesante desde el punto de vista industrial. Sin embargo, cuando se evala la temperatura ptima para la aplicacin de estas enzimas en procesos de la industria alimentaria, uno debe tomas en cuenta adems la duracin del tratamiento enzimtico del producto y la estabilidad de la preparacin, considerando el efecto combinado de la temperatura y el tiempo. Al analizar los perfiles de actividad de poligalacturonasas de A. fumigatus LB-01-AP incubadas entre 20C y 70C por hasta 150 min (Fig. 5), vemos una significante disminucin en los valores enzimticos a mayores temperaturas (60 y 70C). Sin embargo, las PGs presentes en la enzima experimental mostraron una estabilidad relativamente alta a 50C, con la endo-PG manteniendo aproximadamente el 70% de su actividad luego de 120 min a esta temperatura. Hendges, Montanari, Malvessi, y Silveira (2011) evaluaron la termoestabilidad de endo-PG producida por A.niger T0005/007-2, y encontraron que cuando se utilizada la temperatura de 50C, una disminucin de cerca del 50% de la actividad enzimtica fue observada luego de 120 min de tratamiento.Otro factor importante para el uso de pectinasas en la industria alimenticia es la ausencia de aflatoxinas. En consecuencia, la enzima experimental producida por A. fumigatus LB-01-AP no mostr aflatoxinas totales bajo las condiciones estudiadas (B1, B2, G1, G2) a un lmite de deteccin de 2 g/kg. En resumen, los resultados del efecto de temperatura y tiempo de pre incubacin sobre las poligalacturonasas producidas por A. fumigatus LB-01-AP confirma un gran potencial para la aplicacin industrial de estas preparaciones bajo temperaturas relativamente altas, como ocurre a menudo en la industria de jugos y bebidas.

AgradecimientosLos autores estn agradecidos con el Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), la Coordenaao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES), la Fundacao de Amparo Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) (Grant no. 1/1134-1) y la Universidade de Caxias do Sul (UCS) para el apoyo financiero de este trabajo.

Tabla 1.Resultados obtenidos en cultivos sumeridos de Aspergillus fumigatus LB-01-AP en medios con diferentes concentraciones de glucosa y 20 g L-1 de pectina, pH inicial 4,0, luego de 96 h de cultivo.S0, concentracin inicial de azcares reductoras; Scons., concentracin consumida de azcares reductoras; Xmax, mxima concentracin celular; txmax, tiempo para alcanzar la Xmax; pHmin, mnimo valor de pH; pHfinal, valor de pH luego de 96 h de cultivo; Endo-PGmax, mxima actividad de endo-PG; Exo-PGmax, mxima actividad de exo-PG; tPGmax, tiempo para alcanzar endo-PGmax y exo-PGmax.G0.G5.G10.G15.G20.G25.G30-glucosa: 0. 5. 10. 15. 20. 25 y 30 g L-1.Tabla 2.Resultados obtenidos en cultivos sumergidos de Aspergillus fumigatus LB-01-AP en medios con diferentes concentraciones de pectina en medios libres de glucosa, pH inicial 4,0, luego de 96 h de cultivo.S0, concentracin inicial de azcares reductoras; Scons., concentracin consumida de azcares reductoras; Xmax, mxima concentracin celular; txmax, tiempo para alcanzar la Xmax; pHmin, mnimo valor de pH; pHfinal, valor de pH luego de 96 h de cultivo; Endo-PGmax, mxima actividad de endo-PG; Exo-PGmax, mxima actividad de exo-PG; tPGmax, tiempo para alcanzar endo-PGmax y exo-PGmax.P0.P5.P10.P15.P20- pectina: 0. 5. 10. 15 y 20 g L-1.Tabla 3.Resultados obtenidos en cultivos sumergidos de Aspergillus fumigatus LB-01-AP a diferentes pH iniciales, en medio con 20 g L-1 de pectina, luego de 96 h de cultivo.S0, concentracin inicial de azcares reductoras; Scons., concentracin consumida de azcares reductoras; Xmax, mxima concentracin celular; txmax, tiempo para alcanzar la Xmax; pHmin, mnimo valor de pH; pHfinal, valor de pH luego de 96 h de cultivo; Endo-PGmax, mxima actividad de endo-PG; Exo-PGmax, mxima actividad de exo-PG; tPGmax, tiempo para alcanzar endo-PGmax y exo-PGmax.pH 3. pH 4. pH5. pH 6 y pH 7- valores de pH incial del medio.Fig. 1. Variacin de la concentracin de biomasa durante el cultivo de Aspergillus fumigatus LB-01-AP en medio WBE sin adicin de glucosa. Los valores corresponden al promedio de tres pruebas. C1- medio con pH inicial 3,0 y sin control durante el proceso. C2- medio con pH inicial 4,0 y sin control durante el proceso. C3- medio con pH inicial 4,0, con un valor mnimo sin control, y luego con p mximo controlado a 3,5.Fig. 2. Variacin de la actividad de endo-PG (A) y exo-PG (B), y del pH (C) durante el cultivo de Aspergillus fumigatus LB-01-AP en medio WBE sin adicin de glucosa. Los valores corresponden al promedio de tres pruebas. C1- medio con pH inicial 3,0 y sin control durante el proceso. C2- medio con pH inicial 4,0 y sin control durante el proceso. C3- medio con pH inicial 4,0, con un valor mnimo sin control, y luego con p mximo controlado a 3,5.Fig. 3. Efecto del pH sobre las actividades de endo-PG (A) y exo-PG (B) producidas por Aspergillus fumigatus LB-01-AP, manteniendo las condiciones estndar restantes de cada anlisis. Los valores corresponden al promedio de tres pruebas. Los tratamientos con la misma letra no difieren estadsticamente en un 5% (p