inducir cancer cn47-057

Inducción de cáncer en rata

wistar (Rattus norvegicus)

mediante el uso de dimetil

benzo(a)antraceno

(DMBA)

Juan Carlos Cortés-García, Asdrúbal Aguilera-Méndez, Ana Edith Higareda-Mendoza, Elda

Beltrán-Peña y Marco Aurelio Pardo-Galván

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas

Resumen

El cáncer está considerado dentro de las cinco primeras causas de muerte en el hu-mano; su tratamiento incluye acciones individuales o combinadas de quimioterapia,radioterapia, inmunoterapia, cirugía y recientemente terapia génica. A nivel experi-mental el manejo terapéutico debe probarse en modelos animales de cáncer. En elpresente trabajo se implementó un modelo de cáncer en ratas Wistar expuestas a di-metilbenzo(a)antraceno (DMBA) por vía subcutánea. Nueve semanas posteriores ala exposición a 20 mg DMBA se obtuvo en las ratas un volumen tumoral de siete cm

3,

en tanto que la concentración de 10 mg de DMBA indujo un tumor de 4.3 cm3. En las

ratas expuestas a las dos dosis de DMBA los tumores se localizaron a nivel subcutá-neo en forma de nódulos. El tejido tumoral presentó células con núcleos hipercromáti-cos y pleomorfismo característicos de celulas cancerosas.

Palabras clave: Cáncer, dimetilbenzo(a)antraceno, rata.

Ciencia Nicolaita No. 47 57 Agosto de 2007

Abstract

Cancer induction in Wistar rats (Rattus norvegicus) through the use of di-methylbenzo (a) anthracene (DMBA).

Cancer is considered among the five main causes of death in humans; its treatment in-cludes individual or combined actions of chemotherapy, radiotherapy, immunothe-rapy, surgery and most recently, genetic therapy. At experimental level, thetherapeutic treatment must be tested in animal models of cancer. In the present studywe obtained a model of cancer in Wistar rats by the subcutaneous exposure to di-methylbenzo(a)anthracene (DMBA). Nine weeks after exposed to 20 mg of DMBA atumoral volume of 7 cm

3was obtained, whereas the administration of 10 mg of DMBA

induced a 4.3 cm3

tumor. The nodular appearance was recognized in subcutaneoustumors of rats exposed to either DMBA doses. The tumoral tissue presented cells withhyperchromatic and pleomorphic nuclei, typical of carcinogenic cells.

Keywords: Cancer, dimethylbenzo (a) anthracene, rat

Introducción

El cáncer es una enfermedad caracterizada por el desarrollo de una masa anormal detejido nuevo (neoplasia) producida por una multiplicación celular descontrolada. Este pade-cimiento ha sido estudiado mediante diversas estrategias metodológicas que incluyen: mo-delos animales (Hanausek et al., 2001), células en cultivo (Minaguchi et al., 1999), tejidosanimales y/o humanos, técnicas de biología molecular y el monitoreo de la frecuencia decáncer en la población humana (Harris 1991).

En México los tumores cancerosos están considerados dentro de las cinco primerascausas de mortalidad a partir de los 15 años de edad (I.N.E.G.I. 2005), y en el mundo repre-sentan el 13% del total de muertes (O.M.S. 2006). En algunos tipos de cánceres se han iden-tificado alteraciones genéticas; por ejemplo la familia de oncogenes H-ras, K-ras y N-ras, enlos adenomas (tumores benignos de origen epitelial de estructura parecida a la de una glán-dula) presentan alteraciones en el gen K-ras (Collado et al., 2005), y en los carcinomas decélulas epiteliales se encuentra alterado el gen H-ras (Parada et al., 1982), este último codi-fica la proteína p21, la cual es activada mediante el intercambio de GDP por GTP, favore-ciendo así la proliferación y diferenciación celulares. La forma mutada de p21 permaneceactiva de manera permanente debido a la pérdida de regulación por GTP (Kammouni et al.,2002).

Actualmente el tratamiento de los tumores es eficaz en etapas tempranas del desa-rrollo de la enfermedad, y en casos avanzados solo se inhibe su progreso. Además de lasestrategias generales de curación (cirugía, quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia), eltratamiento del cáncer se particulariza dependiendo del tipo de tumor. En el cáncer gástricose recomienda evitar los factores de riesgo como: una dieta deficiente en fibra y vitaminas y

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la infección por Helicobacter pylori (Muñoz y Franceschi, 1997) donde se ha reportado elgene cagA como el principal factor de virulencia (Akhter et al., 2007). En cáncer de mama serequiere cirugía, quimioterapia y prescripción de tamoxifeno, compuesto antiestrogénicoque evita la proliferación en tumores positivos para receptores estrogénicos (Hankinson yStampfer, 1997; Wang et al., 2006). La vacuna contra el virus del papiloma humano (VPH)previenen la formación de lesiones preneoplásicas, este agente biológico está presente enel 70 % de casos de cáncer cérvico uterino (Wheeler, 1997; Barclay y Vega, 2007). La vitami-na C, los carotenos, el zinc y la fibra de los cereales son posibles agentes profilácticos parael tratamiento de cáncer de esófago, en tanto que la vitamina E, con propiedades antioxidan-tes, ayuda a la prevención del cáncer de pulmón (Buiatti 1997).

Debido al grave problema de salud que genera el cáncer, continuamente se evalúannuevos tratamientos, siendo uno de las más recientes la terapia génica, que consiste enusar fragmentos de DNA que al ser liberados intracelularmente actúan adicionando o elimi-nando una función de la célula (Cheney et al 1998). Por ejemplo, el gen mda–7 que codificapara la proteína cinasa dependiente de RNA de doble cadena (PKR) se incorporó en el ge-noma del adenovirus y se administró conjuntamente con geldanamicina, aumentando lamortalidad de las células tumorales a través de un efecto antiangiogénico (Patear et al.,2007).

Independientemente del sistema que se use para la introducción del material genéti-co (electroporación, pistola génica, liposomas o virus) se requiere demostrar la eficacia de laterapia empleada antes de usarla en el humano, con esta finalidad se emplea como modelode estudio roedores que presenten cáncer. Estos modelos animales son necesarios paradeterminar los efectos de fármacos y agentes tóxicos, así como los mecanismos de daño yde curación. La ventaja de su uso es el costo moderado para exponer un número grande deindividuos en condiciones controladas. La rata Wistar se ha utilizado como modelo de estu-dio y se ha secuenciado su genoma lo que facilita determinar blancos génicos y proteicos delas sustancias en investigación (Gibbs 2004).

Desde la década de los cincuenta el uso del DMBA para generar tumores (Steiner yEdgecomb, 1952) se ha mantenido, en 1997 Irwin produjo tumores de mama en rata (Irwin1997) y en este sistema se han hecho estudios de factores angiogénicos que participan en eldesarrollo de dichos tumores (Yan et al 2004). El DMBA también induce efectos mutagéni-cos en bacterias y en células de mamíferos y produce tumores en ratones expuestos aDMBA por diferentes vías: oral, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular y en aplicacióntópica (Irwin 1997). El mecanismo de acción de DMBA en la rata y ratón, se basa en la inte-racción directa de epóxidos derivados del DMBAcon el DNA(de Boer y Glickman, 1998), ge-nerando transversiones A:T por T:A y G:C por T:A a través de dos mecanismos probables: laformación de aductos de DMBA – adenina y DMBA – guanina (de Boer y Glickman, 1998), yla pérdida de purinas producida por lisis espontánea del complejo formado entre epóxido deDMBA y purinas del DNA blanco (Melendez et al., 1999). Es interesante notar que los meta-bolitos del DMBA necesarios para el efecto cancerígeno son similares entre el humano y la



rata (Vater et al., 1991) en tanto que en ratón dichos metabolitos son diferentes a los que in-ducen tumores en humanos (Digiovanni et al., 1980).

El estudio del desarrollo tumoral por DMBA ha sido llevado a cabo en ratones, mien-tras que las ratas han sido usadas para producir cáncer de mama (Kimura et al., 2007, Nat-sume et al., 2007). El objetivo del presente trabajo fue inducir cáncer en ratas Wistarexpuestas a DMBA por vía subcutánea, para lo cual se evaluó el volumen del tumor y se re-gistraron las observaciones morfológicas para valorar y clasificar las neoplasias.

Materiales y Métodos

Se usaron ratas Wistar (Rattus norvegicus) macho de aproximadamente 300 g depeso, a las cuáles se permitió libre acceso al alimento y al agua (Shimizu et al., 2000). Se in-yectaron por vía subcutánea 2, 10 y 20 mg de DMBA disuelto en aceite de oliva estéril, en lazona media del dorso de los animales, previamente rasurada. Dicho procedimiento se reali-zó en dos sesiones los días cero y siete, se evaluaron los animales durante 20 semanas (Ro-dríguez et al., 1997; Henserson et al., 1998).

Evaluación del desarrollo tumoral

Durante el periodo de observación se determinó el volumen del tumor, área bajo lacurva del volumen (AUC) y el crecimiento tumoral promedio (PC), de acuerdo con las si-guientes fórmulas (Barrington et al., 1998). El volumen tumoral se evaluó cada semana.

Volumen = (longitud x amplitud2) / 2

AUC = [(V1 + V2 )/ 2] x (dia2 – dia1)

PC = [(suma AUC)- (vol1 x (dia0-dia1))] / (dían-dia1)2

Asimismo, se registró el peso corporal (Warner 1962), el consumo de alimento y agua(Newberne, 1978). Al término del periodo de observación se sacrificaron los animales.

Observaciones microscópicas

Se tomaron muestras de tejido subcutáneo en la zona de aplicación del tratamientofarmacológico, esta zona se identificó previamente por la presencia de una masa tumoral enel lomo de los animales y se disecaron los tumores. Los tejidos se fijaron en solución de for-mol 10% y se deshidrataron con soluciones de etanol a diferentes concentraciones y final-mente se incluyeron en bloques de parafina. Los cortes histológicos de 5 ìm de espesor setiñeron con la mezcla de colorantes Hematoxilina – Eosina (substancias que identifican áci-dos nucleicos y moléculas de colágena respectivamente) para su análisis microscópico (Ha-nausek et al., 2001).



Criterios histológicos para identificar las células cancerosas

Estos criterios se basaron en alteraciones que presentan las células tumorales en re-lación a las células normales y son los siguientes: presencia de pleomorfismo (variación detamaño y forma celular), DNAhipercromático (DNAcompacto), relación anormal núcleo cito-plasma (rango normal 1:4 o 1:6); y presencia de cromatina con grumos gruesos (Fanburg –Smith et al., 1998). En los cortes histológicos se hizo la búsqueda de las siguientes célulastumorales epiteliales: fibrosarcomas (fibroblastos presentes desde la dermis hasta al tejidoadiposo subcutáneo), carninomas de células escamosas (células con núcleos atípicos) (Co-tran et al., 2000), papilomas (ejes fibrovasculares de células, revestidos por epitelio escamo-so) (Henserson et al., 1998) y queratoacantomas (células escamosas grandes concitoplasma eosinófilo y zonas de queratinización) (Shimizu et al., 2000). Estos tipos tumora-les se determinaron de acuerdo con los criterios reportados por Shimizu et al., 2000; Cotranet al., 2000; Henserson et al., 1998.

Resultados y Discusión

Incremento del volumen tumoral

El volumen tumoral se calculó a través de la medición del largo y ancho de los tumoresen cada animal; el valor promedio obtenido de cada grupo (0, 2, 10 y 20 mg de DMBA), segraficó contra el tiempo de observación en semanas (Figura 1). Como se esperaba con laadministración de 10 y 20 mg de DMBAse desarrollaron masas tumorales detectadas comoincrementos de volumen. Nueve semanas después de la exposición al DMBA observamosque el tratamiento con 20 mg de DMBA produjo un tumor de 7 cm

3, con 10 mg un tumor de

4.3 cm3y con 2 mg se presentó un volumen tumoral de 0.5 cm

3. Es decir, se encontró una re-

lación directamente proporcional entre la cantidad del agente tumoral y el volumen del tumorinducido. Un efecto dosis dependiente ha sido reportado en ratones, donde la exposición tó-pica creciente al DMBA aumentó la formación de aductos entre los epóxidos de DMBA y elDNA (Melendez et al., 1999).

A la semana 20 los animales tratados con 10 y 20 mg de DMBA presentaron el mismovolumen tumoral (Figura 1), en el caso de 20 mg el desarrollo tumoral disminuyó entre las16-20 semanas, probablemente debido a que el volumen alcanzado por la masa tumoralafectó el suministró de oxígeno y nutrientes, ocasionando la inhibición del crecimiento del tu-mor (Korc 2003).

Las fluctuaciones observadas en las masas tumorales fueron similares en los grupostratados con 10 y 20 mg de DMBA: un aumento en la semana 9 (Figura 1) y oscilaciones delvolumen en los grupos desde la semana 10 hasta la semana 16. Este comportamiento osci-lante puede explicarse por la manifestación alternada de procesos de proliferación y de inhi-bición tumoral que involucran mecanismos de protección y la respuesta inmunológica. Elmecanismo de protección corrige los daños producidos por agentes cancerígenos, median-



te un sistema de reparación de nucleótidos que dejan sitios apurínicos en el DNA y probable-mente participan en el desarrollo tumoral (Braithwaite et al., 1998). En lo que se refiere alsistema inmunológico, este detecta y marca a las células tumorales para su eliminación(Burger et al., 1971) a través de linfocitos B y T (CD4 y CD8 citotóxicos), los cuales aparecenen forma lenta y prolongada (Visser et al., 2006). Por otra parte, la activación del sistema in-mune también libera proteínas (factor de necrosis tumoral alfa y el factor nuclear kB) que fa-vorecen el desarrollo tumoral. Cabe mencionar que el sistema inmune es tan importante,que se ha observado en los sistemas animales deficientes en interferón gamma (factor clavede la respuesta inmune) el crecimiento espontáneo de tumores en piel (Visser et al., 2006).

Por otra parte, es importante señalar que entre las 16-20 semanas, se observó que elvolumen tumoral del grupo tratado con 10 mg de DMBA fue mayor que el presentado por elgrupo expuesto a 20 mg, lo que contradice la dependencia de la dosis en el crecimiento tu-moral hasta la semana 20. Para verificar este hecho se calculó el área bajo la curva (AUC)del volumen tumoral.



Figura 1. Curso temporal del volumen de tumores en la rata Wistar expuesta a diferentes dosis de DMBA. La administración de

DMBA se realizó en dos sesiones (recuadro vacio) durante un periodo de 7 días. El volumen se midió cada semana en los grupos

expuestos a 0, 2, 10 y 20 mg de DMBA subcutáneo (x ± ee, n=3).

Desarrollo global del volumen tumoral como área bajo la curva (AUC)

Se determinó el AUC del volumen tumoral representado en la Figura 1. Al término de20 semanas los resultados se sumaron para representarlos en un solo grupo de acuerdo altratamiento. Este parámetro (AUC) describe en forma total el volumen tumoral a lo largo delperiodo de observación. Como puede observarse en la Figura 2 la administración de 20 mgde DMBA generó mayor AUC durante las 20 semanas de observación.

Como los animales se expusieron al DMBAen dos ocasiones, es posible que se afec-taran sólo unas cuantas células durante esos eventos. Dado que el crecimiento tumoral sepresenta en relación al número de células afectadas por el DMBA y su capacidad de prolife-ración; entonces, si el número inicial de células transformadas fue diferente de acuerdo a ladosis administrada el crecimiento de las masas también lo será. Aunque en este estudio nose muestra el número de células, en la Figura 3 puede observarse que el crecimiento tumo-ral promedio por día expresado como cm

3/día en los animales expuestos a 20 mg de DMBA

fue el más alto.



Figura 2. Análisis global del volumen tumoral. Se determinó el área bajo la curva del volumen tumoral producido durante 20

semanas por 0, 2, 10 y 20 mg de DMBA en ratas Wistar. Los tratamientos se aplicaron por vía subcutánea. Los resultados se ex-

presan como x ± ee y n=3.

Crecimiento tumoral en la rata y morfología de las células tumorales

Los animales sometidos a 10 mg (Figuras 4A y 4B) y 20 mg de DMBA (Figuras 4C y4D) desarrollaron tumores, y en el caso del tratamiento con 20 mg los animales presentaronlesiones ulcerosas de aproximadamente 2.5 cm de diámetro encerradas en un círculo (Figu-ra 4C) y 2.2 cm de diámetro (Figura 4D). Las ulceras se localizaron en la zona dorsal de larata, en el cuadrante superior derecho que correspondió a la zona de aplicación del DMBA;en el momento del sacrificio no se observaron a simple vista restos de DMBA ni del vehículoutilizado para administrarlo. Otros autores han reportado desarrollo de carcinomas en los ra-tones después de 23 semanas de tratamiento con DMBA y derivados de forbol. Samarth etal., en 2007, encontraron 67% de incidencia de cáncer pulmonar en ratones después denueve semanas con el uso de benzo(a)antraceno y Henserson et al., en 1998 detectaron tu-mores (papilomas) en ratones, 11 semanas después de tratarlos con DMBA. En este estu-dio, el seguimiento del desarrollo tumoral se prolongó hasta la semana 20, a este tiempo eldiámetro tumoral fue el mismo en los grupos tratados con 10 y 20 mg de DMBA (Figuras 1,4B y 4D).



Figura 3. Crecimiento promedio (cm3/dia) de las masas tumorales de Rattus norvegicus. Las ratas se expusieron a 0, 2, 10 y 20

mg de DMBA por vía subcutánea, en dos sesiones y con siete días de diferencia entre las sesiones. Los resultados se expresan

como x ± ee y n=3.

No se realizaron cortes histológicos de las ratas expuestas a 20 mg de DMBA debidoa que la presencia de ulceras en la piel, es un foco de infección bacteriana que podría com-plicar la interpretación de los resultados. El análisis histológico del tejido de ratas expuestasa 10 mg de DMBA se realizó en secciones de tejido teñidos con Hematoxilina – Eosina, don-de la Hematoxilina permitió la identificación de los núcleos en tono oscuro y denso en tantoque la Eosina se unió a la colágena del citoplasma destacándola en diversas tonalidades degris (Clark et al., 1981; Guerra 1999). En la Figura 5Ase muestra una seccion de tejido repre-sentativo del grupo control, donde puede observarse, la disposición de las células a nivelsubcutáneo, identificando los núcleos como gránulos densos obscuros y al citoplasmacomo bandas en tonos grises; es importante señalar que la distribución de este tipo de célu-las fue uniforme en todo el campo visual. En la figura 5B se muestra una banda densa obscu-ra que corresponde a la epidermis y dermis, con un arreglo regular de las células a nivelsubcutáneo similar a lo descrito anteriormente. En la Figura 5C se observa una probablezona de necrosis del tejido evidenciada por una porción oscura densa y difusa en el campovisual debido a la Hematoxilina, que identifica al DNA.

En los animales tratados con 10 mg de DMBA se observó la presencia de células conun diámetro nuclear aumentado, núcleos hipercrómicos y diferentes tamaño celulares (Fi-gura 5D) que según los criterios reportados por Wang y colaboradores en el 2005 correspon-



Figura 4. Desarrollo tumoral en la rata Wistar por efecto de DMBA. (A, B) 10 mg y (C, D) 20 mg de DMBA, la administración

del agente se aplicó por vía subcutánea en dos sesiones con 7 días de diferencia. (A, C) Desarrollo tumoral después de 9 semanas

y (B, D) desarrollo tumoral después de 20 semanas. En los círculos se muestran las lesiones tumorales y las ulceras.

den a células tumorales (probablemente fibrosarcomas). En esta misma figura, también sepuede observar entre dos y tres células tumorales por campo (indicadas por una flecha) condiámetro aproximadamente 2 veces mayor que en las células normales, lo cual es otra de lascaracterísticas de las células tumorales donde el espacio citoplásmico está ocupado casi to-talmente por el núcleo.

La detección microscópica de células tumorales en este estudio se realizó nueve se-manas después de la administración de DMBA, este periodo de desarrollo fue más largo queel reportado por Wang en el 2005, donde los animales que recibieron implantación de tumo-res malignos, desarrollaron tumores de 3 mm de diámetro en hígado, hueso y pulmón en unlapso de seis a ocho semanas después de la implantación (Wang et al., 2005). La diferenciaen el desarrollo tumoral probablemente se deba a que las células tumorales malignas huma-nas implantadas sólo requieren adaptarse al entorno donde fueron colocadas; mientras queen el caso del tratamiento con DMBAel desarrollo tumoral se inició a partir de células norma-les que debieron transformarse en células tumorales.



Figura 5. Secciones de tejido de ratas Wistar tratadas con DMBA. Se muestran cortes de 5 µm de tejido subcutáneo de rata, con

una amplificación de 400X. El DMBA se administró en dos sesiones con siete días de diferencia entre ellas. A) Tejido subcutá-

neo del grupo control, B) zona donde se observa la epidermis y la dermis indicada por la flecha, en el grupo control, C) Zona con

tejido probablemente en estado necrótico, D) presencia de células tumorales indicadas por la flecha en el grupo tratado con 10

mg de DMBA subcutáneo.

Conclusiones

El DMBAa una concentración de 10 mg fue un agente adecuado para inducir tumoressubcutáneos en ratas Wistar en un tiempo relativamente corto comparado con los reporta-dos en otros sistemas biológicos.

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