herramientas moleculares utilizadas actualmente para el ...instituto nacional de enfermedades...
TRANSCRIPT
Dra Cintia Fabbri
Divisioacuten Biotecnologiacutea y Bioinformaacutetica
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas ldquoDr JIMaizteguirdquo- ANLIS
Centro Colaborador OPSOMS en Fiebres Hemorraacutegicas Virales y Arbovirosis Pergamino-Argentina
Herramientas moleculares utilizadas
actualmente para el diagnoacutestico y
caracterizacioacuten molecular de
Arbovirus en Argentina
Simposio Impacto de las nuevas tecnologiacuteas moleculares en el estudio de
las Zoonosis Virales emergentes y reemergentes en Ameacuterica
8 de octubre de 2019
Reservorio
Viral
Vectores
Mosquitos
Garrapatas
Simuacutelidos
Jejenes
Aacutecaros
Mamiacuteferos
Aves
Reptiles
Anfibios
Virus
Flaviviridae Togaviridae
Bunyaviridae Reoviridae
Rhabdoviridae
Hueacutesped
Terminal
Dependiendo
del virus
Hombre
equinos etc
Virus
Arbovirus
Diversas familias virales pero 3 con mayor relevancia en salud puacuteblica Familia Flaviviridae (Flavivirus DENV YFV WNV SLEV ZIKVILHV ROCV) Familia Togaviridae (Alfavirus MAYV CHIKV WEEV EEEV VEEV Auraacute Una) Familia Bunyaviridae (OROV Cache Valley Kairi Las Mayolas Resistencia
Barranqueras )
Familia Flaviviridae
Geacutenero Flavivirus
M
Dengue Fiebre Amarilla
Encefalitis de San Luis
West Nile Zika
Familia Togaviridae
Geacutenero Alfavirus
Chikungunya Encefalitis Equina
del Este Encefalitis Equina del
Oeste Encefalitis Equina
Venezolana Mayaro Una Auraacute Alta reactividad cruzada de anticuerpos
Cineacutetica de la viremia y de los anticuerpos en
infecciones por virus Zika
Meacutetodos seroloacutegicos Meacutetodos directos
diacuteas 1 3 5 7 9 11 13 15 -5 -4 -3 -2 -1 0
IgG suero IgM suero
Viremia
Inicio siacutentomas
Eliminacioacuten de virus en Orina
Ufpml Anticuerpos La inclusioacuten de la muestra de orina permite ampliar
el periacuteodo de aplicacioacuten de los meacutetodos directos
(idealmente entre los 5-15 dpi)
I RT-PCR convencional o punto final
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
Membrana
A B
1ordm Ciclo
2ordmCiclo
C D
Cebadores
A y B
Cebadores
internos C y D
Producto de
300 pb
bullMeacutetodos de 2 ciclos de amplificacioacuten
(nRT-PCR) tiene mayor sensibilidad
24-48 hs
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
ARN viral
Producto
de 400
pb
Producto
de 300 pb
Diagnoacutestico molecular de las
infecciones por RT-PCR
convencional
II RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Menor probabilidad de contaminacioacuten
Mayor Sensibilidad y Especificidad
Sondas de hidroacutelisis tienen mayor
especificidad que teacutecnicas son SyBR
Green y son utilizadas para el dx
2-4 hs
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Reservorio
Viral
Vectores
Mosquitos
Garrapatas
Simuacutelidos
Jejenes
Aacutecaros
Mamiacuteferos
Aves
Reptiles
Anfibios
Virus
Flaviviridae Togaviridae
Bunyaviridae Reoviridae
Rhabdoviridae
Hueacutesped
Terminal
Dependiendo
del virus
Hombre
equinos etc
Virus
Arbovirus
Diversas familias virales pero 3 con mayor relevancia en salud puacuteblica Familia Flaviviridae (Flavivirus DENV YFV WNV SLEV ZIKVILHV ROCV) Familia Togaviridae (Alfavirus MAYV CHIKV WEEV EEEV VEEV Auraacute Una) Familia Bunyaviridae (OROV Cache Valley Kairi Las Mayolas Resistencia
Barranqueras )
Familia Flaviviridae
Geacutenero Flavivirus
M
Dengue Fiebre Amarilla
Encefalitis de San Luis
West Nile Zika
Familia Togaviridae
Geacutenero Alfavirus
Chikungunya Encefalitis Equina
del Este Encefalitis Equina del
Oeste Encefalitis Equina
Venezolana Mayaro Una Auraacute Alta reactividad cruzada de anticuerpos
Cineacutetica de la viremia y de los anticuerpos en
infecciones por virus Zika
Meacutetodos seroloacutegicos Meacutetodos directos
diacuteas 1 3 5 7 9 11 13 15 -5 -4 -3 -2 -1 0
IgG suero IgM suero
Viremia
Inicio siacutentomas
Eliminacioacuten de virus en Orina
Ufpml Anticuerpos La inclusioacuten de la muestra de orina permite ampliar
el periacuteodo de aplicacioacuten de los meacutetodos directos
(idealmente entre los 5-15 dpi)
I RT-PCR convencional o punto final
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
Membrana
A B
1ordm Ciclo
2ordmCiclo
C D
Cebadores
A y B
Cebadores
internos C y D
Producto de
300 pb
bullMeacutetodos de 2 ciclos de amplificacioacuten
(nRT-PCR) tiene mayor sensibilidad
24-48 hs
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
ARN viral
Producto
de 400
pb
Producto
de 300 pb
Diagnoacutestico molecular de las
infecciones por RT-PCR
convencional
II RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Menor probabilidad de contaminacioacuten
Mayor Sensibilidad y Especificidad
Sondas de hidroacutelisis tienen mayor
especificidad que teacutecnicas son SyBR
Green y son utilizadas para el dx
2-4 hs
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Familia Flaviviridae
Geacutenero Flavivirus
M
Dengue Fiebre Amarilla
Encefalitis de San Luis
West Nile Zika
Familia Togaviridae
Geacutenero Alfavirus
Chikungunya Encefalitis Equina
del Este Encefalitis Equina del
Oeste Encefalitis Equina
Venezolana Mayaro Una Auraacute Alta reactividad cruzada de anticuerpos
Cineacutetica de la viremia y de los anticuerpos en
infecciones por virus Zika
Meacutetodos seroloacutegicos Meacutetodos directos
diacuteas 1 3 5 7 9 11 13 15 -5 -4 -3 -2 -1 0
IgG suero IgM suero
Viremia
Inicio siacutentomas
Eliminacioacuten de virus en Orina
Ufpml Anticuerpos La inclusioacuten de la muestra de orina permite ampliar
el periacuteodo de aplicacioacuten de los meacutetodos directos
(idealmente entre los 5-15 dpi)
I RT-PCR convencional o punto final
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
Membrana
A B
1ordm Ciclo
2ordmCiclo
C D
Cebadores
A y B
Cebadores
internos C y D
Producto de
300 pb
bullMeacutetodos de 2 ciclos de amplificacioacuten
(nRT-PCR) tiene mayor sensibilidad
24-48 hs
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
ARN viral
Producto
de 400
pb
Producto
de 300 pb
Diagnoacutestico molecular de las
infecciones por RT-PCR
convencional
II RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Menor probabilidad de contaminacioacuten
Mayor Sensibilidad y Especificidad
Sondas de hidroacutelisis tienen mayor
especificidad que teacutecnicas son SyBR
Green y son utilizadas para el dx
2-4 hs
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Cineacutetica de la viremia y de los anticuerpos en
infecciones por virus Zika
Meacutetodos seroloacutegicos Meacutetodos directos
diacuteas 1 3 5 7 9 11 13 15 -5 -4 -3 -2 -1 0
IgG suero IgM suero
Viremia
Inicio siacutentomas
Eliminacioacuten de virus en Orina
Ufpml Anticuerpos La inclusioacuten de la muestra de orina permite ampliar
el periacuteodo de aplicacioacuten de los meacutetodos directos
(idealmente entre los 5-15 dpi)
I RT-PCR convencional o punto final
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
Membrana
A B
1ordm Ciclo
2ordmCiclo
C D
Cebadores
A y B
Cebadores
internos C y D
Producto de
300 pb
bullMeacutetodos de 2 ciclos de amplificacioacuten
(nRT-PCR) tiene mayor sensibilidad
24-48 hs
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
ARN viral
Producto
de 400
pb
Producto
de 300 pb
Diagnoacutestico molecular de las
infecciones por RT-PCR
convencional
II RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Menor probabilidad de contaminacioacuten
Mayor Sensibilidad y Especificidad
Sondas de hidroacutelisis tienen mayor
especificidad que teacutecnicas son SyBR
Green y son utilizadas para el dx
2-4 hs
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
I RT-PCR convencional o punto final
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
Membrana
A B
1ordm Ciclo
2ordmCiclo
C D
Cebadores
A y B
Cebadores
internos C y D
Producto de
300 pb
bullMeacutetodos de 2 ciclos de amplificacioacuten
(nRT-PCR) tiene mayor sensibilidad
24-48 hs
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
NS1M EC NS5NS2 NS3 NS4
5rsquo 3rsquo
ARN viral
Producto
de 400
pb
Producto
de 300 pb
Diagnoacutestico molecular de las
infecciones por RT-PCR
convencional
II RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Menor probabilidad de contaminacioacuten
Mayor Sensibilidad y Especificidad
Sondas de hidroacutelisis tienen mayor
especificidad que teacutecnicas son SyBR
Green y son utilizadas para el dx
2-4 hs
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Diagnoacutestico molecular de las
infecciones por RT-PCR
convencional
II RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Menor probabilidad de contaminacioacuten
Mayor Sensibilidad y Especificidad
Sondas de hidroacutelisis tienen mayor
especificidad que teacutecnicas son SyBR
Green y son utilizadas para el dx
2-4 hs
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
II RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
Menor probabilidad de contaminacioacuten
Mayor Sensibilidad y Especificidad
Sondas de hidroacutelisis tienen mayor
especificidad que teacutecnicas son SyBR
Green y son utilizadas para el dx
2-4 hs
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
Diferentes protocolos de RT-PCR
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Diagnoacutestico molecular de las infecciones por
Arbovirus por qRT-PCR
bullMetodologiacutea desarrollada por CDC y aprobada por FDA
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno
de los serotipos
bullMetodologiacutea multiplex igual sensibilidad que singleplex
qRT-PCR para virus West Nile
bullLaniotti et al Journal of
Clinical Microbiology Nov
2000 p 4066ndash4071 Vol 38
Nordm 1
Estudio por qRT-PCR en
muestra de distintas partes
del cerebro (cerebelo
hemisferio y puente) del
equino con sintomatologiacutea
qRT-PCR YFV
bull Amplificacioacuten del
genoma en la regioacuten
del gen C bull Diferenciacioacuten de cepas
silvestre de vacunal
bullHull el al Diagn Microbiol Infect Dis Nov 2008 p272-279 Vol
63 Nordm 3
bull Confirmacioacuten de un caso
fatal en 2013 en biopsia
de cerebro y en muestra
de suero en contacto de
caso confirmado de SLE
en brote de Pergamino
2015
qRT-PCR para virus de la Encefalitis de San Luis
qRT-PCR CHIKV
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
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87
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23
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6
3
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48
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5396
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56
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97
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99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Especiacuteficos disentildeados en
regiones que permiten diferenciar
entre los distintos virus (Ejemplo
gen de la Envoltura para virus
Zika)
Geneacutericos disentildeados en
regiones maacutes conservadas dentro
del geacutenero viral (Ejemplo gen NS5
para Flavivirus)
Singleplex o multiplex
disentildeados para la utilizacioacuten de
un uacutenico par de oligonucleacuteotidos o
muacuteltiples pares
Amplificacioacuten y deteccioacuten del genoma viral
mediante teacutecnicas de RT-PCR
ARN R
T 5
rsquo
3
rsquo
RT
Diferentes disentildeos de RT-PCR
R Q Forward
Reverse
5rsquo 3rsquo
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
qRT-PCR para virus Dengue
bullAmplificacioacuten en distintas regiones del genoma para cada uno de los serotipos
bullLa secuencia de sondas y oligonucleoacutetidos fueron disentildeados en base a
cepas de DENV de circulacioacuten reciente (1998-2012)
Regresioacuten lineal para evaluacioacuten de sensibilidad
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Semillas virales Titulacioacuten Viral bajo
capa de agarosa Extraccioacuten de RNA
qRT-PCR Virus Tiacutetulo UFPml
DEN-1 11 106
DEN-2 345 106
DEN-3 613 105
DEN-4 93 105
CHIK 3 106
ZIK 58 106
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de las
metodologiacuteas usadas
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
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VEV2245 05
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COV3379 01
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COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
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6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
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64
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5396
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99
76
99
44
68
25
46
98
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94
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95
91
33
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73
97
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99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Virus Sensibilidad
(UFPml) protocolo
in house actualmente
en uso en la Red
Sensibilidad
(UFPml)
TRIOPLEX
CDC
Sensibilidad
(UFPml) Kit
Primer Design
Sensibilidad (UFPml)
Kit Roche
DEN-1 001 01 11 001
DEN-2 003 03 35 No hecho
DEN-3 001 01 61 No hecho
DEN-4 001 01 093 No hecho
CHIK 3 03 3 3
ZIK 006 006 58 06
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de 3 reactivos para
dx de Dengue Chikungunya y Zika (multiplex kit) vs
protocolos in house
La Sensibilidad para CHIKV es similar a la obtenida con protocolo ldquoin
houserdquo para los meacutetodos evaluados
La sensibilidad para DENV y ZIKV es inferior respecto de la del protocolo ldquoin
houserdquo para los reactivos comerciales evaluados
La disminucioacuten en las Se podriacutea seriacutea maacutes riesgoso de obtener falsos
negativos para ZIKV ya que eacuteste agente presenta baja viremia en los
pacientes
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
bullDesarrollada por el Dr Lanciotti (2007)
bullDisentildeo de sonda y primer en base a la cepa prototipo S27 detecta
todos los genotipos West Aacutefrica ECSA y Asia
bullLuego de la introduccioacuten de CHIKV al continente americano se han
disentildeado nuevos sets de sondas y primer (Fort Collins- CDC) para la
deteccioacuten del genotipo asiaacutetico (cepa americana)
bullReacciones singleplex
qRT-PCR para virus Chikungunya
Sets de primer y sondas
bull Set 1 (ECSA)
6856F
6981c
6919-FAM
bull Set 2 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
3855F
3957c12
3996-FAM12
bull Set 3 (Asiaacutetico-Ameacuterica)
856F
962c
908-FAM
Liacutemite de deteccioacuten
(cepa americana)
bull Set 1 (genotipo
ECSA) 56 ufpml
bull Set 2 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
bull Set 3 (genotipo
asiaacutetico-americano)
56 ufpml
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
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COV3379 01
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COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
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61
48
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72
96
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18
32
99
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99
82
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64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Para comparar los liacutemites de deteccioacuten se procesaron diluciones
seriadas (factor 10) de dos cepas de referencia (silvestre y vacunal)
realizando extracciones del RNA y al mismo tiempo cuantificacioacuten viral
(UFPml VERO C76)
Se compararon 3 protocolos uno de ellos desarrollado para amplificar
selectivamente cepa silvestre o vacunal (Fischer C y cols Emerg Infect
Dis 2017 Nov 2311)
Cepa Vacunal 17D
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 22 103 154 136 163
-2 22 102 195 172 203
-3 22 101 225 204 245
-4 22 259 236 284
-5 22 10-1 30 285 316
-6 22 10-2 343 319 350
-7 22 10-4 368 362 378
-8 22 10-5 375 NEG NEG
Cepa silvestre 2008
Dilucioacuten UFP ( 5 ul) Protocolo Domingo Protocolo Fisher Protocolo Johnson
Ct Ct Ct
-1 175 10 3 143 167 121
-2 175 10 2 178 208 158
-3 175 10 1 200 221 200
-4 175 252 273 240
-5 175 10 -1
285 307 284
-6 175 10 -2 332 350 313
-7 175 10 -3 350 NEG 342
-8 175 10 -4 NEG NEG NEG
Evaluacioacuten de la sensibilidad analiacutetica de
3 protocolos in house para dx de YFV
Fortalecimiento de la vigilancia
laboratorial del virus de la fiebre
amarilla y deteccioacuten de casos humanos
importados en Argentina 2018
Morales et al
Congreso Argentino de Zoonosis 2018
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
iquestQue estrategia es mejor
Dependeraacute de la situacioacuten
epidemioloacutegica
De los resultados que se
obtengan
De la disponibilidad de
metodologiacuteas en el laboratorio
RT-PCR
convencional
qRT-PCR
Aunque tienen muchas ventajas las teacutecnicas en
tiempo real las metodologiacuteas de RT-PCR
convencional son auacuten sumamente uacutetiles
(caracterizacioacuten geneacutetica) y tienen menor costo
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
RNA
DNA
Muestra SOBRENADANTES DE CULTIVOS
CELULARESMUESTRAS ORIGINALES
Secuenciacioacuten del DNA (Sanger)
1Las secuencias fueron alineadas con otras disponibles en Genbank 2El alineamiento fue realizado empleando el meacutetodo de Clustal-W implementado en el programa BioEdit 3Se realizoacute anaacutelisis filogeneacutetico por el meacutetodo de Neighbour Joining y Anaacutelisis Bayesiano para la caracterizacioacuten del genotipoidentificacioacuten del agente
Anaacutelisis filogeneacuteticosGenotipificacioacutenIdentificacioacuten del agente
Extraccioacuten del RNA
RT-PCR convencional
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
70
77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Caracterizacioacuten
Molecular
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
den1Ar00
den3H87
cfa
78
45
50
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77
45
100
71
67
100
100
100
96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
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COV3391 08
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NIV2330 08
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MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
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50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
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5396
43
99
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99
44
68
25
46
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94
86
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91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Ceacutelulas VERO ndash C636
Muestras de Hiacutegado rintildeoacuten cerebro y
suero (-70ordmC)
Extraccioacuten de RNA
nRT-PCR
Bandas especiacuteficas para YFV
ECP
nRT-PCR virus Dengue y Fiebre Amarilla
YF17D
YFASIBI
AVD2791
YFfVS
YF17DBrz
YFFNS
YFTrini
YFIC99
71192
71191
71042
PA3644
PA3650
PA3675
PA5175
YFUg48a
BSQBeAn4073
ILHorig
WNArg06
SLEMSI-7
den4814669
den2Jam
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cfa
78
45
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100
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96
57
80
57
000005010015020
Humanos y Alouatta caraya Argentina 2007-2008
Identificacioacuten de aislamientos
virales sueros oacuterganos de
animales y humanos de casos
YF silvestre (emergencia en
Argentina2008-2009)
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
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BsAs2009
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BRGO203 2013
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BR1435RJ 09
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BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
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Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Utilidad de la caracterizacioacuten molecular para diferenciacioacuten
de cepas silvestres y vacunale de Fiebre amarilla
Cepas de Fiebre
amarilla silvestres
Genotipo I
Cepas de Fiebre
amarilla vacunales ArgVis
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
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BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
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74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
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75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
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COV3379 01
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NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
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54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
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PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
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5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
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Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Anaacutelisis de fragmento
de 600 pb unioacuten de los
genes prM-E
Ameacuterica
del sur
genotipo I
Ameacuterica
del sur
genotipo II
Brasil 2017
Aislamiento y genotipificacioacuten del virus de
la Fiebre amarilla en casos importados
detectados en Argentina 2018
Fabbri et al
Congreso Argemtino de Zoonosisi 2018
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
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COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
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5396
43
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99
44
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25
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86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Oligonucleoacutetidos
degenerados en la regioacuten
nsp4 (195pb)
nsP
1
nsP
2
nsP
3
nsP
4
C E2 E1
AAAAAAAAAAA
No estructural estructural
Deteccioacuten de EEE WEE VEE CHIK
Ross River Sinbis Semiliki Forest
Para identificar el Alphavirus se
requiere la secuenciacioacuten genoacutemica
CHIKV Secuenciacioacuten genoacutemica parcial gen
nsP4 amplificado con el protocolo geneacuterico
Identificacioacuten del
Genotipo Asiaacutetico-
americano en viajeros
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
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COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
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MX 08
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9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
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54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
56583 SMazza 2003
BR90
PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
5980Parana 2-2016
5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
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Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
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87
99
49
57
99
23
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96
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23
16
18
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98
98
90
90
49
99
64
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43
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33
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73
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Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Las muestras
analizadas agrupan
en el mismo cluster
con cepas
correspondientes al
genotipo Asiaacutetico
de ZIKV que se
encuentra
actualmente
circulando en el
continente
Americano
Se observoacute 998-
100 de identidad
nucleotiacutedica entre
las cepas de
circulacioacuten
autoacutectona en el
fragamento
analizado
Caracterizacioacuten geneacutetica de cepas de
virus Zika circulantes en argentina 2016
Genotipo
Este de
Aacutefrica
Genotipo
Oeste de
Aacutefrica
Genotipo
Asiaacutetico-
Americano
Figura Aacuterbol filogeneacutetico obtenido por anaacutelisis bayesiano con las cepas incluidas en el estudio En rojo se indican las cepas autoacutectonas de Tucumaacuten y en azul la cepa importada de Venezuela
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
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BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
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BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
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BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
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BR2401 08
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COV3391 08
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MX 08
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BR3768RJ 86
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54958 Tartagal2002
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PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
6851CABA 4-2016
6627Concordia 3-2016
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BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
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6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
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5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
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87
99
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23
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5396
43
99
76
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44
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98
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94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
6305Eldorado 12-2015
9670CABA2018
9634Formosa01-2018
8012Rosario 3-2017
6180San Isidro 3-2016
6364Lanus 1-2016
BR0122RJ11
BsAs2009
71226 HIrigoyen2008
71498 Oran2008
74718 suero Catamarca2009
72215 SMazza2009
79061 Misiones2010
80113 CteAndres2010
BsAs2009o
3361 la Rioja 3-2011
3412 RSPe a 4-2011
75045 Hersilia2009
BR15RJ 10
VENV1136 07
VEN1136 07
VEV3541 97
BR2401 08
VEV2245 05
COV3391 08
COV3379 01
VEV2469 08
COV3383 06
COV3390 07
NIV2330 08
NIC05
MX 08
MXV3746 08
9436Misiones01-2018
BR3768RJ 86
BR111 97
BR409 97
BRMR01
54615 SMazza2002
54958 Tartagal2002
56595 SMazza 2003
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PAR280 00
BsAs2010
6642Jesus maria Cba2-2016
6897Chajari 4-2016
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6627Concordia 3-2016
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5845Corrientes 1-2016
BRGO203 2013
3352 Salta 3-2011
BR1435RJ 09
BRV2395 06
6020Ramallo 2-2016
BRSJRP 2014
6480San Fernando 2-2016
5935San Fernando 1-2016
5839CAlberdiFomosa 2-2016
5651Berazategui 1-2016
5814Tucuman 3-2016
6471Lanus 3-2016
6522Salta 3-2016
6843Embarcacion 2-2016
5940Fomorsa 1-2016
5939Corrientes 1-2016
6607Parana 3-2016
Moch43
Haw44
china80
NAURU74
MAL72
Thai63
Thai6499
87
99
49
57
99
23
23
6
3
61
48
73
72
96
50
54
23
16
18
32
99
76
99
82
98
98
90
90
49
99
64
99
72
5396
43
99
76
99
44
68
25
46
98
82
94
86
95
91
33
56
73
97
66
64
99
55
Genotipo V
Genotipo I
Genotipo III Genotipo II
2008-2011 2016-2018
2000-2003
2010 -2011 2016-2017
Genotipo VI
bull Se ha detectado el
genotipo V de DENV-1
en todas las cepas
estudiadas
bull La dinaacutemica de DENV-
1 en Argentina se ha
caracterizado por
introducciones
expansioacuten geograacutefica y
desplazamientos de
distintos linajes
reflejando
fundamentalmente lo
que sucede en el resto
de los paiacuteses de
Latinoameacuterica
Genotipificacioacuten de DENV-1 (fragmento de 1500 pb gen ENV)
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Genotipo II
Genotipo III
Genotipo I
Genotipificacioacuten de DENV-4
(fragmento de 1500 pb gen ENV)
Se ha detectado el genotipo II de
DENV-4 en todas las cepas
estudiadas desde su introduccioacuten
en Argentina en 2010
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
Transbound Emerg Dis 2018 Oct 14 West Nile virus associated with equid encephalitis in Brazil 2018
Silva ASG1 Matos ACD1 da Cunha MACR2 Rehfeld IS1 Galinari GCF1 Marcelino SAC1 Saraiva
LHG1 Martins NRDS1 Maranhatildeo RPA1 Lobato ZIP1 Pierezan F1 Guedes MIMC1 Costa EA1
WNV detectado en Brasil en 2018
bull Utilizaron el protocolo de RT-PCR geneacuterico (Fulop et al 1993 y
Bronzoni et al 2005 (NS5))
bull Identificaron 4 animales positivos
bull Abril 2018 Estado de Epiritu Santo Brasil
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
sect El diagnoacutestico molecular es una herramienta uacutetil para
el diagnoacutestico de Arbovirus aplicando las metodologiacuteas
en el periacuteodo agudo de la enfermedad
sect Pueden existir variantes virales que no son detectadas
por los meacutetodos ya establecidos por lo tanto el disentildeo
de oligonucleoacutetidos y sondas es criacutetico asiacute como
tambieacuten la evaluacioacuten de la Se y Sp de las
metodologiacuteas empleadas
sect Las teacutecnicas de RT-PCR en tiempo real tienen muchas
ventajas en comparacioacuten con las metodologiacuteas de RT-
PCR convencional pero estas uacuteltimas son auacuten
sumamente uacutetiles ya que permiten la caracterizacioacuten
geneacutetica
sect Los protocolos geneacutericos son uacutetiles para vigilar
agentes emergentes
Conclusiones
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN
hellipMUCHAS
GRACIAS POR
SU ATENCIOacuteN