Presentacin de PowerPoint

BIOSINTESIS DE AMINOACIDOSCorynebacterium glutamicumMODIFICACIN DE LA PERMEABILIDAD

CorynebacteriumGram-positivas, forma de barra, distribuidas en la naturaleza, productos alimenticios y tambin en lamucosay piel del hombre y animales. catalasapositivas , carecen demovilidad, bacilos rectos o ligeramente curvados, forma de V o formas elipsoidales, aerobias o anaerobias facultativas, quimioorganotrofos. Pleoformismonecesitanbiotina, algunas cepas requieren tiamina y acido p-aminobenzoico. crecen en caldo simple,medio de loeffler,agarsangre ytelurio potasico(AST), formando colonias pequeas grisceas de aspecto granuloso, traslcidas con centros opacos, convexas con bordes continuos.

son utilizadas en procesos industriales, como en la produccin de aa,Una de las especies ms estudiadas es Corynebacterium glutamicum, el trminoglutamicumse debe a su capacidad de producir acido glutmico.

Kinoshita aisl un microorganismo productor de glutamato que requiere biotina, llamado Corynebacterium glutamicum.la permeabilidad puede ser modificada por el nivel de biotina en el medio. nivel de biotina: Bajo el organismo excreta glutamato Optimo el organismo produce lactatola permeabilidad de C. glutamicum puede ser controlada por la composicin del medio de cultivo. aislamiento de C. glutamicum importancia de la permeabilidad en la produccin de glutamato.

MODIFICACIN DE LA PERMEABILIDAD

El aislado de Kinoshita era deficiente en biotina y en alfa-cetoglutarato deshidrogenasa (alfa cetoglutaratosuccinato, ciclo del cido tricarboxlico).

C. glutamicum en un medio con alta concentracin de biotina sintetiza glutamato (25-36% g/mg de peso seco de las clulas).La produccin adicional se impidi por alguna forma de control de realimentacin por el glutamato de su propia sntesis.Bajo condiciones limitantes de biotina, el glutamato se libera de las clulas y se acumula a un nivel de hasta 50 g/dm-3. El factor crucial en el control de la permeabilidad parece ser la sntesis de membranas deficientes en fosfolpidos.

biotina en la fermentacin de glutamato requiere la limitacin de los niveles de biotina en el medio. medios de limitacin de biotina. La inclusin de la penicilina o derivados de cidos grasos de sorbitn de polioxietileno tales como mono-oleato durante el crecimiento logartmico en un medio rico en biotina caus una alteracin en la envoltura celular que resulta en la liberacin de glutamato. modificacin gentica de la permeabilidad para superar los mecanismos de control normales del organismo productor. Auxtrofo: se dice que un microorganismo es auxtrofo cuando slo es capaz de proliferar en un medio de cultivo si a ste se ha aadido alguna sustancia especfica, que el tipo silvestre, llamado prototrofo, no requiere, porque es capaz de sintetizarlaPrototrofo: Cepa capaz de crecer en medio mnimo. Organismo que no requiere otros elementos nutritivos distintos a los del tipo silvestre del cual derivan. Se presenta especialmente en cepas de bacterias, algas y hongos.

AISLAMIENTO DE MUTANTES QUE NO PRODUCEN INHIBIDORES O REPRESORES DE CAPTACION

Los mutantes que no producen ciertos inhibidores de retroalimentacin o represores pueden ser tiles para la produccin de intermediarios de las vas no ramificadas y productos finales de las vas ramificadas. Los mutantes que se ilustran no producen algunos de los inhibidores o represores de las vas consideradas y, por lo tanto, el control de la va est levantado, pero, debido a los factores de control estos tambin son esenciales para el crecimiento, deben ser incorporados en el medio en concentraciones que permitan el crecimiento, pero que no provoque las reacciones de control normales.Todos los ejemplos hipotticos discutidos son mutantes auxtrofos, pueden acumular concentraciones relativamente altas de productos intermedios o productos finales, siempre que la mutacin para la auxotrofa se produzca en el sitio correcto.va no ramificada controlada por la inhibicin de retroalimentacin o la represin de la primera enzima de la va por el producto final, E. Sin embargo, el organismo es auxtrofo para debido a la incapacidad para convertir C a D, de forma que el control de la va se levanta y C ser acumulado siempre que est incluido en el medio a un nivel suficiente para mantener el crecimiento, pero insuficiente para causar la inhibicin o represin.

va ramificada controlada por la inhibicin concertada de la primera enzima, por los efectos combinados de y G. El mutante ilustrado es auxotrfico para debido a una incapacidad para convertir C a D, lo que resulta en la eliminacin del control concertado de la primera enzima. Siempre que est incluido en el medio a un nivel suficiente para permitir el crecimiento, pero insuficiente para causar la inhibicin entonces C se acumular debido al control del producto final G en la conversin de C a F.

doble auxtrofo, requiere la alimentacin de ambos y G.

doble mutante con la supresin de la produccin de G, lo que resulta en la acumulacin de F.

acumulacin de un producto final de una va ramificada que se controla por la inhibicin de realimentacin de la primera enzima en la va por los efectos concertados de y I. el mutante ilustrado es auxotrfico de I y G debido a la incapacidad para convertir C a F y, por lo tanto, siempre G e I se suministran en cantidades que satisfagan los requisitos de crecimiento sin causar la inhibicin, el producto final E, ser acumulado.

el aislamiento de mutantes auxotrficos puede resultar en el aislamiento de cepas de alta produccinmutacin para la auxotrofa en el sitio correcto los productos e intermedios que paran la reaccin son esenciales para el crecimiento, as que deben ser incorporados en el medio en concentraciones que permitan el crecimiento, pero que no provoque las reacciones de control normales.

procedimiento para seleccionar auxotrofos relevantes de los sobrevivientes de una mutacin y posteriormente detectar los auxotrofos seleccionados para la productividad. Los mtodos ms comnmente utilizados para la recuperacin de mutantes auxotrficos son el uso de alguna forma de cultivo de enriquecimiento o el uso de una tcnica para identificar visualmente los mutantes.Los procesos de enriquecimiento se basan en el establecimiento de condiciones que afectan a las clulas prototrficas pero no daan a los auxotrofos.exposicin de la poblacin, en medio mnimo, a un agente antimicrobiano que slo afecta a las clulas en divisin debera dar lugar a la muerte de los prototrofos en crecimiento pero los auxotrofos no crecen as que sobreviven.

recuperacin de auxtrofos

Davie penicilina como el agente inhibidor. Los sobrevivientes de un tratamiento de mutacin se cultivaron primero en medio completo, se recogieron por centrifugacin, se lavaron y se resuspendieron en medio mnimo ms penicilina. Slo las clulas prototrficas de crecimiento fueron susceptibles a la penicilina y las auxtrofas de no crecimiento sobrevivieron. Las clulas se recogieron por centrifugacin, se lav (para eliminar la penicilina y productos liberados de las clulas lisadas) y se resuspendieron en medio completo para permitir el crecimiento de los auxtrofos, lo que podra ser purificado despus en medio slido. mtodo de seleccin de la penicilinauso del mtodo de seleccin de la penicilina para el aislamiento de mutantes auxotrficos de C. glutamicum

separacin mecnica de esporas auxotrficas y prototrficaslas esporas no germinadas de algunos organismos son ms resistentes a ciertos compuestos. mediante el cultivo de esporas mutadas en un medio mnimo slo los prototrofos germinarn y el tratamiento posterior de la suspensin de esporas con un compuesto adecuado mataran las esporas germinadas prototrficas pero dejara ilesas las esporas germinadas auxotrficas, las cuales pueden entonces aisladas por lavado, para eliminar el inhibidor, y se cultivaran en medio suplementado. mtodo de enriquecimiento de filtracin (organismos filamentosos): un medio mnimo lquido se inocula con esporas mutadas y se agita durante unas horas, tiempo durante el cual los prototrofos germinarn pero el auxotrofos no. La suspensin puede entonces ser filtrada a travs de un medio adecuado que retiene las esporas auxotrofas germinadas.

identificacin visual de auxtrofos

exposicin alternante de las colonias a medios suplementados y mnimos.medio suplementadoauxotrficorplica en placa: Los organismos mutantes desarrollan colonias en placas de Petri en un medio suplementado y luego se transfiere una porcin de cada colonia a medio mnimo. tcnica que consiste en presionar un disco cubierto de terciopelo sobre una placa con colonias celulares de forma que se adhieran al material algunas clulas de las colonias originales y, luego, volver a presionar con el disco de terciopelo en placas secundarias para volver a trasladar las clulas, pero esta vez del terciopelo a la nueva placa virgen.

"tcnica sandwichLos sobrevivientes de un tratamiento de mutacin se siembran en una capa de agar mnimo en una placa de Petri y se cubren con una capa de agar mnimo estril. La placa se incuba durante 1 2 das y las colonias desarrolladas estn marcadas sobre la base de la placa, despus de lo cual una capa de agar suplementado se vierte sobre la superficie. Las colonias, que aparecen despus de un perodo de incubacin ms son auxotrficas.