identificaciÓn de familias litopenaeus vannamei utilizando marcadores moleculares tipo...

IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS Litopenaeus vannamei

UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES TIPO

MICROSATÉLITES

Ph.Dc Franklin Pérez

Yordan Vivanco Muñoz

1. Utilización de los Microsatélites para la identificación de 32 familias de camarón

2. Análisis financiero de la utilización de la técnica de microsatélites para un sistema de producción comercial

IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS

Utilización de los Microsatélites para la identificación de 32

familias de camarón

INTRODUCCIÓN

ACTUALES PROBLEMAS BIOLÓGICOS EN LA

PRODUCCIÓN DE CAMARÓN

Enfermedades

- Síndrome de Las Gaviotas (1990)

- Síndrome de Taura (1994)

- Síndrome de la Mancha Blanca (1999) Bajo crecimiento Endogamia

MEJORAMIENTO GENÉTICO

Cruzando individuos de diferente procedencia con mejores resultados en el campo se puede obtener variedades más resistentes y con mejor crecimiento

Implementación el uso de marcadores moleculares (o genéticos) para programas de mejoramiento genético

VENTAJAS DE LOS MARCADORES MOLECULARES

Identifican el grado de parentesco entre individuos, evitando el cruce entre hermanos (endogamia)

Su relativa fácil aplicación permite incluir programas de mejoramiento genético en programas de producción

MARCADOR MOLECULAR

Es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear.

TIPOS DE MARCADORES MOLECULARES

Marcador Dominante

Marcador Codominante

(Microsatélites)

MICROSATÉLITES

Son secuencias de bases repetitivas ej:

….TCCGTGAGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGGAATAT....….AGGCACTCACACACACACACACACACACACCTTATA….

Abundantes en el genoma Presentan alta variabilidad Repeticiones van de 2 a 6 pares de bases con

longitudes de 20 a 100 pb Pueden estar relacionadas con genes importantes

(de resistencia y crecimiento)

VISUALIZACIÓN DE LOS MICROSATÉLITES

5’GCGGCCATCACA3’

...3’ATACACGCCGGTAGTGTCCAGGCCACA5’…

…5’CATCACCTATTGGATGCTATAGCGTGTCAGCCT3’… 3’TACGATATCGCACA5’

3’5’3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

5’3’

3’

3'3'5’

CICLO 1 CICLO 2

3’ 5’

5’3’

5’ 3’

5’ 3’

CICLO 3

CICLO 4

AISLAMIENTO Y AMPLIFICACIÓN POR PCR DE UN FRAGMENTO DESEADO DE DNA

MATERIALES Y MÉTODOS

OBTENCIÓN DE PRIMERS

Se diseñó a partir de secuencias publicadas en NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) con el programa Genfisher

1ra amplificación: extracción CTAB (DNA purificado) T°: 42 – 45 – 48 – 51 – 54 – 57 – 60 [MgCl2]: 1,0 – 1,5 – 2,0 – 2,5

2da amplificación: extracción CHELEX (DNA no purificado)

OBTENCIÓN DE MUESTRA

32 familias obtenidas por el programa de mejoramiento PROMOGEN. 15 animales por familia

OBTENCIÓN Y DOCUMENTACIÓN DE RESULTADOS

PCR de las muestras Separación de bandas en gen de

Poliacrialmida 6% Visualización por tinción de plata Cámara digital Kodak DC 120 Programa EDAS de Kodak El análisis del tamaño de las bandas corridas

por electroforesis se llevó a cabo con el Programa GeneProfiler

CÁLCULO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA

Análisis de heterocigocidad observada

Análisis de heterocigocidad esperada

Ni

HHo

21 piHe

TIPO DE SEGREGACIÓN ESPERADA EN EL ANÁLISIS DE 2 SEGREG. PARENTAL 1 0,25PARENTAL 2 0,25 0,25 0,25

CASO 1*

CASO 1

1:1*

1:1

1:2:1

1:1:1:1*

1:1:1:1

ANÁLISIS ENTRE FAMILIAS

Análisis de Lineaje de familias: Programa Kinship 1.2

Análisis Cluster (agrupamientos): Programa TFPGA que realiza dendogramas basados en el análisis UPGMA

RESULTADOS

MICROSATÉLITES ESCOGIDOS DE 131 PARES DE PRIMERS

locus Secuencia de los primersT°

(TD)[MgCl2](Mm)

Accesoal NCBI

CN-54 F: TGCTTGTGAAGGTGTGTGAACGTGR: CAAGATGCGTATGCACACATTGCTG 43 1,0 AF360040

CN-67 F: GAAGAGGCAGGGCGGATTTR: GGAAGGGTGGGAACAAGG 51 2,0 AF360007

CN-84 F: GGGTTATGATGACCAAAGR: ATTGGGTCTCGGAGTTTA 59 2,0 AF360114

CN-135 F: ATAATGCGAGCGTGAGR: ATTCCTTAGCGAACCA 43 2,0 AF359979

CN-142 F: TGCTACGCCGACAATGR: GAAGGTGCTTGCGACA 43 2,0 AF360029

CN-148 F: CATCATCGCTAAAATTR: CCTTCTGTTGTGGGTAT 43 2,0 AF360051

CN-159 F: AAGAACGAAGTGGAGGAGR: AAGCACCCAGTGTAGCC 47 2,0 AF360109

PRESENCIA DE ALELOS NULOS

CN-67

CN-46

CN-67

CN-46

Familia 22

Familia 2

HETEROCIGOCIDAD

Proyecto de Familias

Silvestres (Casalla, 2003)

Mic. N. Alelos Rango (pb) He Ho N. Alelos Rango (pb) He Ho

CN-54 17 127 – 187 0,18 0,47 12 126 – 148 0,55 0,36

CN-67 21 213 – 305 0,70 0,71 41 230 – 310 0,91 0,70

CN-84 19 243 – 323 0,89 0,47 20 294 – 332 0,48 0,86

CN-135 4 233 – 263 0,16 0,12 20 232 – 270 0,80 0,81

CN-142 17 295 – 229 0,84 0,65 19 196 – 232 0,78 0,61

CN-148 6 211 – 221 0,70 0,32 11 204 – 224 0,80 0,31

CN-159 14 269 – 195 0,91 0,30 20 148 – 194 0,85 0,31

Promedio 14 0,63 0,43 20,42 0,74 0,57

CN-148, Familia 15

CN-135, Familia 10

CN-135, Familia 4

PARENTALES DESCENDENCIA

CN-142, Familia 16

1

1

SEGREGACIÓN 1:1

CASO 1*

CASO 1

0,50 0,50

SEGREGACIÓN 1:1*

0,50 0,50

PRUEBA DE SEGREGACIÓN MENDELIANA

7 CASOS DE SEGREGACIÓN


7 CASOS DE SEGREGACIÓN

CN-67, Familia 8

CN-67, Familia 22

PARENTALES DESCENDENCIA

CN-142, Familia 12

SEGREGACIÓN 1:1:1:1

SEGREGACIÓN 1:2:1

0,25 0,25 0,25 0,25

SEGREGACIÓN 1:1:1:1*

0,25 0,25

0,25 0,25 0,25 0,25

0,25 0,25

CN-84, familia 23

301297

295 295 295 295 295293

289285 285 285 285 285 285 285 285

257 257 257 257 257 257 257 257


Familia que no presenta ningún caso de segregación

CN-67, Familia 5

CN-84, Familia 5

CN-142, Familia 5

267259 259 259 259 259 259 259 259 259

251 251 251 251 251 251 251 251233 233 233 233 233 233 233 233 233

297 297 297 297 297291 291 291 291 291 291 291 291 291 291

287 287 287 287 287 287 287 287257

221 221 221 221 221213 213 213 213 213 213 213 213 213 213

205 205 205 205 205 205 205197 197 197 197 197 197 197


Individuo que no presenta el perfil del grupo

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 01 - 02 *** - 03 *** *** - 04 *** *** *** - 05 *** *** *** *** - 06 *** *** *** *** *** - 07 *** *** *** *** *** ** - 08 *** *** *** *** *** *** *** - 09 *** *** *** *** *** ** *** *** - 10 *** *** *** *** *** *** *** *** *** - 11 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** - 12 *** *** *** *** *** ** *** *** *** *** *** - 13 *** *** *** *** *** ** *** *** *** *** *** *** - 14 *** *** *** *** *** *** * *** ** ** *** *** ** - 15 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** -

AGRUPAMIENTO FAMILIAR CON EL PROGRAMA KINSHIP

Familia 25

* Probabilidad de 95,0 % que sean hermanos** Probabilidad de 99,0 % que sean hermanos*** Probabilidad de 99.9 % que sean hermanos

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15

01 -

02 *** -

03 *** *** -

04 N.S. N.S. ** -

05 N.S. N.S. N.S. N.S. -

06 *** N.S. *** * N.S. -

07 *** N.S. *** *** N.S. *** -

08 N.S. * N.S. * N.S. *** * -

09 N.S. N.S. ** *** N.S. *** *** *** -

10 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. -

11 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. * N.S. * *** -

12 *** *** *** * N.S. N.S. * ** *** N.S. * -

13 N.S. N.S. N.S. N.S. *** N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. -

14 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. * N.S. * * * N.S. N.S. -

15 N.S. N.S. N.S. *** N.S. *** *** *** *** N.S. N.S. * N.S. * -

* Probabilidad de 95,0 % que sean hermanos** Probabilidad de 99,0 % que sean hermanos*** Probabilidad de 99.9 % que sean hermanosNS No significativo


Familia 24


F1 77% F2 48% F3 83% F4 79% F5 68% F6 73% F7 76% F8 81% F9 79% F10 94% F11 68% F12 81% F13 94% F14 65% F15 86% F16 98% F17 99% F18 96% F19 91% F20 75% F21 66% F22 89% F23 71% F24 36% F25 100% F26 87% F27 100% F28 41% F29 100% F30 50%

F31 61% F32 100%

AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA KINSHIP

AGRUPAMIENTO ENTRE FAMILIAS CON EL PROGRAMA KINSHIP

F16 01

F16 02

F16 03

F16 04

F16 05

F17 01

F17 02

F17 03

F17 04

F17 05

F18 01

F18 02

F18 03

F18 04

F18 05

F16 01 -

F16 02 ** -

F16 03 *** *** -

F16 04 ** *** *** -

F16 05 ** *** *** *** -

F17 01 *** *** ** ** *** -

F17 02 *** *** ** *** ** *** -

F17 03 *** *** *** *** *** N.S. *** -

F17 04 *** *** *** ** *** *** ** ** -

F17 05 ** *** *** *** *** ** * ** *** -

F18 01 * *** *** ** *** ** * * * ** -

F18 02 * *** *** *** *** *** ** ** *** *** *** -

F18 03 *** N.S. ** ** ** ** *** * N.S. N.S. *** *** -

F18 04 *** ** *** *** *** ** *** ** N.S. ** *** *** *** -

F18 05 N.S. *** *** ** *** ** N.S. ** ** *** *** *** N.S. *** -

DENDOGRAMA FAMILIAR REALIZADO CON EL PROGRAMA TFPGA

DISCUSIÓN

PRESENCIA DE ALELOS NULOS

No hay correcto plegado de iniciador, por una mutación

Modificación o cambio de primer podría amplificar el alelo nulo

Puede subir la proporción de falsos homocigotos

VARIABILIDAD GENÉTICA

Cuando la Ho es menor que la He se debe a una alta consanguinidad (muchos homocigotos) o incidencia de alelos nulos

Caso los loci CN-84; CN-135; CN-142; CN-148; CN-159

Cuando la Ho es mayor que la He se debe a un exceso de heterocigotos por a las cruzas dirigidas y no al azar

Caso del locus CN-54

VARIABILIDAD GENÉTICA

La población silvestre ecuatoriana (Casalla, 2003) tiene más variabilidad que las familias en estudio por tener:

Mayor número de alelos Mayor Heterocigocidad

Presencia de 21 alelos en las familias que no tiene la población silvestre debido al origen distinto de algunos reproductores (Panamá)

SEGREGACIÓN MENDELIANA Y AGRUPAMIENTO

En la familia 25 encontramos:

Locus Segregación

CN-54 1*

CN-67 1

CN-84 1:2:1

CN-135 1*

CN-142 1:1:1:1

CN-148 1:2:1

CN-159 1:2:1

2da ley de Mendel: cada alelo tiene segregación independiente, no depende de la segregación de

otro alelo.


Se encotraron 2 grupos de familias, donde cada grupo presentó los mismos perfiles: F7 y F8 F16, F17 y F18

Hecho que supone la división de un desove en algunos tanques


20 individuos específicos (distribuidos en las familias) no pertenecieron al perfil familiar

El individuo F5 12 no perteneció a los perfiles de la familia F5; pero fue agrupado (por el programa Kinship) en la familia 23 indicando el origen de la muestra


Errores y discordancia en la segregación mendeliana se deben principalmente a 3 razones:

Error durante la manipulación de la muestra Mal manejo de familias Por mutación (alelos nulos o alelos diferentes)

ANÁLISIS FINANCIERO

Análisis financiero de la utilización de la técnica de

microsatélites para un sistema de producción

comercial

MÉTODO DE MARCAJ E FAMILIAR

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7

49 Desoves: 7 7 7 7 7 7 7

LARVICULTURA

49 Recipientes de 50 L por 21 días (un recipiente por desove)

49 Tanques de 2 m3 por 15 días

(2000 animales por tanque)

Crecimiento a 1 g y Marcaje

CRECIMIENTO DE REPRODUCTORES

F1 F2 F49 F3

F1 F49 F2

7.000 m2

1.000 1.000 1.000

SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE

SELECCIÓN FAMILIAR

M É T O D O D E “ W A L K B A C K S E L E C T I O N ” ( G E N O T I P E A D O )

G E N O T I P E A D O D E P A R E N T A L E S

L A R V I C U L T U R A

T A N Q U E S C O N V E N C I O N A L E S , F A M I L I A S M E Z C L A D A S

P R O D U C C I Ó N E N C A M A R O N E R A C O N V E N C I O N A L

M E J O R E S E J E M P L A R E S L L E V A D O S A R E P R O D U C T O R E S

SISTEMA DE MEJORAMIENTO GENÉTICO DE

WALK BACK SELECTION

Proyecto Método de Mejoramiento Genético

Característica del Proyecto.

A SELECCIÓN FAMILIAR

Maduración y larvicultura:

Compra de terreno y equipos, construcción de infraestructura.

Camaronera: Compra de camaronera con maquinarias y bombas incluidas.

B SELECCIÓN FAMILIAR Maduración,

Larvicultura y Camaronera: Alquiler

C WALK BACK SELECTION

Maduración y larvicultura:

Compra de terreno y equipos, construcción de infraestructura.

Camaronera: Compra de camaronera con maquinarias y bombas incluidas.

D WALK BACK SELECTION Maduración,

Larvicultura y Camaronera: Alquiler

DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS A y B

Maduración: 1 Galpón de maduración de 132 m2; 8 tanques, producción de

3’200.000 nauplios diarios durante 9 meses al año

Larvicultura: 2 Tanques de 13 m3 c/u; 6’200.000 larvas anual (3 ciclos) 1 Galpón para 50 recipientes de 50 L c/u 49 Tanques plásticos exteriores de 2 m3

Camaronera: 20 Has, 95.466 libras al año (3 ciclos) Están incluidos 1 Ha, selección de reproductores 0,5 Ha, crecimiento de reproductores; 9.900 reproductores al año

CONSTRUCCIÓN DE INFRAESTRUCTURA

MADURACIÓN Y LARVICULTURA

MADURACIÓN COMERCIAL

CAMARONERA

LEVANTAMIENTO DE LARVA A J UVENIL PARA MARCAJ E

PISCINAS DE EVALUACIÓN DE REPRODUCTORES

PISCINA DE CRECIMIENTO DE REPRODUCTORES

0 1 2 3

PROYECTO A. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECES

4 5

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO AProyecto A: 5 años con ciclos de 4 meses



CAMARONERA

LEVANTAMIENTO DE LARVA A J UVENIL PARA MARCAJ E

PISCINAS DE EVALUACIÓN DE REPRODUCTORES


0 1 2 3 4 5

PROYECTO B. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECES

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO B

Proyecto B: 5 años con ciclos de 4 meses

FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS A Y B

Proyecto A Proyecto B

Inversiones $ 219.240,94 $ 72.505,06

Capital de Trabajo $ 92.675,89 $ 160.216,49

TOTAL $ 311.916,83 $ 232.721,55

Capital Propio 30% del Total

$ 93.575,05 $ 69.816,46

Crédito 70% del Total

$ 218.341,78 $ 162.905,08

VENTAS DE LOS PROYECTOS A Y B

Proyecto A Proyecto B

Concepto 1er año 2do año en adelante

1er año en adelante

Nauplios $ 56.320,00 $ 86.400,00 $ 84.480,00

Lb. de camarón

$ 82.737,04 $ 124.105,56 $ 124.105,56

Reproductores $ 4.500,00 $ 9.000,00 $ 9.000,00

TOTAL $ 143.557,04 $ 217.585,56 $ 217.585,56

DIMENSIONAMIENTO DE LOS PROYECTOS C y D

Maduración: 1 Galpón de maduración de 132 m2; 8 tanques, producción de

3’200.000 nauplios diarios durante 9 meses al año

Larvicultura: 2 Tanques 13 m3 c/u; 7’050.000 larvas anual (3 ciclos)

Camaronera: 20 Has, 109.104 libras al año (3 ciclos) Incluiye: 0,5 Ha, crecimiento de reproductores; 7.200 reproductores al año

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO C

CONSTRUCCIÓN DE INFRAESTRUCTURA



CAMARONERA


1 2 3

PROYECTO C. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECES

4 50

Proyecto C: 5 años con ciclos de 4 meses

ORGANIZACIÓN DEL PROYECTO D



CAMARONERA


0 1 2 3 4 5

PROYECTO D. 5 AÑOS CON CICLOS DE 4 MECESProyecto D: 5 años con ciclos de 4 meses

FINANCIAMIENTO DE LOS PROYECTOS C Y D

Proyecto C Proyecto D

Inversiones $ 218.887.11 $ 71.010.64

Capital de Trabajo $ 77.476.07 $ 137.364.19

TOTAL $ 296.363.18 $ 208.374.83

Capital Propio 30% del Total

$ 88.908.95 $ 62.512.45

Crédito 70% del Total

$ 207.454.22 $ 145.862.38

VENTAS DE LOS PROYECTOS C Y D

Proyecto C Proyecto D

Concepto 1er año 2do año en adelante

1er año en adelante

Nauplios $ 56.320,00 $ 84.480,00 $ 84.480,00 Lb. de

camarón $ 94.556,62 $ 141.834,93 $ 141.834,93

Reproductores $ 2.250,00 $ 4.500,00 $ 4.500,00

TOTAL $ 153.126,6 $ 230.814,93 $ 230.814,93

DISCUSIÓN:COMPARACIÓN DE LOS 4 PROYECTOS

Concepto A B C D

Capital Propio de Inversión

$ 93.575,05 $ 69.816,46 $ 88.908,95 $ 62.512,45

VAN (14,8%) $-23.938,65 $-19.276,99 $ 52.174,68 $ 61.649,71

TIR 8,52% 8,07 % 29,73 % 41,64%

B/ C 0,71 0,68 1,67 2,13

P. Recuperación 4,69 años 4,74 años 4,10 años 3,32 años

CONCLUSIONES

CONCLUCIONES DE LA IDENTIFICACIÓN FAMILIAR

CONCLUCIONES FINANCIERAS

CONCLUSION DE LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS

Se puede utilizar microsatélites específicos para Litopenaeus vannamei para la determinación de familias y parentesco

Se comprobó la utilidad de la técnica de marcadores microsatélites para el control de programas de mejoramiento genético en camarón

RECOMENDACIÓN PARA LA IDENTIFICACIÓN DE FAMILIAS

Es preferible tener la información del genotipo de los padres, para conocer el genotipos de la descendencia y determinar si hubo mala manipulación al encontrar individuos introducidos.

Un estudio con mayor número de loci microsatélites, los resultados son más exactos, debido a la presencia de alelos nulos

CONCLUSIONES DE LA COMPARACIÓN DE LOS 4

PROYECTOS Es mejor implementar el sistema de Walk

Back Selection por su menor necesidad de inversión y tener los mejores índices, la mejor opción: alquilar las instalaciones (D)

Mientras mayor sea la cantidad de hectáreas en producción, el proyecto será más estable ante las variaciones de precios de venta y costo de insumos ya que es la venta que produce mayor ganancia.

GRACIAS

identificaciÓn de familias litopenaeus vannamei utilizando marcadores moleculares tipo...

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