Identificación de la Inmunoglobulina G en suero bovino y humano purificado mediante Cromatografía de Afinidad, ensayo de ácido bicinconínico (BCA) para su cuantificación y electroforesis SDS-PAGE para su caracterización final.

Ketsia Y. González Vázquez

Resumen:

Las inmunoglobulinas o anticuerpos se encargan de reconocer un antígeno y de

enviar señales al interior de la célula B para inducir una respuesta inmunológica efectiva

contra el mismo. Se utilizaron diferentes técnicas para lograr la identificación de nuestra

proteína de interés, inmunoglobulina G en suero humano. La primera técnica utilizada fue

cromatografía de afinidad, su propósito, obtener la IgG purificada; para lograr esto se

hicieron tres lavados con amortiguador de unión en los que se indujo la unión de la

proteína A y la IgG. Posteriormente estas uniones fueron rotas utilizando un amortiguador

de elución en tres eluciones diferentes para así obtener la IgG purificada. Se utilizó un

ensayo de BCA para cuantificar la IgG y mediante la realización de una curva estándar de

concentración conocida de una proteína estándar, en este caso albúmina de suero bovino

(BSA), se corrigieron los valores obtenidos de las absorbancias de las muestras de IgG

con concentración desconocida. Por último, mediante la electroforesis de poliacrilamida se

determinó la presencia de la proteína de interés en las muestras y de esta forma también

se comprueba la eficacia de las técnicas utilizadas anteriormente. Durante la identificación

de la proteína de interés se logró purificar la misma, así como conocer la concentración de

esta en la muestra y comprobar su pureza mediante la electroforesis de poliacrilamida

donde se presentaron bandas de las cadenas pesadas y livianas de la inmunoglobulina G.

Este tipo de pruebas son de mucha ayuda en el campo clínico, ya que ayudan a identificar

algunas enfermedades como el virus de inmunodeficiencia humana.

Introducción:

La respuesta inmunológica humoral es la encargada de proteger al organismo de

numerosos patógenos. Los linfocitos B son las células que poseen un rol indispensable en

esta rama de la respuesta inmunológica adaptativa, ya que pueden reconocer una gran

cantidad de antígenos, incluyendo aquellos que son solubles, por medio de moléculas

especializadas llamadas anticuerpos o inmunoglobulinas presentes en su superficie. La

inmunoglobulina inicialmente se encuentra anclada en la membrana celular donde forma

parte del receptor para antígeno de los linfocitos B, el cual se encarga de reconocer el

antígeno y de enviar las señales al interior de la célula B para inducir una respuesta

inmunológica efectiva8.

Biológicamente, las inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas que son producidas

por los linfocitos B o sus células derivadas, las células plasmáticas, y que poseen la

capacidad de reconocer y unirse específicamente al antígeno que indujo su formación. Su

función es inactivar o destruir antígenos en el organismo9. Existen cinco tipos de

inmunoglobulina, en las que se encuentran la IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Para nuestro

propósito nos estaremos concentrando exclusivamente en la Inmunoglobulina G, esta es

la más pequeña y la que más abunda en el fluido corporal, además es la única capaz de

atravesar la placenta y brindarle inmunidad al bebé. La purificación, cuantificación y

electroforesis son procesos esenciales para el estudio de una proteína, por lo tanto fueron

empleados para lograr la identificación de la IgG.

Debido a su estructura, las inmunoglobulinas pueden ser fraccionadas y purificadas

por diferentes métodos, entre los que se encuentra la cromatografía de afinidad. Este

proceso consta de una fase móvil y la fase estacionaria. La sustancia de interés quedará

enlazada a la fase estacionaria y es mediante este enlace que ocurre la separación y los

demás componentes de la muestra migrarán con la fase móvil. La fase estacionaria

utilizada fue un gel de agarosa con la Proteína A y la fase móvil el suero humano que

contenía la IgG.

Existen varias proteínas bacterianas (proteína A, proteína G, proteína L) que tienen

la capacidad de enlazar anticuerpos con mucha eficiencia. Para el estudio que se llevó a

cabo en el laboratorio, se utilizó proteína A que se encuentra en la pared celular de

algunas cepas de la bacteria Staphylococcus aureus10, con el fin de separar de

inmunoglobulina G de una muestra de suero bovino.

En cuanto a la cuantificación de una proteína se refiere a la cantidad y/o

concentración de proteína presente en una muestra, existen diferentes técnicas para

llevar a cabo este proceso1. En este caso se utilizó el ensayo de ácido bincinconínico

(BCA), el reactivo presente en este ensayo forma un complejo ternario en medio alcalino

al unirse al cobre reducido Cu+1, además, posee una elevada sensibilidad y selectividad

en la detección colorimétrica, es así la quelación de un ion cobre por dos moléculas de

BCA3. Al ocurrir esta reacción obtenemos un producto de color violeta con absorbancia a

562nm. La intensidad de este color es esencial para nuestro propósito ya que la

concentración de proteína y la absorbancia que presente la muestra tienen una relación

lineal, por lo tanto, mientras más intenso sea el color, mayor concentración de proteína en

la muestra y viceversa. El BCA tiene como ventaja que puede detectar pocas

concentraciones de la muestra y, además, presenta alteraciones en los resultados debido

a sustancias encontradas usualmente en la preparación de proteínas1. Se preparó una

curva estándar de una proteína conocida, en este caso albúmina de suero bovino (BSA),

con concentración conocida para así poder comparar los resultados obtenidos en el BCA

y determinar la concentración de IgG.

La electroforesis es una técnica que permite la separación de moléculas según la

movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, que finalmente

las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se

utilize7. En este caso, se utilizó la técnica de SDS-PAGE en la cual se mezclan las

proteínas con el detergente aniónico dodecil sulfato de sodio (SDS) en un gel de

poliacrilamida, para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La

electroforesis es utilizada para determinar el peso molecular de una proteína. La

determinación del peso molecular de las proteínas mediante SDS-PAGE es válida cuando

se analizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido

todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para su

interacción con el SDS6.

Para reducir la proteína se utilizó β-mercaptoetanol como agente reductor. Este

causa que los enlaces disulfuro intra- e inter-catenarios son disociados, la estructura

cuaternaria se pierde y las subunidades se separan como cadenas peptídicas

individuales6. Por lo tanto, vamos a tener la cadena pesada y la cadena liviana de la

inmunoglobulina separadas. La cadena pesada tiene un peso molecular de 50KDa,

mientras la cadena liviana tiene un peso de 25KDa, esto resulta en un peso total de

150KDa para la inmunoglobulina sin reducir. En este laboratorio, se analizaron las

muestras de las dos maneras: reducidas y sin reducir.

La integración de las tres técnicas utilizadas tenía como fin varios objetivos. En

purificación por cromatografía de columna se pretendía describir las características

estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas, así como técnicas de cromatografía y

aislar IgG de una muestra de suero por cromatografía de afinidad. En cuantificación, se

buscó describir diversos ensayos de cuantificación de proteínas, comparar y contrastar

ventajas y desventajas de éstos y se determinó la concentración de inmunoglobulina G

purificada de una muestra de suero humano utilizando un ensayo colorimétrico. Mientras

que en el laboratorio de electroforesis se pretendió describir los fundamentos de la técnica

de electroforesis de proteínas, algunos usos de la electroforesis de proteínas y finalmente

se utilizó la electroforesis de proteínas en poliacrilamida para separar algunos

componentes de las fracciones obtenidas por cromatografía de afinidad.

Materiales y Métodos:

I. Purificación de inmunoglobulina G de suero por cromatografía de afinidad.

A.Preparación de la proteína A en agarosa

Se nos entregó 200 µL de agarosa la cual contenía proteína A contenidos en un

microtubo de 1.5 mL. La misma estaba equilibrada en amortiguador de unión: 10 mM Tris,

pH 7.5. Se centrifugó a 3000 RPM por un minuto y luego se descartó el sobrenadante.

B.Preparación de la muestra

Se desinfectó la yema del dedo con alcohol. Luego, se pinchó el dedo en el área

desinfectada con una lanceta estéril. Se colocó varias gotas de sangre (aprox. 600µL) en

un microtubo. Después, se centrifugó por 5 min a 10000 RPM. Se removió

cuidadosamente el sobrenadante y se mezcló con un volumen igual de amortiguador de

unión, 10 mM Tris, pH 7.5, para ajustar la concentración iónica y el pH, para facilitar el

enlace entre IgG y la proteína A.

C.Unión de la IgG a la proteína A

La muestra diluida de suero fue añadida a la agarosa equilibrada en amortiguador

de unión. Se agitó la muestra para mezclar bien. Luego, se incubó esta mezcla por 15 min

a temperatura ambiente agitandose regularmente para evitar el asentamiento de la

agarosa. Posterior a la incubación, se centrifugó la muestra durante 5 min a 3000 RPM. El

sobrenadante fue removido y guardado en un microtubo previamente rotulando como FT

o “flow through”, este corresponde a lo que no se enlazó a la proteína A.

D.Lavado

Se añadió 1.5 mL de amortiguador de unión a la agarosa y se agitó el microtubo

para remover el material retenido de forma no específica en la gel. Luego, se centrifugó la

muestra durante 5 min a 3000 RPM. El sobrenadante fue removido cuidadosamente y

almacenado en un microtubo rotulado como L1, que corresponde al primer lavado. Se

repitieron 3 veces estos pasos del lavado teniendo un total de cuatro lavados, rotulados

L1, L2, L3 y L4, respectivamente.

E.Elución de la IgG de la proteína A

Para desprender la IgG de la proteína A se añadió a la agarosa 350µL de

amortiguador de elución y 100 mM glicina pH 3.0. Luego, se incubó la muestra agitándola

por 2 min. y se centrifugó otros 2 min. a 3000 RPM. El sobrenadante fue removido y

almacenado en un microtubo rotulado E1 el cual contenía 30µL de 1.0 mM Tris, pH 8.8,

esto corresponde a la elución. Este paso fue repetido 2 veces más obteniendo un total de

tres eluciones, rotulados E1, E2 y E3, respectivamente. La muestra de Ig fue recogida en

presencia del amortiguador de Tris para subir el pH de la muestra a nivel fisiológico ya

que el pH ácido de la elución pudo haber desnaturalizado el anticuerpo.

F.Regeneración de la proteína A en agarosa

Para preservar la proteína A después de la elución a pH ácido, se lavó la agarosa

con solución salina amortiguada con fosfato (PBS: Phosphate-Buffered Saline). Se

añadió 1 ml de 1X PBS a la agarosa y se mezcló bien agitando el microtubo. Luego, fue

centrifugado por 2 minutos a 3000 RPM y el sobrenadante fue descartado. Estos pasos

fueron repetidos tres veces para obtener tres lavados de regeneración. Luego de haber

regenerado la proteína A en 1 X PBS, la misma fue entregada a la instructora del

laboratorio.

II. Cuantificación de Inmunoglobulina G de suero

En primer lugar, se tomó una placa de micro ensayo. Luego, se le echó a las fosas

A, B y C desde la columna 1 a la 8, 10μL de la curva estándar más 200μL de reactivo de

trabajo. Con esto se calculó la curva estándar lo que nos ayudó a calcular luego la

concentración del desconocido.

Posteriormente, se añadió 210μl de amortiguador de unión a las fosas designadas

como blanco. A las elegidas para control se le echó 10μL de amortiguador de unión (10

mM Tris, pH 7.5) más 200μL de reactivo de trabajo. Después, se le adicionó 10μL de

cada una de las muestras de las fracciones de la cromatografía más 200μL de reactivo de

trabajo a las fosas designadas para los desconocidos. Cada una de las muestras se

preparó en triplicado.

Luego que se le añadió cada muestra a cada una de las fosas se cubrió la placa

con parafina y se dejó incubar por 30 minutos a 37°C. Una vez pasado este tiempo se le

quitó la parafina y se leyó la absorbancia a 560nm en un “microplate reader”.

III. Electroforesis

El gel de poliacrilamida que se utilizó fue preparado entre dos placas de vidrio. La

electroforesis se corrió verticalmente en presencia de 0.1% SDS, en un sistema de gel

discontinuo, donde el gel de corrida está entre una cámara superior y otra inferior, sin

contacto directo entre sí (Método de Laemmli). El gel de poliacrilamida fue preparado

anteriormente por la técnica de laboratorio y el aparato de electroforesis tenía el

ensamblaje pertinente.

Preparación de las muestras

Para esta parte fueron preparadas las fracciones de la cromatografía de afinidad, la

muestra del lavado de L1 y las tres muestras de lavado E1, E2 y E3, además un control

(FT). El marcador fue provisto por la instructora. El volumen total de cada muestra,

excepto para FT, fue de 30µL, en los cuales se añadió 5µl de amortiguador de muestra y

el volumen del inoculo el cual fue de 25 µL. Para FT se utilizó el volumen calculado de

3µL, se le añadió 5µL de amortiguador de muestra y se completó los 30µl con

amortiguador de corrida.

Para desnaturalizar las proteínas se hirvieron las muestras a 97°C durante 5

minutos, excepto el control. Las muestras de elución fueron preparadas tanto en

condiciones reductoras como en condiciones no reductoras. Con una pipeta se colocaron

las muestras en las fosas del gel. En el primer carril del gel se echaron 7µL del marcador

de peso molecular. En la fosa número cuatro que corresponde al vacío se coloco 30µL de

amortiguador de corrida. Las muestras y marcador fueron colocadas en las fosas como

ilustra la Figura 1.

Figura 1: Orden de las muestras para la corrida de electroforesis

1.Marcador, 2. Control (FT), 3. L1, 4. Vacío, 5. E1 reducido, 6. E1 sin reducir, 7. E2 reducido, 8. E2 sin reducir, 9. E3 reducido, 10. E3 sin reducir

Corrida de electroforesis y tinción del gel

Cuando todas las muestras estuvieron colocadas en las fosas, se prosiguió a

ensamblar el equipo. Se selló la cámara de electroforesis y se colocó los cables en los

electrodos correspondientes. Luego, se conectó la cámara sellada a la fuente de poder y

se le aplicó un pequeño voltaje a la caja de electroforesis. Posteriormente, se aplicó un

voltaje de 120-150V a la cámara de electroforesis hasta que el tinte en el amortiguador de

muestra llegó a la parte inferior del gel.

Subsiguientemente, una vez terminada la corrida, el voltaje fue reducido a cero y

se apagó la fuente de voltaje. Luego, se procedió a desconectar la cámara de

electroforesis. Después, se removieron las placas de vidrio y se removió el gel de estas.

Finalmente, se tiñó con solución teñidora (10% ácido acético, 50% etanol, 40% agua y

0.05% tinte Coomassie blue) por una hora, luego fue desteñido hasta que fueron vistas

las bandas de proteínas.

Resultados:

I. Purificación de inmunoglobulina

En esta parte se obtuvo la proteína purificada por medio de la cromatografía de

afinidad. En los sobrenadantes de los lavados se removió todo lo que no se quedo

enlazado a la proteína. En las eluciones se consiguió la inmunoglobulina purificada.

II. Cuantificación de IgG de suero utilizando ensayo de BCA

Con las absorbancias obtenidas se calculó la absorbancia promedio de las réplicas

de cada muestra y la absorbancia corregida (Tabla 1). Esta última se determinó

restándole la absorbancia promedio del control a la absorbancia promedio de cada una de

las muestras. Por ejemplo, para la absorbancia promedio: Abs562 promedio = (abs #1 +

abs #2 + abs #3)/3 = Abs562 promedio control = (0.097 + 0.096 + 0.097)/3= 0.097nm; para

absorbancia corregida: A562 corregida = A562 promedio - A562 promedio del control = A562

corregida L1= 3.975 – 0.097 = 3.879nm. Los cálculos realizados para obtener los datos

mostrados en la Tabla 1 se encuentran adjuntos en el Apéndice.

Tabla 1: Promedio de absorbancia (Abs) y absorbancia corregida a 562 nm por ensayo de

BCA.

Muestra A 562 #1 A 562 #2 A 562 #3 A 562 promedio A 562 corregidacontrol 0.097 0.096 0.097 0.097 N/A

200 0.161 0.211 0.172 0.181 0.085400 0.163 0.158 0.138 0.153 0.056600 0.231 0.174 0.160 0.188 0.092800 0.204 0.203 0.181 0.196 0.099

1000 0.286 0.304 0.309 0.300 0.2031200 0.388 0.277 0.245 0.303 0.2071400 0.327 0.473 0.419 0.406 0.3101600 0.719 0.645 0.733 0.699 0.6021800 0.809 0.848 0.760 0.806 0.709FT 2.540 2.169 2.786 2.498 2.402L1 3.930 3.962 4.034 3.975 3.879L2 0.472 0.489 0.520 0.494 0.397L3 0.248 0.230 0.255 0.244 0.148L4 0.141 0.152 0.197 0.163 0.067E1 0.541 0.518 0.313 0.457 0.361E2 0.915 0.312 0.913 0.713 0.617E3 0.178 0.240 0.227 0.215 0.118

FT: “Flow Through”, L: Lavado, E: Elución

Se procedió a construir una gráfica titulada Curva Estándar de BSA que comprende

de la absorbancia corregida versus la concentración del estándar (Figura 1). La ecuación

generada por la curva de la Figura 1, y = 0.0004x - 0.1274, se utilizó para determinar las

concentraciones de las muestras desconocidas. La ecuación en la forma y = mx + b, es la

ecuación de una línea recta; donde ‘y’ es la absorbancia de la muestra desconocida, m =

0.0004 la pendiente de la línea recta, ‘x’ es la concentración (μg/μL) de la proteína

desconocida y b= -0.1274 el intercepto en y.

Figura 1. Curva Estándar de BSA (albúmina de suero bovino). Se preparó la gráfica para

determinar las concentraciones desconocidas de la inmunoglobulina G. La ecuación generada es

y = 0.0004x - 0.1274, donde y es la absorbancia corregida y x la concentración de proteína en la

muestra.

Si despejamos para x la ecuación generada por la curva, tenemos: x = (y – b) / m.

Utilizando la ecuación despejada y sustituyendo los valores de y, b y m correspondientes

para cada muestra (b y m son contantes dadas por la ecuación generada por la gráfica)

se determina la concentración de inmunoglobulina G (IgG) en cada muestra. Al obtener la

concentración se puede buscar el volumen inicial (V1) requerido para electroforesis en gel

de poliacrilamida (SDS-PAGE). Este volumen se determina usando la formula de dilución

C1V1= C2V2, donde C1 es la concentración de la proteína que se obtuvo al despejar la

fórmula de la recta, C2 es 0.5 μg/μl y el volumen final (V2) es 30 μl el cual es

aproximadamente el volumen máximo de muestra que se puede añadir a una fosa del gel

de poliacrilamida. Los resultados para cada muestra se muestran en la Tabla 2. Los

cálculos realizados para obtener la concentración de proteína en cada una de las

muestras y el volumen inicial se encuentran adjuntos en el Apéndice.

Tabla 2: Absorbancia corregida, concentración de proteína en la muestra y volumen inicial

requerido para cada muestra en SDS- PAGE.

Muestra A562 corregida [Proteina] μg/μL Volumen inicial (μL)

FT 2.402 6.323 2.37

L1 3.879 10.015 1.50

L2 0.397 1.311 11.44

L3 0.148 0.688 21.81

L4 0.067 0.485 30.92

E1 0.361 1.220 12.29

E2 0.617 1.860 8.06

E3 0.118 0.614 24.42

III.Electroforesis SDS-PAGE

En los resultados obtenidos de la electroforesis SDS-PAGE (Figura 2) se puede

observar la presencia del marcador de peso molecular utilizado.

· Se observó una banda en las fosas 5,7 y 9 las cuales corresponden al peso

del anticuerpo completo (cadena pesada más cadena liviana)

· En el carril 4 estaba vacío.

· En el carril 3 se observaron 4 bandas.

· Se observó dos bandas en el 6,8 y 10. Estas corresponden a la cadena

pesada, la cual pesa 50KDa, y la cadena liviana que pesa 25KDa.

Figura 2: Electroforesis SDS- PAGE. Para separar la IgG se utilizó β-mercaptoetanol que el cual

rompe los puentes de azufre presentes en la IgG, generando dos bandas una de 50KDa y una de

25 KDa. En la fosa 6,8 y 10 se observa una sola banda, mientras que las fosas 5, 7 y 9 presentan

dos bandas. E1r significa la elución 1 reducida, igual para E2r y E3r. E1sr significa elución 1 sin

reducir, lo mismo para E2sr y E3sr.

Carriles: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Discusión y Conclusión:

Los resultados obtenidos en este trabajo nos indican que la purificación de la IgG

fue exitosa porque se logró cuantificar la misma. Esto nos indica que la técnica de

cromatografía de afinidad demostró ser un método efectivo para la purificación de una

proteína, en este caso IgG, en suero humano.

En la parte de Cuantificación de Proteína nuestros resultados indican la

concentración de inmunoglobulina G purificada de una muestra de suero utilizando un

ensayo colorimétrico. La relación entre absorbancia y concentración de proteína es una

lineal. Para nuestros resultados, la curva estándar de BSA fue bien precisa, ya que

obtuvimos una regresión lineal (R2) cercana a 1. Aunque la curva estándar es precisa, no

se obtuvieron los resultados esperados, ya que las concentraciones y

volúmenes .................................................................. Esto pudo deberse a que la proteína

no había sido regenerada la última vez que se utilizó. Sin embargo tampoco que se puede

descartar posibles errores experimentales, ya sean errores en algunos pasos o que el

“microplate reader” no estuviera bien calibrado, entre otros.

A pesar de los errores el ensayo BCA demostró ser un método de cuantificación de

proteínas esencialmente sencillo y rápido, pero es su sensibilidad y tolerancia a muchas

sustancias encontradas comúnmente en las preparaciones de proteínas lo que lo hace

único, ya que en otros tipos de pruebas de cuantificación están presentes grandes

interferencias las cuales hacen menos precisos los resultados.

Este ensayo, además de lograr sus objetivos, comprobó su gran importancia tanto

para futuras investigaciones como también para el área clínica, ya que existen un

sinnúmero de condiciones relacionadas a desniveles de inmunoglobulinas en la sangre

que requieren del conocimiento temprano de concentraciones de inmunoglobulinas en la

sangre12. Un gran ejemplo es la leucemia, en la cual los niveles de IgG sobrepasan el

rango normal de 560 a 1800 mg/dl de IgG en la sangre y este ensayo les provee una

valiosa herramienta para su detección y control11.

Finalmente, para la electroforesis de poliacrilamida con SDS, según las bandas

observadas y el peso relativo de las mismas en los carriles 6, 8 y 10 se obtuvo la proteína

pura bajo condiciones no reductoras ya que se encontró una sola banda de

aproximadamente 150KDa. Esto es así debido a que las proteínas no se dividen porque

no fueron reducidas, sino que mantienen las cadenas pesadas y las cadenas livianas

unidas. El peso aproximado de la cadena pesada es de aproximadamente 50KDa cada

una mientras que la cadena liviana es de 25KDa aproximadamente1. Por lo tanto, la suma

de las dos cadenas pesadas y las dos cadenas livianas que componen la inmunoglobulina

tendrán un total de 150KDa aproximadamente.

Por otro lado, las proteínas en condiciones reductoras, reducen los puentes de

disulfuro que tengan las proteínas de la muestra entre cada una de las cadenas11 y se

reflejan en la electroforesis como dos bandas, una de las cadenas pesadas y otra de las

cadenas livianas. Por esta razón los carriles 5, 7 y 9 presentaron dos bandas. La banda

en el carril 5 correspondiente a la cadena liviana, no se presentó claramente en ninguno

de los resultados, eso pudo haber sido debido a la cantidad o a alguna sustancia que

interfiriera en la reacción.

Sin embargo, se puede concluir que los lavados (rotulados como L) no mostraron

unión de la proteína ya que la concentración era menos en cada lavado, mientras que las

eluciones sí. Esto sustenta los objetivos ya que en los lavados se incluye todo el material

que no se adhirió a la gel excepto la proteína, mientras que las eluciones son el lavado

luego de que la IgG queda separada de la proteína A.

En este laboratorio se logró aislar IgG de una muestra de suero humano utilizando

cromatografía de afinidad. Además se determinó la concentración de inmunoglobulina

utilizando un ensayo colorimétrico, BCA. Por último, se utilizó la electroforesis de

proteínas en poliacrilamida separar componentes de las fracciones obtenidas por

cromatografía de afinidad. Estas técnicas se utilizan a menudo para identificar

enfermedades, como por ejemplo electroforesis la cual se utiliza a menudo en el ámbito

clínico y se considera la prueba definitiva para determinar si un paciente ha sido infectado

por el virus de inmunodeficiencia humana1.

Referencias

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afinidad de el Laboratorio de Inmunología, Universidad de Puerto Rico RUM.

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12Tscheliessnig A., A. Jungbauer. 2008. High-performance monolith affinity chromatography for

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Apéndice:

Cálculos realizados para obtener los datos en la Tabla 1 y Tabla 2.

Muestra Absorbancia Cor-regida

Conversión de μg/ml a μg/μl

Volumen inicial Volumen final = 30 μl

FT 2.498-0.097 =2.402 6322.6÷1000=6.323 2.37μl 15μl + 15μl = 30 μl

L1 3.975-0.097=3.879 10015.1 ÷1000=10.016 1.50 μl 15μl + 15μl = 30 μl

L2 0.494-0.097 =0.397 1311.0÷1000=1.311 11.44 μl 15μl + 15μl = 30 μl

L3 0.244-0.097 =0.148 687.667 ÷1000=0.688 21.81 μl 15μl + 15μl = 30 μl

L4 0.163-0.097 =0.067 485.167 ÷1000=0.485 30.92 μl 5μl + 25μl = 30 μl

E1 0.457-0.097 = 0.361 1220.167 ÷1000=1.220 12.29 μl 15μl + 15μl = 30 μl

E2 0.713-0.097 = 0.617 1860.167 ÷1000=1.860 8.06 μl 15μl + 15μl = 30 μl

E3 0.215-0.097 = 0.118 614.333 ÷1000=0.614 24.42 μl 15μl + 15μl = 30 μl

Fórmulas utilizadas:

1. Absorbancia Corregida = Abs promedio de muestra – Abs promedio de control

2. Conversión de μg/ml a μg/μl = Concentración de proteína en μg/ml ÷ 1000μl

3. Volumen inicial (Vi) = CfVf /Ci ; donde Vf = 30 μl Cf = 0.5 μg/μl

4. Volumen final (Vf ) = ___μl de amortiguador de muestra + __μl de muestra = 30 μl