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43Biotecnología y Mejoramiento Vegetal

II.-Capítulo 3

Herramientas básicas de ingenieríagenética

Gómez, Marisa; Echenique, Viviana

1 Introducción

Hasta aproximadamente 1970 el ADN erala molécula de la célula que planteaba másdificultades para su análisis bioquímico. Exce-sivamente larga y químicamente monótona,la secuencia de nucleótidos del ADN sólopodía ser estudiada por caminos indirectos,tales como la determinación de la secuenciade proteínas, del ARN o por el análisisgenético. Actualmente es posible separar re-giones determinadas del ADN, obtener can-tidades ilimitadas de esos fragmentos y de-terminar incluso la secuencia de esosnucleótidos. Estos adelantos técnicos formanparte de la tecnología del ADN recom-binante, constituida por una mezcla de téc-nicas, algunas de las cuales son nuevas, perootras son adaptaciones de procesos natura-les de la genética microbiana que han sidoestudiados y se conocen en profundidad.

2 Genética microbiana

En los procariotas existen mecanismos deintercambio genético que permiten tanto latransferencia de genes como la recombina-ción. La recombinación genética en procario-tas ocurre porque se transfieren fragmentosde ADN homólogos desde un cromosomadonador a una célula receptora por uno deestos tres procesos:

• Transformación: es un proceso porcual el ADN libre del medio ambiente se in-corpora en una célula receptora, trayendoaparejado un cambio genético. Esto ocurresólo en algunas especies bacterianas. El mo-vimiento de las moléculas de ADN a travésde la membrana y dentro del citoplasma dela célula receptora es un proceso activo, querequiere energía. Una célula que es capaz detomar una molécula de ADN y ser transfor-mada se dice que es competente. Estas célu-las secretan el factor de competencia, que es

una pequeña proteína que induce la síntesisde 8 a 10 nuevas proteínas requeridas parala transformación.

• Transducción: es un proceso por el cualel ADN se transfiere de una célula a otra pormedio de un virus (que en el caso dehospedadores bacterianos se denominafago). Puede ocurrir de dos maneras. En lallamada transducción generalizada, unafracción del ADN celular, que puede proce-der de cualquier porción del genoma delhospedador, pasa a formar parte del ADNde la partícula vírica madura, reemplazandoal genoma del fago. En la transducción es-pecializada, que ocurre sólo en algunos fagosatemperados (aquellos que se integran en elgenoma como parte de su ciclo biológico), elADN de una región específica del cromosomadel hospedador se integra directamente enel genoma del fago, reemplazando algunosde sus genes. En ambos casos, la partículavírica transductora es normalmente defectivacomo virus, ya que los genes víricos han sidoreemplazados. No todos los fagos puedentransducir, ni todas las bacterias sontransducibles. Pero el fenómeno está lo sufi-cientemente extendido para suponer quedesempeña un importante papel en lastransferencias genéticas que se producen enla naturaleza.

• Conjugación: es un proceso de trans-ferencia genética que requiere contacto decélula a célula y que está mediado por unplásmido. Consiste en la transferencia deuna copia de este plásmido al nuevohospedador. Sin embargo, otros elementosgenéticos resultan a veces movilizados duran-te la conjugación, como pueden ser otrosplásmidos o grandes bloques del cromosomadel hospedador. La conjugación requiere unacélula donadora, que contiene un tipo parti-cular de plásmido conjugativo, y una célulareceptora que carece de él. El contacto serealiza a través del filamento o pelo sexual,que permite el apareamiento específico y queposeen sólo las células donadoras. Constitu-ye un puente de conjugación a través delcual pasa el ADN.

3 La clonación molecular

El desarrollo de la tecnología del ADNrecombinante y la clonación molecular han

44 GÓMEZ, Marisa; ECHENIQUE, Viviana

aportado sofisticados procedimientos quepermiten el aislamiento, purificación yreplicación de fragmentos específicos deADN. La finalidad de la clonación moleculares aislar gran cantidad de genes específicos,en forma pura. El procedimiento implica esen-cialmente dos etapas (Fig 1):

• Creación del ADN recombinante, queconsta de dos pasos:

1) Aislamiento del ADN de partida. Estepuede ser ADN genómico, ADN sintetizadoa partir del ARNm por transcripción reversa(ADNc por «copia»), ADN amplificado porla reacción en cadena de la polimerasa o sin-tetizado in vitro. Si se parte de ADNgenómico, generalmente se corta conenzimas de restricción para obtener los frag-mentos a clonar.

2) Unión de los fragmentos de ADN a unvector de clonación utilizando una ligasa deADN. Un vector es una molécula de ADN quevehiculizará al fragmento de interés. Losvectores de clonación están diseñados deforma tal que permiten la recombinación deADN foráneo en un sitio de restricción delvector, sin afectar su replicación. A fin de se-leccionar las células que incorporaron el vector,el mismo lleva genes marcadores (por ejem-plo un gen de resistencia a antibióticos).

• Introducción del ADN en una célulahospedadora donde se replicará (amplifi-cación): éste es realmente el verdadero even-to de clonación, en el cual el ADNrecombinante es multiplicado para producirvarias copias idénticas. Involucra tres pasos:

1) Introducción y mantenimiento delADN recombinante en un organismohospedador. La molécula de ADNrecombinante se introduce en el organismohospedador, que puede ser procariota (bac-terias) o eucariota (levaduras, células de ma-míferos cultivadas). En el caso de la utiliza-ción de sistemas bacterianos, la introducciónse realiza por los procesos naturales de lagenética microbiana (transformación,transducción, conjugación) o modificacionesespecíficas de los mismos. También se utilizaampliamente la introducción del ADN me-diante electroporación (descargas eléctricasque crean poros en la membrana celular per-mitiendo la introducción del ADN).

2) Detección y purificación del clon desea-do. La transferencia del ADN al hospedador

a menudo genera un grupo de clones queportan el vector. A fin de separar las célulasque incorporaron el plásmido de las que nolo hicieron se inoculan las células en un me-dio sólido (agarificado) que contiene el anti-biótico al cual son resistentes las células queposeen el vector. Sólo éstas sobrevivirán. Lue-go deberá buscarse específicamente aquellascélulas que poseen el fragmento de interés.Para ello puede utilizarse la reacción en ca-dena de la polimerasa (PCR) o la hibrida-ción molecular con una sonda específica.

3) Crecimiento y amplificación de las cé-lulas hospedadoras que incorporaron el ADNrecombinante deseado para su aislamiento,estudio, etcétera

ADN foráneoa insertar

Ligación

Vectorplasmídico Gen de resistencia

a antibiótico

Molécula de ADNrecombinante

Introducción en lacélula hospedadora

Selección de las células que contienen moléculas de ADNrecombinante por crecimiento en presencia de antibiótico

Figura 1: Pasos básicos en la clonación de unfragmento de ADN..... En primer lugar el ADN a clonar yel vector (plásmido) se cortan con la misma enzima derestricción. Luego se ponen en contacto en presencia deuna ligasa para obtener una molécula de ADNrecombinante que se introduce en bacterias quemultiplicarán el plásmido junto con el fragmento deinterés (Modificado de Watson y col., 1992).


4 Herramientas y procedimientosimplicados.

• Endonucleasas de restricciónLa habilidad para clonar cualquier gen o

secuencia de ADN de interés, depende, engran medida, de un tipo especial de enzimasdenominadas endonucleasas de restricción,que son enzimas que cortan la molécula deADN en sitios específicos denominados sitiosde restricción. Estas enzimas reconocen se-cuencias específicas de 4 a 8 bases. Las di-ferentes endonucleasas de restricción sonproducidas por distintos microorganismos,para los cuales constituyen un mecanismo dedefensa contra el ataque de fagos. Cuandoel ADN de un fago ingresa en la célulabacteriana, ésta lo degrada gracias a su ba-tería de enzimas de restricción. Para prote-ger su propio ADN, las bacterias contienenenzimas (metilasas) que se encargan demodificar (metilar) ciertas bases en los sitiosque reconocen sus propias enzimas de res-tricción, de manera que ya no pueden reco-nocer dichos sitios de clivaje. La metilaciónocurre rápidamente después de la replicación,catalizada por metilasas producidas por elmicroorganismo.

Las enzimas de restricción se denominanutilizando la primera letra del género y lasdos primeras letras de la especie que la pro-duce, seguidas por un número que indica elorden en que han sido identificadas lasenzimas correspondientes a la misma espe-cie (Tabla 1). Una interesante característicade las enzimas de restricción es que común-

mente reconocen secuencias de ADN que sonpalíndromes (conjunto de caracteres que selee de igual manera de derecha a izquierdaque de izquierda a derecha). Además produ-cen cortes en las dos cadenas. Muchasenzimas de restricción están compuestas dedos unidades idénticas, cada una de las cua-les reconoce y corta una de las cadenas.Como las secuencias reconocidas son relati-vamente cortas y frecuentemente palindró-micas, tales enzimas siempre hacen cortes enADN bicatenarios y tales cortes no están su-jetos a corrección por enzimas de reparación.Gracias a este mecanismo pueden destruir elADN extraño.

Ciertas enzimas como EcoRI producencortes escalonados que crean colas cortas decuatro bases de cadena simple en cada ex-tremo del fragmento. Estas colas tienden aasociarse a una cadena complementaria porapareamiento de bases, por eso se denomi-nan extremos cohesivos o pegajosos(«sticky ends») (Fig. 2 A). Los extremoscohesivos pueden unirse permanentementea secuencias complementarias de otro frag-mento con colas producidas de la mismamanera (corte con la misma enzima), adicio-nando la enzima ADN ligasa, que cataliza laformación de nuevos puentes fosfodiésteresy las apropiadas condiciones de renaturaliza-ción. Esta cohesividad permite unir fragmen-tos de ADN no homólogos, una característi-ca de relevancia para la creación del ADNrecombinante.

Existe otro tipo de enzimas de restricción,como HindII, que cortan el ADN en el centro

Organismo Designación Secuencia Nota

Bacillus subtilis BsuRI 5’..GG�CC..3’

3’..CC�GG..5’

Genera extremos romos

Escherichia coli EcoRI 5’..G�AATTC..3’

3’..CTTAA�G..5’

Genera extremoscohesivos

Escherichia coli EcoRII 5’..�CCAGG..3’

3’..�GGTCC..5’

No palindrómica

Escherichia coli EcoRV 5’..GAT�ATC..3’

3’..CTA�TAG..5’

Genera extremos romos

Haemophilusinfluenzae

HindII 5’..GTPy�PuAC..3’

3’..CAPu�PyTG..5’

Pu: cualquier purinaPy: cualquier pirimidina

Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restricción de diferentes endonucleasas de restricción


de la secuencia de reconocimiento (en el mis-mo punto, en ambas cadenas) produciendoextremos romos («blunt-ends»), es decir quelas bases están apareadas en sus extremos,y por lo tanto no presentan tendencia paraunirse con las bases complementarias (Fig. 2B). Esto puede solucionarse adicionando ex-tremos cohesivos por medio de la transfera-sa terminal, enzima que permite adicionarcolas de «poliA» o «poliT», que se comporta-rán como extremos cohesivos (Fig. 2 C).

• Vectores de clonaciónComo se mencionara más arriba, un

vector es una molécula de ADN quevehiculizará al fragmento de interés y permi-tirá su amplificación. Los vectores declonación más utilizados derivan del genomaviral o de plásmidos bacterianos. Un vectorde clonación tiene tres componentes esen-ciales:

1. Un origen de replicación2. Un gen marcador fácilmente seleccio-

nable3. Al menos un sitio único de restricción

Los vectores de clonación de última ge-neración son muy prácticos y sencillos demanejar. Incluyen un sitio múltiple declonación o sitio de restricción múltiple(«polylinker»), que es un segmento corto deADN con muchos sitios de restricción diferen-tes, cada uno de ellos único para el vector(Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte delmarco abierto de lectura («ORF») de un genresponsable de alguna característicafenotípica, por lo que resulta sencillo confir-mar si tras la restricción y ligado se ha inser-tado efectivamente un fragmento de ADN,ya que la inclusión de este interrumpe la se-cuencia del vector, lo cual redunda en la pér-dida de funcionalidad del gen medianteinactivación por inserción.

Los vectores pueden clasificarse de la si-guiente manera:

A) Plásmidos: son moléculas de ADN cir-cular, de doble cadena, extracromosómicas,presentes en las bacterias, que poseen pro-piedades muy útiles como vectores de clona-ción:

Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restricción..... a. Corte en secuencias palindrómicasoriginando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de laenzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporación de extremos cohesivos a un fragmento deextremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992).


1. Pequeño tamaño que permite mayorfacilidad de aislamiento y manipulación.

2. Son circulares, lo que hace que el ADNsea más estable durante su aislamiento quí-mico.

3. Su replicación transcurre independien-temente del ADN nuclear en la célula bacte-riana.

4. Existen múltiples copias en la célula,dependiendo del plásmido y de la especiehospedadora, puede haber de varias a nu-merosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copiasde pBR322 por célula).

5. La presencia de genes de resistenciaa los antibióticos que actúan como marca-dores seleccionables facilita la detección yselección de los clones que los contienen.

6. El tamaño de los insertos que se pue-den clonar puede ser considerable; sin em-bargo, si son mayores de 10 kb, el plásmidose hace generalmente inestable.

Figura 3: Vectores de clonación. a. Sitio de restricciónmúltiple: corto segmento de ADN con varios sitios derestricción, cada uno de ellos único para el vector. b.Plásmido pBR322 con los sitios de restricción de BamHIy PstI dentro de los genes marcadores (genes deresistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente).(Modificado de Watson y col., 1992).

Aunque en el ambiente natural losplásmidos conjugativos generalmente setransfieren por contacto célula a célula, losplásmidos vectores de clonación generalmen-te han sido modificados a fin de evitar sutransferencia por conjugación y así lograr sucontención biológica. Sin embargo, en ellaboratorio es posible realizar la transferen-cia a la célula hospedadora por transforma-ción, utilizando choque de calor, o porelectroporación.

Los primeros plásmidos utilizados comovectores de clonación existían en forma na-tural. El plásmido pBR322 constituye una ge-neración posterior de vectores construidos invitro (Fig 3 B). En este plásmido, el sitio derestricción de BamHI está dentro del gen deresistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstIestá dentro del gen de resistencia a laampicilina. Si se inserta un trozo de un ADNen uno de estos sitios, la resistencia al anti-biótico conferida por el gen que contieneeste sitio se pierde (inactivación por inserción).Por tanto, cuando pBR322 es digerido conBamHI y se liga a un ADN, y luego se aíslanlos clones transformados, aquellostransformantes que posean resistencia a latetraciclina y ampicilina no portan ningúnADN clonado. Aquellas células que continúansiendo resistentes a la ampicilina pero sensi-bles a la tetraciclina, contienen el plásmidocon el fragmento del ADN clonado. Como laresistencia a la ampicilina y a la tetraciclinapueden determinarse independientementeen placas con agar, resulta fácil aislar bacte-rias que contengan los clones deseados y eli-minar las células que no los contengan.

B) Bacteriófagos o fagos:Fago λ: tiene un mapa genético comple-

jo. Se conoce la secuencia completa de sus48.502 pares de nucleótidos y la función desus genes. El tercio central del cromosomacontiene genes que son requeridos para lalisogenia (estado integrado) pero no para elciclo lítico (ciclo productivo de nuevas partí-culas virales). Esa parte central (de aproxima-damente 15 kb) del cromosoma puede sercortada con enzimas de restricción y subs-tituida por un fragmento de ADN foráneo(Fig. 4 A). La molécula resultante de ADNrecombinante puede ser empaquetada enlas cabezas del fago in vitro. Las partículas


del fago pueden inyectar el ADNrecombinante en E. coli, que se replica pro-duciendo colonias bacterianas que contienenlos fragmentos a clonar.

El fago l silvestre no es indicado comovector de clonación porque tiene demasia-dos sitios para enzimas de restricción. Paraobviar esta dificultad se han construído fagosl modificados (Charon), en los cuales los si-tios de restricción no deseados han sido al-terados de manera tal que la correspondien-te enzima no los reconozca.

Es un vector de clonación particularmen-te útil porque:

1. Se conoce bien su estructura, secuen-cia y funcionamiento

2. Puede insertar mayor cantidad de ADNque la mayoría de los plásmidos (entre 10 y20 kb)

3. El ADN puede ser eficientemente em-paquetado in vitro dentro de las partículasdel fago

4. Las partículas del fago son mucho máseficientes en la infección de las célulashospedadoras (transfección) que la trans-formación.

Fago M13: es un fago filamentoso quecontiene ADN monocatenario y se replica sinmatar a su hospedador. Para poder utilizarlocomo vector de clonación es necesario dis-poner de una forma bicatenaria, ya que lasenzimas de restricción sólo trabajan sobreADN de doble cadena. El ADN bicatenariode M13 puede obtenerse de células infecta-das, donde se encuentra en formareplicativa bicatenaria. La mayor parte delgenoma del tipo silvestre contiene informa-ción genética esencial para la replicación. Exis-te, sin embargo, una pequeña región llama-da secuencia intergénica que puede ser uti-lizada como sitio de clonación. Es posibleclonar ADN de longitudes variables (hasta5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADNmonocatenario de M13 y de sus vectoresderivados ha sido extremadamente útil parasecuenciar ADN.

Tanto en el fago l como en M13 se hainsertado un fragmento funcional de lacZ, elgen de E. coli que codifica para la enzima β-galactosidasa (β-gal), que es utilizado comogen marcador. En el inicio de este gen se hainsertado un sitio múltiple de clonación. Porlo tanto, los fragmentos de ADN clonadosen el «polylinker» interrumpen el gen lacZ y

anulan la actividad de la β-galactosidasa.Cuando esta enzima hidroliza un compues-to químico denominado X-gal, se libera uncolorante azul relativamente insoluble. El X-gal se incorpora al medio de cultivo en placade Petri, donde crecerán las célulashospedadoras del ADN recombinante. Si elADN clonado se insertó en el polylinker ydesactivó la β-galactosidasa, no se produci-rá pigmento azul y las células formarán co-lonias que se verán blancas en la placa dePetri. En caso contrario, las colonias de lascélulas hospedadoras se verán de color azul.

Figura 4: Vectores de clonación..... a. Utilización delfagoλ. 1. Dos sitios de restricción EcoRI en el ADN delfagoλ. 2. Región central no esencial del fago 3. El ADNforáneo puede reemplazar al segmento no esencial delADN del fago 4. Unión con ADN ligasa, se eligen lascondiciones para que el ADN híbrido tenga la longitudadecuada para ser empaquetada dentro de la partículadel fago y 5. Empaquetamiento del ADN híbridoañadiendo extractos celulares que contengan laspartículas de la cabeza y cola para permitir la formaciónde partículas viables del fago. b. Cromosoma artificialde levadura (YAC). ARS: origen de replicación, CEN:centrómero, TEL: telómeros, URA. gen marcadorseleccionable par el desarrollo en medio con uracilo.Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomasartificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith etal., 2000).

a

C


C) Cósmidos:Son vectores híbridos, que combinan las

características ventajosas de los plásmidosbacterianos y del fago λ. Cos proviene desitio cohesivo («cohesive site»), en referen-cia a las secuencias terminales de simple ca-dena de 12 bases complementarias en elcromosoma de λ maduro. El sitio cos es re-conocido por el sistema de empaque-tamiento de ADN de λ, que hace cortes es-calonados que originan los extremoscohesivos complementarios en el cromosomamaduro del fago. Poseen la habilidad delplásmido para replicarse autónomamente enlas células de E. coli y la capacidad deempaquetamiento in vitro del cromosomade λ. Contienen el origen de replicación y losgenes de resistencia a los antibióticos de suplásmido parental. La principal ventaja de loscósmidos como vectores es su habilidad parainsertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb.

D) Fásmidos (fagémidos):Son vectores que combinan las caracte-

rísticas de un fago filamentoso (M13) y unplásmido (pBR323) y contienen tanto el ori-gen de replicación del fago como delplásmido. Normalmente la replicación depen-de del plásmido, pero cuando una célula quecontiene un fásmido se infecta con un fagode tipo silvestre, el origen del fago es respon-sable de la replicación y se generan copias

monocatenarias. Este ADN monocatenarioes empaquetado en viriones y puede aislar-se fácilmente y ser utilizado para secuenciar.Habitualmente, los fásmidos pueden trans-portar de forma estable un fragmento deADN clonado mayor que un vector típicoderivado de M13.

E) Cromosomas artificiales:Estos vectores se desarrollaron con el

objetivo de clonar grandes segmentos decromosomas eucarióticos. En la preparaciónde mapas físicos de genomas se utilizanvectores como los cósmidos, los YAC(cromosomas artificiales de levaduras), losBAC (cromosomas artificiales de bacterias) ylos PAC (cromosomas artificiales basados enel fago P1).

Los YAC son minicromosomas de leva-dura creados por ingeniería genética quepueden contener insertos de ADN de 200 a500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen dereplicación y un centrómero de levadura, dostelómeros en los extremos del cromosoma,un marcador seleccionable y un sitio múlti-ple de clonación.

Los BAC se basan en el plásmido F de7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BACy los PAC aceptan fragmentos menores quelos YAC tienen algunas ventajas:

Figura 5: Método de hibridación de Southern. a. Inclusión del ADN en el gel de agarosa. b. las moléculas de ADNmigran a través del gel dependiendo de su tamaño y forma, c. transferencia de las moléculas de ADN del gel a unamembrana por capilaridad (S. Solución tampón, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P:papel de filtro y peso), d. incorporación de la sonda e hibridación con las moléculas de ADN, f: detección porautorradiografía, contacto de la membrana con el filme autorradiográfico, g: revelado de la autorradiografía,observación de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).


1. Son menos complejos y por lo tantomás fáciles de construir. Pueden amplificarseen bacterias y manipularse con la tecnologíabásica de los plásmidos bacterianos.

2. Contienen menor cantidad de insertoshíbridos (insertos compuestos por dos o másfragmentos no contiguos en el genoma) quelos YAC. Estos insertos híbridos pueden en-torpecer los intentos de ordenar los clones

Por estos motivos los BAC han reempla-zado a los YAC como vectores en la construc-ción de mapas físicos de cromosomas ente-ros.

Estos vectores simplifican mucho el pro-ceso de secuenciación, ya que aún organis-mos simples como el nemátodoCaenorhabditis elegans poseen enormescantidades de ADN (100 Mb). En este casose necesitarían 2.500 cósmidos para conte-ner el genoma completo (el inserto prome-dio de un cósmido es de 40 kb). Los YACpueden aceptar 1Mb, por lo cual el procesose simplifica.

5 Análisis molecular de ADN, ARN yproteínas: hibridación.

La hibridación es la construcción artifi-cial de un ácido nucleico bicatenario porapareamiento (emparejamiento) de basescomplementarias de dos ácidos nucleicosmonocatenarios. Para que exista la formaciónde híbridos estables debe haber un alto gra-do de complementaridad. Se define formal-mente como sonda («probe») a un fragmen-to determinado de ARN o ADN marcadoquímica o radiactivamente, utilizado para lo-calizar determinadas secuencias de ácidosnucleicos mediante hibridación.

• Análisis de ADN por hibridacionesSouthern Blot

La electroforesis en gel es una podero-sa herramienta para separar macromoléculasde diferentes tamaños y cargas. Las molécu-las de ADN tienen esencialmente una cargaconstante por unidad de masa, por lo tan-to se pueden separar en geles de agarosa oacrilamida, casi completamente, sobre la basede su tamaño o conformación. Los geles deagarosa o acrilamida actúan como tamicesmoleculares, retardando el pasaje de lasmoléculas más grandes en relación con lasmás pequeñas. Los geles de agarosa actúan

como mejores tamices para las moléculas másgrandes, mientras que los de acrilamida se-paran mejor las moléculas pequeñas. Los pro-cedimientos utilizados, para separar ácidosnucleicos y proteínas tienen el mismo princi-pio, pero involucran algunas diferencias detécnicas debidas a las características particu-lares de cada clase de moléculas.

En 1975 E. M. Southern, publicó un nue-vo procedimiento que permitió a los investi-gadores ubicar los genes y otras secuenciasde ADN sobre fragmentos de restricciónseparados por electroforesis en gel. La prin-cipal característica de esta técnica es la trans-ferencia de las moléculas de ADN que hansido separadas por electroforesis en gel a unamembrana de nylon o nitrocelulosa. Estatransferencia se denomina Southern Blot, enhonor al científico que desarrolló la técnica(Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnatura-lizado (abierto en sus dos cadenas), sea an-tes o durante la transferencia, ubicando elgel en una solución alcalina. Una vez comple-tada la transferencia, el ADN es inmovilizadosobre la membrana por exposición a eleva-da temperatura o a radiación UV. Una son-da de ADN conteniendo la secuencia de in-terés es entonces incubada con el ADN in-movilizado. La sonda sólo va a hibridar conmoléculas de ADN que contienen la secuen-cia de nucleótidos complementaria a su se-cuencia. El excedente de sonda no hibridadase elimina mediante repetidos lavados de lamembrana. Las sondas pueden marcarse pordiferentes métodos: con elementos radio-activos, por métodos químicos que produ-cen color o luminiscencia, etc. Luego de lahibridación, la membrana se somete a dife-rentes procedimientos para poner en eviden-cia la sonda, de acuerdo al método con elque haya sido marcada.

• Análisis de ARN por transferencia ehibridación: Northern Blot

De manera similar al tratamiento realiza-do con las moléculas de ADN, las moléculasde ARN también pueden ser separadas porelectroforesis en geles de agarosa, transferi-das a membranas y analizadas. La transfe-rencia de ARN se denomina Northern blot,en reconocimiento al hecho de que el proce-dimiento es la imagen de espejo de la técni-ca Southern blot.

Ambos procedimientos son esencialmen-


Figura 6: Reacción en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva latemperatura de la reacción para separar las hebras de ADN (1) y a continuación la temperatura baja nuevamente, loque permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entoncesse ensamblan, actuando como límites de la región de la molécula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva latemperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nuevacomplementaria (4). Después de varios ciclos se obtienen múltiples copias del fragmento en cuestión. b) La PCR esuna reacción donde el número de copias del gen de interés crece exponencialmente. c) Verificación de un productode PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases(bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 falló la amplificación y en la calle 5 se hanformado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en más de un sitio en el genoma.


te idénticos. Sin embargo, las moléculas deARN son muy sensibles a la degradación porARNasas. Por lo tanto, se debe tener muchaprecaución para evitar la contaminación delos materiales con estas enzimas. Además, lamayoría de las moléculas de ARN contienenestructuras secundarias (producidas porapareamiento complementario intracade-nas), por lo tanto deben mantenerse des-naturalizadas durante la electroforesis parapoder separarlas sobre la base de su tama-ño. La desnaturalización se provoca incorpo-rando formaldehído u otro químicodesnaturalizante a la solución tampón («bu-ffer») utilizada en la electroforesis. Despuésde la transferencia a la membrana apropia-da, las moléculas de ARN pueden hibridar consondas de ADN o ARN.

• Análisis de proteínas por transferen-cia e inmunodetección o Western Blot

La electroforesis en gel de poliacrilamidaes una herramienta muy importante para laseparación y caracterización de proteínas.Debido a que muchas de las proteínas estáncompuestas por dos o más subunidades, lospolipéptidos individuales son separados porelectroforesis en presencia del detergentedodecil sulfato de sodio (SDS), que desna-turaliza las proteínas. Los polipéptidos sepa-rados por electroforesis también pueden sertransferidos del gel a una membrana de ni-trocelulosa y pueden ser detectados utilizan-do anticuerpos específicos. Esta transferen-cia de proteínas se denomina Westernblotting y se realiza utilizando una corrienteeléctrica para trasladar las proteínas del gel ala superficie de la membrana. Después de latransferencia, la proteína de interés es iden-tificada colocando la membrana con las pro-teínas inmovilizadas en una solución que con-tiene un anticuerpo contra esa proteína. Elanticuerpo está conjugado (marcado) ya seacon isótopos radioactivos, que permiten ladetección por autorradiografía, o conenzimas que producen un producto visiblecuando se adiciona el sustrato correspondien-te.

6 La reacción en cadena de la polimerasa(PCR)

La PCR es una tecnología poderosa queinvolucra la síntesis enzimática in vitro de

millones de copias de un segmento especí-fico de ADN. La reacción se basa en la hibri-dación y extensión de un par de oligonu-cleótidos, sintetizados artificialmente, utiliza-dos como iniciadores o cebadores (primers)que delimitan una secuencia de ADN de do-ble cadena que se desea amplificar.

Un ciclo de PCR comprende tres etapas(Fig. 6): desnaturalización de la doble ca-dena, unión de una secuencia de ADN (pri-mer) a la hebra simple y replicación delADN a partir del primer. La doble cadenade ADN se desnaturaliza por elevación de latemperatura a 92-95º°C. Luego la tempera-tura se baja rápidamente a 35-60ºC, depen-diendo del tamaño y secuencia del oligonu-cléotido utilizado, permitiendo la hibridaciónADN-ADN de cada primer con las secuenciascomplementarias que flanquean la regiónobjetivo. Luego, se eleva la temperatura a72º °C para que la Taq polimerasa (una ADNpolimerasa termoresistente aislada deThermus aquaticus, bacteria que vive enfuentes termales) realice la replicación a par-tir de cada extremo 3´ de los primers. Esteciclo es repetido por algunas decenas de ve-ces y, como el producto de cadapolimerización sirve como molde para el si-guiente, cada ciclo duplica la cantidad deproducto del anterior. El resultado de la re-acción es un fragmento de ADN de doblecadena, cuyos extremos corresponden a losextremos 5´ de los primers y su tamaño a ladistancia entre los mismos. A pesar de quese forman moléculas más largas a partir delmolde original en cada ciclo, se acumulan soloa una tasa lineal y no contribuyen signifi-cativamente a la masa final de secuencia blan-co.

Después de apenas 20 ciclos se logra másde un millón de veces la cantidad inicial dela secuencia de interés. Esta escala de ampli-ficación permite, por lo tanto, iniciar el pro-ceso con cantidades mínimas de ADN (delorden de pico o nanogramos) y terminar lareacción con grandes cantidades de una se-cuencia de interés. La versatilidad de estareacción es enorme y la combinación de laPCR y la secuenciación constituye una pode-rosa herramienta para el análisis de genes.

La tecnología de PCR es de suma utilidadpara amplificar ADN a partir de fragmentosclonados en distintos vectores. Solo se nece-


sita un par de iniciadores complementarios alos sitios del vector que flanquean el fragmen-to para amplificar cualquier fragmento inde-pendientemente de su secuencia. Puedeamplificarse ADN de material embebido enparafina por varios años, de material momi-ficado, de restos fósiles, etc. Se utiliza paradetectar enfermedades genéticas, determi-nar el sexo en embriones humanos, paraclonar genes, para mutagénesis in vitro y paramapeo y secuenciación de genomas, entreotras aplicaciones.

• RT-PCRLa reacción de PCR en unión con la trans-

cripción reversa (RT-PCR) puede ser utiliza-da para el estudio de ARNm casi a nivel deuna célula individual. Esta técnica puede utili-zarse para determinar la presencia o ausen-cia de un transcripto, para estimar el nivelde su expresión y para el clonado de ADNcsin la necesidad de construir una genoteca.Consiste en la síntesis de una cadena de ADNa partir de ARNm por medio de latranscriptasa reversa (enzima extraída devirus tumorales cuyo material genético esARN), que utiliza ARN como molde para sin-tetizar una hebra de ADN. La cadena com-plementaria se sintetiza por PCR .Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten te-ner cantidades apropiadas del ADNc paradiversas manipulaciones genéticas.

• PCR cuantitativaLa clave en la PCR cuantitativa es la posi-

bilidad de detectar el nivel de amplificaciónde una secuencia de interés, con el objetode estimar la cantidad de esa secuencia en lamuestra original. Para llevar a cabo esta de-tección existen varios métodos pero casi to-dos basados en la utilización de otro frag-mento de ADN (sonda) complementario auna parte intermedia del ADN que se quiereamplificar. Esta sonda lleva adherida unamolécula fluorescente y otra molécula queinhibe esta fluorescencia («quencher»), detal forma que sólo cuando la sonda es des-plazada de su sitio por acción de la ADNpolimerasa la molécula fluorescente se libe-ra de la acción del «quencher» y emite fluo-rescencia al ser iluminada con un láser. Lafluorescencia detectada durante cada ciclode la PCR será proporcional a la cantidadde ADN que se está amplificando. En gene-

ral para que sea válida esta técnica requiererealizar en paralelo una curva patrón en lasmismas condiciones para conocer la cantidadtotal de ADN que se está amplificando. Exis-ten varios tipos de PCR cuantitativa. La másmoderna y sofisticada es la llamada PCR entiempo real.

• PCR en tiempo realLa PCR en tiempo real es una técnica que

ha ganado mucha importancia en los últimosaños debido a que ofrece la posibilidad decuantificar el número de copias de untransgen incorporadas en un genoma.Como se explicara más arriba, se basa en ladetección de un informador fluorescentecuya señal aumenta en proporción directacon la cantidad de producto de PCR en lareacción. Se emplea un ciclador térmico quetiene acoplado un sistema de detección ca-paz de captar y cuantificar la señal emitidapor el informador al final de cada ciclo. Sepueden utilizar diferentes reactivosfluorescentes como agentes intercalantes(SYBR green®) que se unen a la doble cade-na de ADN dando un incremento de la fluo-rescencia a medida que aumenta la cantidaddel producto de PCR. También se puedenemplear sondas que tienen unidas unfotocromo informador y un fotocromo«quencher» (TaqMan®). Cuando ambosfotocromos están unidos a la sonda, el infor-mador no emite señal, pero cuando éstahibrida con la secuencia de interés, durantela reacción de PCR, la enzima Taq polimerasa,mediante su actividad de exonucleasa, clivaal fotocromo informador, liberándolo delresto de la sonda y permitiendo la emisiónde una señal fluorescente. Se monitorea estaseñal que se va acumulando en los sucesivosciclos de PCR. De este modo, es posible es-timar la cantidad de la secuencia originalexpresada en número de copias porgenoma o en unidad de masa.

En la Parte IX, Capítulo 4, se detalla máseste punto y se aplica esta técnica para ladetección de organismos genéticamentemodificados (OGM).

7 Genotecas

Una genoteca («gene library») es unacolección de fragmentos de ADN clonadosque representan en su conjunto el ADN to-


tal de un organismo de interés o bien elADNc, que representa el conjunto de genesque se están expresando en un órgano otejido determinado o bajo una situación par-ticular o momento de crecimiento o desarro-llo. En el primer caso hablamos de unagenoteca genómica, donde se encuentrantodas las secuencias que se expresan y no seexpresan en el organismo y en el segundode una genoteca de ADNc, donde se en-cuentran sólo las secuencias expresadas.

Estas genotecas carecen de un catálogoa través del cual se pueda saber cuál es el clonque contiene una secuencia de interés. Porello es necesario realizar un relevamiento detodas las colonias utilizando una sonda conla secuencia de ácido nucleico que tenga quesea complementaria a la secuencia o genbuscados. Parte de esta secuencia puede serconocida o puede deducirse de la secuenciade aminoácidos de la proteína purificada.Alternativamente, puede buscarse la proteí-na producida por un gen clonado usandoanticuerpos contra la proteína o a través deun análisis funcional.

Una de las principales dificultades en elclonado de ADN genómico es que algunassecuencias están representadas una sola vezen el genoma y es difícil hallarlas. Para obviaresta dificultad puede clonarse directamenteel ADNc, ya que el número de copias delARNm en el tejido es más elevado. El proble-ma se plantea cuando no se sabe en qué cir-cunstancias o en qué tejido se expresa un genen particular. Pero existen varias formas dedeterminarlo. Actualmente es posible clonarun ADNc a partir de mensajeros poco abun-dantes en la célula, con concentraciones de1 a 2 moléculas por célula.

• Genotecas de ADNcEl primer paso en la construcción de una

genoteca de ADNc consiste en el aislamien-to del ARN del cual es posible separar elARNm tomando ventaja de la característicacola de poliadeninas que posee en su extre-mo 3´. Para ello se empaqueta en una co-lumna de celulosa a la cual se unenoligonucleótidos compuestos sólo pordesoxitimina –oligo(dT)–, a través de la cualpasa el ARN quedando el mensajero unido ala timina a través de la cola de poliA. Este esluego eluido de la columna utilizando unasolución tampón adecuada.

Estas colas de poliA también son utiliza-das en el próximo paso de clonado. La reac-ción consiste en poner en contacto el ARNmaislado con oligo(dT) de 12 a 20desoxitiminas que actúan como cebadores oprimers para la transcriptasa reversa. El pro-ducto de la reacción es un híbrido ARN-ADN.El problema que tiene esta técnica es que siel ADNc es muy largo, al comenzar en el ex-tremo 3´, muchas veces no se llega al extre-mo 5´. Para salvar esta dificultad existe otratécnica donde se utilizan primers al azar. Es-tos constan de 6 a 10 nucleótidos de longi-tud y están confeccionados de manera derepresentar muchas secuencias diferentes,por lo que la reacción comienza a partir demuchos sitios diferentes, no sólo del extre-mo 3´. Por cualquiera de los dos métodos seobtiene un híbrido ARN-ADN, a partir del cualse obtienen moléculas de ADN de doble ca-dena que puede clonarse en el vector apro-piado.

El primer método desarrollado para ob-tener la segunda cadena tomaba ventaja deuna «vuelta» o «giro» que da la hebra reciénsintetizada, como un efecto de cambio derumbo de la transcriptasa reversa al llegar alfinal de la cadena de ARN. Este artefacto pro-vee un cebador adecuado para la síntesis dela segunda cadena de ADN y puede eliminar-se una vez obtenida la segunda cadena, conuna nucleasa S1, perdiéndose parte de lasecuencia correspondiente al extremo 5’ delmensajero.

Existe una segunda técnica, que presen-ta dos ventajas sobre la anterior. Una es quegenera moléculas de ADNc más largas y lasegunda es que contiene prácticamente todala secuencia correspondiente al extremo 5´.Se basa en la utilización de la enzima RNasaH,que reconoce moléculas híbridas ARN-ADN ydigiere la cadena de ARN dejando trozospequeños que permanecen unidos a la pri-mera cadena del ADNc y sirven como primerspara la ADN polimerasa I, que usa el ADNcoriginal como molde para sintetizar la hebracomplementaria de ADN. Sólo queda un pe-queño segmento de ARN en el extremo 5´.La segunda cadena de ADN tiene algunos sec-tores no unidos que son sellados por unaligasa de ADN.

Estas moléculas de ADNc de doble cade-na están listas ahora para ser insertadas en


un vector, que puede ser unplásmido o un derivado delfago l. Para ello se utiliza latransferasa terminal, queadiciona colas de poliA opoliT, o se agreganadaptadores, que son sitiosartificiales de reconoci-miento de alguna enzima derestricción que se unen a losextremos de la secuencia. Setrata de oligonucleótidos ar-tificiales (8-12 bp) que seunen al fragmento utilizan-do una ligasa de ADN y soncortados con la enzima derestricción apropiada (Fig. 7a). Ambos procedimientossirven para generar extremoscohesivos a fin de unir el frag-mento al vector, que poseeextremos cohesivos cortadospor la misma enzima.

Los plásmidos son intro-ducidos en bacterias portransformación (choque tér-mico o electrofusión), y se se-leccionan por la característi-ca del gen marcador delplásmido. Si se trata defagos, los vectores son em-paquetados in vitro paraformar partículas víricas, queintroducirán su ADN en elhospedador apropiado porinfección de un césped debacterias crecido sobre la su-perficie de una placa de agar(Fig. 7 a). Si bien los vectoresplasmídicos son más fácilesde manipular, las genotecasconstruidas en los fagos po-

Figura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadenasimple complementarias a los sitios de restricción del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con unaenzima de restricción, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNclos adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa,que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, a fin de protegerlo de la acción de la enzima. Losadaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADNdel fago, cortado con la misma enzima. Se genera así una serie de moléculas recombinantes dispuestas en tandem,flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partículas infecciosas del fago, quese utilizarán para infectar un césped de bacterias. Esto se visualizará como placas o calvas. Cada placa surge de unamolécula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construída la genoteca puedelocalizarse un gen en la misma por hibridación con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson etal., 1992).


seen fragmentos de mayor tamaño.Como resultado del cultivo en placa

(plaqueo) de la genoteca, se obtienen cien-tos de miles a un millón de placas de fagos(zonas claras o de lisis resultado de la pro-ducción de particulas víricas) o, en el caso devectores plasmídicos, colonias bacterianas,cada una conteniendo un fragmentoclonado, distribuidas sobre la placa de agar.A fin de realizar la búsqueda de un gen parti-cular («screening»), la genoteca es replicadaen membranas de nylon o nitrocelulosa, demanera tal que el patrón de placas en la cajaoriginal se vea exactamente reproducido enla membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B).

Búsqueda del gen clonado: Elección dela sonda

La búsqueda se lleva a cabo por hibrida-ción con una sonda de ácido nucleico, locual requiere un conocimiento previo de lasecuencia de interés. En algunos casos, don-de parte del gen ha sido clonado, este seutiliza para buscar las partes faltantes. Si seusa una sonda donde la homología es com-pleta, el «screening» puede realizarse en con-diciones de alta rigurosidad (es decir, conlavados más fuertes, temperatura elevada yconcentración salina baja, que tienden a des-pegar lo que se ha unido inespecíficamente).Si la sonda no es completamente homólogael «screening» deberá realizarse a menorestemperaturas y utilizando concentracionessalinas más elevadas en los lavados. Si no setiene conocimiento previo de la secuenciapuede construirse una sonda a partir de lasecuencia de aminoácidos de la proteína.Cuando se utiliza esta estrategia, el tamañomínimo de la sonda debe ser de 15 a 16nucleótidos (que permite encontrar secuen-cias únicas en genotecas de ADNceucarióticos. Generalmente se utilizan sondasde 17 a 20 nucleótidos (correspondientes a6 aminoácidos contiguos). Otra consideracióna tener en cuenta cuando se construye lasonda es que existe más de un codón otriplete para definir la mayoría de losaminoácidos (es lo que se conoce como la«degeneración» del código genético), por loque un aminoácido puede estar especifica-do por hasta 6 codones diferentes. Por ello,estas sondas oligonucleotídicas están consti-tuidas por una mezcla de todas las combi-naciones posibles. Una de ellas corresponde-

rá a la secuencia correcta del gen buscado. Elproblema de esta estrategia es el elevadonúmero de falsos positivos que pueden darlas secuencias adicionales. Una variante con-siste en usar un menor número deoligonucleótidos o uno solo pero de mayorlongitud (35-75 nucleótidos), eligiendo unaregión de la proteína que contenga el me-nor número posible de codones degenera-dos, utilizando el conocimiento de loscodones más probables para la especie enestudio.

Existen otras técnicas para localizar genesen las genotecas de ADNc, como hibridacióndiferencial, si se trata de genes expresadosen diferentes tejidos o la utilización de son-das de regiones conservadas en familias deproteínas para encontrar genes relacionadoso bien la utilización de vectores de expre-sión.

• Genotecas GenómicasUn genoteca genómica puede obtenerse

de cualquier tejido, ya que todas las célulasde un organismo tienen la misma constitu-ción genética. Como se mencionara previa-mente, se encuentran en ella no sólo secuen-cias expresadas y no expresadas sino tam-bién las correspondientes secuenciasregulatorias.

Pueden utilizarse fagos como vectores,pero sucede que muchos de los genomaseucariotas son muy grandes, por ejemplo elde mamíferos contiene 3x109 pb de ADN. Siel promedio típico de inserto es de 15.000pb, se necesitarán unos 200.000 fagos paracontener el genoma completo. Para asegu-rar que todas las secuencias estén represen-tadas al menos una vez, los cálculos estadís-ticos dicen que deberán analizarse aproxima-damente de 1 a 2 millones de fagos.

Muchos genes eucarióticos tienen más de1000 kb, por lo que deben ser clonados comoun conjunto de fragmentos parcialmentesuperpuestos. Para esto pueden utilizarsecósmidos, que pueden contener unas 45 kb.Para hacer una genoteca con estos vectoresel ADN se corta con enzimas de restricciónde manera de dejar fragmentos de tamañoapropiado. El cósmido se empaqueta in vitroen fagos que se usan para infectar E. coli .Una vez dentro de la célula el cósmido se re-plica y puede recuperarse de la célula comoun plásmido.


Cuando se trata de genomas muy gran-des, como es el caso del humano o de variasespecies vegetales y animales la utilización decósmidos resulta ineficiente. Por ello en es-tos casos se utilizan los YAC y BAC.

A) Genotecas genómicas en cromo-somas artificiales

La capacidad de clonar fragmentos demás de 100 kb es crucial para la genómicaestructural, funcional y comparativa de or-ganismos complejos. El primer sistema declonado de grandes fragmentos de ADN fue

informado en 1987 por Burke y colaborado-res. Este sistema estaba basado en YAC, quepermitían clonar y mantener fragmentos demás de 1000 kb en levaduras. Debido a estaventaja el sistema fue rápidamente adopta-do para los proyectos de genómica. Sin em-bargo, tienen algunos problemas que limitansu utilización, como el alto nivel dequimerismo o insertos híbridos (artefactoque resulta de la unión de fragmentos nocontiguos en el genoma original en un mis-mo clon), la inestabilidad de los insertos y la

dificultad de purificar losinsertos clonados.

Para minimizar estosproblemas se desarrollaronsistemas alternativos queutilizan bacterias en lugarde levaduras: los BAC y losPAC, que son vectores declonación de copia simple.Cuando se los utiliza paratransformar plantas se losllama BIBAC. BAC y PACpueden contener estable-mente fragmentos mayo-res de 300 kb en E. coli.

Para preparar unagenoteca genómica, el ADNse corta con enzimas derestricción o, para evitar lapresencia de fragmentosdemasiado largos o cortos,se fragmenta al azar. Unpaso crítico en el proceso esel aislamiento de moléculasintactas de ADN de eleva-do peso molecular, esen-cialmente ADN cromosómi-co. Para ello las células seembeben en bloques deagarosa de baja tempera-tura de gelificación y setratan con en-zimas y otros

Figura 8: Búsqueda de imágenes en una genoteca genómica. Utilización de la reacción en cadena de la polimerasapara buscar un gen específico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen ungenoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismofiltro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos.El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers específicos para el gen de interés. Comocontrol positivo se utiliza un ADN vegetal, también amplificado por PCR. La reacción se analiza sobre un gel deagarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genómico del vegetal y también en uno de losclones. En este caso en el conjunto que contenía los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales seencuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos darála posición exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de interés (Modificado de Watson et al.,1992).


reactivos para separar el ADN de las proteí-nas celulares y del RNA. La función del blo-que de agarosa es proteger a las grandesmoléculas, que, embebidas en esta matriz,se someten a la digestión con enzimas derestricción que realicen cortes poco fre-cuentes («rare cutters»). La preparación deADN de alta calidad en plantas es más com-plicada que la correspondiente para el casode animales debido a la presencia de la pa-red celular, que dificulta el embebido enagarosa de bajo punto de gelificación. Paraobviar esta dificultad se aíslan los núcleos yse trabaja con ellos directamente. Si se de-sea separar estos fragmentos porelectroforesis, los bloques de agarosa conte-niendo el DNA digerido pueden ser directa-mente embebidos en la matriz del gel quese correrá.

B) Separación de grandes trozos deADN: electroforesis de campo pulsátil

Las técnicas estándares de separación deADN en geles de agarosa no son adecuadaspara moléculas mayores de 10 kb. Esta limi-tación ha sido subsanada con una técnica lla-mada electroforesis de campo pulsátil, porla cual el campo eléctrico que conduce a lasgrandes moléculas de ADN a través del gelcambia periódicamente de orientación. Deesta manera pueden separarse moléculas tangrandes como los cromosomas de levaduras(200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separación delas moléculas de este tamaño depende desu relativa facilidad o dificultad para reorien-tarse en respuesta a direcciones cambiantesde un campo eléctrico. Esta técnica puedeutilizarse para hacer mapas físicos a gran es-cala.

C) Preparación de una genoteca de BACEl procedimiento consiste en 4 pasos,

preparación del vector, aislamiento y diges-tión del ADN y selección de los fragmen-tos por tamaño, transformación de las bac-terias y ensamblado de la genoteca

El vector debe estar bien purificado, di-gerido y defosforilado (cuando se corta conuna sola enzima, se eliminan los fosfatos ter-minales, para evitar la recircularización). Ladigestión del ADN es crítica para obtener frag-mentos adecuados para clonar. Los fragmen-tos son seleccionados por electroforesis decampo pulsátil y se separan de la matriz deagarosa por digestión de la misma con

agarasa o gelasa, o por elución del ADNdesde el gel. Esto permite construirgenotecas con fragmentos de tamaños simi-lares, de aproximadamente 150 kb.

Estas genotecas de grandes insertos sonconsideradas recursos de largo plazo para in-vestigación genómica y deben ser manteni-das continuamente, especialmente cuandoson utilizadas para proyectos de secuenciadoy mapeo a gran escala. En general, cuandose va a construir una genoteca debe elegirsecuidadosamente el genotipo de la especieutilizada como fuente de ADN, el tipo de in-serto, etc. ya que la misma puede utilizarsepara variados propósitos. Si en lugar de unagenoteca de BAC se hace una de BIBAC, setiene la ventaja adicional de poder usar di-rectamente los fragmentos para transformarplantas utilizando Agrobacteriumtumefaciens

En la Fig. 8 se esquematiza la búsquedade un gen en una genoteca de BAC. Másdetalles acerca del ensamblado de los distin-tos fragmentos clonados pueden encontrar-se en el capítulo correspondiente a genómica.

· Genotecas de cromosomas específi-cos o de segmentos de cromosomas

Cuando se busca un gen que se sabe estáubicado en un cromosoma específico simpli-fica mucho el trabajo hacer una genoteca deese cromosoma solamente. Se trata de unatécnica que permite separar cromosomasmetafásicos teñidos con un colorante fluo-rescente (Hoechst 33258) (para regiones ri-cas en AT) y cromomicina A (para regionesricas en GC) y tratados de manera que el ADNno se desnaturalice. Los cromosomas teñidosfluorescerán cuando se expongan a luz UV(de longitudes de onda de 361 y 363 nm)(Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A).Las cantidades y proporciones de colorantesvarían para cada cromosoma y una compu-tadora reconoce el patrón fluorescente típi-co de cada cromosoma. Algunoscromosomas son muy similares, por lo queno pueden ser separados. Se necesita unmillón de cromosomas para hacer unagenoteca. Equipos automáticos pueden ha-cer este trabajo en unas pocas horas.

También puede microdisectarse uncromosoma, tomando un segmento del mis-mo que tenga la región de interés. En princi-pio se utilizó esta técnica para cromosomas


grandes, fácilmente distinguibles pormicroscopía de contraste de fase. Actual-mente, la combinación con PCR posibilita laaplicación de la técnica a cualquiercromosoma. Estos son teñidos con Giemsa-tripsina y las bandas deseadas son cortadascon agujas de vidrio ultrafinas y clonadas.Primers posicionados en el vector permitenamplificar secuencias desconocidas. El ADNamplificado se clona en un vector apropiadoy la localización cromosó-mica de cada clonse determina utilizando hibridación in situ(ver III.5)

8 Secuenciación

Una vez que se ha obtenido el clon conel fragmento de interés, el paso siguiente essecuenciarlo. La determinación de la secuen-cia puede realizarse por el método químicode Maxam y Gilbert o por el métodoenzimático de Sanger. El primero consisteen la utilización de un compuesto que des-truye selectivamente una o dos de las 4bases que constituyen el ADN. Se realizan4 reacciones de síntesis de ADN, marcandoun extremo de las moléculas, dependiendode la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De estaforma, se generan fragmentos de distintotamaño en función de la distancia de la basedestruida al extremo marcado radiactiva-mente del fragmento a secuenciar. Los pro-ductos de las 4 reacciones se corren lado alado en un gel de poliacrilamida y la secuen-cia del fragmento se determina a través delpatrón de bandas, después de efectuada unaautorradiografía para revelarlas.

El método de Sanger, se basa en el mis-mo principio y consiste en preparar 2´,3´-didesoxinucleótidos (ddNTP) de cada unade las 4 bases. Estas moléculas pueden serincorporadas al ADN por el ADN polimerasade E.coli porque tienen un 5´trifosfato nor-mal, pero no pueden formar un enlacefosfodiéster con el nucleótido siguiente,por lo que el crecimiento de la cadena sedetiene. En la mezcla de la reacción se inclu-ye la cadena a secuenciar, una proporcióncontrolada de uno de los 4 ddNTP con sudesoxinucleótido normal y los otros 3 dNTP.Cuando se agrega polimerasa la reaccióncomienza a partir del primero hasta que seintroduce en la cadena un ddNTP, con lo

cual su crecimiento cesa. Con una propor-ción correcta ddNTP:dNTP, se generan unaserie de fragmentos de distinta longitud,dependiendo de la distancia de la última baseincorporada al extremo marcado del ADN.Estos fragmentos son separados en un gelde poliacrilamida, donde, previa autorradio-grafía, se determina el patrón de bandas, querefleja la secuencia del ADN. Al principio, laposición de cada banda revelada en la pelí-cula radiográfica se anotaba manualmente,luego, los digitalizadores de imágenes posi-bilitaron la lectura directa de la película. Exis-ten actualmente secuenciadores automáti-cos que realizan la electroforesis en gel y de-terminan automá-ticamente la secuencia uti-lizando un sistema de detección con láser.

Messing desarrolló una serie de vectoresde clonado basados en el fago filamentosoM13, muy útiles para el secuenciadoenzimático. La ventaja es que sólo una delas cadenas del vector es empaquetada enlas cabezas del fago (ver Vectores declonación). Este ADN de simple cadena esideal para utilizar con el método de Sanger.Clonando el inserto en M13, en las dosorientaciones posibles, se obtiene una o laotra hebra del ADN a secuenciar. Para ello seutiliza un primer que se posiciona en un lu-gar adyacente a la región de policlonado deM13, que se llama «primer universal», ya quese puede utilizar para secuenciar cualquierclon recombinante.

Actualmente se utilizan fásmidos (verVectores de clonación). La adición de un«fago ayudante» («helper phage») a las cé-lulas que lo contienen, hace que el ADN delmismo, de simple cadena, sea replicado,empaquetado y extraído de la célula. Al serde menor tamaño (aprox. 3000 bp) que M13permite la inserción de fragmentos de ADNmás largos.

Los proyectos de secuenciacióngenómica han requerido métodos desecuenciado más veloces y económicos. Paraello se ha desarrollado una técnica llamadaMultiplex, que permite manejar mayor can-tidad de muestras en menor tiempo. Se utili-zan 20 vectores plasmídicos que permitenconstruir 20 genotecas diferentes a partir delmismo ADN. Cada vector lleva dos secuen-cias únicas que flanquean al sitio declonado, que pueden ser usadas como eti-


quetas («tags») para el ADN clonado y esta-rán presentes sobre cada fragmento a sersecuenciado. Se toma un clon de cada unade las genotecas plaqueadas (20 colonias) yse mezclan. Se hace crecer el cultivo, se aíslael ADN y se secuencian los plásmidos utilizan-do el método Maxam y Gilbert. Los produc-tos de 12 conjuntos de reacciones desecuenciación se corren en un gel y se trans-fieren a una membrana de nylon. El filtro sehibrida secuencialmente (es decir, se despe-ga una sonda para luego hibridar con las si-guiente y así sucesivamente), utilizando comosonda la etiqueta de cada uno de los 20vectores. En cada caso se van leyendo lassecuencias correspondientes a cada uno delos distintos vectores. De esta manera, unasola reacción produce datos de 20 clones ala vez.

Actualmente existen equipos robotiza-dos que pueden llevar a cabo dos de las re-acciones más limitantes en el proceso desecuenciado: la detección de las bandas deADN y la traducción de un patrón de ban-das en uno de secuencia. Estos equipos uti-lizan nucleótidos marcados con fluorocromos.Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al serexitados por láser emiten luz de diferentelongitud de onda. Los colorantes puedenutilizarse para marcar el primer universal desecuenciación de M13 o cada uno de los 4terminadores de cadena didesoxi. En estecaso, cada mezcla de reacción con unterminador diferente se marca con un co-lorante diferente. Cuando la reacción es com-pletada, los productos de las 4 reacciones semezclan y se corren en una sola calle de ungel, en un secuenciador automático. A medi-da que los fragmentos pasan a través del lá-

ser, sus marcas fluorescentes se excitan yemiten luz que se detecta mediante unfotomultiplicador. Después de ser procesadapor una computadora, la secuencia es mos-trada como una serie de picos o cromatogra-ma, donde cada uno de los 4 colores repre-senta a un nucleótido diferente (rojo:timina, verde: adenina, negro: guanina yazul: citosina).

9 Lecturas Recomendadas

FÜTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.;MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL,G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.;WANG, Z.Y. 1995. Standard Molecular Techniques forthe Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer toPlants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer LabManual.

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