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TESIS DOCTORAL
IDENTIFICACIÓN DE LAS VARIABLES BIOLÓGICAS
DETERMINANTES DE LA FARMACOCINÉTICA DEL FLUORURO
EN LA RATA. APLICACIÓN A LA MEDIDA DE LA
REMODELACIÓN ÓSEA.
Licenciada Maela Lupo
Director Alfredo Rigalli
Doctorado en Ciencias Biomédicas. Facultad de Ciencias Médicas
Universidad Nacional de Rosario
2012
2
A mi familia
3
AGRADECIMIENTOS
A mi director Alfredo Rigalli por continuar el camino que comenzamos en la
realización de mi tesina, con la oportunidad de realizar esta tesis junto a él. Por ser una
parte esencial en mi formación como profesional y como persona. Por siempre brindarme
su apoyo y sus conocimientos humildemente en todo momento. Es un inmenso orgullo
haber realizado mi tesis junto a él y se lo agradeceré eternamente. Y como siempre le digo,
gracias por ser el mejor Director del mundo!!
A Mercedes Lombarte y Brenda Fina gracias por ser tan buenas compañeras y
amigas. Por ayudarme en cada momento, escucharme, y porque sé que voy a contar con
ellas siempre.
A Mirta Armendáriz, Cristina Aguirre y Verónica Di Loreto por haber formado
una muy linda amistad, por ayudarme, escucharme y aconsejarme en todo lo que necesité.
A Lucas Brun y Lorena Brance por su gran colaboración en la parte
experimental, como en la de mi formación y por haber compartido tantos lindos momentos
juntos.
A Soledad, Bárbara, Florencia y Nicolás por haberme dejado ser con un gran
orgullo su co-tutora y por todo lo que he aprendido junto a ellos. También, gracias por la
hermosa amistad que hemos formado.
A Hilda Moreno por estar siempre dispuesta a ayudarme en todo momento y por
ser muy importante en la realización de la mayoría de mis experimentos. Y por ser una
excelente persona, junto a la cual he aprendido muchísimo.
A el resto de los miembros del laboratorio por ayudarme por medio de sus
preguntas, sus acotaciones y sus aportes, que hicieron muy interesante, productivo y único
el camino recorrido dentro de este laboratorio.
A mi familia y amigos por siempre apoyarme, aconsejarme, contenerme y ser
fundamentales en mi vida.
4
ÍNDICE
Agradecimientos ............................................................................................................................3
ÍNDICE .........................................................................................................................................4
RESUMEN ....................................................................................................................................8
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 10
Introducción................................................................................................................................. 11
Fluoruro ................................................................................................................................... 11
Metabolismo del F................................................................................................................ 12
Absorción del F .................................................................................................................... 13
F plasmático ......................................................................................................................... 13
Excreción renal .................................................................................................................... 14
Flúor óseo ............................................................................................................................ 14
Efectos tóxicos del F ............................................................................................................ 15
Modelo farmacocinético del F en la rata ............................................................................... 16
Tejido óseo .............................................................................................................................. 17
Composición del tejido óseo ................................................................................................. 18
Remodelación ósea............................................................................................................... 20
Diferentes formas de medición de la remodelación ósea ....................................................... 21
Estudios previos utilizando al F como trazador del tejido óseo .............................................. 23
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 25
Objetivos ..................................................................................................................................... 26
Objetivo general ....................................................................................................................... 26
Objetivos específicos planteados .............................................................................................. 26
MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 27
Materiales y Métodos ................................................................................................................... 28
Objetivo específico 1................................................................................................................ 28
Objetivo específico 2................................................................................................................ 30
Objetivo específico 3................................................................................................................ 31
5
Objetivo específico 4................................................................................................................ 33
Objetivo específico 5................................................................................................................ 36
RESULTADOS ........................................................................................................................... 38
Resultados ................................................................................................................................... 39
Objetivo específico 1................................................................................................................ 39
Correlación entre variables ................................................................................................... 39
Correlación realizada entre la velocidad de inyección del NaF y las fluoremias obtenidas a
distintos tiempos .................................................................................................................. 42
Efecto de la manipulación del animal y la excreción urinaria del F........................................ 43
Captación de F por glóbulos rojos in vitro ............................................................................ 43
Estudio de la distribución de F entre sangre y tejidos blandos ............................................... 44
Objetivo específico 2................................................................................................................ 47
Procedimiento de cálculo de Ro y Fo: ................................................................................... 53
Objetivo específico 3................................................................................................................ 55
Objetivo específico 4................................................................................................................ 56
Comparación de Ro con Deoxipiridinolina: .......................................................................... 57
Comparación de FAo y Fo: ................................................................................................... 59
Comparación de FA total y Fo: ............................................................................................. 60
Objetivo específico 5................................................................................................................ 63
En ausencia de dosis de fluoruro:.......................................................................................... 64
Luego de la dosis oral de NaF: ............................................................................................. 67
DISCUSIÓN ................................................................................................................................ 75
Discusión ..................................................................................................................................... 76
CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 80
Conclusiones ............................................................................................................................... 81
ANEXOS..................................................................................................................................... 82
Anexo I: Metodología general ...................................................................................................... 84
Peso corporal ....................................................................................................................... 84
Anestesia general ................................................................................................................. 84
6
Obtención de sangre ............................................................................................................. 84
Hidratación rectal ................................................................................................................. 84
Cateterismo intrauretral ........................................................................................................ 85
Inyección endovenosa de F ................................................................................................... 85
Modelos biológicos estudiados ................................................................................................. 85
Ratas ovariectomizadas (OVX) ............................................................................................ 86
Tratamiento antiresortivo (OVX+Z) ..................................................................................... 86
Ovariectomía más dieta hipocálcica (OVX+Hipo) ................................................................ 86
Ovariectomía más dieta hipercálcica (OVX+Hiper) .............................................................. 86
Determinación de fluoruro, flúor ácido lábil y flúor ligado por enlaces resistente al tratamiento
con ácidos. ............................................................................................................................... 87
Perfeccionamiento de la técnica de destilación isotérmica para la medición de flúor ............. 87
Diferentes formas químicas en las que se encuentra el flúor en las muestras biológicas ............. 88
Medición de fluoruro en orina por potenciometría directa ..................................................... 90
Medición de flúor por potenciometría directa previa destilación isotérmica ........................... 90
Medición de flúor por potenciometría directa previa calcinación y destilación isotérmica ..... 91
ANEXO II: Metodología específica aplicable a cada objetivo ....................................................... 92
ANEXOII: Metodología específica aplicable a cada objetivo........................................................ 93
Metodología utilizada en el objetivo 1 ...................................................................................... 93
Cálculo de los parámetros farmacocinéticos del F ................................................................. 93
Determinación de la excreción fecal de flúor ........................................................................ 95
Determinación de la excreción urinaria de F ......................................................................... 95
Determinación de flúor en el alimento .................................................................................. 95
Velocidad de inyección intravenosa de F .............................................................................. 96
Efecto de la manipulación previa de los animales sobre la excreción urinaria de F ................ 96
Distribución de fluoruro entre plasma y glóbulos rojos ......................................................... 97
Estudio de la distribución de F entre sangre y tejidos blandos ............................................... 97
Histomorfometría estática ..................................................................................................... 97
Medida de deoxipiridinolina urinaria (Dpd) .............................................................................. 99
7
ANEXO III: Producción científica ............................................................................................. 101
Anexo III: Producción científica................................................................................................. 102
Trabajos publicados ............................................................................................................... 102
Capítulos de libros relacionados al tema de tesis ..................................................................... 102
Abstract publicados ................................................................................................................ 103
Premios recibidos ................................................................................................................... 104
Trabajos presentados a congresos ........................................................................................... 105
Asistencia a congresos, seminarios y jornadas ........................................................................ 108
TABLA DE ABREVIATURAS ................................................................................................. 109
REFERENCIAS ........................................................................................................................ 111
Referencias ................................................................................................................................ 112
8
RESUMEN
En este trabajo de tesis se demostró que los parámetros farmacocinéticos del
fluoruro (F) son un recurso adecuado para la medida de la formación y la resorción del
tejido óseo. El F es un ión con afinidad por dicho tejido, y luego de una dosis oral es
absorbido a nivel gastrointestinal, pasa a la sangre de donde es eliminado por captación
ósea y excreción renal. La concentración plasmática y urinaria de flúor pueden ser
descriptas a partir de ecuaciones diferenciales que permiten la obtención de un modelo
matemático que ajusta los cambios de dichas concentraciones luego de una dosis oral de F.
Resultados obtenidos en trabajos anteriores a esta tesis hicieron sospechar que los
parámetros farmacocinéticos estarían dependiendo de factores aun no estudiados y, por
ende afectarían a la medida de la remodelación ósea.
Los objetivos de esta tesis fueron 1) identificar los factores que podrían influir
sobre los parámetros farmacocinéticos, 2) desarrollar y validar un modelo matemático para
estimar la remodelación ósea a partir de los parámetros farmacocinéticos del F luego de
una dosis endovenosa y 3) adaptar el modelo farmacocinético para la medición de la
remodelación ósea en ratas luego de una dosis oral. Este último objetivo deja un camino
abierto para su aplicación en seres humanos, ya que el F puede ser administrado por vía
oral en seres humanos.
Se realizaron experimentos en ratas de diferente sexo y edad, con o sin alteraciones
de la remodelación ósea por modificaciones dietarias o por procedimientos quirúrgicos. Se
correlacionaron diferentes variables medidas a lo largo del experimento con los parámetros
farmacocinéticos del F (ke: constante eliminación plasmática de F, ku: constante de
excreción urinaria de F y ko+: constante de incorporación ósea de F).
Los resultados mostraron que: ke se correlacionó negativamente con la fluoremia
basal (p=0.0075, n=57, r=-0.35) y positivamente con la fluoremia a los 3 min de la
inyección endovenosa (p=0.0006, n=57, r=0.45). Contrariamente, el valor de ke se halló
negativamente correlacionado con la fluoremia a los 18 min de la dosis endovenosa
(p=0.0007, n=57, r=-0.44) y la fluoremia a los 33 min (p=0.0046, n=57, r=-0.37). ku se
halló correlacionada con el volumen de agua consumido durante la experiencia (p=0.05,
n=18, r=-0.46) y el contenido de flúor en el alimento (p=0.03, n=18, r=0.51).
9
Teniendo en cuenta las variables mencionadas se desarrolló un modelo matemático
para estimar las constantes farmacocinéticas del F, y a través de ellas la resorción y
formación ósea, luego de administrar una dosis endovenosa de F. Este modelo se validó en
ratas normales, en ratas con ovariectomía (ovx), en ratas ovx en tratamiento con dieta
hipocálcica, en ratas ovx en tratamiento con dieta hipercálcica y en ratas ovx en
tratamiento con zoledronato. En los mismos animales se midió excreción de
deoxipiridinolina urinaria y fosfatasa alcalina ósea plasmática, como marcadores
bioquímicos de resorción y formación ósea, respectivamente.
En adelante se denominarán Ro y Fo a las medidas de resorción y formación ósea,
respectivamente, obtenidas utilizando el modelo matemático desarrollado en esta tesis. Se
realizó un análisis de curvas ROC de la medida de Ro y Fo que permitió determinar la
sensibilidad, especificidad y precisión de la técnica y compararla con técnicas aceptadas
para medida de la remodelación ósea, como deoxipiridinolina y fosfatasa alcalina ósea. El
análisis ROC demostró que la precisión de la técnica desarrollada en esta tesis, medida por
el área bajo la curva ROC (AUC) no difiere significativamente de la precisión de la
fosfatasa alcalina ósea cuando se mide formación ósea (AUC para fosfatasa alcalina ósea=
0.57, AUC para Fo= 0.64, p=0.328) tampoco difiere significativamente cuando se
comparan las mediciones de la resorción ósea (AUC para deoxipiridinolina= 0.79, AUC
para Ro= 0.6, p=0.897). Los resultados indican que la técnica permite detectar cambios en
el remodelado óseo y presenta ciertas ventajas sobre otras técnicas como los marcadores
bioquímicos, trazadores radiactivos e histomorfometría. Entre algunas ventajas cabe
mencionar: menor costo, medida simultánea de formación y resorción ósea, uso de drogas
sin tiempo de vencimiento y no radiactivas.
También, se desarrolló un modelo matemático y la metodología para medir la Fo y
Ro a partir de los parámetros farmacocinéticos obtenidos luego de una dosis oral de F. La
ventaja de esta técnica sobre la que involucra inyección endovenosa de F, es que podría ser
adaptada para la medida de Ro y Fo en seres humanos. Esta última metodología se validó
en modelos biológicos, ratas Sprague Dalwey con remodelado óseo normal, con
remodelación ósea aumentada (ovx en tratamiento con dieta hipocálcica) y con
remodelación ósea disminuida (ovx en tratamiento con zoledronato). Los resultados fueron
coincidentes para cada modelo biológico estudiado. Estos últimos resultados dejan abierto
el camino para futuros trabajos en los que se investigue la aplicación de esta técnica a la
medición de la resorción y formación ósea en seres humanos.
10
INTRODUCCIÓN
11
INTRODUCCIÓN
Fluoruro
Aclaración: en el desarrollo de esta tesis se nombrarán diferentes formas químicas
en las cuales el flúor se encuentra en la naturaleza (ver ANEXO I, pág. 87). Cada forma
química se nombrará de la siguiente manera: Flúor: cuando hablemos del elemento en
general o cuando nos refiramos al contenido del elemento en algún medio sin importar la
forma química. Utilizaremos fluoruro y su abreviatura F, cuando hagamos referencia al
flúor iónico formando parte de compuestos inorgánicos solubles en agua. El término flúor
ácido lábil o su abreviatura FAL: cuando se mencionen compuestos que contengan flúor
unido por uniones que se destruyen por el tratamiento con ácidos fuertes. Por último, se
utilizará el término flúor ácido resistente (FAR): cuando se haga referencia a aquellos
compuestos que contienen flúor unido de forma covalente y dicho enlace no es afectado
por ácidos fuertes.
La corteza terrestre contiene 300 mg de flúor por cada kilogramo de la misma (300
partes por millón, ppm) y se encuentra formando parte de rocas y sales, como el fluoruro
de calcio, fluoraluminato de calcio y principalmente como fluoruro de sodio (NaF). Dada
la elevada electronegatividad del flúor se lo encuentra habitualmente reducido al estado de
F en minerales, aunque también puede formar parte de compuestos orgánicos. El F ingresa
al organismo en forma espontánea o como recurso terapéutico, siendo la forma más común
la ingestión con el agua de bebida. Con respecto a esta última, la Organización Mundial de
la Salud (OMS) recomienda la ingestión de aguas cuyo contenido de F no supere 1.5 ppm
[1,2]. Además del agua, otras formas de incorporación de flúor al organismo son algunos
alimentos como los peces, el té y los vegetales de zonas con suelos ricos en F o zonas con
alta concentración de flúor en el aire [3,4,5
]. Aún con todas las fuentes naturales disponibles
de incorporación de flúor al organismo, el total de F incorporado es en la gran mayoría de
los casos menor a la dosis letal, la cual es 4 g por vía oral [6]. Sin embargo, ciertos efectos
adversos del F pueden presentarse con concentraciones miles de veces menores a la dosis
letal.
Las dosis terapéuticas utilizadas principalmente para el tratamiento de
osteoporosis, enfermedad de Paget [7] y de lesiones óseas por mieloma múltiple [
8,9],
oscilan entre 5 y 50 mg de F por día. En la última década, se ha disminuido el uso del F en
el tratamiento de patologías óseas, principalmente por el avance de la medicina y el
12
descubrimiento de nuevas drogas con la misma o mejor acción terapéutica.
El uso del F en la prevención de caries dentales sigue vigente y es utilizado en
forma tópica sobre el esmalte dental [10
]. Los métodos eficaces incluyen el uso de
dentífricos, colutorios y barnices [11
]. Su uso se fundamenta en que el F reemplaza al
oxhidrilo en el cristal de hidroxiapatita: Ca10(PO4)6(OH)2 [12
], transformándolo en
fluorapatita: Ca10(PO4)6F2 [13
], un cristal de menor solubilidad. Además, tiene efecto
bactericida que se logra con las concentraciones halladas en estos materiales. Por ello, la
fluoración de aguas de consumo ha sido una práctica habitual, que en la actualidad está
siendo reanalizada [14,15
].
Metabolismo del F
El F es la principal forma química en la que este elemento ingresa al organismo y
puede tener efectos biológicos. La farmacocinética del F y la mayoría de sus efectos
biológicos se conocen desde hace décadas y han sido descriptos en revisiones muy
completas [16
]. A pesar del extenso estudio sobre el tema en la actualidad se están
describiendo nuevos efectos y se han realizado revisiones actualizadas [17
].
El ingreso de F al organismo es principalmente por vía digestiva y en menor
medida por vía respiratoria. Se distribuye en sangre y tejidos blandos, siendo eliminado del
plasma a través de la captación ósea y la excreción renal. La concentración plasmática de F
es constante dependiendo de la exposición previa. Luego del ingreso de F al organismo se
produce un rápido incremento de la concentración plasmática, y pocas horas después de la
ingesta de F los niveles plasmáticos retornan a los valores basales quedando una
proporción variable del mismo retenida en el tejido óseo, dicha proporción depende del
metabolismo de este tejido. Por esta razón el F es un buen trazador del metabolismo óseo
(ver más abajo). La Ilustración 1 resume los principales componentes del metabolismo del
F en el organismo humano. En los párrafos siguientes se amplían los conceptos referentes a
los procesos farmacocinéticos del F.
13
Ilustración 1: Metabolismo del F. Luego de una dosis de F (Do) se distribuye en sangre (F) y
luego se depura reteniéndose en hueso (Fo) o se excreta en orina (U).
Absorción del F
Luego de la administración de una dosis oral, la absorción del F comienza en el
estómago como ácido fluorhídrico, especialmente si el pH es menor de 4.4 [18
], mientras
que en el intestino es absorbido rápidamente por difusión simple, sin ser afectado por el
pH. Este proceso de absorción en el estómago e intestino se lleva a cabo en un período
variable en el hombre [19
] y la rata [20
]. Las sales de calcio disminuyen la absorción [21
], al
igual que los cationes trivalentes del aluminio, hierro y cromo [22
]. La fracción no
absorbida (menos del 20% de la dosis) es excretada en la materia fecal. La absorción
intestinal de F se auto-inhibe cuando la concentración supera los 50 mmol/L,
concentración que se alcanza cuando un comprimido conteniendo 10-20 mg de F se ingiere
con un vaso de agua [23
].
F plasmático
Luego de una dosis oral o intravenosa, el F se distribuye rápidamente en los tejidos
blandos, sin mostrar un proceso significativo en lo que respecta a su fijación a las proteínas
[24,25
], además se distribuye de manera similar en eritrocitos y plasma [26
]. En ayuno la
concentración de F plasmático, mantiene un estado estacionario con concentraciones que
oscilan entre 0.1 y 2 mol/L, siendo despreciable la concentración de ácido fluorhídrico
[27
]. La fluoremia va aumentando con la edad en ambos sexos [26
], fenómeno que se
14
evidencia al analizarla durante periodos de más de 10 años de duración. Luego de una
dosis terapéutica (5-50 mg de F) la concentración plasmática de F puede alcanzar hasta 40
mol/L en el hombre. La fluoremia es influenciada fundamentalmente por el contenido de
flúor óseo, la velocidad de filtración glomerular, la actividad paratiroidea, la vitamina D,
las lesiones osteolíticas y el efecto de la calcitonina [28
].
Excreción renal
La orina es la principal vía de excreción del F [29
]. Una pequeña fracción se excreta
por saliva, pero el F excretado por esta vía es recirculado por absorción gástrica o
intestinal. La excreción urinaria disminuye en casos de acidosis. Cuando se ingieren sales
de aluminio la excreción de F aumenta dado que filtra formando iones complejos con el
aluminio, impidiendo su reabsorción. El F puede sufrir absorción en vejiga si el pH
urinario es inferior a 5 [30
].
Flúor óseo
El F reemplaza al oxhidrilo en el cristal de hidroxiapatita y genera fluorapatita. La
cantidad de F depositado en el mineral óseo depende de la edad, cantidad de F en
alimentos y período durante el cual se realizó la ingesta. Una vez incorporado al mineral
óseo, el F puede permanecer largos períodos de tiempo dentro del hueso, dado que la vida
media del F en este tejido es de 8-9 años [31
]. La prolongada vida media del F en el hueso,
en parte, es debida a que es liberado durante el proceso de resorción ósea, además gran
parte del F liberado es re-captado por el mismo tejido óseo. Esta última observación ha
sido comprobada en ratas jóvenes en crecimiento donde el 50-70% del F óseo liberado del
tejido por el proceso de resorción se redeposita en el hueso [32
]. Si bien cuando el
contenido de F es bajo, el hueso es completamente normal, cuando la concentración de F
óseo es elevada, el hueso formado está poco mineralizado y posee una mala organización
histológica, con alto contenido de osteoide [33
]. Esto afecta a las propiedades biomecánicas
del hueso, generando menor deformabilidad y mayor fragilidad [34
]. Por otra parte, el F
puede interferir en procesos bioquímicos y celulares, produciendo la síntesis de colágeno
anormal [35
], aumento del número de osteoblastos [36
] y aumento de la actividad
osteoclástica. En general se ha demostrado que estos son efectos dosis dependientes.
Cuando la ingesta no es excesiva, como ocurre a través del agua de bebida, se han
observado algunos efectos beneficiosos sobre el esqueleto en mujeres que consumieron
agua de bebida con concentraciones de F cercanas al límite superior expresado por la OMS
15
[37
]. En estos casos se observó menor frecuencia de fracturas vertebrales que en mujeres de
poblaciones donde el contenido de F en agua era menor [38
]. Por otra parte, con las
concentraciones mencionadas en el agua de bebida, no se ha encontrado diferencia en el
crecimiento del esqueleto en mujeres jóvenes [39
].
Muchos trabajos y por diferentes métodos describen aumento de tejido óseo,
disminución de la resorción, aumento de la densidad mineral, disminución de dolores óseos
y de la frecuencia de fracturas en tratamientos crónicos con F [40
]. En todos estos trabajos
se observa que la presentación de las mejorías requiere al menos un año de tratamiento. Si
bien los efectos son generales sobre el esqueleto, estos varían según la porción considerada
del mismo [41
].
Efectos tóxicos del F
Son más los efectos adversos descriptos en trabajos de investigación que los
trabajos que indican algún efecto beneficioso, más allá de los mencionados a nivel dental.
La contradicción en los resultados ha sido una constante en la bibliografía a lo largo de casi
100 años de investigación. Varios autores han descripto un cuadro de hiperparatiroidismo
en diferentes especies estudiadas: en ovejas [42
], humanos [43
] y ratas [44
]. Existen estudios
que no hallan esta manifestación [45
]. La principal complicación por la elevada ingesta de F
es la fluorosis, caracterizado por osteoesclerosis, endo y exostosis [46
], con deformaciones
óseas en los miembros inferiores, y dolores articulares [47
]. A nivel del sistema digestivo, la
dispepsia, gastritis y úlcera gástrica [48
] son otros efectos adversos comunes. Menos
comunes son las alteraciones hepáticas [49
], dermatitis y urticaria [50
], diarrea, alteraciones
de glándulas salivales, estomatitis y úlceras resistentes a antibióticos. Por otra parte el F es
un conocido inhibidor del metabolismo intermedio, especialmente de la glucólisis, por
inhibición de la enzima enolasa [51
]. Las dosis con que se presentan los efectos
mencionados son muy variables, pudiendo variar desde concentraciones de µmol/L hasta
mmol/L.
El F tiene efecto modulador sobre las proteínas G y la enzima adenilil ciclasa [52
],
estos efectos se demostraron a nivel de glándulas paratiroides [53
] y páncreas [54
]. Sin
embargo, los resultados no siempre han sido coincidentes, y fueron dosis dependiente [55
].
La ingestión de F a través del agua de bebida o en forma de sales con F para el tratamiento
de osteoporosis, produce disminución de la secreción de insulina [56
] o de la acción de esta
hormona a nivel de los tejidos blanco [57,58,59
]. Este efecto fue corroborado por estudios
16
sobre humanos que viven en zonas de fluorosis [60,61
].
Modelo farmacocinético del F en la rata
La farmacocinética del F ha sido estudiada en la rata y en seres humanos. En estos
estudios se desarrolló un modelo farmacocinético, y se caracterizaron y calcularon las
constantes de velocidad de los procesos involucrados [62
].
Luego de una dosis oral, el F es absorbido a nivel gástrico e intestinal, pasa a la
sangre de donde es eliminado por captación ósea y excreción renal. La Ilustración 2
muestra los procesos mencionados, junto con las constantes de velocidad de los mismos.
Estos procesos son representados utilizando ecuaciones diferenciales descriptas a
continuación.
Ilustración 2: Luego de una dosis oral (Do), el fluoruro es absorbido a nivel del tracto
gastrointestinal (TGI), pasa a la sangre (F) de donde es eliminado por captación ósea y excreción
renal, encontrándose de esta manera fluoruro en orina (U) y en hueso (Fo). Cada proceso está
caracterizado por una constante de velocidad: ka: constante de absorción gastrointestinal de F, ko+:
constante de captación ósea del F, ko-: constante de eliminación ósea de F, y ku: constante de
excreción urinaria de F.
La Ecuación 1 representa la velocidad de cambio de la cantidad de F en el tracto
gastrointestinal (D). La Ecuación 2 expresa la velocidad de cambio de la cantidad de F en
plasma (F) y la Ecuación 3 representa el cambio de la cantidad de F en orina (U) luego de
haber ingerido una dosis oral de F.
17
kaDdt
dD
Ecuación 1
óseoFkokuFFkodt
dF
Ecuación 2
kuFdt
dU
Ecuación 3
La Ecuación 2 muestra claramente el efecto del metabolismo óseo sobre la
concentración de F en plasma. El remodelado óseo es un proceso que influye de manera
significativa sobre la farmacocinética del F. En los siguientes párrafos se hace una breve
descripción del tejido y metabolismo óseo.
Tejido óseo
El tejido óseo [63
,64
] es un tipo de tejido conectivo que forma los huesos y participa
en funciones de protección, sostén, locomoción y en la homeostasis del metabolismo
mineral, especialmente del calcio y fósforo. Este tejido concentra la mayor parte de los
minerales del organismo y está sometido a la acción de factores físicos (fuerzas), químicos
(hormonas, citoquinas) y celulares. El tejido óseo forma distintos tipos de huesos: planos,
cortos y largos, clasificación que se hace en base a su morfología. Estos huesos pueden
tener dos formas de tejido óseo: el compacto o cortical y el esponjoso o trabecular, que
tienen la misma composición, pero diferente distribución microscópica. Pueden originarse
a partir de dos procesos que conducen prácticamente al mismo resultado: la osificación
intramembranosa y la osificación endocondral. Los huesos largos están formados por dos
extremidades, llamadas epífisis, y un cuerpo cilíndrico llamado diáfisis. La metáfisis es la
zona de pasaje progresivo de epífisis a diáfisis. La epífisis y la metáfisis están separadas
por el cartílago de crecimiento que es el responsable del crecimiento longitudinal del
hueso. La parte externa de los huesos está formada por una capa de hueso compacto, en el
cual el 80-90% es tejido calcificado. El hueso compacto predomina en la diáfisis. Hacia la
metáfisis y epífisis la corteza se torna progresivamente más fina y el espacio interno es
llenado por el hueso esponjoso que consiste en una red de finas trabéculas calcificadas. El
hueso esponjoso es responsable de la actividad metabólica y la participación del hueso en
la homeostasis del metabolismo mineral. Se presenta calcificado en un 15-25% y el
volumen remanente está ocupado por la médula ósea, las células óseas y una porción de
18
matriz no mineralizada conocida como osteoide.
La superficie externa del hueso está cubierta por una capa de tejido fibroso que
contiene células osteoprogenitoras y representa el periostio. La superficie interna está
recubierta también por células osteoprogenitoras y representa el endostio. El 70 al 80% del
endostio está cubriendo el hueso trabecular.
Composición del tejido óseo
El tejido óseo está formado por una matriz extracelular mineralizada y células.
Matriz extracelular: está constituida por una sustancia fundamental y por proteínas.
La sustancia fundamental está constituida por glicoproteínas y proteoglicanos. De las
proteínas, el 85-90 % es colágeno tipo I. Luego de su síntesis en el retículo endoplásmico
rugoso, la proteína es translocada al lumen del retículo y una secuencia líder de 20
aminoácidos es eliminada. Aun así le queda una porción amino terminal de 25 kDa
(propéptido N-terminal, NPP1), una fracción de 100 kDa que dará origen a la molécula de
colágeno y un propéptido C-terminal de 35 kDa. Las secuencias no colágenas de los
extremos C-terminal se asocian por puentes disulfuro, esta asociación progresa hacia el
extremo N-terminal, y las tres cadenas se arreglan en una triple hélice. Los dos propéptidos
mencionados favorecen el empaquetamiento de la triple hélice, luego se remueven
extracelularmente, quedando atrapados en la matriz o bien son liberados a la circulación,
siendo su concentración una medida de la formación ósea. Antes de la secreción, el
colágeno sufre diferentes modificaciones postraduccionales, entre las que se pueden
mencionar: la hidroxilación, de lisina que luego se unirá a glucosa y galactosa; o de
prolina, llevada a cabo por la enzima prolil hidroxilasa que forma hidroxiprolina por
hidroxilación en posición 4 del anillo de prolina. Finalmente, el colágeno se empaqueta en
gránulos y es secretado al exterior. El colágeno tipo I es insoluble por la presencia de
enlaces covalentes intra e intercatenarios. Estos enlaces se producen por acción de la
enzima lisil oxidasa que forma anillos de piridinolina. Estos anillos son liberados durante
la degradación del colágeno originando deoxipiridinolina (Dpd) que es un marcador de
resorción ósea. La Dpd es originada exclusivamente a partir de colágeno tipo I y es
excretada en orina sin metabolización. Además del colágeno, en el tejido óseo se
encuentran un 10-15% de proteínas no colágenas generalmente de bajo peso molecular y
un cuarto de las mismas son proteínas no óseas atrapadas en la matriz. Las proteínas no
colágenas se pueden agrupar en 4 grupos:
19
- proteínas de unión celular: fibronectina, trombospondina, osteopontina,
sialoproteína ósea.
- proteoglicanos: contienen glicosaminoglicanos unidos a un corazón proteico,
existen varios tipos: el biglican y el decorin. El decorin se une al colágeno y regula la
formación de la fibrilla de colágeno. En el hueso se encuentra el condroitín sulfato y
heparán sulfato.
- gama carboxiproteína: la osteocalcina y la proteína Gla de la matriz que se
encuentran en cartílago y hueso. La osteocalcina es producida por el osteoblasto y su
concentración plasmática es una medida del proceso de formación ósea.
- proteínas relacionadas con el crecimiento: osteonectina.
Mineral óseo: El principal componente mineral del tejido óseo es la hidroxiapatita,
cuya estructura es Ca10(PO4)6(OH)2. Puede sufrir sustitución del oxhidrilo por F generando
fluorapatita: Ca10(PO4)6F2. En el organismo hay alrededor de 1000 g de calcio
distribuyéndose el 99% en el esqueleto y el 1% en el líquido extracelular con
concentraciones cercanas a 2.5 mmol/L. Por otra parte, en el espacio intracelular la
concentración se halla en el rango 0.1-1 mol/L. El calcio plasmático se distribuye un 50%
ionizado, un 40% ligado a proteínas y un 10 % ligado a otros complejantes como el citrato.
La concentración de calcio es regulada por la acción de hormonas como la hormona
paratiroidea (PTH), la calcitonina y el 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3), siendo el
calcio iónico el valor censado por los receptores de las células paratiroideas.
El 90-99% del calcio intracelular está en la mitocondria y microsomas unido a
fosfato orgánico o inorgánico. Es mantenido por sistemas activos y canales ubicados en:
membrana citoplasmática, membrana interna de la mitocondria y en microsomas. El calcio
intracelular acopla el estímulo nervioso con la contracción del músculo estriado y cardíaco.
Actúa como segundo mensajero en las vías de la calmodulina y la C-kinasa, pero no en la
vía de la adenilil ciclasa – AMPc. Sin embargo, tiene efecto modulador de esta última vía
de señalización.
Células óseas: El hueso tiene tres tipos fundamentales de células: osteoblastos,
osteocitos y osteoclastos. Los osteocitos se originan de los osteoblastos. Tienen finas
prolongaciones que están en contacto con otras prolongaciones de otros osteocitos,
osteoblastos o células recubridoras del endostio y periostio.
Los osteoblastos son las células responsables de la producción de colágeno y de la
20
sustancia fundamental. Se originan a partir de células del mesénquima, que se diferencian
primero a preosteoblastos y luego a osteoblastos. Los osteoblastos expresan fosfatasa
alcalina en su membrana plasmática. La actividad de esta enzima en plasma es una medida
de la magnitud del proceso de formación ósea. Presentan prolongaciones que se dirigen
hacia el osteoide y están en contacto a través de ellas con los osteocitos. Tienen receptores
para la PTH pero no tienen receptores para calcitonina.
El osteoclasto es una célula multinucleada responsable de la resorción ósea, que se
encuentra en contacto con la superficie calcificada, en la cavidad que él mismo crea, sitio
conocido como laguna de Howship. El osteoclasto se encuentra fundamentalmente en la
superficie endosteal y en los sistemas Haversianos, excepcionalmente se lo encuentra en la
superficie perióstica. Presentan un borde en cepillo orientado hacia el tejido calcificado,
delimitando una cavidad entre el borde en cepillo y el tejido calcificado. Hacia esta
cavidad se bombean protones y transportan enzimas como la fosfatasa ácida tartrato
resistente (TRAP) que participarán en el proceso de disolución del mineral y degradación
de la matriz orgánica, proceso que en conjunto se conoce como resorción ósea. Por esta
razón los niveles plasmáticos de TRAP son una medida del proceso de resorción ósea. Este
proceso libera moléculas como la Dpd y los telopéptidos C-terminales (CTX) y N-
terminales del colágeno (NTX), razón por la cual la concentración de estas sustancias es
estimadora del proceso de resorción ósea. Los CTX son los péptidos de la región no
helicoidal del colágeno tipo I, mientras que los NTX son péptidos de la región N-terminal.
El osteoclasto tiene en su membrana receptores de calcitonina, pero no tiene receptores
para la PTH. Presenta receptores nucleares de estrógenos pero no de vitamina D3. Los
precursores de los osteoclastos expresan en su membrana el receptor activador del factor
nuclear κ β (RANK), que puede interaccionar con la proteína RANK ligando (RANKL)
producida por el osteoblasto. Esta interacción inicia una cascada de señalización que
produce la diferenciación y proliferación de osteoclastos, con la consecuente degradación
de la matriz ósea. Además, el osteoblasto produce osteoprotegerina (OPG), una proteína
dimérica cuyos dominios presentan homología con el receptor RANK, actuando como un
receptor señuelo y disminuyendo la acción de RANKL sobre el receptor RANK.
Remodelación ósea
Como se mencionó en párrafos anteriores, el tejido óseo se origina por dos
mecanismos: osificación intramembranosa y osificación endocondral. Ambos procesos
conducen a la formación de un mismo tipo de hueso, que luego se mantiene por el proceso
21
de remodelación ósea, por el cual el tejido óseo se renueva. La remodelación ósea consta
de dos procesos básicos que son: la resorción o remoción de tejido óseo y la formación de
nuevo tejido en su lugar (siempre la resorción precede a la formación). La secuencia de
remodelación puede dividirse en varias etapas: activación, resorción y formación. Entre la
etapa de resorción y la de formación, se da un proceso conocido como fase de reversión, en
el cual las células mononucleares, como macrófagos, forman una capa de cemento que une
el hueso neoformado con el tejido óseo existente.
Una vez formada la matriz ósea, el hueso se calcifica, proceso que se inicia por
vesículas de matriz exocitadas por osteoblastos, los cuales actúan como núcleos de
cristalización. La velocidad de mineralización depende de la presencia de pirofosfato,
proteínas no colágenas acídicas de la matriz ósea y de la expresión de fosfatasa alcalina en
la membrana del osteoblasto.
Normalmente los procesos de resorción y formación ósea están acoplados, es decir
la resorción y formación proceden en igual magnitud. Estos procesos mantienen la
estructura del hueso, removiendo hueso antiguo con defectos o con microfracturas y
rellenando el sitio con tejido óseo nuevo [65
]. En algunas patologías el proceso de
remodelación puede estar aumentado o disminuido respecto del valor normal, no siendo
ninguna de las dos situaciones deseables.
La medición de la remodelación ósea es un proceso que ha sido encarado de
maneras diferentes, dependiendo si se trata de necesidades clínicas o de investigación
básica.
Diferentes formas de medición de la remodelación ósea
Existen diversas formas de evaluar el estado del remodelado óseo, teniendo
ventajas y desventajas, haciendo que puedan ser algunas de ellas más útiles que otras en
ciertas circunstancias.
Una técnica utilizada para la determinación de la remodelación ósea es la
histomorfometría ósea [66
]. Este estudio puede ser estático o dinámico. La
histomorfometría ósea requiere de toma de biopsias óseas y del procesamiento del material
con técnicas histológicas convencionales para tejidos blandos. Por otra parte, la
histomorfometría dinámica se realiza sobre cortes histológicos de hueso sin desmineralizar,
incluido en metilmetacrilato y teñidos con azul de toluidina. El análisis de los resultados
puede dar medidas de la remodelación ósea respecto de la zona donde se obtuvo la biopsia.
22
Esta característica es tanto una ventaja, si se desea evaluar un foco de lesión localizado,
como una desventaja si se está intentando conseguir una medida del proceso de
remodelado global del organismo. Existen diferentes tipos de índices: estáticos y
dinámicos. Los parámetros que se pueden medir son numerosos y la aparición de software
de análisis de imágenes ha contribuido a hacer estas mediciones de manera cuantitativa.
Otra forma de estimar la remodelación ósea es a través de la medición de la
concentración de sustancias producidas durante el proceso de formación ósea o el proceso
de resorción indicando el estado metabólico del tejido óseo. Existen marcadores de
resorción y de formación ósea. Los marcadores de formación más utilizados son: la
osteocalcina (BGP) [67
], la fosfatasa alcalina total (FA), la fosfatasa alcalina ósea (FAo) [68
]
y los propéptidos N terminales del procolágeno (NPP1). Entre los marcadores de resorción,
en la actualidad se dispone de: hidroxiprolina (HYPRO) [69
], deoxipiridinolina (Dpd) [70
],
telopéptidos N-terminales del colágeno (NTX) [71
], telopéptidos C-terminales del colágeno
(CTX) [72
] y fosfatasa ácida tartrato resistente del osteoclasto (TRAP). La relación de estos
marcadores y los procesos de formación y resorción ósea a cargo de los osteoblastos y
osteoclastos, respectivamente, se resume en Ilustración 3.
Ilustración 3: Marcadores de formación ósea: BGP (osteocalcina), NPP1 (propéptidos N-
terminales del procolágeno), FAo (fosfatasa alcalina ósea), F (fluoruro), MBP (metil bisfosfonato
radiactivo), Ca45 (calcio radiactivo) y Sr (estroncio). Los marcadores de resorción son: TRAP
(fosfatasa ácida tartrato resistente), CTX (telopépticos C-terminales del colágeno), NTX
(telopéptidos N-terminales del colágeno), Dpd (deoxipiridinolina) e HYPRO (hidroxiprolina).
23
Las concentraciones de estos marcadores bioquímicos de resorción y formación
ósea se detectan habitualmente por enzimo inmuno ensayos (ELISA), por técnicas
inmunoradiométricas (IRMA), por radioinmuno ensayos (RIA) o por cromatografía líquida
de alta presión (HPLC). Existen diversas marcas comerciales y tipos de ensayos para cada
uno. Los valores de referencia dependen de las marcas comerciales y de la metodología
utilizada. Son de amplia aplicación en la clínica porque dan una medida global del
esqueleto, pero sus datos no siempre se correlacionan con la clínica o la realidad dentro del
tejido óseo. Una desventaja adicional es el elevado costo de los equipos de determinación.
Existen iones que tienen afinidad específica por el tejido óseo y pueden ser
utilizados como trazadores de dicho tejido. La captación ósea de calcio radiactivo (Ca45)
[73
] y la de bisfosfonatos marcados (MBP) han sido utilizadas como medida de la
remodelación ósea [74,75
].
Existen otros iones que pueden ser intercambiados por otras partes del cristal, tal es
el caso del estroncio y del F.
Estudios previos utilizando al F como trazador del tejido óseo
Como se describió anteriormente, luego de una dosis oral de F (Do), una parte
queda retenida en el hueso (F óseo) y el remanente se excreta por orina (U). La excreción
urinaria de una dosis oral de F se completa en más de un 90% en las primeras 24 h. El
porcentaje de retención corporal de F (%RCF):
100%
Do
UDo=RCF
Ecuación 4
ha sido utilizado para estimar el proceso de remodelado óseo en mujeres
postmenopáusicas [76
], teniendo efectividad en detectar estados de alto y bajo remodelado,
pero careciendo de sensibilidad para discriminar pequeños cambios en el estado de
remodelación ósea. En el trabajo citado se comparó el %RCF, luego de una dosis oral de F,
con la captación de metil-bisfosfonato marcado con 99m
Tc, un trazador radiactivo del tejido
óseo que ha sido utilizado para medir la remodelación ósea. Se halló que en pacientes en
los cuales el proceso de remodelación ósea estaba aumentado, el %RCF se hallaba
aumentado y esto, correlaciona adecuadamente con otros parámetros de la remodelación
ósea como son la excreción urinaria de hidroxiprolina y los niveles plasmáticos de la
fosfatasa alcalina ósea. Sin embargo, la técnica carece de adecuada sensibilidad para
24
detectar pequeños cambios, y como se determina por la excreción urinaria de F, el
resultado puede ser erróneo si la persona está consumiendo F de alguna fuente (como por
ejemplo agua con alto contenido de F). Esta técnica fue utilizada en seres humanos pero no
pudo ser utilizada en animales de experimentación. Los resultados hallados en animales no
fueron acordes con el estado de remodelado óseo de los modelos biológicos estudiados.
La medición de la remodelación ósea y los resultados obtenidos sigue siendo un
problema en la clínica y en la investigación básica especialmente con animales, donde los
marcadores bioquímicos óseos no están tan desarrollados, son de alto costo y no se hallan
fácilmente accesibles en países en desarrollo.
En los últimos 20 años se ha desarrollado un modelo farmacocinético [77
,78
,79
] que
describe en forma muy precisa los cambios de concentración de F en intestino, plasma y
orina. La modificación de las ecuaciones de este modelo y la adecuación de los tiempos de
obtención de muestras de plasma y orina, permitirían la medida de los procesos de
formación y resorción ósea a partir de datos de concentración de F en plasma y orina,
luego de una dosis de F.
En una primera aproximación a la resolución de la alternativa planteada en el
párrafo anterior se desarrolló un modelo matemático a partir del modelo farmacocinético
que permitió medir la incorporación de F al hueso (proceso proporcional a la formación
ósea) y la salida de F del hueso (proporcional al proceso de resorción ósea) [80
,81
]. Sin
embargo, algunos resultados obtenidos con el mencionado modelo matemático indicarían
que estas medidas de ingreso y egreso de F del hueso dependerían de algunos factores aun
no identificados. En base a estas observaciones se plantearon los objetivos de esta tesis.
25
OBJETIVOS
26
OBJETIVOS
Objetivo general
Medir el proceso de remodelación ósea a través de un modelo matemático
sustentado por la farmacocinética del F en la rata e identificar las variables biológicas que
afectan sus parámetros.
Objetivos específicos planteados
1. Identificar las variables que influyen sobre el valor de los parámetros
farmacocinéticos del F en la rata.
2. Desarrollar un modelo matemático para la estimación de los procesos de
formación y resorción ósea en ratas, utilizando la farmacocinética del F, luego de una dosis
endovenosa de NaF.
3. Obtener los parámetros farmacocinéticos óseos luego de una dosis
endovenosa de NaF, utilizarlos como estimadores de la formación y resorción ósea y
validarlos en modelos biológicos con remodelado óseo modificado.
4. Comparar la técnica de medida de la formación y resorción ósea a través del
modelo matemático mencionado con marcadores bioquímicos óseos conocidos.
5. Desarrollar un modelo matemático para estimar los procesos de formación y
resorción ósea en la rata, utilizando la farmacocinética del F luego de una dosis oral y
obtener los parámetros farmacocinéticos del F a partir de datos urinarios.
27
MATERIALES Y MÉTODOS
28
MATERIALES Y MÉTODOS
A continuación se describen los materiales y métodos empleados, y los desarrollos
realizados para cumplir con los objetivos específicos planteados. Cuando se requiera por
fines de claridad, los detalles de la metodología utilizada se describirán en anexos ubicados
al final de este trabajo de tesis.
Objetivo específico 1
Identificar las variables que influyen sobre el valor de los parámetros
farmacocinéticos del F en la rata.
Se realizaron mediciones de variables y se evaluaron procesos que pudieran influir
sobre los parámetros farmacocinéticos del F. Simultáneamente se estimaron los parámetros
farmacocinéticos utilizando datos de concentraciones de F en orina y plasma. La
correlación de cada variable con los parámetros farmacocinéticos se realizó utilizando una
matriz de correlación con la función “rcorr.adjust” del software R [82]. Las correlaciones se
consideraron significativas si p<0.05. Durante la medición de las variables y la obtención
de muestras para la medida de los parámetros farmacocinéticos los animales fueron
mantenidos en un bioterio con ciclo luz-oscuridad (12h-12h) y con temperatura entre 23-
25°C. Cuando se requirió se utilizaron dispositivos de contención individual del animal
con control de excreción de heces, de excreción de orina, de consumo de agua y de
alimento. En el ANEXO II, pág. 93, se describe la metodología para la obtención de los
datos necesarios para realizar las correlaciones, la base matemática y la metodología para
la obtención de los parámetros farmacocinéticos y los experimentos realizados para la
investigación de procesos que pudieran influir sobre la farmacocinética del F.
Se determinaron las siguientes variables: peso corporal (g), consumo de alimento
(g/día), consumo de agua (mL/día), cantidad de F inyectado (µmol), F consumido en
alimento (µmol/día), FAL consumido en alimento (µmol/día), FAR consumido en alimento
(µmol/día), flúor consumido en alimento (µmol/día), fluoremia basal (µmol/L), fluoremia a
3, 18 y 33 min (µmol/L) luego de la inyección de una dosis endovenosa de F, F excretado
en orina (µmol/día), flúor excretado en heces (µmol/día), actividad plasmática de fosfatasa
alcalina total (U/L) y de fosfatasa alcalina ósea (U/L), Dpd (nmol Dpd/mmol creatinina).
Los parámetros farmacocinéticos calculados fueron: ku: constante de velocidad de
29
excreción urinaria (L/min), ke: constante de eliminación plasmática (L/min), ko+: constante
de incorporación de F al hueso (L/min) y Vd: volumen de distribución (mL).
Además, se evaluaron los efectos de dos procesos sobre variables farmacocinéticas
del F:
1. Efecto de la manipulación experimental del animal sobre variables
farmacocinéticas. Dado que los animales sometidos a estudios farmacocinéticos del F están
habitualmente sometidos a tratamientos de administración de sustancias, se evaluó el
efecto de la inyección endovenosa sobre la excreción urinaria de F. Para investigar la
relación entre las variables mencionadas se utilizaron 8 ratas Sprague Dawley de 200 g de
peso corporal, a todos los animales se les administró una dosis endovenosa de NaF 67 µL
de NaF 15 mmol/L/100 g peso corporal y se recolectó orina durante 24 h donde se
determinó la concentración de F y se calculó la excreción urinaria en ese período. Un
grupo de 4 ratas recibió 24 h antes de la dosis de NaF una inyección endovenosa de 67 µL
de solución fisiológica /100 g peso corporal. Los otros 4 animales no recibieron la
inyección. Se compararon las excreciones urinarias de F entre ambos grupos.
2. Proceso de distribución de F entre plasma y células a través de dos modelos.
Utilizando un modelo in vitro, se evaluó la velocidad de equilibrio entre la concentración
de flúor en plasma y glóbulos rojos. A través de experimentos in vivo se evaluó la
distribución de F entre sangre, plasma y tejidos blandos (músculo, riñón e hígado),
inmediatamente después de una inyección endovenosa de F.
El número de datos (n) utilizado en estos experimentos se detalla en el apartado
Resultados, por razones de claridad.
30
Objetivo específico 2
Desarrollar un modelo matemático para la estimación de los procesos de
formación y resorción ósea en ratas, utilizando la farmacocinética del F, luego de una
dosis endovenosa de NaF.
El modelo matemático se desarrolló a partir de las ecuaciones del modelo
farmacocinético del F descripto anteriormente. Este modelo matemático permitió estimar
los valores de los parámetros farmacocinéticos del F, y a partir de estos se obtuvieron
medidas de la velocidad de eliminación de F del hueso (estimador de la resorción ósea: Ro)
y de la velocidad de captación ósea de F (estimador de la formación ósea: Fo). El modelo
diseñado se fundamentó en dos ecuaciones diferenciales que expresan la variación de la
cantidad de µmol de flúor en plasma y de F en orina, y se desarrolló utilizando
herramientas del análisis matemático. Tanto el modelo matemático como la metodología
de aplicación se diseñaron con la intención de calcular sus parámetros en base a un dato de
fluoremia basal y medidas de fluoruria a lo largo del tiempo, luego de una dosis
endovenosa de NaF. La utilización de un solo dato de fluoremia y numerosos datos de
fluoruria se sustentó en el análisis de los resultados de las variables y procesos que
influyen sobre los parámetros farmacocinéticos, investigados en el objetivo específico 1 de
esta tesis.
31
Objetivo específico 3
Obtener los parámetros farmacocinéticos óseos luego de una dosis endovenosa
de NaF, utilizarlos como estimadores de la formación y resorción ósea y validarlos en
modelos biológicos con remodelado óseo modificado.
Se realizó la medida de formación ósea (Fo) y resorción ósea (Ro) en ratas
utilizando el modelo matemático propuesto en el objetivo específico 2. El experimento se
realizó con las ratas en ayunas e involucró una medición de fluoremia basal y la medición
de la excreción urinaria a lo largo del tiempo antes y después de la inyección endovenosa
del F.
La medición se realizó en ratas Sprague Dawley con remodelado óseo normal y
modificado por ovariectomía, por modificación del calcio dietario y por tratamiento
farmacológico. De esta manera se constituyeron grupos con remodelado óseo normal,
aumentado o disminuido.
1- Ratas con remodelado óseo normal: ratas Sprague Dawley hembras normales
alimentadas con dieta normocálcica (n=12).
2- Ratas con remodelado óseo aumentado:
2.1- ratas ovariectomizadas (OVX) alimentadas con dieta normocálcica (n=12).
2.2- ratas OVX alimentadas con dieta hipocálcica (OVX+Hipo) (n=12).
3- Ratas con remodelado óseo disminuido:
3.1- ratas OVX alimentadas con dieta hipercálcica (OVX+Hiper) (n=12)
3.2 ratas OVX con tratameinto antiresortivo con ácido zoledrónico (OVX+Z)
(n=12).
Los detalles sobre estos modelos de encuentran en el ANEXO I, pág. 85. El estado
de remodelación ósea en los modelos biológicos mencionados, además de afirmarse por el
modelo quirúrgico-biológico se ratificó por histomorfometría ósea estática en la tibia
izquierda obtenida al finalizar el estudio farmacocinético (detalles en ANEXO II, pág. 97)
y por medida de marcadores bioquímicos: Dpd y FAo, descriptos en el siguiente objetivo
específico 4.
La medición de la Fo (nmol/min) y Ro (nmol/min) se llevó a cabo en ratas bajo
anestesia general, manteniendo a la rata con hidratación a través de una sonda rectal y se
32
recolectó orina a través de una sonda uretral (detalles de las técnicas mencionadas en
ANEXO I, pág. 84).
Se recolectó orina a intervalos de 10 min en tubos de polietileno y el volumen
urinario se determinó por diferencia de peso entre el tubo vacío y lleno. A tal fin se utilizó
una balanza de sensibilidad 0,1 mg y se asumió que la densidad urinaria es 1g/mL. Se
recolectó orina durante un período de aproximadamente 60 min y durante este tiempo se
obtuvo una muestra de sangre, como se indica en ANEXO I pág. 84, en la que se
determinó la concentración de F por potenciometría con destilación isotérmica (ver
ANEXO I, pág. 90). Luego de este período y previa desinfección de la zona con etanol, se
inyectó 1 µmol F/100 g peso corporal (67µL NaF 15 mmol/L/100g peso corporal) por vía
endovenosa a través de un vaso de la cola [83
].
A continuación de la inyección se continuó con la recolección de orina durante 4h.
A todas las muestras de orina se les determinó la concentración de F como se indica en
ANEXO I, pág. 90.
Con el dato de fluoremia obtenido y los datos de fluoruria medidos antes y después
de la dosis endovenosa de F, se calcularon los valores de formación y resorción ósea,
utilizando el modelo matemático desarrollado en esta tesis.
El procedimiento descripto se aplicó a ratas normales y con estados de remodelado
óseo modificado, que se describen en el ANEXO I, pág. 85, como se mencionó
anteriormente.
En estos mismos animales se obtuvo, el día previo, una muestra de orina de 24 h
para medida de Dpd y una muestra de sangre para la medida de FA total y FAo, destinadas
a cumplir con el objetivo siguiente.
33
Objetivo específico 4
Comparar la técnica de medida de la formación y resorción ósea a través del
modelo matemático mencionado con marcadores bioquímicos óseos conocidos.
Para cumplir con este objetivo en los mismos grupos experimentales detallados en
los materiales y métodos destinados al objetivo específico 3, se estimó la formación ósea
por medida de la actividad plasmática de la FA y de la isoenzima FAo, valores que se
compararon con los valores de Fo obtenidos con el modelo desarrollado en esta tesis. En
los mismos animales también se estimó la resorción ósea por medida de la excreción
urinaria de Dpd, valores que se compararon con los valores de Ro obtenidos con el modelo
matemático desarrollado.
La comparación de las distintas metodologías se realizó utilizando el análisis ROC
(Característica Operativa del Receptor) o curva ROC. La aplicación de este método
requiere dividir a las unidades experimentales en dos estados (estado 1 y 2) según un
criterio aceptado. Por otra parte en las unidades experimentales se mide una variable que
estimaría ambos estados. El análisis ROC genera diferentes valores de corte de la variable
estimadora y clasifica a las unidades experimentales en estado 1 o 2, según el valor de la
variable sea mayor o menor que el valor de corte establecido. Como consecuencia de esta
división un grupo de animales coincidirá en el estado tanto por criterio de división como
por el valor de la variable. Otros animales no coincidirán en el estado determinado por el
criterio o por la variable. Se definen de esta manera cuatro grupos:
1. Verdaderos positivos (VP): animales que tienen estado 1 por el criterio y
por la medición de la variable estimadora.
2. Verdaderos negativos (VN): animales que tienen estado 2 por el criterio de
división y por la medición de la variable estimadora.
3. Falsos positivos (FP): animales que tienen estado 2 por el criterio pero 1 por
la medida de la variable estimadora.
4. Falsos negativos (FN): animales con estado 1 por el criterio de división pero
estado 2 por el valor de la variable.
Estos resultados se suelen representar en una tabla de doble entrada, Tabla 1.
34
Tabla 1: Indica la clasificación de los animales de acuerdo al valor de la variable
medida y al valor de corte establecido.
Clasificación del estado por el valor de la
variable
Clasificación del estado por criterio de
división
estado 1 estado 2
estado 1 VP FP
estado 2 FN VN
Con estos valores se calcula:
La sensibilidad (S) = VP/(VP+FN)
La especificidad (E) = VN/(VN+FP)
La precisión = (S+ E)/2
Valor predictivo de test negativo (npv) = VN/(VN+FN)
Valor predictivo de test positivo (ppv) = VP/(VP+FP)
El mejor valor de corte de la variable para indicar si las unidades experimentales
tienen alto o bajo valor de resorción ósea es aquel para el cual la precisión es máxima. La
capacidad diagnóstica del test utilizado se evalúa en función del área bajo la curva de S vs
E. Un área igual a 0.5 indica que la medida de la variable no tendría valor diagnóstico para
evaluar estados de alta o baja resorción ósea utilizando ese test diagnóstico.
Para aplicar el análisis ROC y comparar la Ro con la Dpd, una técnica aceptada de
medida de la resorción ósea, se dividieron a los animales en: ratas con resorción ósea
normal o baja y con resorción ósea aumentada. El criterio para dividir a las ratas en alto o
bajo valor de resorción ósea fue el modelo biológico utilizado, cuyo estado de resorción es
conocido por trabajos previos, y su confirmación se realizó por recuento de osteoblastos y
osteoclastos, obtenidos por histomorfometría. Con el fin de evaluar la validez de Ro como
test diagnóstico del estado de la resorción ósea, los datos mencionados se analizaron con la
función roc.test del paquete estadístico pROC [84
] y las diferencias entre las técnicas se
consideraron significativas si p<0.05. pROC es un paquete estadístico que funciona en el
entorno R [82
] y permite el análisis de sensibilidad y especificidad de un ensayo
diagnóstico. Este paquete además permite el cálculo de la precisión, el área bajo la curva,
punto de corte, valor predictivo de test positivo, valor predictivo de test negativo, falsos
35
positivos, falsos negativos, verdaderos positivos, verdaderos negativos y la construcción de
la curva ROC.
La determinación de Dpd urinaria se realizó con un kit comercial por RIA,
utilizando un contador de centelleo sólido Alfanuclear modelo Cmos. La técnica consiste
en la competencia entre Dpd marcada con I125
y la Dpd de la muestra o las soluciones
estándar, por un anticuerpo anti-Dpd fijado al tubo. Luego de 2 h de incubación a 20 °C, se
decantó el sobrenadante y se determinó la radioactividad fijada al tubo. La radiactividad
sigue una función inversa a la concentración de Dpd en la muestra. En las mismas muestras
se determinó la concentración de creatinina (Creatinina cinética AA líquida, Wiener Lab,
Rosario, Argentina) espectrofotométricamente (Perkin Elmer lambda 11) ya que los
resultados se expresan en nmol Dpd/mmol creatinina urinaria.
El mismo análisis se realizó para comparar Fo como medida de la formación ósea,
con dos técnicas aceptadas, que también miden dicho proceso: la fosfatasa alcalina (FA)
plasmática y la fosfatasa alcalina ósea (FAo).
La actividad plasmática de la FAo se determinó en los mismos modelos biológicos
descriptos para la Dpd urinaria. La determinación se realizó con un kit comercial ALP 405
cinética optimizada (Wiener Lab, Rosario). El método se fundamenta en la hidrólisis del
pNFF que es incoloro, produciendo fosfato y p-nitrofenol a pH 9.8. La velocidad de
aparición del anión p-nitrofenol (amarillo) a 405 nm, es proporcional a la actividad
enzimática de la muestra. La dietanolamina (DEA) regula el pH de la reacción y actúa
como aceptor del fosfato. La FAo se determinó por diferencia entre la medida de FA total
del plasma sanguíneo y la actividad remanente luego de realizar una precipitación selectiva
de la isoenzima ósea con lectina de germen de trigo [85
]. Mediante este ensayo la
reactividad cruzada con la isoforma hepática es menor al 5%. La determinación de la
actividad de la FA total se obtiene en la misma determinación FAo, sin el agregado de
lectina.
36
Objetivo específico 5
Desarrollar un modelo matemático para estimar los procesos de formación y
resorción ósea en la rata, utilizando la farmacocinética del F luego de una dosis oral y
obtener los parámetros farmacocinéticos del F a partir de datos urinarios.
El modelo matemático se desarrolló a partir del modelo farmacocinético del F. Este
modelo permitió estimar los valores de los parámetros farmacocinéticos del F y, a partir de
estos, obtener medidas de la velocidad de eliminación de F del hueso (estimador de la
resorción ósea: Ro) y la velocidad de captación ósea de F (estimador de la formación ósea:
Fo); de la misma manera que cuando se desarrolló el modelo luego de una dosis
endovenosa. El modelo se fundamenta en dos ecuaciones diferenciales que expresan la
variación de la concentración de flúor en plasma y de F en orina, y se desarrolló utilizando
herramientas del análisis matemático. El modelo se diseñó con la intención de calcular sus
parámetros en base a un dato de fluoremia y medidas de fluoruria a lo largo del tiempo,
luego de una dosis oral de NaF. En el desarrollo se usaron herramientas convencionales del
análisis matemático.
La medición de Fo y Ro se realizó en ratas Sprague Dawley normales, con
remodelación ósea aumentada (OVX+Hipo, ver ANEXO I, pág. 86) y con remodelación
ósea disminuida (OVX+Z, ver ANEXO I, pág. 86). El estado de remodelación ósea de los
modelos biológicos mencionados, además de aceptarse por el modelo quirúrgico-biológico
se ratificó por histomorfometría ósea estática en la tibia (ver ANEXO II, pág.97) obtenida
al finalizar el estudio farmacocinético.
Para la medición de las constantes farmacocinéticas se indujo anestesia general en
los animales y se aplicaron los mismos cuidados detallados en el modelo que se empleó
luego de la administración de F por vía endovenosa. Luego de inducida la anestesia, se
comenzó la hidratación rectal del animal y se colocó un catéter uretral para la obtención de
orina (detalles en el ANEXO I, pág. 85).
Se recolectó orina durante un período de aproximadamente 60 min y durante este
tiempo se obtuvo una muestra de sangre como se indicó previamente (ver pág.84) en la que
se determinó la concentración de F por potenciometría previa destilación isotérmica (ver
ANEXO I, pág. 90). Luego de este lapso se administraron, por vía oral, 20 µmol F/100 g
peso corporal (0.08 mL de NaF 0.25 mol/L/100g peso corporal). La administración se
realizó con una sonda K35 para alimentación de pacientes neonatales.
37
A continuación de la dosis oral se continuó con la recolección de orina durante 5h.
En las muestras se determinó la concentración de F como se indicó en el ANEXO I, pág.
90.
Con el dato de fluoremia obtenido y los datos de fluoruria medidos antes y después
de la dosis oral de F se calcularon los valores de la formación y la resorción ósea,
utilizando el modelo matemático desarrollado en esta tesis.
38
RESULTADOS
39
RESULTADOS
Objetivo específico 1
Identificar las variables que influyen sobre el valor de los parámetros
farmacocinéticos del F en la rata.
Correlación entre variables
Se evaluaron las correlaciones entre los parámetros farmacocinéticos del F y
diversas variables. Las constantes farmacocinéticas evaluadas fueron: ku: constante de
velocidad de excreción urinaria (L/min), ke: constante de eliminación plasmática (L/min),
ko+: constante de incorporación de F al hueso (L/min) y Vd: volumen de distribución
(mL).
Las variables que se midieron en los experimentos y se correlacionaron con las
constantes farmacocinéticas fueron:
Peso corporal (g).
Consumo de alimento (g/día).
Consumo de agua (mL/día).
Cantidad de F inyectado (µmol).
F consumido en alimento (µmol/día).
FAL consumido en alimento (µmol/día).
FAR consumido en alimento (µmol/día).
Flúor consumido en alimento (µmol/día).
Fluoremia basal (µmol/L).
Fluoremia a 3, 18 y 33 min (µmol/L) luego de la inyección de una dosis
endovenosa de F.
F excretado en orina (µmol/día).
Flúor excretado en heces (µmol/día).
Actividad plasmática de FA total (U/L).
FAo (U/L).
Dpd (nmol Dpd/mmol creatinina).
40
A continuación se muestran los coeficientes de correlación de Pearson obtenidos
para las correlaciones en las que se obtuvo significado estadístico. Para cada correlación se
indica entre paréntesis coeficiente de correlación de Pearson (r), número de pares de datos
(n) y probabilidad de la correlación (p).
Los valores de ke se hallaron negativamente correlacionados con la fluoremia basal
(r=-0.35, n=57, p=0.0075). Por otra parte el valor de ke se halló positivamente
correlacionado con la fluoremia a los 3 min de la inyección endovenosa (r=0.45, n=57,
p=0.0006), considerándose este último el dato más relevante (ver Discusión).
Contrariamente, el valor de ke se halló negativamente correlacionado con la fluoremia a
los 18 min de la dosis endovenosa (r=-0.44, n=57, p=0.0007) y la fluoremia a los 33 min
(r=-0.37, n=57, p=0.0046).
Por su parte ku se halló correlacionada con el volumen de agua consumido durante
la experiencia (r=-0.46, n=18, p=0.05), el FAR en alimento (r=0.50, n=18, p=0.03) y el
FAL en alimentos (r=0.51, n=18, p=0.03). No hallándose ko+ relacionada con ninguna de
estas variables.
Los valores de ke se hallaron correlacionados con las otras constantes
farmacocinéticas, siendo la correlación positiva con ku (r=0.36, n=57, p=0.0065,
Ilustración 4), positiva con el valor de ko+ (r=0.83, n=57, p<0.0001, Ilustración 5) y
negativa con el valor de Vd (r=- 0.53, n=57, p<0.0001, Ilustración 6).
Ilustración 4: Correlación entre valores de ke y ku.
41
Ilustración 5: Correlación entre ko+ y ke.
Ilustración 6: Correlación entre Vd y ke.
Conclusión parcial: Las variables que se encontraron relacionadas con los valores
de los parámetros farmacocinéticos fueron: consumo de agua, FAR y FAL en alimentos y
valores de fluoremia luego de una inyección endovenosa.
42
Correlación realizada entre la velocidad de inyección del NaF y las fluoremias
obtenidas a distintos tiempos
Aunque es deseable obtener uniformidad en el tiempo que le requiere al operador
realizar la inyección endovenosa de NaF, no siempre se logra la inyección en un tiempo
constante. La Ilustración 7 muestra la variación que existe entre los diferentes animales.
Ilustración 7: Tiempo requerido para realizar la inyección endovenosa de NaF.
Se analizaron las correlaciones de Pearson entre la velocidad de inyección de NaF
y las fluoremias alcanzadas a los 3, 18 y 33 min. La velocidad de inyección también se
correlacionó con el valor de ke. No se halló correlación entre los valores de fluoremia o ke
y el tiempo de inyección en los 57 animales que se analizaron.
Tiempo de inyección vs fluoremia 3 min (r = 0.03, n=57, p>0.05).
Tiempo de inyección vs fluoremia 18 min (r = 0.05, n=57, p>0.05).
Tiempo de inyección vs fluoremia 33 min (r = 0.02, n=57, p>0.05).
Tiempo de inyección vs ke (r = 0.16, n=57, p>0.05).
Estos resultados indican que la velocidad de inyección de la solución de NaF no
sería una variable que pudiera influir significativamente en los valores de los parámetros
farmacocinéticos del F.
43
Efecto de la manipulación del animal y la excreción urinaria del F
En dos grupos de animales se realizó la medida de excreción urinaria de F luego de
una dosis endovenosa de NaF (67 µL/100g peso corporal de una solución 15 mmol/L de
NaF). Un grupo recibió el día previo una inyección endovenosa de solución fisiológica
(SF) (simulando un tratamiento farmacológico) y otro grupo no recibió dicha manipulación
experimental. Se observó mayor excreción urinaria de F en los animales que tuvieron una
inyección intravenosa de SF, t de Student p<0.05. Los datos se pueden observar en forma
de gráfico en la Ilustración 8.
Ilustración 8: Datos de excreción urinaria de F sin inyección previa de solución fisiológica (sin
SF) y con inyección previa (con SF). Los valores están representados como media±SEM.
Estos resultados indican que la manipulación previa del animal podría afectar
notablemente las variables farmacocinéticas a medir, y como consecuencia influir sobre el
valor de los parámetros. Este dato es relevante para tener en cuenta y producir en todos los
grupos de estudio la misma manipulación experimental. No se investigaron otros factores
experimentales.
Captación de F por glóbulos rojos in vitro
A un pool de sangre se le adicionó F (concentración final 100 µmol/L) y se
obtuvieron muestras seriadas durante 1 h. La concentración de flúor en plasma y sangre se
mantuvo constante a lo largo del tiempo. La pendiente de la recta de regresión entre la
concentración de flúor, en plasma y sangre, y el tiempo no discrepó de cero (regresión
44
lineal, p>0.05). Dado que los valores de concentración no cambiaron a lo largo del tiempo,
se tomaron en conjunto los valores de concentración de flúor en plasma y sangre. La
Ilustración 9 muestra que las concentraciones de flúor en plasma y sangre, obtenidas
durante todo el experimento, no discrepan entre sí, ni de 100 µmol/L, que fue la
concentración fijada por adición de una solución conteniendo F. Esto indica que el
equilibrio entre plasma y glóbulos rojos in vitro es inmediato.
Ilustración 9: Concentración de flúor en sangre y en plasma. Los valores están representados
como media±SEM.
Estudio de la distribución de F entre sangre y tejidos blandos
En un primer análisis se comparó la concentración de flúor en plasma y sangre a
los 3 min de la inyección endovenosa de NaF. Simultáneamente se compararon las
concentraciones de flúor en hígado, riñón y músculo esquelético.
No se hallaron diferencias significativas entre la concentración de flúor en sangre y
plasma, t de Student para datos apareados, p>0.05, n=12, (Ilustración 10), coincidiendo
con los experimentos in vitro.
45
Ilustración 10: Concentración de flúor en sangre y plasma a los 3 min de la inyección endovenosa
de NaF. Los datos se muestran como media±SEM.
Tampoco se hallaron diferencias significativas entre las concentraciones de flúor
medidas en hígado, músculo y riñón, ANOVA p>0.05, n=12 (Ilustración 11).
Ilustración 11: Concentración de flúor en hígado, músculo y riñón a los 3 min de una dosis
endovenosa de NaF. Los datos se muestran como media±SEM.
Dado que no se hallaron diferencias significativas entre flúor en plasma y sangre,
ni entre los tres tejidos investigados, se consideraron solo dos grupos (sangre: plasma +
glóbulos) y tejidos blandos (hígado, riñón y músculo). La Ilustración 12 muestra que a los
46
3 min la concentración de flúor en sangre es significativamente diferente de la
concentración en los tejidos, t de Student p<0.05.
Ilustración 12: Concentración de flúor en sangre y tejidos a los 3 min de una dosis endovenosa de
NaF. Los datos se muestran como media±SEM.
Conclusión parcial: los resultados anteriores indican que inmediatamente después
de una dosis endovenosa de F no existe un equilibrio entre la sangre y los tejidos blandos.
Por lo tanto, la concentración de flúor en sangre no sería un buen estimador de la
concentración en todo el volumen de distribución.
En consecuencia se desarrolló un modelo matemático para estimar las contantes de
velocidad de captación y liberación de F del hueso luego de una dosis intravenosa de F,
prescindiendo de los valores de fluoremia inmediatamente luego de la dosis. El modelo se
desarrolló de manera que los procesos farmacocinéticos de interés: incorporación y
liberación de F del hueso puedan ser calculados con un valor de concentración de flúor
plasmático basal (anterior a la dosis) y valores de F en orina antes y luego de la dosis. El
modelo farmacocinético que se utilizó queda representado en la Ilustración 13.
Por otra parte, la dependencia de ku del volumen de agua y del consumo de
alimento, obligó a realizar las experiencias en condiciones estrictas de ayuno de alimento y
agua durante 12 h.
47
Objetivo específico 2
Desarrollar un modelo matemático para la estimación de los procesos de
formación y resorción ósea en ratas, utilizando la farmacocinética del F, luego de una
dosis endovenosa de NaF.
El modelo matemático que se desarrolla a continuación tiene como principal
finalidad permitir la medida del ingreso y egreso de F del hueso en la rata a partir de un
dato de fluoremia y de datos de excreción urinaria de F antes y después de una dosis
endovenosa de NaF. A continuación se muestra la deducción de las ecuaciones
farmacocinéticas antes y después de una dosis endovenosa de F.
Antes de administrar una dosis endovenosa de F, el intercambio del mismo entre
plasma y los tejidos queda representado en la Ilustración 13.
Ilustración 13: Distribución y eliminación plasmática del F luego de una dosis endonevosa. Fo:
velocidad de incorporación de F al hueso, Ro: velocidad de salida de F del hueso, Vu: velocidad de
excreción urinaria de F. U cantidad de F en orina.
Donde:
[F]: concentración plasmática de flúor.
Fp: cantidad de µmol de flúor plasmático.
Fo: velocidad de incorporación de F al hueso.
Ro: velocidad de liberación de F del hueso.
48
Vu: velocidad de excreción renal de F.
U: cantidad de µmol de F excretado en orina.
Se supone que Fo es proporcional a [F] y a la magnitud del proceso de formación
ósea que quedaría representada por la constante de velocidad de formación ósea (ko+).
bFkoFo ][ Ecuación 5
Donde [F]b es la concentración plasmática basal de flúor, previa a la dosis.
Por su parte se supone que Ro es proporcional al contenido de flúor óseo [F]hueso y
a la actividad de resorción ósea, representada por ko-.
huesoFkoRo ][ Ecuación 6
La velocidad de excreción urinaria (Vu) se supuso directamente proporcional a la
concentración plasmática basal de flúor y a una constante de velocidad de depuración
urinaria, ku.
bFkuVu ][ Ecuación 7
Antes de administrar la dosis de F y en ausencia de otra fuente de F (recordar que
el modelo se desarrolló para aplicación en ayuno de alimento y agua, por lo estudiado en el
objetivo específico 1), los µmol de flúor plasmático (Fp) permanecen constantes
dependiendo exclusivamente de los valores de Ro, Fo y Vu. En esta situación la variación
del µmol de flúor plasmático se halla en estado estacionario, situación en que la derivada
primera de los µmol de flúor plasmático respecto del tiempo podría escribirse:
0 VuFoRodt
dFp
Ecuación 8
Si representamos
FoRoVo Ecuación 9
49
reemplazando Ecuación 7 y Ecuación 9 en Ecuación 8, se obtiene:
0][ bFkuVodt
dFp
Ecuación 10
De la cual resulta
bFkuVo ][ Ecuación 11
Por su parte la velocidad de excreción urinaria de F es proporcional a la
concentración plasmática basal de flúor ([F]b)y a la constante de velocidad de excreción
urinaria de F, ku.
bFkudt
dU][
Ecuación 12
Reordenando,
dtFkudU b][ Ecuación 13
resolviendo la ecuación diferencial entre t=0 y un tiempo t
dttFkudUt
b
U
.][00
Ecuación 14
Se obtiene la excreción urinaria de F en un intervalo de tiempo, 0 - t.
tFkuU b][ Ecuación 15
Como ku y [F]b son constantes pueden unificarse como una sola constante:
bFkukb ][ Ecuación 16
50
Siendo kb la excreción urinaria basal de F, que corresponde a la pendiente de la
regresión lineal entre la excreción urinaria de F (U) y el tiempo. Relacionando la Ecuación
11 y Ecuación 16, se obtienen:
kbFoRoVo Ecuación 17
y
bF
kbku
][
Ecuación 18
De lo expuesto anteriormente se puede concluir que es posible obtener los valores
de ku y Vo a través de mediciones de U en función del tiempo y de la concentración
plasmática de flúor antes de inyectar una dosis de F.
Luego de la dosis endovenosa de F: la variación de los µmol de flúor en plasma
viene dada por la Ecuación 8, que en esta situación no se puede igualar a cero, ya que Fp
cambia a lo largo del tiempo
VuFoRodt
dFp
Ecuación 19
En la Ecuación 19, Ro se puede considerar despreciable, porque luego de una
dosis de F se asume que la concentración plasmática de flúor es muy superior al valor
basal, y por lo tanto el proceso de incorporación de F al hueso sería mucho mayor que el
proceso de liberación de F del hueso.
Reemplazando la Ecuación 5 y la Ecuación 7 en la Ecuación 19, se obtiene la
siguiente ecuación:
][][ FkuFkodt
dFp
Ecuación 20
Trabajando matemáticamente,
51
])[( Fkukodt
dFp
Ecuación 21
Y siendo la constante ke representada por la siguiente ecuación.
kukoke
Ecuación 22
Reemplazando la Ecuación 22 en la Ecuación 21 se obtiene la siguiente ecuación:
][Fkedt
dFp
Ecuación 23
Expresando la concentración en función de la cantidad y el volumen, donde Vd es
el volumen de distribución de F:
Vd
Fpke
dt
dFp
Ecuación 24
Reordenando:
dtVd
FpkedFp
Ecuación 25
Integrando entre 0 y t:
tFp
Dodt
Vd
ke
Fp
dFp
0
Ecuación 26
Se obtiene:
dteDo
FpVd
tke
Ecuación 27
52
Dividiendo a ambos miembros por el Vd se obtiene:
Vd
tke
eVd
DoF
][
Ecuación 28
A partir de la variación urinaria de F respecto al tiempo:
][Fkudt
dU
Ecuación 29
Y reemplazando la Ecuación 28 en la Ecuación 29 se obtiene:
Vd
tke
eVd
kuDo
dt
dU
Ecuación 30
Reordenando:
dteVd
kuDodU
tVd
tkeU
00
Ecuación 31
Resolviendo la integral y sumando la excreción basal en el tiempo (kb.t):
tkbeke
kuDoU Vd
tke
.)1(
Ecuación 32
Si se calcula la derivada primera de la excreción urinaria de F, representada por la
Ecuación 32 se obtiene:
kbVd
kee
ke
kuDoU Vd
tke
)(0(
Ecuación 33
Reordenando:
53
kbeVd
kuDoU Vd
tke
Ecuación 34
La expresión de U' para t=0 resulta:
kbVd
kuDoU
)0(
Ecuación 35
Dado que ku, Do y kb son valores conocidos y ya calculados, y U' es fácilmente
aproximable a través de la excreción de F en orina a tiempos inmediatos después de la
dosis, dividido por el tiempo en que se recolectó la muestra de orina, se puede obtener el
valor de Vd.
Procedimiento de cálculo de Ro y Fo:
La Ilustración 14 muestra un esquema de la metodología para la obtención de los
valores de Fo y Ro.
Ilustración 14: Descripción esquemática de la metodología para la medición de Ro y Fo. Donde el
símbolo * representa el producto. Ver explicación en el texto.
54
El procedimiento consta de los siguientes pasos:
1. Al inicio del experimento, antes de la administración de una dosis
endovenosa de F (Do), se obtiene una muestra de sangre para la medición de la
concentración de flúor basal ([F]b).
2. Luego de anestesiar el animal y realizar el cateterismo uretral se recolecta
orina durante 1 h y en la misma se mide la excreción urinaria de F (U). La U se ajusta por
una función lineal del tiempo, cuya pendiente es el parámetro kb.
3. Con el valor del parámetro kb y [F]b se obtiene el valor de la constante de
velocidad de excreción urinaria (ku) utilizando la Ecuación 18. A su vez, el parámetro kb
es igual a la diferencia entre Ro y Fo.
4. Inmediatamente luego de este período se administra una dosis endovenosa
de F (Do) y se continua recolectando orina a intervalos de 10-15 min durante 4 h. En las
muestras recolectadas se mide la concentración de F y se calcula la U.
5. Utilizando los primeros valores de U luego de la administración de Do se
calcula la velocidad de cambio de U (U') y a partir de este valor, junto con ku, kb y Do se
obtiene Vd utilizando la Ecuación 35.
6. El valor de ke se obtiene realizando un ajuste de los datos de U luego de
administrar Do, utilizando la Ecuación 32 y los valores de Do, ku, kb y Vd obtenidos
previamente.
7. Se calcula ko+ utilizando la Ecuación 22 con los valores de ke y ku
obtenidos.
8. Utilizando la Ecuación 5 y los valores de ko+ y [F]b, se obtiene Fo.
9. Se calcula Ro con la Ecuación 17 y los valores de kb y Fo.
55
Objetivo específico 3
Obtener los parámetros farmacocinéticos óseos luego de una dosis endovenosa
de NaF, utilizarlos como estimadores de la formación y resorción ósea y validarlos en
modelos biológicos con remodelado óseo modificado.
Se midió Fo (formación ósea) y Ro (resorción ósea) en diferentes grupos
experimentales, cada uno de ellos con un estado de remodelación ósea conocida. Los
resultados se muestran en la Tabla 2, como media±SEM.
Los valores de Ro y Fo fueron acordes a lo esperado para cada modelo biológico
estudiado. Se observó un aumento de Ro y Fo en las ratas OVX con respecto a los
controles. Por otra parte se observó un descenso de Ro y Fo en ratas OVX con dieta
hipercálcica (OVX+Hiper) y en ratas OVX con tratamiento antirresortivo con ácido
zoledrónico (OVX+Z) respecto de la las ratas OVX sin tratamiento. Mientras que al
comparar las OVX con dieta hipocálcica (OVX+Hipo) se observó un aumento de Fo y Ro
con respecto a los controles. Las diferencias mencionadas no fueron estadísticamente
significativas, debido a la gran variabilidad en los valores de Ro y Fo en todos los grupos
investigados. Esta observación es coincidente con los valores de resorción y formación
ósea estimados a partir de los valores de Dpd y FAo (ver Ilustración 15).
Tabla 2: Valores de Fo y Ro para cada uno de los modelos biológicos estudiados.
Los resultados se muestran como nmol de F/l.min±SEM. Grupos Fo (nmol/min) Ro (nmol/min)
Control 16.25 ± 4.41 13.12 ± 3.40
OVX 29.65 ± 19.19 30.64 ± 19.19
OVX+Hiper 17.52 ± 11.99 18.07 ± 12.14
OVX+Z 11.04 ± 4.14 12.37 ± 4.50
OVX+Hipo 31.15 ± 30.05 44.10 ± 18.70
56
Objetivo específico 4
Comparar la técnica de medida de la formación y resorción ósea a través del
modelo matemático mencionado con marcadores bioquímicos óseos conocidos.
Se comparó la capacidad diagnóstica de Ro y Fo con marcadores bioquímicos
óseos de resorción y formación en uso, tanto en la clínica como en investigación con
animales. Para ello se realizó el análisis ROC de los valores obtenidos de Ro por este
modelo matemático y los valores de Dpd, como marcador de resorción ósea. A su vez, se
realizó el análisis ROC de los valores de Fo y se lo comparó con la medición de FA y FAo.
Los animales estudiados fueron separados según su remodelado óseo en: normal o
bajo y alto, en base a los modelos biológicos estudiados (ver Materiales y Métodos). La
Ilustración 15 muestra los valores de los marcadores de resorción (Dpd y Ro) y de
formación ósea (Fo, FA y FAo) en animales que por el modelo utilizado tenían
bajo/normal remodelado (estado 0, n=33) y alto remodelado óseo (estado 1, n= 27). Se
observó en todos los casos un aumento del valor del marcador en los modelos con alto
remodelado. En este caso se eligió un gráfico de cajas y bigotes para mostrar el rango de
variación de cada marcador.
Ilustración 15: Valores de marcadores óseos de formación (FA, FAo y Fo) y de resorción ósea
(Dpd y Ro) en ratas con remodelado óseo normal/bajo (estado 0) y en ratas con remodelado óseo
alto (estado 1). Las cajas muestran mediana, percentilos 25% y 75 %, y los bigotes muestran el
rango de los datos.
57
Comparación de Ro con Deoxipiridinolina:
No se halló diferencia entre los análisis ROC realizados para Dpd y Ro (p=0.1827,
roc.test), indicando que no hay diferencias significativas en las estimaciones de la
resorción ósea entre ambos ensayos. Los datos de dichos análisis se muestran en la Tabla 3
y en la Ilustración 16.
Tabla 3: Análisis ROC de Dpd y Ro.
Análisis ROC Dpd Ro
Área bajo la curva 0.79 0.87
Sensibilidad 0.851 0.89
Especificidad 0.666 0.88
Umbral 155 (nmol/mmol creatinina) 14 (nmol/min)
Verdaderos negativos 22 29
Verdaderos positivos 23 24
Falsos negativos 4 3
Falsos positivos 11 4
Precisión 0.76 0.88
Valor predictivo negativo 0.85 0.91
Valor predictivo positivo 0.68 0.86
58
Ilustración 16: Curvas ROC para Dpd (línea punteada) y Ro (línea continua).
En la Tabla 3 se indica un umbral para Ro igual a 14 nmol/min. Este valor está
indicando que valores superiores a 14 nmol/min corresponden a animales con alta
resorción ósea, con una probabilidad del 86%. Esto está indicando que del 100% de valores
con alto remodelado medidos con la técnica, un 14% no lo tendrían. El resultado no
discrepó con el valor diagnóstico de la Dpd, cuyo valor predictivo de test positivo fue 0.68.
Se halló una correlación significativa entre los valores de Dpd y Ro (r=0.55, n=60,
p<0.05), Ilustración 17.
Ilustración 17: Correlación entre los valores de Ro y Dpd medidos en ratas con diferente grado de
remodelado óseo.
59
Comparación de FAo y Fo:
La Tabla 4 muestra los datos del análisis ROC de los valores de Fo y FAo para los
modelos estudiados. No se hallaron diferencias significativas entre las curvas ROC de FAo
y Fo, Ilustración 18 (roc.test p=0.92).
Tabla 4: Análisis ROC de FAo y Fo.
Análisis ROC FAo Fo
Área bajo la curva 0.92 0.82
Sensibilidad 0.89 0.85
Especificidad 0.85 0.82
Umbral 48.5 (U/L) 14 (nmol/min)
Verdaderos negativos 28 27
Verdaderos positivos 24 23
Falsos negativos 3 4
Falsos positivos 5 6
Precisión 0.87 0.84
Valor predictivo negativo 0.90 0.87
Valor predictivo positivo 0.83 0.80
Ilustración 18: Curvas ROC para FAo (línea punteada) y Fo (línea continua).
60
El valor 0.8 para el valor predictivo de test positivo de Fo indica que una rata con
un valor de Fo mayor a 14 nmol/min (umbral de la determinación) tiene un 80 % de
probabilidad de tener formación ósea aumentada. De la misma manera un valor inferior a
14 nmol/min indica que dicho animal tiene un 87 % de probabilidad de tener una
formación ósea normal o disminuida.
Se halló una correlación significativa entre los valores de FAo y Fo (r=0.43, n=60,
p<0.05), Ilustración 19.
Ilustración 19: Correlación entre los valores de Fo y FAo medidos en ratas con diferente grado de
remodelado óseo.
Comparación de FA total y Fo:
La Tabla 5 muestra los datos del análisis ROC de los valores de Fo y FA para los
modelos estudiados. No se hallaron diferencias significativas entre las curvas ROC de FA
y Fo (roc.test p=0.79). La Ilustración 20 muestra las curvas ROC para ambas
determinaciones.
61
Tabla 5: Análisis ROC de FA y Fo.
Análisis ROC FA Fo
Área bajo la curva 0.87 0.82
Sensibilidad 0.85 0.85
Especificidad 0.81 0.82
Umbral 128 (U/L) 14 (nmol/min)
Verdaderos negativos 27 27
Verdaderos positivos 23 23
Falsos negativos 4 4
Falsos positivos 6 6
Precisión 0.83 0.84
Valor predictivo negativo 0.87 0.87
Valor predictivo positivo 0.79 0.80
Ilustración 20: Curvas ROC para FA (línea punteada) y Fo (línea continua).
Se halló una correlación altamente significativa entre los valores de FA y Fo
(r=0.63, n=60, p<0.05), Ilustración 21.
62
Ilustración 21: Correlación entre los valores de Fo y FA medidos en ratas con diferente grado de
remodelado óseo.
Conclusión parcial: en este objetivo se verificó, utilizando el análisis ROC, que Fo
y Ro son test con valor diagnóstico para determinar estados de alta y baja remodelación
ósea. Y a su vez, por la comparación con los marcadores bioquímicos comúnmente
utilizados (Dpd, FA y FAo) se verificó la buena sensibilidad, especificidad y precisión de
este nuevo método de detección.
63
Objetivo específico 5
Desarrollar un modelo matemático para estimar los procesos de formación y
resorción ósea en la rata, utilizando la farmacocinética del F luego de una dosis oral y
obtener los parámetros farmacocinéticos del F a partir de datos urinarios.
A partir de los resultados obtenidos en el objetivo anterior se decidió desarrollar un
método para medir Fo y Ro luego de la administración de F por vía oral. Este método sería
una aproximación para la aplicación de esta técnica en seres humanos, dado que no hay
estudios realizados en seres humanos de administración de F por vía endovenosa. Para ello,
se desarrolló un modelo matemático para el cálculo de Fo y Ro de características similares
al modelo desarrollado para la administración endovenosa de F. Dado que el F se
administra por vía oral se realizó la incorporación de una nueva constante: ka: constante de
absorción gastrointestinal de F. Este modelo matemático se desarrolló a partir del modelo
farmacocinético descripto en la pág. 16.
Este modelo matemático consta de dos partes, al igual que el modelo desarrollado
para su aplicación por vía endovenosa. La primer parte del modelo se desarrolla para la
situación en que aun no se ha administrado la dosis oral de F. Esta parte del modelo no
discrepa del modelo matemático aplicado para la dosis endovenosa. La segunda parte del
modelo se modifica, introduciéndose el término que representa la absorción
gastrointestinal de F, luego de ser administrado por vía oral. Los compartimientos del
modelo, sus variables y constantes se describen en la Ilustración 22.
Ilustración 22: Absorción gastrointestinal, distribución y eliminación plasmática del F luego de
una dosis oral de F (Do). Fo: velocidad de incorporación de F al hueso, Ro: velocidad de salida de
F del hueso, Vu: velocidad de excreción urinaria de F, U cantidad de F en orina, ka: constante de
absorción gastrointestinal de F y TGI: tracto gastrointestinal.
64
Donde:
[F]: concentración de flúor plasmático.
Fp: cantidad de µmol de flúor plasmático.
Fo: velocidad de incorporación de F al hueso.
Ro: velocidad de liberación de F del hueso.
Vu: velocidad de excreción renal de F.
U: F excretado en orina.
En ausencia de dosis de fluoruro:
Esta primer parte es igual que el modelo anterior, a partir de la cual se obtienen los
valores de ku (constante de velocidad de depuración urinaria de F) y kb (excreción urinaria
basal de F) necesarios para el cálculo del resto de los parámetros:
Se supone que Fo es proporcional a la concentración plasmática basal de flúor
([F]b) y a la a la magnitud del proceso de formación ósea que estaría representada por la
constante de velocidad de formación ósea (ko+).
bFkoFo ][ Ecuación 36
Por su parte se supone que Ro es proporcional a la magnitud del proceso de
resorción ósea.
La velocidad de excreción urinaria (Vu) es directamente proporcional a la
concentración plasmática basal de flúor ([F]b) y a una constante de velocidad de
depuración urinaria, ku.
65
bFkuVu ][ Ecuación 37
Antes de administrar la dosis de F y en ausencia de otra fuente de F (recordar que
el modelo se desarrolla para aplicación en ayuno de alimento y agua, por lo estudiado en el
objetivo específico 1), los µmol de flúor plasmático (Fp) permanecen constantes
dependiendo exclusivamente de los valores de Ro, Fo y Vu. En esta situación los µmol de
flúor plasmático se hallan en estado estacionario, situación en que la derivada primera de
los µmol de flúor en plasma respecto del tiempo podría escribirse:
0 VuFoRodt
dFp
Ecuación 38
Si representamos
FoRoVo Ecuación 39
Reemplazando la Ecuación 37 y la Ecuación 39 en la Ecuación 38 se obtiene:
0][ bFkuVodt
dFp
Ecuación 40
De la cual resulta
bFkuVo ][ Ecuación 41
por su parte la velocidad de excreción urinaria de F es proporcional a la
concentración plasmática basal de flúor y a la constante de velocidad de excreción , ku.
bFkudt
dU][
Ecuación 42
Reordenando,
66
dtFkudU b][ Ecuación 43
resolviendo la ecuación diferencial entre t=0 y un tiempo t
dttFkudUt
b
U
.][00
Ecuación 44
Se obtiene la excreción urinaria de F en un intervalo de tiempo, 0 - t.
tFkuU b][ Ecuación 45
Definimos una variable kb:
bFkukb ][ Ecuación 46
Reemplazando la Ecuación 46 en la Ecuación 45 resulta:
tkbU . Ecuación 47
Donde kb es la pendiente de la recta de regresión entre los valores de la excreción
urinaria basal de F en función del tiempo. Relacionando la Ecuación 41 y la Ecuación 46
se obtiene:
VoFoRokb Ecuación 48
y
bF
kbku
][
Ecuación 49
Las ecuaciones desarrolladas anteriormente, permiten calcular los valores de los
parámetros: ku y Vo.
67
Luego de la dosis oral de NaF:
La variación de la cantidad de µmol de flúor en plasma queda representada por la
siguiente ecuación diferencial:
VaVuFoRodt
dFp
Ecuación 50
Luego de una dosis, la salida de F del tejido óseo (Ro) puede considerarse
despreciable respecto del valor de ingreso de F al hueso (Fo). En la Ecuación 50, Va es la
velocidad de absorción de F gastrointestinal y se representa por la ecuación:
kaDVa Ecuación 51
Reemplazando en la Ecuación 50 por la Ecuación 36, la Ecuación 37 y la Ecuación
51 se obtiene la siguiente ecuación:
kaDFkuFkodt
dFp ][][
Ecuación 52
Teniendo en cuenta la siguiente ecuación:
kukoke
Ecuación 53
Reemplazando la Ecuación 45 y la Ecuación 53 en la Ecuación 52 se obtiene:
kaDFkedt
dFp ][
Ecuación 54
Como D es una función del tiempo, su variación puede expresarse con la siguiente
ecuación diferencial:
68
kaDdt
dD
Ecuación 55
Dado que la Ecuación 54 no es una ecuación diferencial a variables separables, se
resuelve la Ecuación 55 utilizando la transformada de Laplace:
sKa
DoD
Ecuación 56
Al aplicar la transformada de Laplace a la Ecuación 54 y teniendo en cuenta la
Ecuación 56 se obtiene:
ska
DokaFp
Vd
keFpFps
0
Ecuación 57
Resolviendo la transformada de Laplace y dividiendo por el Vd, para expresar la
ecuación como concentración de flúor, obtenemos:
)(
)(
][ Vd
tke
kat ee
VdkaVd
ke
kaDoF
Ecuación 58
A partir de la variación urinaria de F en el tiempo:
Ecuación 29
Reemplazado la Ecuación 58 en la Ecuación 29, resulta:
)(
)(
Vd
tke
kat ee
VdkaVd
ke
kaDoku
dt
dU
Ecuación 59
Resolviendo la ecuación diferencial:
F ku dt
dU ] [
69
dtee
VdkaVd
ke
kaDokudU
tVd
tke
katU
00
)(
)(
Ecuación 60
Con el fin de simplificar se realiza la siguiente sustitución:
VdkaVd
ke
kaDokuA
)(
Ecuación 61
Reemplazando e integrando resulta:
dtAedtAeUt
Vd
tket
kat
00
Ecuación 62
cuya sustitución es
)1(
)(
)1(
)(
Vd
tke
kat e
VdkaVd
keke
kukaDoVde
VdkaVd
ke
kuDoU
Ecuación 63
La ecuación anterior expresa la excreción urinaria correspondiente a la dosis oral
administrada. La excreción urinaria total será el valor indicado por la Ecuación 63 sumado
a la excreción basal de F (kb.t). De esta manera la excreción total de F luego de una dosis
oral queda representada por la siguiente ecuación:
kbte
kaVd
keke
kukaDoe
VdkaVd
ke
kuDoU Vd
tke
kat
)1(
)(
)1(
)(
Ecuación 64
por lo tanto si a este valor se le resta la excreción urinaria basal
kbtkbte
kaVd
keke
kukaDoe
VdkaVd
ke
kuDoU Vd
tke
kat
)1(
)(
)1(
)(
Ecuación 65
70
se obtiene la excreción de F correspondiente a la dosis que había quedado
expresada ya por la Ecuación 63. Si a esta Ecuación 63 se le toma el límite para el tiempo
tendiendo a infinito, se obtiene la expresión de la asíntota de U en función del tiempo
(U∞):
)1(
)(
)1(
)(
kaVd
keke
kukaDo
VdkaVd
ke
kuDoU
Ecuación 66
Trabajando matemáticamente:
kekaVdke
kukaDoVd
kekaVdke
kuDokeU
)()(
Ecuación 67
kekaVdke
kaVdkekuDoU
)(
)(
Ecuación 68
Se obtiene la siguiente expresión para la excreción urinaria del F administrado por
vía oral y no retenido en el organismo:
ke
kuDoU
Ecuación 69
La Ilustración 23 muestra el cálculo representado desde la Ecuación 64 hasta la
Ecuación 69.
71
Ilustración 23: Se observan tres gráficas: Excreción urinaria basal de F, que representa la
excreción previa a la dosis, Excreción urinaria, que representa la excreción total de F luego de la
dosis incluyendo la basal, y Excreción urinaria-excreción urinaria basal de F, que representa la
asíntota de la excreción de F proveniente de la dosis oral.
La Ilustración 24 muestra un esquema de la metodología para la obtención de los
valores de Fo y Ro a partir de datos de fluoruria y un valor de fluoremia, luego de una
dosis oral de F (Do).
72
Ilustración 24: Descripción esquemática de la metodología para la medición de Ro y Fo. Donde el
símbolo * representa el producto. Ver explicación en el texto.
El procedimiento consta de los siguientes pasos:
1. Al inicio del experimento, antes de la administración de una dosis oral de F,
se obtiene una muestra de sangre para la medición de la concentración de flúor basal ([F]b).
2. Luego de anestesiar el animal y realizar el cateterismo uretral se recolecta
orina, y en la misma se mide la excreción urinaria de F (U) durante 1 h. La U se ajusta por
una función lineal del tiempo, cuya pendiente es el parámetro kb.
3. Con el valor del parámetro kb y la [F]b se obtiene el valor de la constante de
velocidad de excreción urinaria (ku) utilizando la Ecuación 49. A su vez, el parámetro kb
es igual a la diferencia entre Ro y Fo.
4. Posteriormente a este período se administra una dosis oral de F (Do), y se
continua recolectando orina a intervalos de 10-15 min, durante 4 h. En las muestras
recolectadas se mide la concentración de F y se calcula U.
73
5. Restando a los valores de U, los valores de la excreción basal de F (que se
obtienen con la Ecuación 47) se obtienen los valores de U correspondiente a la dosis y con
cuya asíntota se calcula ke, utilizando la Ecuación 69.
6. Se calcula ko+ utilizando la Ecuación 53 y los valores de ke y ku obtenidos.
7. Utilizando la Ecuación 36 y los valores de ko+ y [F]b se obtiene Fo.
8. Se calcula Ro reemplazando los valores de kb y Fo en la Ecuación 48.
Este modelo se validó en los siguientes modelos biológicos: OVX+Hipo y OVX+
Z, explicados anteriormente, y se comparó con ratas controles (C), n=4 por grupo, ver
Tabla 6, los valores se muestran como media±SEM.
Tabla 6: Valores de Ro y Fo para cada modelo biológico estudiado.
Grupos Fo (nmol/min) Ro (nmol/min)
Control 30.41 ± 7.80 36.62 ± 10.15
OVX+Hipo 163.50 ± 36.50 164.00 ± 36.00
OVX+Z 9.15 ± 4.56 9.81 ± 4.74
Como se observa en la Tabla 6, los valores obtenidos de Fo y Ro son los esperados
para cada modelo biológico estudiado. Donde las ratas OVX con dieta hipocálcica
presentan una Fo mayor que los controles y que las ratas OVX en tratamiento con
zoledronato (OVX+Z). La misma relación se observa para los valores de Ro.
Se realizó la curva ROC de Fo y Ro para determinar si la sensibilidad,
especificidad y precisión de este método eran similares a las del modelo desarrollado
aplicando la dosis de F por vía endovenosa. Se calculó el área bajo la curva en ambos casos
dando para Fo: 0.96 y para Ro: 0.98, indicando que este método también es diagnóstico
para medir Ro y Fo. Las curvas ROC se pueden observar a continuación en la Ilustración
25 y en la Ilustración 26.
74
Ilustración 25: Curva ROC de la medida de Fo.
Ilustración 26: Curva ROC de la medida de Ro.
75
DISCUSIÓN
76
DISCUSIÓN
El F es un ión de amplia aplicación en diversos campos de la salud, industria y
producción agropecuaria. Se ha utilizado con fines de tratamiento de afecciones óseas [40
]
y como prevención de la aparición de caries dentales [10
]. Esta última aplicación está aún
vigente, aunque la primera ha caído en desuso al ser desplazada por formas terapéuticas
más modernas. A nivel industrial se lo utiliza en industrias como las relacionadas a la
producción de aluminio, producción de papeles, teflón, entre otras [86
]. A nivel
agropecuario se lo utiliza formando parte de compuestos como pesticidas y puede estar en
proporción importante en fertilizantes [87
]. Por último, a nivel doméstico puede formar
parte de productos para el pulido de pisos, etc. [88
].
Por su afinidad por el tejido óseo [32
], es un trazador ideal del metabolismo de este
tejido: no radiactivo, de muy baja toxicidad al utilizarse en dosis adecuadas, sin fecha de
vencimiento y de fácil determinación.
La farmacocinética del F ha sido estudiada y sus constantes han sido caracterizadas
[62
]. El F luego de ser administrado por vía oral se distribuye en sangre (glóbulos y plasma)
y en tejidos blandos de manera homogénea, pudiendo ser descripta su farmacocinética por
un modelo monocompartimental. Este modelo ha satisfecho los estudios previos con esta
droga. Este modelo farmacocinético incluye una constante de velocidad de eliminación
plasmática que puede descomponerse en dos constantes, una que expresa la eliminación
renal y otra el intercambio óseo. El proceso de eliminación de F del plasma es un proceso
de orden uno, y se supone que los dos mecanismos que lo componen también lo son. Este
modelo permitiría la descomposición del intercambio de F óseo en dos procesos: uno de
captación y otro de liberación de F del hueso. El conocimiento de estos procesos permitiría
tener una estimación del proceso de remodelado óseo.
La medida de la remodelación ósea es una herramienta invalorable a la hora de
tomar decisiones sobre tratamientos orientados a mejorar la densidad mineral ósea, la
microarquitectura del tejido y su resistencia a la fractura. Los marcadores actuales
muestran algunas desventajas como el costo y la medición de ambos procesos del
remodelado por separado. Además no permiten tomar iniciativas a la hora de diagnosticar
una enfermedad y en general solo son utilizados como marcadores a lo largo del
tratamiento. El estudio de la remodelación ósea en animales es aun más costoso y de menor
aplicación. El desarrollo de una metodología que permita distinguir procesos metabólicos
77
óseos en menor tiempo y con mayor sensibilidad es una búsqueda constante a nivel
experimental.
El cálculo de las constantes de velocidad de incorporación y salida de F del hueso
confrontó con resultados que indicarían que, al menos en los tiempos investigados, las
constantes farmacocinéticas podrían ser influenciadas por algunos factores experimentales
o variables biológicas del animal (consumo de agua y alimento, F en alimento y fluoremias
luego de la dosis). En esta tesis se diseñaron experimentos que permitieron calcular las
constantes farmacocinéticas del F en animales con un amplio rango de variación de
variables biológicas (peso, consumo de alimento, de agua, edad, volumen de orina
excretado, cantidad de heces excretadas, etc.) y de tratamiento (contenido de F en la dieta,
velocidad de administración de F, cantidad de F inyectado, FA, FAo, Dpd, etc.). Como se
muestra en Resultados las variables investigadas sin llegar a agotar el espectro, mostraron
que en general las constantes farmacocinéticas no tienen una correlación significativa con
el peso del animal, velocidad de inyección del F, edad, volumen de orina excretado,
cantidad de heces excretadas, F en heces, etc. Sin embargo, se halló una relación
“interesante” con otras, que se detallan a continuación.
Las fluoremias luego de la inyección endovenosa estuvieron correlacionadas con la
constante de eliminación (ke) de una manera significativa. La correlación negativa entre
fluoremia basal y ke se explica ya que si ke es baja, indica una baja depuración del F, lo
que conducirá a aumento de la F basal. El cálculo de ke surge de la pendiente de la recta
que involucra los valores de fluoremia a los 3,18 y 33 min. Un alto valor de fluoremia a los
3 min determinará un valor elevado de ke. El valor de la fluoremia a los 3 min puede ser
influenciado por factores como la distribución entre el compartimento sanguíneo y los
tejidos blandos (ver más adelante). Pero se trata de un artefacto del cálculo, ya que la
fluoremia a los 3 min es el producto de un proceso de inyección y la dosis se administra
por peso. Si la distribución del F fuera uniforme en los animales el valor de fluoremia
hallado debería ser igual en todos los animales.
La correlación negativa entre la fluoremia a los 18 y a los 33 min con ke se explica
fácilmente debido a que como estos puntos determinan la pendiente de la recta, a mayores
valores de fluoremia se obtienen menores valores de la pendiente. Como se verá en los
párrafos siguientes, la distribución entre tejidos blandos y el compartimento sanguíneo es
un fenómeno que persiste durante los 33 min que se realizaron las mediciones.
78
Las correlaciones positivas entre ke, ko+ y ku son razonables ya que la suma de ko
+
y ku dan ke. La mejor correlación entre ke y ko+ se explica porque del 100 % de una dosis
de F se excreta por orina no más del 10%.
La dependencia de las constantes farmacocinéticas con algunas variables, como
son: FAR y FAL de la dieta ingerida, consumo de agua y valores de fluoremia luego de la
inyección de la dosis, confrontó con dos posibilidades para hallar la solución: por un lado
expresar las constantes farmacocinéticas en función de las variables mencionadas y por
otro lado intentar eliminar la influencia de las variables. Si bien las correlaciones son
significativas entre las variables y las constantes, los valores de los coeficientes de
correlación indicarían que no son estas variables las únicas condicionantes de los valores
de las constantes. Por lo tanto la función que relacionaría las constantes con las variables
sería incompleta, al menos hasta que se identifiquen otras variables que expliquen una
mejor dependencia. Por esta razón en lugar de expresar las constates en función de las
variables se optó por incorporar modificaciones en la preparación de los animales y en las
muestras utilizadas. La utilización de animales con 12 h de ayuno de agua y comida y el
cálculo de los parámetros farmacocinéticos a partir de datos de fluoruria y solo un valor de
fluoremia, soluciona el problema de las dependencias de las constantes mencionadas.
En este trabajo de tesis se muestra el desarrollo de una metodología que permite
estimar la resorción y formación ósea en ratas, utilizando la combinación de los procesos
farmacocinéticos del NaF y la modelización matemática. El modelo desarrollado permitió
calcular los valores de los parámetros farmacocinéticos del F luego de una dosis
endovenosa en la rata, a partir de muestras urinarias y un solo valor de fluoremia antes de
administrar la dosis de F. Los parámetros farmacocinéticos permiten obtener una
estimación de los procesos de formación y resorción ósea. Los valores de formación y
resorción ósea obtenidos en diferentes modelos biológicos con remodelación ósea
modificada, fueron coincidentes con los valores esperados para dichos modelos.
Por otra parte, la capacidad diagnóstica del estado de resorción y formación ósea
del método desarrollado no discrepó de otras metodologías utilizadas a tal fin. La
comparación de la Fo con la medida de FAo y de FA total del plasma mostró que ambas
técnicas son equivalentes. A la misma conclusión se arribó al comparar la medida de Ro
con los valores de Dpd.
79
En esta tesis se hizo un avance en la medida de la Ro y Fo utilizando una dosis oral
de F. La ventaja de esta metodología es que permitiría su aplicación en seres humanos
donde la vía oral de administración de F ya ha sido utilizada y se conocen perfectamente
las dosis que se podrían utilizar.
La gran ventaja de la metodología radica en su bajo costo, ya que luego de la
inversión inicial del equipo de medición de F, el costo posterior es insignificante. Cabe
aclarar que un equipo de medición de F, cuya media se puede estimar en 20 años, tiene un
costo equivalente a solo 100 determinaciones de las técnicas actuales (marcadores
bioquímicos, histomorfometría, etc). Otra desventaja adicional de estas técnicas de medida
de la resorción y formación ósea es que utilizan reactivos con tiempo de expiración como
pueden ser los isótopos radiactivos, mientras que los reactivos utilizados en la medición de
F no tienen fecha de vencimiento.
80
CONCLUSIONES
81
CONCLUSIONES
Las variables estudiadas que influyen sobre las constantes farmacocinéticas
de F son el consumo de agua, el F en agua y la concentración de F plasmática luego de una
dosis de NaF.
El modelo matemático desarrollado a partir del modelo farmacocinético es
independiente de las variables que influyen sobre las constantes farmacocinéticas
estudiadas.
Los valores de resorción ósea (Ro) y formación ósea (Fo) obtenidos
coincidieron con los valores esperados de dichas variables en los modelos biológicos
estudiados.
La comparación de la metodología desarrollada en esta tesis con las técnicas
vigentes de medición de la remodelación ósea no dio diferencias significativas.
Ventajas de la metodología planteada para medir la remodelación ósea con
respecto a otros métodos de medición de la remodelación ósea: 1. Bajo costo. 2. Mini-
invasividad. 3. Reducido volumen de sangre. 4. Permite el seguimiento de tratamientos con
otras drogas. 5. El mismo marcador es utilizado para medir ambos procesos. 6. Da una
medida de resorción y formación ósea que hace referencia a todo el esqueleto.
El modelo matemático y la metodología desarrollada por vía oral permitiría
la aplicación de este método de medición de la remodelación ósea a seres humanos.
82
ANEXOS
83
ANEXO I: METODOLOGÍA GENERAL
84
ANEXO I: METODOLOGÍA GENERAL
Peso corporal
El peso corporal se determinó con una balanza Ohaus Traveler apreciación 0.1 g.
Esta determinación se realizó con un error relativo porcentual máximo (E%)= 0.1 %.
Anestesia general
El procedimiento anestésico comprendió una pre-anestesia inducida por inyección
subcutánea de una mezcla de 1.2 mg xilazina /100 g peso corporal y 3 mg ketamina /100 g
peso corporal. Este procedimiento fue llevado a cabo en el bioterio para evitar el estrés del
traslado. Luego de alcanzado un grado adecuado de narcosis y sedación el animal se
trasladó al quirófano, y se inyectó por vía subcutánea 3 mg de clorhidrato de lidocaína/100
g peso corporal y 5 min después, en el mismo sitio, se inyectaron 3 mg ketamina /100 g
peso corporal por vía intramuscular [89
]. El procedimiento permite un estado de anestesia
general por 4-5 h. Durante la anestesia se controló la temperatura rectal, la que se mantuvo
en 34 ± 1 ºC utilizando una lámpara de radiación infrarroja. Sólo se utilizó intubación de
las vías respiratorias cuando se presentaron problemas de broncoaspiración o evidente
dificultad respiratoria.
Obtención de sangre
Las muestras de sangre se obtuvieron de la vena lateral de la cola, por un corte
longitudinal de 2-3 mm con bisturí Nº15, previa desinfección de la zona con alcohol
etílico. El procedimiento mencionado permite obtener muestras de hasta 200 µL. Las
muestras se obtuvieron en capilares heparinizados. Terminado el proceso de extracción se
desinfectó nuevamente con alcohol etílico y se colocó una venda para evitar la pérdida de
sangre.
Hidratación rectal
Luego de inducida la anestesia, se comenzó la hidratación rectal del animal de
manera de asegurar un flujo urinario constante durante el estudio. La vía rectal se eligió
por la simplicidad y la efectividad en este procedimiento. Se introdujo una sonda K35 por
vía rectal, a través de la cual se infundió solución fisiológica a un flujo de 8 mL/h,
utilizando una bomba peristáltica.
85
Cateterismo intrauretral
Se colocó un catéter uretral para la obtención de orina. Previo a la realización del
cateterismo se infiltró la zona periuretral con 2 mg de clorhidrato de lidocaína por vía
subcutánea y luego se introdujo por vía uretral un catéter de teflón de 24 Gx¾” con punta
roma. Por esta vía se recolectó orina a intervalos de 10 min en tubos de polietileno y el
volumen urinario se determinó por diferencia de peso entre el tubo vacio y lleno. A tal fin
se utilizó una balanza de sensibilidad 0.1 mg y se asumió que la densidad urinaria es
1g/mL. En este procedimiento el E% en la medida del volumen urinario fue como máximo
de 0.05%.
Inyección endovenosa de F
La inyección endovenosa de F se realizó por la vena lateral de la cola del animal a
un 50% de la longitud total de la cola, previa desinfección con alcohol etílico. La inyección
se realizó con una aguja G30 estando el animal bajo anestesia general. El procedimiento se
realizó en un período de tiempo de 4-10 s dependiendo del animal.
Modelos biológicos estudiados
La preparación de los modelos biológicos implicó la utilización de técnicas
quirúrgicas, farmacológicas y nutricionales. En los casos que se requirió cirugía las mismas
se realizaron en un quirófano para pequeños animales. Previo a la cirugía se expuso el
ambiente a radiación UV y se desinfectó la mesada con alcohol etílico. El material
quirúrgico no metálico se esterilizó en autoclave a 134 ºC por 15 min en bolsas de papel,
las que fueron abiertas durante la cirugía en el momento requerido. El material metálico se
esterilizó en horno a 140 ºC durante 3 h en cajas de acero inoxidable, las que fueron
abiertas en el momento de la cirugía. El cirujano y el asistente utilizaron vestimenta
esterilizada. Treinta minutos antes de la cirugía se realizó antibioticoterapia con
ceftriaxona (3 mg/100 g peso corporal) y luego de la cirugía se realizó analgesia con
diclofenac (2.5 mg/100 g peso corporal). Cuando la cirugía requirió laparotomía, luego de
la misma durante las siguientes 48 h al animal se le colocó un collar Isabelino para evitar la
autoinjuria.
86
Ratas ovariectomizadas (OVX)
La ovariectomía [90
] produce deficiencia de estrógenos y alteraciones comparables
a las observadas en mujeres postmenopáusicas. Es un modelo aceptado de osteoporosis
postmenopáusica y corresponde a un modelo de alta remodelación ósea. Se realizó
ovariectomía bilateral en ratas Sprague Dawley hembras de 9 semanas. El grupo control
estuvo formado por ratas que fueron sometidas a cirugía simulada, sin la extirpación de los
ovarios (Control). La ovariectomía fue realizada bajo anestesia general (descripta
anteriormente), previa rasuración y desinfección con iodopovidona de la zona de incisión.
Con la rata en posición decúbito dorsal se realizaron dos incisiones ventrales paramediales
de 1 cm. Identificados los ovarios, se realizaron dos ligaduras, una a la altura de la arteria
ovárica y otra en el extremo proximal del útero. Se realizó luego la escisión del ovario
utilizando una tijera iris. Luego de la cirugía se suturó, lavó con solución de clorhexidina y
se desinfectó con iodopovidona. Antes de la recuperación de la anestesia se le colocó al
animal un collar isabelino, el que fue retirado luego de 24 h. Durante 150 días los animales
fueron mantenidos en jaulas colectivas con agua y alimento ad libitum, con contenido
normal de calcio (normocálcico: 1%). El éxito de la ovariectomía fue verificado al finalizar
el experimento por comparación del peso del útero con el de los animales controles.
Tratamiento antiresortivo (OVX+Z)
El ácido zoledrónico es una droga con propiedades antiresortivas, que como
consecuencia disminuye la resorción ósea por inhibir la actividad osteoclástica. Ratas
ovariectomizadas como se detalló anteriormente recibieron una inyección subcutánea
semanal de ácido zoledrónico (0.15 µg/100 g peso corporal), durante 150 días. Las ratas
OVX actuaron como control de este grupo. Este modelo corresponde a un estado de bajo
remodelado óseo.
Ovariectomía más dieta hipocálcica (OVX+Hipo)
La ovariectomía produce un estado de remodelado óseo aumentado, la
combinación con una dieta hipocálcica aumenta más aun el estado de remodelación ósea.
Ratas ovariectomizadas recibieron una dieta hipocálcica (0.2% calcio) durante 150 días. El
grupo OVX actuó como grupo control de este grupo de animales.
Ovariectomía más dieta hipercálcica (OVX+Hiper)
La dieta hipercálcica disminuye la función paratiroidea y produce por lo tanto un
estado de menor remodelación ósea. Las ratas ovariectomizadas recibieron dieta
87
hipercálcica (2% calcio) durante 150 días. El grupo control fue el grupo OVX. La
ovariectomía más la dieta hipercálcica se utilizó como modelo de bajo remodelado óseo
respecto de ratas ovariectomizadas, hecho que fue validado histomorfométricamente.
Determinación de fluoruro, flúor ácido lábil y flúor ligado por enlaces
resistente al tratamiento con ácidos.
Para el desarrollo de este trabajo de tesis fue necesario realizar un mejoramiento en
la técnica existente en el laboratorio y esto se detalla a continuación.
Perfeccionamiento de la técnica de destilación isotérmica para la medición de
flúor
La medición de flúor en muestras complejas (plasma, tejidos, alimento, heces)
consta de dos pasos: aislamiento del flúor por destilación isotérmica y determinación
potenciométrica del F aislado. Durante este trabajo de tesis se realizaron cambios en la
técnica que determinaron un aumento de la sensibilidad y precisión.
La técnica de destilación isotérmica disponible al inicio de esta tesis consistía en
una destilación isotérmica a 60 ºC durante una semana, utilizando como reactivo para
desplazar el flúor de las muestras, 100 µL de ácido sulfúrico 6 mol/L y como trampa para
el HF desplazado, 10 µL NaOH 1.65 mol/L. Este último se secaba durante 1 día para evitar
pérdidas por escurrimiento. Luego de la destilación isotérmica la trampa de NaOH con el F
se ajustaba a pH 5.5 con HAc diluido 1/60 del HAc glacial. Esta técnica presentaba las
siguientes dificultades:
1. tiempo prolongado de destilación.
2. incompleta recuperación del flúor de la muestra.
El mejoramiento realizado permitió reducir el tiempo necesario para la obtención
de los resultados y aumentar la recuperación del flúor de las muestras. Se sustituyó el ácido
sulfúrico por ácido fosfórico concentrado. Con este ácido se disminuyó el tiempo de
destilación de 7 a 1 día. Por otra parte, se redujo el volumen de NaOH utilizado como
trampa del HF desprendido de 10 a 5 µL, evitando de esta manera la necesidad de secado y
la pérdida por escurrimiento. Finalmente, se modificó la concentración del HAc,
adicionándose 60 µL diluido 1/120, disminuyéndose la fuerza iónica de la solución final
aumentando así la sensibilidad del electrodo. La Ilustración 27 muestra esquemáticamente
88
el procedimiento antes y después de la modificación. El avance más relevante ha sido el
acortamiento del tiempo de destilación que permite obtener valores en 24 h. La técnica
actualizada se describe adelante en pág. 90.
Ilustración 27: Tiempo empleado en la determinación al inicio de la tesis y el tiempo requerido
luego del mejoramiento de la técnica.
La metodología para medir la concentración de F en muestras biológicas y su
interpretación son dependientes de las especies químicas de flúor que tiene la muestra. A
continuación se realiza una descripción de las diferentes formas químicas que contienen
flúor en una muestra biológica.
Diferentes formas químicas en las que se encuentra el flúor en las muestras
biológicas
El flúor en las muestras biológicas puede hallarse como F, flúor ácido lábil (FAL) y
flúor ácido resistente (FAR). La Ilustración 28 muestra las diferentes formas de flúor y su
forma de medición.
89
Ilustración 28: Diferentes formas químicas de flúor y su forma de medición.
El F es la especie de flúor soluble en agua y su medición se realiza por
potenciometría directa con un electrodo ión específico, ver la descripción de la técnica
potenciometría directa en pág. 90.
FAL son aquellas formas químicas de flúor que se encuentran unidas a otras
moléculas por enlaces que pueden destruirse por el tratamiento con ácidos fuertes. Están
incluidas en FAL compuestos poco solubles o poco disociados, iones complejos con
metales pesados y uniones no covalentes a moléculas orgánicas. Por lo tanto, para poder
determinar la concentración de esta especie es necesario romper esos enlaces, por medio de
la adición de ácidos. Esto se realiza utilizando la destilación isotérmica de flúor descripta
en pág. 90. Al realizar la destilación isotérmica se aísla el FAL junto con el F de la
muestra, por lo tanto al realizar la medida potenciométrica se obtiene la suma de ambas
formas. Para conocer la concentración de FAL se debe restar a esta determinación la
concentración de F determinada por potenciometría directa.
FAR son aquellas formas químicas de flúor que se encuentran unidas a otras
moléculas por enlaces covalentes, resistentes al tratamiento por ácidos. Para poder medir
este flúor es necesario, previo a la medición calcinar la muestra de manera de eliminar todo
el material orgánico y romper los enlaces covalentes del flúor. Una vez calcinado el
material se procede a la medición del mismo por potenciometría directa previa destilación
isotérmica. De esta manera se obtiene una medición del flúor total (F + FAL + FAR) de la
90
muestra, independientemente de su forma química inicial. El contenido de FAR de la
muestra se obtiene por diferencia entre el flúor medido por este procedimiento y el
contenido de FAL mas el F de la muestra.
Medición de fluoruro en orina por potenciometría directa
La medición de la concentración de F en orina se realizó por potenciometría directa
utilizando un electrodo de ión específico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de
Ag/AgCl conectados a un conversor analógico-digital. La determinación se basa en la
relación lineal existente entre los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la
concentración de F en las muestras o patrones utilizados. Simultáneamente con las
muestras se procesan soluciones patrones de NaF de 1 mmol/L- 0.001mmol/L [91]. A las
muestras y las soluciones patrón se les adiciona un 10 % de buffer ácido acético/acetato de
sodio 2 mol/L para ajustar pH a 5.25 y homogeneizar la fuerza iónica de las soluciones. La
técnica requiere muestras de orina de 50 µL o superiores.
La medición con electrodo de ión específico no es aplicable a muestras sólidas, en
solución con concentraciones de F menores al límite de detección (<0.1 µmol/L) o cuando
se encuentren presente sustancias como las proteínas que interfieren en la determinación.
En todos estos casos independientemente de la forma química en la que se encuentre el
flúor se requerirá destilación isotérmica para aislar el flúor o lograr concentrarlo.
Medición de flúor por potenciometría directa previa destilación isotérmica
Esta técnica se utilizó para muestras sólidas, acuosas con concentraciones menores
al límite de detección, con presencia de FAL y/o proteínas, como es el caso de la sangre y
el plasma. La destilación isotérmica se realizó colocando 70 µL de la muestra en una
cámara de destilación junto con 100 µl de ácido fosfórico concentrado. En la tapa de la
cámara se colocaron 5 µL de NaOH 1.65 mol/L. Se tapó la cámara y luego de 24 h se
destapó, y en la tapa se agregaron 60 µL de HAc 1/120 para generar un pH= 5.25 y una
fuerza iónica adecuados para realizar la medición potenciométrica. La medición de la
concentración de flúor en la solución resultante se realizó utilizando un electrodo de ion
específico ORION 94-09 y un electrodo de referencia de Ag/AgCl conectados a un
conversor analógico-digital. La determinación se basa en la relación lineal existente entre
los mV desarrollados por los electrodos y el logaritmo de la concentración de F en las
muestras o patrones utilizados. Simultáneamente con las muestras se procesan soluciones
patrones de NaF de 1mmol/L- 0.001mmol/L [91
].
91
Medición de flúor por potenciometría directa previa calcinación y destilación
isotérmica
Esta técnica se utilizó para muestras donde existe FAR. Las muestras se sometieron
a calcinación a 600 ºC durante 4 h en crisoles de porcelana utilizando un horno eléctrico de
calcinación. Luego de este proceso la muestra fue tratada como se indicó en el párrafo
anterior.
92
ANEXO II: METODOLOGÍA ESPECÍFICA
APLICABLE A CADA OBJETIVO
93
ANEXOII: METODOLOGÍA ESPECÍFICA APLICABLE A CADA OBJETIVO
Metodología utilizada en el objetivo 1
Cálculo de los parámetros farmacocinéticos del F
Las mediciones se realizaron en animales entre 80 y 150 días, de manera de obtener
un amplio rango de las variables que podrían influir sobre los parámetros farmacocinéticos
(mencionadas en Materiales y Métodos: Objetivo específico 1) y se correlacionaron con los
mismos.
Los parámetros farmacocinéticos se obtuvieron utilizando el método ya descripto
[80,81
] que implica dos días de trabajo, la obtención de muestras de orina de 24 h en dos
días consecutivos para la medición de excreción urinaria de F y la obtención de 4 muestras
de sangre para medidas de fluoremia.
Brevemente, el modelo utilizado supone que antes de administrar una dosis de F, la
concentración plasmática de flúor es constante. En estas condiciones la cantidad de F
excretado en orina durante 24 h (U24) se puede expresar en función de la constante de
velocidad de excreción urinaria de F (ku), la concentración plasmática del ion [F ] y el
intervalo de tiempo (t), que en este caso es 24 h:
tFku=U ][24 Ecuación 70
Por otra parte, la concentración plasmática de flúor luego de una dosis de NaF
alcanza un máximo de concentración y luego decae ajustándose por una función mono-
exponencial:
tkeeVd
Do=F .
Ecuación 71
Donde Do es la dosis administrada de NaF, Vd el volumen de distribución, ke la
constante de velocidad de eliminación plasmática de flúor y t el tiempo.
A partir de estas ecuaciones se calcularon los parámetros farmacocinéticos.
94
Calculo de la constante de velocidad de excreción urinaria de F
La constante de velocidad eliminación urinaria se obtuvo a partir de la Ecuación
70.
Para obtener la misma se colocaron a los animales en jaulas individuales, se
recolectó orina durante 24 h (t = 1440 min), se determinó la excreción de F durante ese
período (ver pág.90) y se obtuvo una muestra de sangre de la vena de la cola (ver pág.84),
en la que se determinó flúor (ver pág.90). Con estos datos se obtuvo el valor de U24 y [F].
Se administró una dosis endovenosa (Do) de F de 1 µmol/100 g peso corporal y se
obtuvieron muestras de sangre (ver pág. 84) a los 3, 18 y 33 min. En dichas muestras se
determinó la concentración de F (ver ANEXO I, pág.90). Los valores de la concentración
de flúor plasmático se ajustaron en función del tiempo con la Ecuación 72 que resulta de
rectificar la Ecuación 71.
tkeVd
Do=F .lnln
Ecuación 72
La pendiente de esta recta permite conocer el valor de ke. Por otra parte, la
ordenada al origen de la recta permite conocer el Vd.
Calculo de la constante de velocidad de incorporación de F al hueso:
Dado que el F se depura del plasma por eliminación plasmática y por el
intercambio que tiene con el tejido óseo. Si los órdenes de los procesos son iguales, ke se
puede calcular por la siguiente ecuación:
ku+ko+ko=ke +
Ecuación 73
donde ko- es la constante de velocidad de salida de F del hueso, ko
+ es la constante
de velocidad de incorporación de F al hueso y ku es la constante de velocidad de excreción
urinaria de F. Luego de una dosis de F, se puede suponer que el proceso de eliminación de
F del hueso es mucho menor que el proceso de incorporación, por lo tanto incorporando
esta simplificación, la Ecuación 73 se puede escribir como:
95
ku+ko=ke + Ecuación 74
De esta ecuación se puede calcular ko+,
utilizando los valores de ke y ku calculados
como se expresó anteriormente.
Determinación de la excreción fecal de flúor
Se recolectó materia fecal durante 24 h colocando los animales (n=18) en jaulas
individuales equipadas con un dispositivo para la recolección de materia fecal. Finalizado
el período de recolección se determinó flúor total (F+FAL+FAR) como se indicó
anteriormente (ver ANEXO I, pág. 90).
Determinación de la excreción urinaria de F
Se recolectó orina durante 24 h colocando los animales (n=75) en jaulas
individuales equipadas con un dispositivo de recolección de orina. El volumen urinario se
recolectó en una probeta de 25 mL con apreciación 0.5 mL, con un E% máximo de 5 %. Se
determinó la concentración de F en orina como se detalló anteriormente (ver ANEXO I,
pág. 90).
Determinación de flúor en el alimento
El flúor se encuentra en el alimento bajo sus tres formas químicas: F, FAL y FAR.
La medición de cada forma química se realizó como se indicó anteriormente (ver ANEXO
I, pág.88).
El F en el alimento se midió en el sobrenadante que resulta de tratar una alícuota de
alimento con 50 mL de agua destilada durante 180 min con agitación constante. En esta
solución se determinó F por potenciometría directa (ver ANEXO I, pág.90).
El FAL se determinó por diferencia entre el F del alimento (medido como se indicó
en el párrafo anterior) y la medida de flúor por potenciometría directa previa destilación
isotérmica (ver ANEXO I, pág.90).
El FAR se obtuvo por diferencia de la medida de F en cenizas luego de calcinar la
muestra y la concentración de F y FAL.
Para medir el consumo de las diferentes formas químicas de flúor en alimentos se
colocaron 18 ratas Sprague Dawley de 80-140 días de edad en jaulas individuales con un
96
dispositivo de control del alimento consumido. La cantidad de alimento consumido en 24 h
se obtuvo por pesada del comedero al inicio del período y luego de 24 h. La medición se
realizó con una balanza Ohaus Traveler apreciación 0.1 g, con un E % máximo de 0.1 %.
Se extrajeron muestras representativas del alimento consumido en las que se midió F, FAL
y FAR como se indicó anteriormente.
Velocidad de inyección intravenosa de F
El F al ser inyectado por vía endovenosa produce una rápido incremento en la
concentración plasmática, que luego de un breve período de homogeneización comienza la
fase de distribución. La velocidad a la que se realiza la inyección podría ser determinante
de las fluoremias obtenidas luego de la inyección. Para investigar esta variable se utilizaron
57 ratas Sprague Dawley de 80-140 días de edad a las que se les inyectó por la vena de la
cola 1 µmol F/100 g peso corporal en un período de tiempo variable (3 a 90 s). Se obtuvo
sangre de la vena de la cola a los 0, 3, 18 y 33 min y se determinó la concentración de flúor
plasmática (ver ANEXO I, pág.90). Se correlacionó la velocidad de inyección con los
valores de concentración sanguínea de flúor y con la constante de depuración plasmática
del F (ke).
Efecto de la manipulación previa de los animales sobre la excreción urinaria de
F
Datos obtenidos previamente a esta tesis indicaban que la excreción urinaria podría
ser influenciada no sólo por la dosis de F y los procesos farmacocinéticos descriptos
anteriormente (ver Introducción), sino también por la manipulación experimental del
animal. Para verificar esta hipótesis se realizó una experiencia en la que se colocaron dos
grupos de 4 ratas Sprague Dawley en jaulas individuales con dispositivo para recolección
de orina. Los animales de ambos grupos recibieron una dosis intravenosa de NaF de 1
µmol/100 g peso corporal. Un grupo recibió 24 h antes de la inyección de F, una inyección
endovenosa de 0.06 mL de solución fisiológica/100 g peso corporal. El objetivo de esta
inyección fue simular un tratamiento farmacológico independiente del F en un grupo de
animales. Se determinó la excreción de F por potenciometría directa en muestras de orina
recolectadas durante las 24 h posteriores a la inyección endovenosa de solución fisiológica.
Se compararon los valores de excreción urinaria de F en 24 h con y sin la inyección
endovenosa previa de solución fisiológica utilizando t de Student para datos
independientes.
97
Distribución de fluoruro entre plasma y glóbulos rojos
Experimentos previos a esta tesis indicaron la posibilidad de dos procesos
involucrados en el decaimiento en la concentración plasmática de flúor luego de una dosis
endovenosa: una de distribución en tejido blandos y otra de eliminación por orina e
incorporación al hueso. Se evaluó la distribución in vitro de flúor en plasma y en glóbulo
rojo. Para investigar este proceso se obtuvo sangre de 2 animales sin tratamiento previo
con F. Se realizó un pool a partir de las mismas, se separaron 10 mL y se adicionó NaF
obteniéndose una concentración de F de 0.1 mmol/L, la muestra se mantuvo con agitación
constante durante todo el experimento. A los 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 60 min se
obtuvieron dos muestras de 400 µL. En una de ellas se midió la concentración de flúor
directamente y la otra se centrifugó durante 5 s, se separó el plasma en el que se midió la
concentración de flúor. Por diferencia entre ambas mediciones se determinó la
concentración de flúor en los glóbulos rojos. El experimento descripto se repitió 5 veces.
Del análisis de los datos se infirió sobre la velocidad de entrada del F al glóbulo rojo.
Estudio de la distribución de F entre sangre y tejidos blandos
Se evaluó el proceso de distribución de F in vivo en diferentes tejidos blandos.
Luego de inducir anestesia general, se administró una dosis intravenosa de NaF de 1
µmol/100 g peso corporal a 12 ratas Sprague Dawley. Los animales se sacrificaron por
punción cardíaca obteniéndose a los 3 min muestras de sangre, plasma y de hígado, riñón y
músculo esquelético del muslo. En dichas muestras se determinó la concentración de flúor
(ver ANEXO I, pág. 90).
Histomorfometría estática
En todos los modelos animales en los que se midió Fo yRo se confirmó el estado
de alto o bajo remodelado óseo por comparación de los parámetros de histomorfometría
estática con sus respectivos grupos controles. Luego del estudio farmacocinético los
animales se sacrificaron por punción cardíaca, previa anestesia general y se separó la tibia
izquierda para realizar histomorfometría estática. La tibia se fijó con formol-PBS al 10 %
durante 72 h [92
]. Posteriormente, se descalcificó en EDTA 10 % por 35 días a 4 °C. El
tejido se incluyó en parafina y se prepararon los bloques de parafina empleando moldes
plásticos y anillos de inclusión. Se realizaron cortes de 5 µm con un micrótomo (Minot-
Mikrotm Typ 1212. Leitz, Wetzlar, Alemania) con cuchilla especial para tejidos duros
(H35N). Los cortes fueron adheridos a un portaobjeto con albumina glicerinada de Mayer.
98
Se realizaron tinciones del tejido con hematoxilina-eosina, realizándose en primer
término la eliminación de la parafina con xilol y seguidamente la rehidratación mediante
una serie de soluciones alcohólicas de graduación decreciente. Finalmente, se cubrió con
un cubreobjeto montado con bálsamo de Canadá.
Se procedió a la digitalización de las imágenes obtenidas de los preparados
histológicos descriptos, mediante la utilización de un microscopio (Mikoba S320, China)
con una cámara fotográfica adaptada (Olympus SP-350, Japan). Se tomaron fotografías a
40x aumentos de la epífisis proximal de la tibia en un área de 2 mm2, a 1 mm del cartílago
de crecimiento. Esta imagen fue recortada y posteriormente analizada con un software
específico (ImageJ). Se determinó, como describió Parfitt et al. [93
]: área total de tejido
analizado: TV (μm2); área ocupada por hueso: BV (μm
2); y perímetro de dicha área: BS
(μm). Se midió la superficie erodada y cubierta por osteoclastos (OC.S) y la superficie
cubierta por osteoblastos (Ob.S). Con estos datos se calculó el porcentaje de la superficie
cubierta por osteoblastos (Ob.S/BS %) y por osteoclastos (OC.S/BS %). Estos valores se
muestran en la Ilustración 29 e Ilustración 30.
Control OVX OVX+Hipo OVX+Hiper OVX+Z0
2
4
6
8
OC
.S/B
S (
%)
Ilustración 29: Superficie cubierta por osteoclastos (OC.S/BS %) de los grupos analizados.
Control OVX OVX+Hipo OVX+Hiper OVX+Z0
10
20
30
40
Ob
.S/B
S (
%)
Ilustración 30: Superficie cubierta por osteoblastos (Ob.S/BS %) de los grupos analizados.
99
Medida de deoxipiridinolina urinaria (Dpd)
Dado que en este trabajo la Dpd se utilizaró como técnica de estimación de la
resorción ósea, se realizó en primer término la elección de la mejor metodología disponible
en el mercado. Se compararon dos equipos de medición de Dpd urinaria: ELISA y RIA en
distintos modelos biológicos con remodelación ósea modificada. Para ello, se realizaron
mediciones de Dpd con ambos métodos en orina de ratas con remodelación ósea
predictible de acuerdo a su edad, por las modificaciones inducidas quirúrgicamente o por
modificaciones dietarias. Las comparaciones se realizaron utilizando muestras de ratas de
diferente edad (21-150 días), ratas con resorción ósea aumentada (ovariectomizadas, con
dieta hipocálcica) y con resorción ósea disminuida (ovariectomizadas con tratamiento con
zoledronato), detalles de las cirugías en ANEXO I, pág. 85. Los estados de remodelación
fueron confirmados por captación ósea de F y por histomorfometría estática.
Resultados: las siguientes tablas (Tabla 7 y Tabla 8) muestran los valores de Dpd
con las dos metodologías (nmol Dpd/mmol creatinina) para cada uno de los modelos
estudiados (media±SEM):
Tabla 7: Medida de resorción ósea utilizando Dpd como marcador para distintos grupos
experimentales.
Métodos Control OVX OVX+Hipo OVX+Z
RIA 403.84 ±177.01 391.86 ±175.70 613.68 ±352.16 166.14 ±70.17
ELISA 307.4 ±114.1 300.0 ±163.8 161.7 ±63.16 141.5 ±42.61
Tabla 8: Ratas en crecimiento.
Métodos 30 días 40 días 60 días 80 días 110 días
RIA 398.50 ± 57.26 230.91 ± 29.73 204.62 ± 21.94 170.81 ± 36.11 110.10 ± 8.65
ELISA 171.30 ± 9.15 135.45 ±18.68 117.56 ± 13.84 107.93 ± 13.00 76.44 ± 3.67
Se halló una correlación significativa entre los valores de Dpd medidos por RIA y
ELISA r=0.4983, p<0.005. Sin embargo, comparando los valores de Dpd obtenidos por
ambas metodologías se puede concluir que los valores de Dpd obtenidos por ELISA no
coinciden con los esperados en ratas con OVX y con dieta hipocálcica. Las diferencias de
100
los valores de cada tratamiento con respecto a sus controles son más marcadas con RIA. La
mayor cantidad de pasos involucrados en la realización del ELISA podría ser la causa de
dicha discrepancia. El menor costo y la mayor precisión de los equipos, hacen que la
metodología RIA haya sido elegida como marcador de resorción ósea en este trabajo de
tesis [94].
101
ANEXO III: PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
102
ANEXO III: PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
Trabajos publicados
Lombarte M, Lupo M, Campetelli G, Basualdo M, Rigalli A. Mathematical model
of glucose-insulin homeostasis in healthy rats. Math Biosc. Enviado a publicar. 2012.
Brun LR, Brance ML, Lupo M, Rigalli A. Relevamiento del contenido de calcio en
lácteos de uso masivo. Actualizaciones en Osteología 8 (3): 158-163. 2012.
Lupo M, Fina B, Aguirre MC, Armendariz M, Rigalli A. Determination of water
fluoride concentration and the influence of the geographic coordinate system and time.
Water Air and Soil Pollut. 223(8): 5221-5225. 2012.
Aguirre MC, Armendariz M, Lupo M, Rigalli A. Mathematical model for the
homeostasis of alpha-macroglobulins in the rat. Math Biosc. 234 (1) 17-24. 2011.
Lupo M, Buzalaf M, Rigalli A. Effect of fluoridated water on plasma insulin levels
and glucose homeostasis in rats with renal deficiency. Biol Trace Elem Res. 140(2):198-
207. 2010.
Lupo M, Rigalli A. Control de la tetania en modelos quirúrgicos de hipocalcemia
en ratas. Actualizaciones en Osteología 5(3):165-170. 2009.
Lupo M, Rigalli A. Método miniinvasivo de medición de la remodelación ósea en
ratas. Validación en distintos modelos biológicos. Actualizaciones en osteología. 5(1): 9-
19. 2009.
Capítulos de libros relacionados al tema de tesis
Lupo M, Di Loreto V, Rigalli A. Chapter 11: Substances administration. En:
Rigalli A. Di Loreto V. Experimental Surgical Models in the Laboratory Rat Taylor and
Francis Group. CRC Press. Boca Ratón. USA. ISBN 976-1-4200-9326-1, 2009. pág. 55-61
Lupo M, Rigalli A. Chapter 31: Parathyroid glands. En: Rigalli A. Di Loreto V.
Experimental Surgical Models in the Laboratory Rat Taylor and Francis Group. CRC
Press. Boca Ratón. USA. ISBN 976-1-4200-9326-1, 2009. pág. 157-158
103
Abstract publicados
Fina BL, Lupo M, Da Ros ER, Moreno H, Roma SM, Rigalli A. Effect of sodium
fluoride on biomechanical and Histomorphometric bone parameters: Identification of
variables that determine the fracture load in NaF-treated rats. Fluoride 45: 151-218. 2012.
Dri N, Brun L, Di Loreto V, Lupo M, Rigalli A. Study of the composition of the
egg shell. A low cost calcium supplement. Bone. In press.
Brance ML, Brun LR, Arias L, Lupo M, Vicente D, Rigalli A. Sequential
treatment with monofluorophosphate (MFP) and zoledronate (Z) leads to increased bone
mass in rats with modified bone remodeling. Bone. In press.
Mejia S, Lupo M, Moreno H, Vicente D, Rigalli A. Effect of
monofluorophosphate (MFP) and sodium fluoride (NaF) on the reparation of a non critical
bone defect in rats. Bone. In press.
Lupo M, Garcia B, Moreno H, Rigalli A. Measurement of bone resorption (BR)
and formation (BF) in rats using the urinary pharmacokinetic of fluoride (F). Bone,
49(6).1377. 2011.
Mejia S, Lupo M, Moreno H, Vicente D, Rigalli A. Effect of monofluorophophate
(MFP) and sodium fluoride (NaF) on the repartion of a non critical bone defect in rats.
Bone 49(6).1378. 2011.
Brance ML, Brun LR, Arias L, Lupo M, Vicente D, Rigalli A. Sequential
treatment with monofluorophosphate (MFP) and zoledronate (Z) leads to increased bone
mass in rats with modified bone remodeling. Bone 49(6).1380. 2011.
Lupo M, Rigalli A. Rat bone resoption (BR) measurements by urinary
deoxypyridinoline (Dpd) determination. Comparison between two different comercial kits.
Bone 48(6). S290. 2011.
Brance ML, Lupo M, Arias L, Brun LR, Rigalli A. Effect of monofluorophosphate
(MFP) and zoledronate (Z) on bone mass of rats with modified bone remodelling. Bone
48(6). S290. 2011.
Lupo M, García B, Rigalli A. Bone fluoride (F) uptake rate determination. Bone
48(6). 2011.
104
Mejia S, Lupo M, Moreno H, Vicente D, Rigalli A. Efecto del monofluorofosfato
(MFP) y fluoruro de sodio (NaF) sobre el proceso de reparación de defectos no críticos
óseos en ratas. Actualizaciones en Osteología 7 (2): 132. 2011.
Brance ML, Brun LR, Arias L, Lupo M, Vicente D, Rigalli A. El tratamiento
secuencial con monofluorofosfato (MFP) y zoledronato (Z) produce aumento de la masa
ósea en ratas con modificación del estado de remodelación ósea. Actualizaciones en
Osteología 7 (2): 155. 2011.
Lupo M, García B, Moreno H, Rigalli A. Medida de la resorción y formación ósea
en ratas a partir de la farmacocinética del fluoruro estudiada por vía urinaria.
Actualizaciones en Osteología 7 (2): 120. 2011.
Brance L, Lupo M, Arias L, Brun L, Rigalli A. Efecto sobre la masa ósea de una
terapéutica secuencial con monofluorofosfato en rats con diferente estado de remodelación
ósea. Actualizaciones en Osteología. 6:134. 2010.
Lupo M, Garcia B, Rigalli A. Determinación de la velocidad de captación de
fluoruro por el tejido óseo. Actualizaciones en Osteología. 6:152.2010.
Lupo M, Rigalli A. Estimación de la resorción ósea en ratas por medidas de
deoxipiridinolina urinaria. Comparación de equipos comerciales. Actualizaciones en
Osteología. 6:158. 2010.
Lupo M, Rigalli A. Control de la calcemia y tetania en modelos de hipocalcemia
en la rata. Actualizaciones en Osteología 5 (2): 124. 2009.
Lupo M, Rigalli A. Calcemia and tetany in hypocalcemic models in the rat. Bone
45: S153. 2009.
Lupo M, Rigalli A. A novel technique for the measurement of bone remodelling in
rats. Bone 43: S124. 2008.
Lupo M, Rigalli A. Método mini-invasivo de medición de la formación y resorción
ósea en ratas. Actualizaciones en Osteología 4 (Supl I) S75. 2008.
Premios recibidos
1° Premio Niloufer Chinoy Awards: Fina BL, Lupo M, Da Ros ER, Moreno H,
Roma SM, Rigalli A. Effect of sodium fluoride on biomechanical and histomorphometric
bone parameters. Identification of variables that determine the fracture load on NaF-treated
105
rats. XXXth Conference of the International Society for Fluoride Research. Szczecin,
Polonia, 5 de Septiembre de 2012.
2º Premio la Investigación Básica por el trabajo titulado: Efecto sobre la masa ósea
de una terapéutica secuencial con monofluorofosfato (MFP) y zoledronato (Z) en ratas con
diferente estado de remodelación ósea. Brance ML, Lupo M, Arias L, Brun LR, Rigalli A.
XXVII Reunión anual de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral.
Córdoba, 9 de septiembre de 2010.
7º Premio XX Congreso Científico Argentino de Estudiantes de Medicina de las
FACES. Resultados preliminares de la utilización de dietas con diferente contenido de
calcio (Ca) con fines de modificar la remodelación ósea (RMO) y el efecto de drogas
osteotrópicas. Córdoba. Octubre de 2009.
1° Premio a la Investigación Básica por el trabajo titulado: Método mini-invasivo
de medición de la formación y resorción ósea en ratas. Autores: Lupo M, Rigalli A. XXV
Reunión anual de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral. Buenos
Aires 6-8 de noviembre de 2008.
3° premio XIX Congreso Científico Argentino de Estudiantes de Medicina de la
FACES. Rosario. 22-24 octubre de 2008. Método mini-invasivo de medición de la
remodelación ósea en ratas. Validación en distintos modelos biológicos.
Trabajos presentados a congresos
2012. Pilotti F, Lupo M, Rigalli A. Estudio de la variación en la concentración de
fluoruro en agua de pozo en localidades de la provincia de Santa Fe. XXIII Jornadas
Científicas Anuales de la ACREM. Rosario, 4 de Octubre de 2012.
2012. Lupo M, Lombarte M, Pilotti F, Moreno H, Fina BL, Rigalli A.Temporal
and spatial measurement of fluoride in drinking water. XXXth Conference of the
International Society for Fluoride Research. Szczecin, Polonia, 5 de Septiembre de 2012.
2012. Fina BL, Lupo M, Da Ros ER, Moreno H, Roma SM, Rigalli A. Effect of
sodium fluoride on biomechanical and histomorphometric bone parameters. Identification
of variables that determine the fracture load on NaF-treated rats. XXXth Conference of the
International Society for Fluoride Research. Szczecin, Polonia, 5 de Septiembre de 2012.
2011. Lupo M, García B, Moreno H, Rigalli A. Medida de la resorción y
formación ósea en ratas a partir de la farmacocinética del fluoruro estudiada por vía
106
urinaria. XXVIII Reunión anual de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo
Mineral. 26-27/8/2011. Buenos Aires.
2011. Mejia S, Lupo M, Moreno H, Vicente D, Rigalli A. Efecto del
monofluorofosfato (MFP) y fluoruro de sodio (NaF) sobre el proceso de reparación de
defectos no críticos óseos en ratas. XXVIII Reunión anual de la Asociación Argentina de
Osteología y Metabolismo Mineral. 26-27/8/2011. Buenos Aires.
2011. García B, Rigalli A, Lupo M. Estimación de parámetros farmacocinéticos
del fluoruro a partir de datos de fluoruria luego de la administración de una dosis oral de
fluoruro de sodio en la rata. XXII Jornadas científicas anuales de la Asociación científica
Rosarina de Estudiantes de Medicina. 4-5/10/11. Rosario.
2011. Brance ML, Brun LR, Arias L, Lupo M, Vicente D, Rigalli A. El
tratamiento secuencial con monofluorfosfato (MFP) y zoledronato (Z) produce aumento de
la masa ósea en ratas con modificación del estado de remodelación ósea. XIII Congreso y
XXXI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario, Rosario, 1- 2/12/2011.
2011. Lupo M, Garcia B, Rigalli A. Técnica de recolección de muestras urinarias
mini-invasiva en ratas. XII Jornadas de divulgación técnico científicas en ciencias
veterinarias. Esperanza, 16/9/2011.
2010. Lupo M, Rigalli A. Variación del contenido de flúor (F) en aguas de la
provincia de Santa Fe por tiempo y sitio de muestreo. XII Congreso Sociedad de Biología
de Rosario. 2-3 diciembre 2010.
2010. Garcia B, Rigalli A, Lupo M. Determinación de parámetros
farmacocinéticos del fluoruro en la rata a través de valores de fluoruria. XXI Congreso
científico Argentina de Estudiantes de Medicina. 26-30 octubre 2010. Buenos Aires.
2010. Garcia B, Rigalli A, Lupo M. Determinación de parámetros
farmacocinéticos del fluoruro en la rata a través de valores de fluoruria. XXI Jornadas
Científicas anuales de la ACREM. Rosario. 13-14 de octubre de 2010.
2010. Brance L, Lupo M, Arias L, Brun L, Rigalli A. Efecto sobre la masa ósea de
una terapéutica secuencial con monofluorofosfato en rats con diferente estado de
remodelación ósea. XXVII Reunión Anual Asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. Córdoba 9-11 de septiembre 2010.
107
2010. Lupo M, Garcia B, Rigalli A. Determinación de la velocidad de captación de
fluoruro por el tejido óseo. XXVII Reunión Anual Asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. Córdoba 9-11 de septiembre 2010.
2010. Lupo M, Rigalli A. Estimación de la resorción ósea en ratas por medidas de
deoxipiridinolina urinaria. comparación de equipos comerciales. XXVII Reunión Anual
Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral. Córdoba 9-11 de septiembre
2010.
2009. Brance ML, Lupo M, Garcia B, Arias L, Vicente D, Rigalli A. Resultados
preliminares de la utilización de dietas con diferente contenido de calcio (Ca) con fines de
modificar la remodelación ósea (RMO) y el efecto de drogas osteotrópicas. XXIX Reunión
Anual de la Sociedad de Biología de Rosario. Rosario. 3-4 diciembre de 2009.
2009. García B, Arias L, Vicente D, Lupo M, Brance ML, Rigalli A. Efectos de un
tratamiento osteogénico y antirresortivo en ratas alimentadas con dieta con contenido
cálcico variable. Resultados preliminares. Jornadas científicas anuales de la ACREM.
Rosario. Noviembre 2009.
2009. García B, Arias L, Vicente D, Lupo M, Brance ML, Rigalli A. Resultados
preliminares de la utilización de dietas con diferente contenido de calcio (Ca) con fines de
modificar la remodelación ósea (RMO) y el efecto de drogas osteotrópicas. XX Congreso
Científico Argentino de Estudiantes de Medicina de las FACES. Córdoba. Octubre de
2009.
2009. Lupo M, Rigalli A. Control de la calcemia y tetania en modelos de
hipocalcemia en ratas. XXVI Reunión Anual de la Asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. 27-29 de agosto de 2009. Buenos Aires.
2008. Lupo M, Rigalli A. Método mini-invasivo de medición de la formación y
resorción ósea en ratas. XXV Reunión anual de la asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. Buenos Aires, 7 de noviembre de 2008.
2008. Dalmau V, Ramirez Stieben LA, Lupo M, Rigalli A. Metabolismo glucídico
en ratas con insuficiencia renal crónica e ingesta de agua fluorada de consumo. XIX
Congreso Argentino Científico de Estudiantes de Medicina de la FACES. Rosario. 22-24
octubre de 2008.
108
2008. Lupo M, Rigalli A. Método miniinvasivo de medición de la remodelación
ósea en ratas. Validación en distintos modelos biológicos. XIX Congreso Argentino
Científico de Estudiantes de Medicina de la FACES. Rosario. 22-24 octubre de 2008.
Asistencia a congresos, seminarios y jornadas
2012. XXX Conference of the International Society for Fluoride Research.
Szczecin, Polonia, 5 de Septiembre de 2012.
2011. II Jornadas Patagónicas de Biología. I Jornadas Patagónicas de Ciencias
Ambientales. IV Jornadas Estudiantiles de Ciencias Biológicas. Trelew, 21 de Septiembre
de 2011.
2011. XII Jornadas de Divulgación Técnico Científicas, Facultad de Ciencias
Veterinarias, UNR. Jornada Nacional de Divulgación Técnico Científica 2011. Facultad de
Ciencias Veterinarias, UNR– UNL. 250º Aniversario de la Enseñanza Veterinaria.
Esperanza, 16 de Septiembre de 2011.
2011. XXVIII Reunión anual de la Asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. Buenos Aires, 25 de agosto de 2011.
2010. XII Congreso, XXX Reunión anual, Sociedad de Biología de Rosario.
Rosario, 2- 3 Diciembre de 2010.
2010. XXVII Reunión anual de la Asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. Córdoba, 9 de septiembre de 2010.
2009. XI Congreso y XXIX Reunión Anual Sociedad de Biología de Rosario.
Rosario, 3 de diciembre de 2009.
2009. XX Jornadas Científicas Anuales de la ACREM. Rosario, 10 de noviembre
de 2009.
2009. XXVI Reunión anual de la Asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. Buenos Aires, 27 de agosto de 2009.
2008. XXV Reunión anual de la Asociación Argentina de Osteología y
Metabolismo Mineral. Buenos Aires, 7 de noviembre de 2008.
2008. XIX Congreso Argentino Científico de Estudiantes de Medicina de la
FACES. Rosario. 22-24 octubre de 2008
109
TABLA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Descripción
AMPc Adenosín monofosfato cíclico
AUC Área bajo la curva
BGP Osteocalcina
Ca45 Calcio radiactivo emisor beta positivo
C-terminal Carboxilo terminal
CTX Telopéptidos c-terminales del colágeno tipo I
Do Dosis inicial
Dpd Deoxipiridinolina
E Especificidad
E% Error relativo porcentual máximo
ELISA Enzimo inmuno ensayo
F Fluoruro
[F] Concentración plasmática de flúor
FA Fosfatasa alcalina total
FAL Flúor ácido lábil
FAo Fosfatasa alcalina ósea
FAR Flúor ácido resistente
Fo Medida de formación ósea obtenida con el modelo desarrollado en la tesis
Fp Cantidad de µmol de flúor plasmático
HPLC Cromatografía líquida de alta presión
HYPRO Hidroxiprolina
IRMA Técnica inmunoradiométrica
ka Constante de absorción gastrointestinal de F
kb Excreción urinaria basal de F
kDa kiloDaltons
ke Constante de eliminación plasmática de F
ko- Constante de eliminación ósea de F
ko+ Constante de incorporación ósea de F
ku Constante de excreción urinaria de F
MBP Metilbisfosfonato
NaF Fluoruro de sodio
NNP1 Propéptidos N terminales de procolágeno tipo I
npv Valor predictivo de test negativo
110
N-terminal Amino terminal
NTX Telopéptidos N-terminales del colágeno tipo I
OMS Organización Mundial de la Salud
OPG Osteoprotegerina
OVX Ovariectomizadas
OVX+Hiper Ovariectomizadas con dieta hipercálcica
OVX+Hipo Ovariectomizadas con dieta hipocálcica
OVX+Z Ovariectomizadas en tratamiento con ácido zoledrónico
pNFF p-Nitrofenilfosfato
ppm Partes por millón
ppv Valor predictivo de test positivo
PTH Hormona paratiroidea
RANK Receptor activador del factor nuclear κ β
RANKL RANK Ligando
RIA Radioinmuno ensayo
Ro Medida de resorción ósea obtenida con el modelo desarrollado en la tesis
ROC Característica Operativa del Receptor
S Sensibilidad
TGI Tracto gastrointestinal
TRAP Fosfatasa ácida tartrato resistente
U Cantidad de µmol de F excretado en orina.
Vd Volumen de distribución de F
Vu Velocidad de excreción urinaria de F
1,25(OH)2D3 1,25 dihidroxicolecalciferol o calcitriol
111
REFERENCIAS
112
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