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Microbiología.
Maestría en Ingeniería Ambiental.
Ciclo 2012-2013.
Laboratorio de:
Tinción de Gram.
Integrantes:
Ing. Pablo Angulo.
Ing. Alejandro Gonzales.
Ing. Bayardo Bojorge.
Ing. Julio Vado E.
Ing. Henry Javier Vílchez.
Docente:
MSc. Lic. Elda Escobar.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENERIA.
Viernes, 19 de octubre 2012.
Programa de Investigación Estudios
Nacionales y Servicios Ambientales.
Programa de Investigación Estudios Nacionales y Servicios Ambientales. Aislamiento de Microorganismo –Método de Drigalski.
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Contenido 1 Introducción ...................................................................................................... 3
2 Objetivos. .......................................................................................................... 4
2.1 Objetivo General ........................................................................................ 4
2.2 Objetivos específicos ................................................................................. 4
3 Fundamento de los métodos. ........................................................................... 5
3.1Taxonomía. ..................................................................................................... 5
3.2 Técnicas de tinción para la microscopia óptica. ............................................. 5
3.2.1 Preparación del extendido ....................................................................... 5
3.2.2 Coloración gram....................................................................................... 6
3.1 Materiales. .................................................................................................. 8
3.2 Procedimiento ............................................................................................ 8
3.2.1 Principio: .............................................................................................. 9
3.2.2 Observación de la tinción de gram. ................................................... 10
3.2.3 Tinción de gram de las bacterias que crecen en cultivos. (Frotis indirectos). ...................................................................................................... 12
4 Resultados obtenidos. .................................................................................... 14
5 Conclusiones .................................................................................................. 16
6 Anexos. ........................................................................................................... 17
6.1 Cuestionario. ............................................................................................ 18
7 Referencias bibliográficas ............................................................................... 23
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1 Introducción
El laboratorio es una herramienta primordial, ya que por medio de este se
diagnostican diferentes patologías y además se realizan estudios para establecer
el tipo de tratamiento que se debe administrar, al igual que el seguimiento del
mismo. Es necesario conocer y llevar a la práctica ciertas “actitudes” correctas y
necesarias para el buen uso de los materiales de la actividad practica en un
laboratorio, es así como debemos informarnos sobre la bioseguridad y los posibles
riesgos que conlleva un mal manejo de los instrumentos pertenecientes a este
recinto.
El dia sábado 13 de octubre se llevo acabo el segundo laboratorio de
microbiología que abordaba la temática de tinciones de gram, por ende en este
laboratorio se aplicaron dos procedimientos de tinción de Gram, el primer método
es el frotis es el mas completo y el segundo que es el método rápido utilizando
KOH.
Para poder realizar estas actividades prácticas con microorganismos, debemos
contar con medios de cultivo adecuados para el crecimiento y desarrollo de éstas
bacterias. Todos los microorganismos necesitan agua, carbono, hidrógeno, calcio,
fósforo y hierro como elementos vitales, hay además, microorganismo exigentes
que requieres otros factores de crecimiento para poder vivir. En este curso se
usaran principalmente agar McConkey, con el cual podremos realizar análisis
microscópicos. Los análisis microscópicos deben ser precedidos por una tinción
(tensión de Gram) la cual permite observar claramente la forma, el tamaño y la
agrupación bacteriana en un microscopio.
En este practico, el objetivo general será conocer los materiales principales en la
elaboración de cultivos y practicar las técnicas adecuadas y los procedimientos
correctos en la elaboración de siembra y análisis microscópico. Entre los objetivos
específicos encontramos: practicar diferentes tipos de siembra, describir colonias,
practicar tinciones diferenciales y reconocer géneros de acuerdo a sus
características macro y microscópicas.
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2 Objetivos.
2.1 Objetivo General
Identificar bacterias Gram + y Gram – mediante la tinción de Gram.
2.2 Objetivos específicos
Conocer utilidad de la tinción de gram como herramienta para el
diagnostico microbiológico de algunos procesos bacterianos.
Aprender a hacer frotis y fijar la muestra para su visualización.
Conocer el fundamento de la coloración de Gram.
Adquirir conocimientos teóricos prácticos sobre la realización de esta
técnica de coloración.
Realizar lecturas microscópicas para identificación bacteriana preliminar.
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3 Fundamento de los métodos.
La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y
puede utilizarse para separar la mayoría de las especies bacterianas en dos
grandes grupos, a saber, las que captan el colorante básico, cristal violeta (es
decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado
con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas).
3.1Taxonomía.
Todos los organismos tienen un nombre que consta de dos partes: el género
seguido por la especie (ejemplo: el Homo sapiens). Las bacterias se han agrupado
y denominado principalmente en su morfológicas y bioquímicas / metabólicas
diferencias. Sin embargo, las bacterias son ahora también clasificadas de acuerdo
a su inmunología y las características genéticas.
Esta práctica se centra en la tinción de Gram, morfología bacteriana,
y características metabólicas, todos los cuales permiten al médico - clínico
determinar rápidamente el organismo que está causando la infección de un
paciente.
3.2 Técnicas de tinción para la microscopia óptica.
3.2.1 Preparación del extendido:
Los métodos de tinción se utilizan en forma directa con las muestras del paciente
o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los
microorganismos en cultivos.
Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con el asa bacterial
que contiene el material. El material que se va a teñir se coloca en forma de una
gota (si la muestra es líquida), o se rota (si esta en un hisopo) sobre la superficie
de un portaobjeto limpio y seco, en la parte media con un largo aproximado de 2
cm por 1 cm de anchó.
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Es importante evitar la contaminación de los medios de cultivo; por lo tanto, una
vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estéril no debe utilizarse
para la inoculación posterior de medios de cultivo.
Para la tinción de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una
aguja estéril para transferir una pequeña cantidad del cultivo desarrollado en un
medio solido a la superficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una
gota de agua o solución salina 0.9% estéril sobre el portaobjeto. En caso de
cantidades pequeñas que puedan perderse incluso en una gota de solución
fisiológica se puede utilizar un aplicador de madera estéril para obtener el material;
luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teñir se
deja secar y se fija al portaobjeto mediante su colocación sobre:
1).- una platina caliente (a 60⁰C) durante por lo menos 10 minutos
2).- cubriéndolo con metanol al 95% durante 1 minuto o
3).- flameando la placa portaobjetos por el mechero en tres ocasiones
Para examinar los microorganismos que crecen en medio líquido se aplica una
muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes
de la tinción.
La preparación de los frotis varía de acuerdo con el tipo de muestra que se va a
procesar y con los métodos de tinción que se van a utilizar. No obstante la regla
general para la preparación de frotis es que debe aplicarse una cantidad de
material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de
detectar y diferenciar los microorganismos. Por último, el método de tinción que se
debe utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado.
3.2.2 Coloración gram. Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la
microscopía de luz, diferentes técnicas de tinción se han desarrollado para
visualizarlas (Ver Figura 1 y 2). La más útil es la tinción de Gram, que separa los
organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y gram-negativas.
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Esta tinción también permití determinar si el organismo es redondo o en forma de
varilla, etc.
Ambos organismos, gram-positivas y gram-negativas tienen más que una capa de
protección de su citoplasma y núcleo desde el medio extracelular, a diferencia de
las células animales, que tienen una sola membrana citoplasmática compone de
una bicapa de fosfolípidos. La capa externa de la membrana citoplasmática
bacteriana es el peptidoglicano o pared celular. Está presente en ambos
organismos gram-positivos y gram-negativas.
La capa de peptidoglicano o pared celular está compuesta de repetidos
disacáridos con 4 aminoácidos en una cadena lateral que se extiende desde cada
disacárido.
Figura 1 y 2: Paredes de Gram Positiva y negativa
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Las cadenas de amino-ácidos del peptidoglicano se unen covalentemente a otros
aminoácidos de las cadenas vecinas. Esto resulta en una estable estructura
reticulada. La enzima que cataliza la formación de esta unión Se llama
transpeptidasa y está situado en el interior citoplásmica
membrana. El antibiótico se une a la penicilina inhibe esta enzima. Por esta
razón, la enzima es también llamada proteína de unión a la penicilina.
La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico de
las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse
con este método. Las únicas excepciones son:
Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las
células huésped (p. ej., clamidias).
Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).
Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el
microscopio óptico (p. ej., espiroquetas).
Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los
colorantes (p. ej., mycobacterias).
3.1 Materiales.
Portaobjetos
Cubreobjetos
Asas de inoculación
Mechero Bunsen
Pipetas
Colorantes
3.2 Procedimiento
El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico
a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol.
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Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del
colorante principal cristal violeta (metil rosanilina o violeta de genciana). Luego se
aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una
a la pared celular a través de enlaces químicos. La decoloración distingue las
bacterias grampositivas de las gramnegativas. Después de la decoloración los
microorganismos aparecen como grampositivos retienen el cristal violeta y los
gramnegativos lo pierden. El agregado colorante de contraste safranina
(Contratinción) teñirá de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras.
3.2.1 Principio:
Las diferencias de composición de las paredes de las bacterias grampositivas, que
contienen una gruesa capa de peptidoglucano con numerosos enlaces cruzados
de ácido teicoico, y las paredes de las células gramnegativas, en las que la capa
de peptidoglucano es más delgada, explican las diferencias de la tinción de Gram
entre estos dos grupos principales de bacterias es probable que la gran cantidad
de enlaces cruzados de ácido teicoico de los microorganismos gram positivos
contribuya a su capacidad de resistir la decoloración con alcohol.(Figura 3) Si
bien el colorante de contraste puede ser captado por los microorganismos gram
positivos, su color violeta no se altera.
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*Los microorganismos gram positivos que perdieron la integridad de la pared
celular debido al tratamiento antibiótico, al envejecimiento o a la acción de
enzimas autolíticas permiten que el violeta se elimine durante la decoloración y
pueden aparecer como gram variables, con algunas células coloreadas de rosa y
otras de violeta.
Sin embargo, con propósitos de identificación, estos microorganismos se
consideran gram positivos verdaderos. Por otro lado, las bacterias gram negativas
raras veces (o nunca) retienen el cristal violeta si el procedimiento de tinción se ha
realizado de manera apropiada.
Las células huésped, como los eritrocitos y los leucocitos (fagocitos), pierden el
cristal violeta con la decoloración y aparecen de color rosa en los frotis preparados
y teñidos de manera correcta.
3.2.2 Observación de la tinción de gram.
Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x). Cuando
el material orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se
evalúa en busca de la presencia de células bacterianas así como de las
reacciones Gram, (Fig. 4) En el análisis de muestras suele ser un estudio
fundamental por cumplir varias funciones:
Fig. 3.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y GRAM(-).
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Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos
bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con
aislamientos bacterianos realizados en los cultivos.
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos
distintos (Ver Fig. 5):
Los cocos son de forma esférica.
Los bacilos poseen forma alargada.
Los cocobacilos.
Los vibriones que son bacilos en forma de coma o curvados.
Los espirilos, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o
espiroquetas si son blandas y onduladas.
Pueden aparecer agrupados de diferente forma:
Aislados después de la división celular (Micrococos).
Fig. 4: Resultados de las tinciones de Gram.
Fig. 5. Clasificación de las bacterias de acuerdo a su morfología
agrupación.
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Aparecer por pares Diplococos.
Formar cadenas Estreptococos.
Agruparse de manera irregular Estafilococos.
Los bacilos en general suelen agruparse en forma de cadena
(Estreptobacilos) o en empalizada.
La tinción de gram proporciona una cantidad relativa de las bacterias infectantes.
Esta información a menudo proporciona un diagnostico preliminar con respecto a
los agentes infecciosos y con frecuencia se utiliza para el tratamiento directo inicial
del paciente.
Si bien la evaluación de la tinción de Gram del frotis directo se utiliza de rutina
como una ayuda en el diagnostico de las infecciones bacterianas, es posible que
se detecten y no deben ignorarse hallazgos inesperados pero importantes de otras
etiologías infecciosas. Por ejemplo, las células y los elementos micóticos por lo
general se tiñen como grampositivos pero pueden captar el cristal violeta de
manera deficiente y aparecer como gram variables (p. ej., rosa y violeta) o gram
negativos. Dado que con la tinción de Gram pueden detectarse otros agentes
además de las bacterias:
Como células inflamatorias (PMN o mononucleares)
Elementos sanguíneos (eritrocitos)
Restos celulares o mucosos (detritus celulares)
3.2.3 Tinción de gram de las bacterias que crecen en cultivos. (Frotis indirectos).
La tinción de Gram también desempeña un papel clave en la identificación de las
bacterias en crecimiento en cultivos. De manera similar a los frotis directos, en los
preparados a partir del crecimiento bacteriano se evalúan las reacciones de Gram,
las morfologías y no es valorable las disposiciones (agrupación) de las células
bacterianas. Si se va a teñir más de una muestra en el mismo portaobjeto, puede
utilizarse un lápiz de cera para crear divisiones.es útil dibujar una especie de
“mapa” de ese portaobjetos de modo que los resultados de las diferentes tinciones
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de Gram puedan registrarse de manera organizada. Los resultados del examen
del frotis se utilizaran para determinar comprobaciones ulteriores para la
identificación y la caracterización de los microorganismos aislados.
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4 Resultados obtenidos.
Esquema diferencial de las tinciones de gram observadas por microscopio:
Gram Positivos. Gram Negativos.
Tinción de gram Violeta Rosa
Decoloración No de coloro Decoloración
Endotoxina No Si
Pared Fina Compleja
Superficie Homogénea Rugosa
Lípidos + ++++
Acido Teicoco Si No
Sensib. Betalactamico. Notable ++ Escasa +
Sensib. Lisozima Si No
Relación DNA/RNA 8/1 1/1
Observaciones de las tinciones en microscopio.
Gram (+):
Tras la observación en el microscopio el bacilo es una bacterias gram (+) por que
presenta una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos
que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona, reteniendo el
colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en un tono azul claro,
como se vizualisar en la Figura Nº6 de acuerdo a su forma es cocobacilar.
Fig. Nº6: Bacilo color
azul.
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Gram (-)
Tras la observación en microscopio la ecoli es una bacterias gram (–) por que
tiene en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una
membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es
dañada por el alcohol de la decoloración, permitiendo que el primer colorante
acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante de hay
que toma el color rosado indicativo que de las gram (-) como se puede ver en la
figura Nº 7.
Fig. Nº9: E coli gram (-)
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5 Conclusiones
La práctica es de suma importancia ya que se conocieron los fundamentos
básicos de cómo realizar una impregnación bacteriológica en una lámina y poder
identificar qué tipo de bacteria es.
Cabe mencionar que el trabajo con bacterias representa un riesgo de contagio por
lo cual conociendo las normas de bioseguridad y el manejo adecuado como se
hizo, nos permite obtener tanto buenos resultados en la identificación de la
bacteria como en la prevención de contagio.
Se logro conceptualizar en la practica las diferencias en las tinciones de las gram
negativas y postivas de las siguiente manera las bacterias Gram-negativas
presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared
celular de peptidoglicano presentado una tonalidad rosada, mientras que las
bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de
peptiglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante
durante la tinción de Gram presenta una tonalidad azul.
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6 Anexos.
Utensilios para la tinción de gram:
Esterilización de la Asa bacterial.
Utensilios para la tención.
Flameado del porta objeto.
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6.1 Cuestionario. 1-¿Por qué la capa rígida de la pared celular bacteriana se llama
peptidoglucano?
R: La capa rigida de la pared celular bacteriana se llama peptidoglicano, debido a
que esta se compone por finas láminas compuestas por dos derivados de
azúcares, N-acetilglucosamina y ácido-N-acetilmurámico, y un pequeño grupo de
aminoácidos que incluyen L-alanina, D-alanina, D-glutámico y o bien lisina o ácido
diaminopimélico (DAP). Estos componentes se unen entre sí para formar una
estructura repetitiva que se denomina tetra péptido del glicano.
2-¿Cuáles son las razones químicas de la rigidez que confieren a la pared
celular la estructura del peptidoglicano?
R: Las razones químicas que confieren rigidez a la pared celular la estructura del
peptidoglicano, es debido a que la estructura básica del peptidoglicano está
constituida por una lámina en la que las cadenas de derivados de azúcares se
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conectan entre sí por puentes peptídicos a través de los aminoácidos. Los enlaces
glicosídicos que unen los azucares en las cadenas son muy fuertes, pero las
cadenas por si solas no pueden conferir rigidez en todas las direcciones. Cuando
las cadenas se entrecruzan mediante puentes peptídicos se logra la rigidez
característica de la pared. El número de puentes peptídicos no es igual en todas
las especies de Bacteria y las paredes más rígidas son aquellas que presentan
mayor número de puentes intercatenarios.
3- Tanto la Lisozima como la penicilina provocan la lisis de la célula
bacteriana, pero por mecanismos muy diferentes. Describa el mecanismo
mediante el cual cada uno de estos agentes ocasiona la lisis celular.
Asegúrese de incluir en su explicación una descripción exacta de por qué
ocurre la lisis.
Lisis por medio de Lisozima: La Lisozima es una enzima que aparece de forma
natural en algunas células eucariotas y es un componente de las lágrimas,
mucosidad y saliva. Es particularmente activa sobre los principales componentes
de la pared celular de la mayoría de bacterias gram-positivas, haciéndolas
vulnerables a la ruptura o lisis. La lisozima cataliza la hidrólisis de los enlaces que
unen las moléculas de azúcar en las cadenas polisacarídicas del péptido glicano.
Esta acción es análoga a cortar con un soplete los soportes de acero de un
puente. La pared celular de las bacterias gram-positivas es destruida casi
totalmente por la lisozima. Sin embargo, el contenido celular que permanece
rodeado por la membrana citoplasmática puede conservarse intacto si no tiene
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lugar la lisis osmótica (ver más adelante); esta célula sin pared se denomina
protoplasto. Los protoplastos son típicamente esféricos y capaces aún de realizar
su metabolismo.
Cuando se aplica la lisozima de forma similar a las células gram-negativas su
pared no suele destruirse en la misma medida que las de las gram-positivas,
conservándose además parte de la membrana externa. En este caso el contenido
celular, la membrana citoplasmática y el resto de la capa externa de la pared,
constituyen un esferoplasto, que es también una estructura esférica. Para que la
lisozima actúe sobre las células gran-negativas es necesario tratarlas antes con
ácido etiléndiamino tetracético (EDTA), compuesto que debilita las células iónicas
de la membrana externa y la altera, permitiendo el acceso de la lisozima al péptido
glicano.
Lisis por medio de Penicilina: El proceso de síntesis de la pared celular
comienza en el citoplasma bacteriano, a partir de N-acetilglucosamina-1-fosfato
que se une al UDP (uridin difosfato).
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El UDP se combina con la N-acetilglucosamina-1-fosfato, para dar UDP-N-
acetilglucosamina que primero forma el éter láctico y luego en sucesivos pasos
enzimáticos se unen al mismo los cinco aminoácidos para formar el N-
acetilmurámico.
En el siguiente paso, que ocurre en el ámbito de la membrana citoplasmática la
molécula que es hidrófila cambia a lipófila, lo cual facilita su transporte, por el
cambio del UDP por undecaprenil-fosfato y el agregado de un pentapéptido de
glicina a nivel de la L-lisina.
En la siguiente fase, en el ámbito de la pared celular, se produce la
transglucosidación y formación del enlace beta alargando de esta manera la
molécula.
Los enlaces transversales entre moléculas del polímero se produce por
transpeptidación, se libera una D-alanina y el grupo carboxilo se une a un grupo
amino de la lisina de otro oligopéptido, también se libera el undecaprenil-fosfato.
La penicilina interfiere en este último paso, es decir impide la unión transversal o
puente interpeptídico pero no la elongación del polímero. De la misma manera
actúan las cefalosporinas, vancomicina, bacitracina y cicloserina. Debe notarse
que la síntesis de la pared no se realiza cuando no hay lisina disponible o cuando
se impide la racemización de la L-alanina y por lo tanto la disponibilidad de la D-
alanina por efecto de la c-clicoserina (oxamicina).
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La mayoría de las bacterias gram-negativas no son tan sensibIes a la penicilina
porque la membrana externa de las bacterias gram-negativas forma una barrera
que impide la entrada de la penicilina y otras sustancias.
4- Describa lo que provoca el KOH en la pared celular de las bacterias Gram
negativas.
Este método está basado en la rotura de la pared celular de las bacterias al
ponerlas en contacto con soluciones alcalinas diluidas. Una suspensión de células
bacterianas en KOH al 3% toma un aspecto viscoso debido a la liberación del DNA
cuando se trata de una bacteria Gram negativa. Sin embargo, Blachmann y col.
(1980) y Bourgault y
col.(1988) demostraron que el método del KOH no tiene una correlación muy
precisa con la tinción de Gram.
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7 Referencias bibliográficas
1. Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana,
2. Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual
moderno, México, México 2002.
3. Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial
Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004.
4. Salazar Wilson, Guías de práctica de Laboratorio de Microbiología, Depart.
de publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito – Ecuador, 2007.
5. 2.- Prácticas de Microbiología. Departamento de Microbiología y Genética
Universidad de Salamanca
6. 3.- Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual
moderno, México, México 2002
7. 4.- SEQUEIRA, L. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la
tuberculosis normas y guía técnica. OPS 2008
8. 5.- Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial
Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004.
9. 6.- Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico
panamericana, 110 − 111.
10. 7. - Mandell, Bennett, & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases
6th ed.
11. Copyright © 2005. Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier.
12. 8.- http://www.opsecu.org/informativo/informativo5/tuberculosis.htm