caracterización molecular de poblaciones de globisporangium spp. obtenidas de invernaderos...
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Perfil de proyecto de tesis de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPETRANSCRIPT
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
PERFIL DE PROYECTO DE INVESTIGACIN
TTULO:
Caracterizacin molecular de poblaciones de Globisporangium spp. obtenidas de invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014 utilizando microsatlites SSR.
AUTOR:
Christian Orlando Ayala Ortiz
DIRECTOR:
Alma Koch M. Sc.
PROYECTO DE INVESTIGACINJULIO/2015
SANGOLQU, JULIO DEL 2015.
17
NDICE1TTULO DEL PROYECTO42UNIDAD ACADMICA RESPONSABLE43RESPONSABLE DEL PROYECTO44LNEA DE INVESTIGACIN45SUBLNEA DE INVESTIGACIN46GRUPO DE INVESTIGACIN47COLABORADORES CIENTFICOS48LOCALIZACIN GEOGRFICA58.1Trabajo de Laboratorio58.2Anlisis Bioestadstico59REA DE INFLUENCIA510ANTECEDENTES611PROYECTOS RELACIONADOS O COMPLEMENTARIOS711.1Proyectos Realizados en el Exterior712JUSTIFICACIN O IMPORTANCIA DEL PROBLEMA A RESOLVER813OBJETIVO GENERAL DEL PROYECTO914OBJETIVOS ESPECFICOS915MARCO REFERENCIAL1015.1Globisporangium spp.1015.1.1Taxonoma1015.1.2Biologa1015.1.3Enfermedad que causa1115.2Marcadore Moleculares1115.2.1Marcadores SSR1215.3Anlisis filogentico1316METODOLOGA1416.1Participantes1416.1.1Instituciones1416.1.2Colaboradores Cientficos1416.2Revisin Bibliogrfica1416.3Trabajo de Laboratorio1516.3.1Extraccin de ADN1516.3.2Determinacin de la concentracin y pureza de los aislados1516.3.3Dilucin del ADN1516.3.4Anlisis gentico con marcadores SSR1517ANLISIS ESTADSTICO1618HIPTESIS1719OPERATIVIDAD DE LAS VARIABLES1820ACTIVIDAD PARA LA EJECUCIN1821DURACIN DEL PROYECTO1922BIBLIOGRAFA1923ANLISIS DE COSTOS DEL PROYECTO2224FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO2325CONTENIDO2326CRONOGRAMA2427FECHA DE PRESENTACIN DEL PROYECTO2528FIRMA DEL RESPONSABLE2529FECHA DE APROBACIN DEL PROYECTO2530FIRMA DE LA AUTORIDAD25
TTULO DEL PROYECTO
Caracterizacin molecular de poblaciones de Globisporangium spp. obtenidas de invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014. mediante el uso de microsatlites SSR.
UNIDAD ACADMICA RESPONSABLE
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa en convenio con la Universidad Estatal de Oklahoma (OSU), Estados Unidos, Departamento de Fitopatologa y Entomologa.
RESPONSABLE DEL PROYECTO
El responsable del proyecto es el seor AYALA ORTIZ CHRISTIAN ORLANDO, egresado de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa de la Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE).
Telfonos: 0987640518/023441810
E-mail: [email protected]
LNEA DE INVESTIGACIN
La Lnea de Investigacin de este proyecto es Ciencias Vegetales.
SUBLNEA DE INVESTIGACIN
La Sublnea de Investigacin del proyecto es Fitopatgenos
GRUPO DE INVESTIGACIN
Grupo de Investigacin en Microbiologa y Ambiente
COLABORADORES CIENTFICOS
Posible Director del Proyecto: Alma Koch Kaiser M. Sc.
LOCALIZACIN GEOGRFICATrabajo de Laboratorio
La parte experimental y trabajo de laboratorio del proyecto se llevar a cabo en el Laboratorio de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma ubicada en la ciudad de Stillwater, Oklahoma en Estados Unidos de Norteamrica.
Anlisis Bioestadstico
El anlisis bioestadstico de los datos obtenidos se realizar una parte en el Laboratorio de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma y se finalizar en el Laboratorio de Microbiologa de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE ubicado en Sangolqu, Pichincha en Ecuador.
REA DE INFLUENCIA
El rea de influencia de este estudio sern los invernaderos ornamentales ubicados en Nueva York, a partir de los cuales se obtuvieron las muestras; ya que mediante los anlisis a realizar se podr conocer las especies de Globisporangium spp. se encuentran contaminando sus suelos y las medidas a tomar a fin de evitar prdidas por la contaminacin de este oomiceto.
Tambin los Laboratorios del Departamento de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma, ya que en ellos se realizarn todos los anlisis necesarios y se elaborarn colecciones de ADN a partir de las muestras obtenidas, las que podrn ser utilizadas para cualquier estudio posterior que el Laboratorio requiera.
En el pas, la influencia de este proyecto sera principalmente para el sector florcola y de viveros ornamentales, el cul es uno de los sectores econmicos ms importantes del Ecuador y cuyo principal cliente son los Estados Unidos de Norteamrica. El conocer las distintas poblaciones de Globisporangium spp. puede servir a la industria florcola para llevar a cabo las prcticas de cultivo necesarias para prevenir su infeccin.
ANTECEDENTES
En 2004 Levesqu y de Cock propusieron la existencia de 11 clados (A-K), dentro del gnero Pythium, el cual se volvi un estndar para los anlisis filogenticos de Pythium. En el 2006 Villa, et al. Demostr que los miembros del clado K estaban ms cerca a Pythoptora que a Pythium y por lo que Bala, et al. en 2006 propuso la creacin de un nuevo gnero llamado Pythophytium (Kageyama, 2014).
En 2010 Uzuhashi, et al., mediante anlisis filogenticos basados en las secuencias de ADNr LSU y el gen coxII propusieron que el gnero se dividiera en cinco gneros nuevos: Pythium sensu stricto, Ovatisporangium, Globisporangium, Elongisporangium y Pilasporangium.
En este mismo ao inicia el proyecto Rastreo y Manejo de las Enfermedades de Cultivos Florcolas Causadas por Oomicetos y Hongos del Centro de Extensin Long Island para a Investigacin en Horticultura perteneciente a la Universidad de Cornell el cual cuenta con la colaboracin de la Universidad Estatal de Oklahoma (Agricultural Research Service, 2015).
Este proyecto tiene como finalidad reducir la prdida de cultivos florcolas causados tanto por las enfermedades ms comunes y conocidas as como por algunas de las nuevas y ms inusuales. Para lograrlo, se propone el diseo de nuevas herramientas y prcticas agrcolas que permitan un mejor manejo de las enfermedades (Agricultural Research Service, 2015).
Como parte de este proyecto, en el 2012 cuatro negocios con invernadero en Long Island fueron muestreados en busca de miembros del antiguo gnero Pythium, el cual ya para aquel entonces inclua a Pythium y Globisporangium (Uzuhashi, Tojo, & Kakishima, 2010). Se recolect un total de 389 muestras a partir de los cultivos, las estaciones de llenado de macetas e incluso el suelo fuera de los invernaderos, obtenindose un total de 74 aislados de Pythium.
Las muestras fueron analizadas utilizando secuencias ITS y marcadores SSR por la Doctora Carla Garzn en la Universidad Estatal de Oklahoma (OSU), encontrndose nueve especies de Globisporangium y cinco especies de Pythium. Entre los aislados de G. irregulare sensu lato se identificaron cuatro grupos provenientes de dos linajes distintos: el primero conteniendo solo G. irregulare sensu stricto y el otro conteniendo a G. cryptoirregulare, G. cylindrosporum y G. irregulare sensu lato.
PROYECTOS RELACIONADOS O COMPLEMENTARIOSProyectos Realizados en el Exterior
Molecular characterization of Phytium populations in ornamental greenhouse and nursery crops (Garrido, 2014).
Molecular taxonomy and its application to ecological studies of Pythium species (Kageyama, 2014).
First Report of Globisporangium ultimum Causing Pythium Damping-Off on Aleppo Pine in Algeria, Africa, and the Mediterranean Region (Lazreg, et al., 2013).
Molecular phylogeny and taxonomy of the genus Pythium (Lvesque & de Cock, 2004).
Phylogeny of the genus Pythium and description of new genera (Uzuhashi, Tojo, & Kakishima, 2010).
Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis and Internal Transcribed Spacer and coxII Sequences Reveal a Species Boundary Within Pythium irregulare (Garzn, Geyser, & Moorman, 2005)
Pythium cryptoirregulare, a new species within the P. irregulare complex (Garzn, Yanz, & Moorman, 2007).
Relacin filogentica de cepas de Pythium irregulare sensu lato de Long Island, New York en base al anlisis de secuencias del gen -tubulina (Proao, 2014).
Identification and characterization of simple sequence repeat markers for Pythium aphanidermatum , P . cryptoirregulare , and P . irregulare and the potential use in Pythium population genetics (Lee & Moorman, 2008).
Genetic structure and distribution of Pythium aphanidermatum populations in Pennsylvania greenhouses based on analysis of AFLP and SSR markers (Lee, Garzn, & Moorman, 2010).
JUSTIFICACIN O IMPORTANCIA DEL PROBLEMA A RESOLVER
La horticultura ambiental, que incluye invernaderos y viveros ornamentales, es uno de los segmentos agrcolas de ms rpido crecimiento y expansin en los Estados Unidos, incluso durante las recesiones (Hall, 2006).
En la Tabla 1 se pueden observar el valor de las ventas al por menor de productos provenientes de la Industria Florcola durante los ltimos aos.
EL aumento en la produccin de cultivos ornamentales en invernaderos y viveros ha contribuido al aumento de varias enfermedades como el damping-off pre y post-emergente de las plntulas y semillas, pudriciones de tallo o pudriciones de raz, lo que se ha convertido en factores que afectan a la economa de los negocios (Garrido, 2014).
Para que la industria florcola pueda continuar con su crecimiento, los productores de plantas ornamentales no pueden permitirse la presencia de plantas enfermas en sus invernaderos y viveros, ya que siempre conllevan a prdidas econmicas. Por lo tanto los tratamientos preventivos y el control de enfermedades deben ser eficientes para ser econmicamente rentables, adems de ser seguros para las personas y el medio ambiente (Daughtrey, 2004).
Tabla 1. Valor anual de las ventas al por menor de la Industria Florcola Estadounidense, (U. S. Bureau of Economic Analysis, 2015).
Ao
Valor de las ventas al por menor
(billones de USD)
2014
26.6
2013
25.7
2012
26.3
2011
25.8
2010
25.9
2009
25.7
2008
28.9
2007
30.3
2006
29.8
2005
27.8
2004
25.4
2003
24.2
2002
24.3
OBJETIVO GENERAL DEL PROYECTO
Caracterizar molecularmente poblaciones de Globisporangium spp. obtenidas de invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014. mediante el uso de microsatlites SSR.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Construir colecciones de ADN a partir de aislados de Globisporangium spp. recolectados de cultivos ornamentales de Nueva York durante el 2014.
Caracterizar las poblaciones usando marcadores SSR.
Determinar la posicin filogentica de los aislados de Globisporangium spp.
MARCO REFERENCIALGlobisporangium spp.Taxonoma
Globisporangium spp. es una especie conocida de oomiceto que antiguamente formaba parte del gnero Pythium, por lo tanto pertenece a la familia Pythiaceae, clase Oomycete, phylum Oomycota (Buller, 2014).
El gnero Pythium fue descrito por primera vez en 1858 por Pringsheim. Desde entonces su taxonoma ha cambiado varias veces, generalmente en funcin de sus caractersticas morfolgicas. Sin embargo debido a que estas pueden confundirse entre especies, o no siempre se forman en el agar, el uso de mtodos moleculares ha sido necesario para poder obtener una mejor identificacin y delimitacin de la taxonoma de Pythium (Lvesque & de Cock, 2004).
Mediante el anlisis filogentico de genes de Pythium como: la subunidad larga de ADNr D1/D2 (LSU rDNA D1/D2) y coxII, Se enmend el gnero Pythium y se dividi de las especies restantes en cuatro gneros diferentes: Ovatisporangium, Elongisporangium, Globisporangium y Pilasporangium (Uzuhashi, Tojo, & Kakishima, 2010).
Biologa
Como parte del antiguo gnero al que pertenecan, estn bien distribuidos alrededor del mundo y pueden ser hallados en diversos nichos ecolgicos. Pueden ser saprfitos o patgenos facultativos de plantas tanto en ambientes terrestres como acuticos. En el suelo poseen un amplio rango de plantas hospederas en las cuales causan las enfermedades de damping-off y pudricin de la raz, entre otras (Garrido, 2014).
Como caractersticas morfolgicas poseen un micelio bien desarrollado que pueden presentar apresorios. Las hifas son hialinas y raramente septadas. El esporangio puede ser terminal, intercalar o lateral con forma globosa, de limn o de corazn. Las zoosporas son biflageladas, el oogonio puede ser terminal o intercalar y los anteridios pueden tener distintas formas y haber uno o varios (Uzuhashi, Tojo, & Kakishima, 2010).
Enfermedad que causa
Algunas especies pertenecientes a Globisporangium spp. son conocidas por causar marchitamiento fngico (damping-off) y pudricin de la raz (root rot) en gran variedad de especies alrededor del mundo incluyendo conferas y cultivos florcolas (Lazreg, et al., 2013).
El damping-off causado por diferentes especies de Pythium (y otros gneros relacionados) comienza generalmente como pudricin de la raz. El hongo sobrevive en el suelo como oospora y germina para atacar las raicillas de las plntulas causando el deterioro progresivo de todo el sistema radical. La plntula muere antes de que se puedan apreciar lesiones en las partes areas y por lo general ni siquiera llega a germinar, damping-off pre-emergente, (Laemmlen, 2001).
En algunos hospederos, las lesiones en la raz pueden observarse como hmedas, babosas, de color caf o marchitas y en ocasiones incluso se puede observar el micelio (Daughtrey, Wick, & Peterson, 1995).
La fuente de los patgenos en cultivos florcolas puede ser restos de plantas, polvo, herramientas, equipos, mezcla para macetas, tuberas de irrigacin, entre otras. Las oosporas o el esporangio son los inculos primarios que tambin pueden ser movilizados en material vegetal infectado como en el caso de semillas o plntulas que se mueven entre invernaderos (Sutton, y otros, 2006).
Marcadores Moleculares
Los marcadores moleculares son sitios donde se pueden encontrar diferencias en las secuencias de ADN entre miembros de la misma especie. Es decir representan polimorfismos a nivel de ADN. Una gran cantidad de marcadores se han descubierto desde 1980 y cada ao se desarrollan nuevos tipos (White, Adams, & Neale, 2007).
Los diferentes tipos de marcadores moleculares pueden clasificarse por su capacidad de detectar polimorfismos en un nico loci o en varios; y por ser dominantes (AFLPs, ISSRs, RAPDs) o codominantes (RFLPs, SSRs) (Alcantara, 2007). Tambin pueden agruparse entre aquellos que se basan en la hibridacin ADN-ADN (como los RFLPs) y aquellos que se basan en la amplificacin mediante PCR (como los SSRs). A diferencia de los mtodos basados en hibridacin ADN-ADN, la tcnica de la PCR requiere de una menor cantidad de material gentico para funcionar correctamente (White, Adams, & Neale, 2007).
Marcadores SSR
Los marcadores de repeticin de secuencia simple (marcadores SSR), tambin llamados microsatlites, son repeticiones se secuencias cortas de nucletidos de no ms de seis bases de largo. Durante los ltimos aos ha aumentado de manera considerable la utilidad de los marcadores para estudios de diversidad gentica, estudios ecolgico-genticos, caracterizacin de flujo de genes, mapeo gentico entre otros (Stafne, Clark, Weber, Graham, & Lewers, 2005)
La ventaja que ofrece el usar microsatlites es que son abundantes, estn distribuidos por todo el genoma, son ms polimrficos que otro tipo de marcadores moleculares, son especficos para cada especie y son codominantes. Sin embargo tambin existen sus contras, pues presentan un alto costo de desarrollo y existen varios retos tcnicos al momento de construir los primers especficos para cada especie (Miah, et al., 2013).
Como se mencion anteriormente, los marcadores SSR requieren del uso de una PCR para funcionar. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en amplificar un segmento del ADN mediante el uso de primers o cebadores. La reaccin consta de tres pasos principales: 1) Desnaturalizacin de la doble cadena de ADN. 2) EL alineamiento de los primers a la secuencia objetivo. 3) La sntesis de las nuevas cadenas de ADN mediante el uso de una polimerasa termoresistente (Taq Polimerasa). Los tres pasos se consideran un ciclo. Al final del primer ciclo se obtienen dos nuevas dobles cadenas de ADN a partir de la original que servirn de molde para el siguiente ciclo, obtenindose as una amplificacin geomtrica de las molculas (White, Adams, & Neale, 2007).
En el caso de la PCR para el anlisis de microsatlites, la secuencia objetivo es aquella donde se encuentran las secuencias repetidas que interesa analizar. Por lo tanto los primers que se utilizan son diseados a partir de las secuencias flanqueantes de los microsatlites. Debido a los polimorfismos de los microsatlites entre individuos de la misma especie, las secuencias obtenidas tendrn diferente peso molecular y por lo tanto mediante una electroforesis podemos comparar la similitud gentica entre varios individuos (Pico, 2014).
Anlisis filogentico
La filogenia es el estudio de las relaciones evolutivas. El anlisis filogentico es el medio por el cual estimamos estas relaciones. Los datos obtenidos de la historia evolutiva de un anlisis filogentico por lo general son presentados en forma de diagramas de rbol que representan las relaciones entre molculas, organismos o ambos (Brinkman & Leipe, 2001).
De manera tradicional, la filogenia trabaja con caractersticas fsicas o morfolgicas (como tamao, color, nmero de patas, etc.). Sin embargo en la actualidad se utiliza material gentico, principalmente secuencias de ADN y protenas. Las relaciones se infieren por la presencia de bloques conservados encontrados a la hora de alinear las secuencias analizadas (Stettiner & Gabor, 2001).
Un anlisis filogentico consiste de cuatro pasos principales (Brinkman & Leipe, 2001):
1) Alineamiento: Usualmente consiste en un alineamiento mltiple. Posterior al cual es necesario extraer el set de datos filogenticos, que algunas veces puede no corresponder exactamente al alineamiento en funcin de cuanta ambigedad e inserciones y deleciones se van a permitir en el proceso de construccin del rbol.
2) Determinacin del modelo de substitucin: Elegir el modelo de sustitucin de bases adecuado de acuerdo al tipo de organismo y secuencia que se est analizando.
3) Construccin del rbol filogentico: Se tiene que elegir entre mtodos basados en distancias y mtodos basados en caractersticas de acuerdo a los datos que se tienen.
4) Evaluacin del rbol filogentico.
METODOLOGAParticipantesInstituciones
Esta investigacin se realizar con la colaboracin entre el Laboratorio del Departamento de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma ubicada en Stillwater, Estados Unidos y el Laboratorio de Microbiologa perteneciente a la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa del Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE ubicada en Sangolqu, Ecuador.
Colaboradores Cientficos
Dra. Carla Garzn Ph.D. (OSU)
Alma Koch M.Sc. (UFA-ESPE)
Francisco Flores Ph.D. (UFA-ESPE)
Revisin Bibliogrfica
Se comenzar este proyecto con una revisin detallada de la informacin existente hasta la fecha del gnero Globisporangium as como del gnero Pythium del cual formaba parte hasta hace unos cinco aos. De igual manera, se har una revisin bibliogrfica de los mtodos moleculares y estadsticos necesarios para la elaboracin de anlisis filogenticos.
Trabajo de LaboratorioExtraccin de ADN
A partir de muestras liofilizadas se proceder a realizar la extraccin de ADN utilizando el kit DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia CA) segn el protocolo descrito por el fabricante.
Determinacin de la concentracin y pureza de los aislados
Se utilizar un espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Se configurar el equipo en modo ADN y con unidades de concentracin en ng/L. Se colocar 1,5 L de buffer AE como blanco y luego se analizar 1,5 L de cada una de las muestras. Para evaluar la calidad de las muestras se utilizar la relacin de absorbancias 260/280 y se considerar la muestra como pura si esta relacin se encuentra en el rango entre 1.8 y 2.1.
Dilucin del ADN
El ADN extrado se diluir a una concentracin final de 10 ng/L y un volumen final de 30 L de acuerdo con la Ecuacin 1.
Ecuacin 1. Clculo del volumen de muestra necesaria
Donde V2 es el volumen final deseado (30 L), C2 es la concentracin final deseada (10ng/L), C1 es la concentracin obtenida del espectrofotmetro y V1 es la cantidad de muestra que se necesita tomar.
Anlisis gentico con marcadores SSR
Se utilizar cuatro marcadores polimrficos SSR (P18GAA1-71, P18GAA1-72, P18CAT1-74 and P18TCC3-25) desarrollados para el anlisis de poblaciones de Pythium (Lee & Moorman, 2008).
La PCR se llevar a cabo en 20 L de mezcla de reaccin que contendr: 1X PCR Buffer, 2.5 mM dNTP, 1U Taq Polimerasa y 3 M de cada primer (Lee, Garzn, & Moorman, 2010). En la Tabla 2 se puede observar el programa de PCR
Tabla 2. Programa de la PCR (Lee, Garzn, & Moorman, 2010).
Ciclo
Temperatura
Tiempo
Desnaturalizacin inicial
94 C
5 min
30-35 ciclos
Desnaturalizacin
94 C
30 s
Alineamiento
55-60 C (Dependiendo del set de primers)
30 s
Extensin
72 C
30 s
Extensin
72 C
10 min
Los productos de la PCR se analizarn mediante el uso de electroforesis capilar con un equipo ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems).
ANLISIS ESTADSTICO
A fin de determinar el nmero de poblaciones entre los aislados obtenidos se utilizar el software Structure versin 2.3.2 el cual mediante mtodos de Inferencia Bayesiana determina el nmero de ancestros comunes (K) entre todas las muestras y asigna a cada uno de los individuos a la poblacin correspondiente.
Los coeficientes estadsticos que se analizarn sern diversidad allica, nmero de alelos por locus (Na), nmero efectivo de alelos (Ne), heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) en el equilibrio de Hardy Weinberg (HWE) la cual se calcula mediante la Ecuacin 2.
Ecuacin 2. Heterocigosidad esperada para ms de dos alelos (Frankman, Ballou, & Briscoe, 2010).
Donde:n = nmero de los alelos
pi = frecuencia del alelo i
El contenido de informacin del polimorfismo (PIC), el cual es usado para medir el polimorfismo de un locus determinado y usado principalmente en anlisis de parentesco se calcular mediante lo demostrado por Bolstein y colaboradores en 1980 (Shete, Tiwari, & Elston, 2000) como se indica en la Ecuacin 3.
Ecuacin 3. Contenido de Informacin del Polimorfismo (Shete, Tiwari, & Elston, 2000).
Donde:pi = frecuencia del alelo i
pj = frecuencia del alelo j
Tambin se realizar el clculo de la varianza molecular (AMOVA) mediante el software GenAIEx.
HIPTESIS
El uso de marcadores SSR permite caracterizar poblaciones de Globisporangium spp. entre los aislados obtenidos de invernaderos ornamentales de Nueva York en el 2014.
OPERATIVIDAD DE LAS VARIABLES
Tabla 3. Operatividad de las Variables.
Proceso
Variable a determinar
Extraccin y cuantificacin de ADN
Concentracin de ADN
Anlisis gentico con marcadores SSR
Nmero de poblaciones encontradas
Anlisis estadstico
Diversidad allica
Nmero de alelos por locus (Na)
Nmero efectivo de alelos (Ne)
Heterocigosidad observada (Ho)
Heterocigosidad observada (He)
Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE)
Contenido de informacin del polimorfismo (PIC)
Varianza molecular
ACTIVIDAD PARA LA EJECUCIN
1) Revisin bibliogrfica de informacin existente sobre Globisporangium spp.
2) Elaboracin del perfil del proyecto de investigacin
3) Viaje a Stillwater, Oklahoma a la Universidad Estatal de Oklahoma donde este proyecto se llevar a cabo.
4) Extraccin de ADN de las muestras y construccin de colecciones de ADN.
5) Obtencin de los fragmentos de ADN contiendo los SSR mediante una PCR.
6) Anlisis de los fragmentos mediante electroforesis capilar.
7) Anlisis filogentico de la informacin obtenida.
8) Determinacin de las posiciones filogenticas de cada uno de los aislados.
9) Anlisis de los resultados obtenidos
10) Redaccin del informe final del proyecto
DURACIN DEL PROYECTO
Este proyecto tiene una duracin de cuatro meses.
BIBLIOGRAFAAgricultural Research Service. (1 de Julio de 2015). Research Project: Tracking and Managing Diseases of Floriculture Crops Caused by Oomycetes and Fungi. Obtenido de United States Deparment of Agriculture. Agricultural Research Service: http://www.ars.usda.gov/research/projects/projects.htm?ACCN_NO=420346Alcantara, M. (2007). Breve Revisin de los Marcadores Moleculares. En L. Eguiarte, V. Souza, & X. Aguirre, Ecologa Molecular (pgs. 541-565). Mxico D.F., Mxico: SEMANART.Arias, O. (2014). Caracterizacin de poblaciones de Fusarium spp. a partir de aislados de Israel y Estados Unidos. Sangolqu, Ecuador.Brinkman, F., & Leipe, D. (2001). Phylogenetic Analysis. En A. Baxevanis, & F. Ouellete, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Second Edition (pgs. 323-358). John Wiley & Sons, Inc.Buller, N. (2014). Bacteria and Fungi from Fish and other Aquatic Animals, 2nd Edition: A Practical Identification Manual. Boston, USA: CABI.Daughtrey. (2004). Disease Management for Floral and Nursery Crops. Obtenido de Long Island Horticultural & Extension Center. Cornell University: http://www.longislandhort.cornell.edu/staff/DaughtreyMargery2004.pdfDaughtrey, M., Wick, R., & Peterson, J. (1995). Compendium of flowering potted plant diseases. American Phytopathological Society (APS Press).Frankman, R., Ballou, J., & Briscoe, D. (2010). Introduction to Conservation Genetics. Nueva York: Cambridge University Press.Garrido, P. (2014). Molecular characterization of Phytium populations in ornamental greenhouse and nursery crops. Department of Entomology and Plant Pathology. Oklahoma State University. Obtenido de Department of Plant Pathology and Entomology. Oklahoma State University.Garzn, C., & Y. (s.f.). Pythium cryptoirregulare, a new species within the P. irregulare complex.Garzn, C., Geyser, D., & Moorman, G. (2005). Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis and Internal Transcribed Spacer and coxII Sequences Reveal a Species Boundary Within Pythium irregulare. Phytopathology 95, 1489-1498.Garzn, C., Yanz, J., & Moorman, G. (2007). Pythium cryptoirregulare, a new species within the P. irregulare complex. Mycologia 99, 291-301.Hall, C. (2006). The U.S. Floriculture Industry: Structural changes, marketing practices, and economic impact. Obtenido de Aggie-horticulture. Texas A&M University: http://aggie-horticulture.tamu.edu/faculty/hall/Media/Hall-paper.pdfKageyama, K. (2014). Molecular taxonomy and its application to ecological studies of Pythium species. J Gen Plant Pathol 80, 314-326.Laemmlen, F. (2001). Damping-off Diseases. Obtenido de University of California. Agriculture and Natural Resources: http://anrcatalog.ucdavis.edu/pdf/8041.pdfLazreg, F., Belabid, L., Sanchez, J., Gallego, E., Garrido, J., & Elhaitoum, A. (2013). First Report of Globisporangium ultimum Causing Pythium Damping-Off on Aleppo Pine in Algeria, Africa, and the Mediterranean Region. Plant Disease, 1111.Lee, S., & Moorman, G. (2008). Identification and characterization of simple sequence repeat markers for Pythium aphanidermatum , P . cryptoirregulare , and P . irregulare and the potential use in Pythium population genetics. Current Genetics 53, 81-93.Lee, S., Garzn, C., & Moorman, G. (2010). Genetic structure and distribution of Pythium aphanidermatum populations in Pennsylvania greenhouses based on analysis of AFLP and SSR markers. Mycologia 102, 774-784.Lvesque, A., & de Cock, A. (2004). Molecular phylogeny and taxonomy of the genus Pythium. Mycol. Res. 108, 1363-1383.Miah, G., Rafii, M., Ismail, M., Puteh, A., Rahim, H., Islam, N., & Latif, M. (2013). A Review of Microsatellite Markers and Their Applications in Rice Breeding Programs to Improve Blast Disease Resistance. Int. J. Mol. Sci 14, 22499-22528.Pico, B. (6 de Noviembre de 2014). Marcadores moleculares basados en PCR: Marcadores SSR. Microsatelites. Valencia, Espaa.Proao, M. F. (2014). Relacin filogentica de cepas de Phytium irregulare sensu lato de Long Island, New York en base al anlisis de secuencias del gen -tubulina. Sangolqu, Ecuador.Shete, S., Tiwari, H., & Elston, R. (2000). On Estimating the Heterozygosity and Polymorphism Information Content Value. Theoretica Population Biology 57, 265-271.Stafne, E., Clark, J., Weber, C., Graham, J., & Lewers, K. (2005). Simple Sequence Repeat (SSR) Markers for Genetic Mapping of Raspberry and Blackberry. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 130.Stettiner, O., & Gabor, R. (27 de Diciembre de 2001). Phylogenetics and Phylogenetics Trees. Obtenido de The Blavatnik School of Computer Science: http://www.cs.tau.ac.il/~rshamir/algmb/01/scribe08/lec08.pdfSutton, J., Sopher, C., Owen-Going, T., Liu, W., Grodzinski, B., Hall, J., & Benchimol, R. (2006). Etiology and epidemiology of Pythium root rot in hydroponic crops: current knowledge and perspectives. Summa Phytopathologica 32, 307-321.U. S. Bureau of Economic Analysis. (2015). Flower Industry Overview. Obtenido de About Flowers: http://www.aboutflowers.com/about-the-flower-industry/industry-overview.htmlUzuhashi, S., Tojo, M., & Kakishima, M. (2010). Phylogeny of the genus Pythium and description of new genera. Mycoscience 51, 337-365.White, T., Adams, W., & Neale, D. (2007). Forest Genetics. Cambridge, USA: CABI.
ANLISIS DE COSTOS DEL PROYECTO
En la Tabla 3 que se encuentra a continuacin se encuentran los gastos personales y del laboratorio en los que se incurrir durante el proyecto.
Tabla 4. Costos del Proyecto
Costos Personales
tem
Detalle
Cantidad
V. Unitario
V. Total
1
Pasaje de avin
(Ida y Vuelta)
1
$1100
$1100
2
Estada (mensual)
3
$350
$1050
3
Alimentacin (mensual)
3
$500
$1500
4
Gastos varios (mensual)
3
$350
$350
Total
$3900
Costos del Laboratorio
tem
Detalle
Uso
1
Kit de Extraccin de ADN
Extraccin de ADN
2
NanoDrop ND-1000
Determinacin de concentracin y pureza del ADN
3
Buffer PCR
PCR
4
Taq Polimerasa
5
dNTPs
6
Primers
7
Marcadores SSR
8
Termobloque
9
ABI 3730 DNA Analyzer
Electroforesis capilar
10
Micropipetas
Insumos Varios
11
Cmara de Flujo Laminar
12
Centrfuga
FINANCIAMIENTO DEL PROYECTO
Los costos personales y del viaje sern financiados por el responsable del proyecto: Christian Orlando Ayala Ortiz.
Todos los dems costos de ejecucin del proyecto incluyendo reactivos, materiales, equipos y softwares necesarios para la realizacin del mismo sern financiados por el Laboratorio del Departamento de Fitopatologa y Entomologa de la Universidad Estatal de Oklahoma a cargo de la Dra. Carla Garzn Ph.D.
CONTENIDO
PARTE INTRODUCTORIA
CAPTULO 1: INTRODUCCIN
Formulacin del Problema
Justificacin del Problema
Objetivos de la Investigacin
Objetivo General
Objetivos Especficos
Marco Terico
Globisporangium spp.
Taxonoma
Biologa
Enfermedad que causa
Marcadores Genticos
Marcadores SSR
Anlisis Filogentico
Hiptesis
CAPTULO 2: MATERIALES Y MTODOS
Revisin Bibliogrfica
Extraccin de ADN
Determinacin de la pureza y concentracin de los aislados
Dilucin del ADN
Anlisis gentico con marcadores SSR
PCR
Electroforesis capilar
Anlisis estadstico
CAPTULO 3: RESULTADOS
CAPTULO 4: DISCUSIN
CAPTULO 5: CONCLUSIONES
CAPTULO 6: RECOMENDACIONES
CAPTULO 7: BIBLIOGRAFA
ANEXOS
CRONOGRAMA
En la Figura 1 se observa el cronograma del proyecto elaborado en forma de un Diagrama de Gantt. El proyecto una duracin de 4 meses y est previsto a iniciar en la segunda semana de agosto.
Figura 1. Cronograma del Proyecto
FECHA DE PRESENTACIN DEL PROYECTO
16 de Julio del 2015
FIRMA DEL RESPONSABLE
___________________________
Christian Orlando Ayala Ortiz
CI: 1713535530
FECHA DE APROBACIN DEL PROYECTO
___________________________
FIRMA DE LA AUTORIDAD
___________________________
Dra. Mara Augusta Chvez
Coordinadora de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa
___________________________
Alma Koch M. Sc.
Posible Directora del Proyecto