guia laboratorio reacciones quimicas naturales-20141 (1)

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA CONTENIDO DIDÁCTICO DEL CUSO: 401585 – REACCIONES QUÍMICAS NATURALES

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS, TECNOLOGÍA E INGENIERÍA PROGRAMA DE QUÍMICA

GUÍA COMPONENTE PRÁCTICO

401585 – REACCIONES QUÍMICAS NATURALES

Curso Metológico de tres (3) créditos (con componente práctico presencial)

PATRICIA JOYCE PAMELA ZORRO MATEUS

(Directora Nacional)

LIC. DOLFFY RODRÍGUEZ

Acreditador

BOGOTÁ

JULIO 2013

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1. ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO Esta guía de laboratorio fue escrita por la Química Msc. Bioquímica Patricia Joyce Pamela Zorro Mateus en el segundo semestre de 2012 y fue actualizada para el segundo semestre de 2013. Quién actualmente se desempeña como tutora de la UNAD en en CEAD JAG. Este documento contiene prácticas de laboratorio de bioquímica con técnicas básicas de biología molécular y es suceptible a cambios que dependerán de las necesidades de los estudiantes. Este documento hace parte del curso de bioquímica “Reacciones Químicas Naturales” que es ofertado para la carrera de Química de la UNAD como un complemento al curso de bioquímica básica. Como ya se mencionó, la primera parte de este documento contiene técnicas básicas en biología molecular que deben ser conocidas por cualquier investigador que se dedique al campo de la bioquímica. Tanto la estructura como el contenido de está guía práctica han sido diseñados según las directrices impartidas por la VIMMEP y la ECBTI. El diseño de esta guía práctica fue acreditado por parte de la Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingenierías (ECBTI) por la Lic. en Química Dolffy Rodríguez, docente de la UNAD, adscrita a la ECTBI - CEAD Arbeláez, quien hizo aportes al presente documento en el proceso de acreditación. Este documento se puede copiar, distribuir y comunicar públicamente bajo las condiciones siguientes:

• Reconocimiento. Debe reconocer los créditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra).

• No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. • Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir

de esta obra. • Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los términos de la licencia de

esta obra. • Alguna de estas condiciones pueden no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los

derechos de autor • Nada en esta menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

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2. INDICE DE CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN

PRÁCTICA No. 1. EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES 8

PRÁCTICA No. 2. EFECTO HIPERCRÓMICO DEL ADN 15

PRÁCTICA No.3. FUENTE DE ROS EN ALIMENTOS: DETERMINACIÓN DE PERÓXIDO

EN ACEITES VEGETALES

21

PRÁCTICA No. 4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE ALGUNOS ALIMENTOS 27

PRÁCTICA No. 5. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES EN MUESTRAS

NATURALES POR LA REACCIÓN DE TRAUTZ-SCHORIGIN

33

PRÁCTICA No. 6. ACTIVIDAD CATALÍTICA: IMPORTANCIA DE LOS COFACTORES

40

FUENTES DOCUMENTALES 46

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3. CARACTERÍSTICAS GENERALES

Introducción Este documento hace parte del curso de Reacciones Químicas Naturales, el cual ha sido diseñado como un complemento al curso de Bioquímica ofertado para los estudiantes de la carrera de Química. Por lo tanto este contiene prácticas que buscan ampliar el conocimiento de técnicas que pueden convertirse en conocimiento básico para aquellos estudiantes que escojan trabajar en el área de la bioquímica. Este curso empieza con técnicas básicas en biología molecular para el estudio de ácidos nucléicos, luego presenta prácticas que tienen como temática los radicales libres y sustancias antioxidantes en los alimentos y finaliza con una práctica sobre las coenzimas o cofactores enzimáticos. Esta guía ha sido diseñada como componente práctico, el cual será guiado por un tutor y por ser práctica es de carácter presencial. Este proceso será desarrollado según la programación del CEAD o CCAV al que se encuentre adcrito el estudiante. En los laboratorios los estudiantes desarrollarán las prácticas, las cuales deberán ser estudiadas y preparadas con anterioridad, para asegurar el aprovechamiento de este documento, el cual si bien contará con la guianza de un tutor, deberá ser de interés directo del estudiante por lo que el proceso de aprendizaje recaerá principalmente en él. Con los resultados obtenidos durante el laboratorio, los estudiantes desarrollaran un informe en el que se prestará especial atención al análisis de resultados que derá ser soportado con los conocimientos teóricos y contar con la literatura debidamente referenciada.

Justificación Esta guía de laboratorio se desarrolló como complemento práctico del curso de Reacciones Química Naturales y tiene como fin mostrar al estudiante reacciones químicas que suceden en los organismos como el metabolismo de los ácidos nucléicos, de las proteínas, los pros y contras de las reacciones de radicales libres y algunas moléculas que son importantes para la transmisión de señales y respuestas a estímulos en los organismos vivos. Por lo tanto esta guía de laboratorio busca, como primera medida, introducir al estudiante en técnicas básicas de extracción y separación de ácidos nucléicos que son indispensables para quienes quieren profundizar en bioquímica o biotecnología. Este curso también busca que los estudiantes pongan en práctica los conocimientos aprendidos en teoría por medio de prácticas sencillas que estimulan el pensamiento crítico para relacionar y analizar los resultados obtenidos.

Intencionalidades formativas

Propósito: Que los estudiantes evidencien algunos temas vistos en teoría en prácticas de laboratorio reales que les permitan abstraer el conocimiento a un plano más tangible. Objetivo: Aplicar los conocimientos aprendidos sobre reacciones químicas que son básicas para el funcionamiento de seres vivos e introducir al estudiante en algunas técnicas básicas en los laboratios de bioquímica.

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Meta: El estudiante explicará reacciones químicas que suceden en los organismos a nivel molecular y lo relacionará con los resultados obtenidos a nivel práctico y desarrollará hábilidades para el trabajo en laboratorios de bioquímica. Competencia: El estudiante conoce, intepreta, argumenta, analiza y concluye de forma lógica sobre reacciones químicas naturales que incluyen el metabolismo de los ácidos nucléicos, proteínas, radicales libres y sobre principios de transducción de señales.

Denominación de la Práctica

PRÁCTICA No. 1. EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES

PRÁCTICA No. 2. EFECTO HIPERCRÓMICO DEL ADN

PRÁCTICA No.3. FUENTES DE ROS EN ALIMENTOS: DETERMINACIÓN DE

PERÓXIDOS EN ACEITES VEGETALES

PRÁCTICA No. 4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE ALGUNOS ALIMENTOS PRÁCTICA No. 5. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES EN

MUESTRAS NATURALES POR LA REACCIÓN DE TRAUTZ-SCHORIGIN PRÁCTICA No. 6. ACTIVIDAD CATALÍTICA: IMPORTANCIA DE LOS

COFACTORES

Número de horas 18

Porcentaje 30% (150 puntos/500 puntos) Cada práctica tendrá un valor de 50 puntos, los cuales serán evaluados así:

15 puntos correspondientes a los trabajos colaborativos que se describen en las actividades 6, 10 y 14 en el curso en campus virtual; para un total de 45 puntos. Estos trabajos serán un informe que los estudiantes deben presentar en un formato de reporte rápido de la revista científica Biochemistry. Para la presentación de éstos el estudiante deberá haber presentado la práctica de laboratorio ya que gran parte será sobre los resultados obtenidos en la práctica.

35 puntos correspondientes al desempeño en cada sesión de laboratorio, sumando un total de 105 puntos en 3 sesiones de laboratorio. Debido a que el curso en total tiene 6 prácticas, cada una de ellas tendrá un valor de 17,5 puntos los cuales serán evaluados por el tutor de laboratorio según la rúbrica de evaluación presentada en esta guía.

Curso Evaluado por proyecto

SI _ NO X

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4. DESCRIPCIÓN DE PRÁCTICAS

A continuación se muestras las normas de Bioseguridad que se deben seguir por el personal del laboratorio en su comportamiento, manejo de reactivos y material de laboratorio: Comportamiento 1. Los estudiantes deben portar bata de laboratorio blanca, manga larga, que se pueda

cerar y cubra hasta cerca de las rodillas. 2. En el laboratorio, como en todo reciento cerrado, esta prohibido fumar. 3. Mientras trabaje en el laboratorio debe usar guantes de látex o nitrilo. 4. Si trabaja con luz UV debe portar gafas de protección. 5. En el laboratorio no se puede comer (incluyendo masticar chicle), ni beber. 6. El personal que trabaja en el laboratorio debe portar pantalón y zapatos cubiertos 7. Mantenga en orden su área de trabajo y trate de no llevar al laboratorio objetos

delicados. Trate de entrar al laboratorio sólo con aquello que vaya a usar. 8. El cabello siempre debe estar recogido. 9. Evite el ingreso de personal ajeno a la práctica al laboratorio y no juegue mientras

que se encuentra en él. 10. Asegurese que al finalizar las prácticas las llaves del gas, agua y aire queden

cerradas, las luces y los equipos electrónicos apagados. 11. En caso de emergencia, trate de mantener la calma y buscar al personal capacitado

para que la atienda, sin escandalizarse o alterar a quienes trabajan con usted. 12. El estudiante debe conocer la guía de laboratorio y específicamente los

procedimientos que va a trabajar, los equipos que va a emplear para éste y la peligrosidad d elos reactivos que va a usar.

Manejo de material de laboratorio 1. Asegure de que el material de laboratorio este limpio antes de iniciar la práctica. 2. Tenga en cuenta que hay varias prácticas en este laboratorio para las que se requiere

que el material se encuentre debidamente esterilizado y que se trabaje cerca a un mechero o en una cabina de tuboo laminar para evitar contaminación.

3. Limpie el área de trabajo antes de iniciar el laboratorio. Si va a trabajar con material estéril, asegurese de limpiar con etanol al 70% el lugar de trabajo previamente.

4. Verifique el buen estado de material de laboratorio cuando éste sea entregado al principio d ela práctica por el auxiliar de laboratorio, recuerde que después de que firme el formato de entrega, no se aceptan reclamos sobre el estado de material y usted será responsable de mantenerlo en buen estado durante la práctica.

5. En caso de que rompa algún material de vidrio, recójalos usando una escoba y un recogedor, si se encuentran en el piso, o un pedazo de carton y una bandeja, si están sobre el mesón y avisé al auxiliar de laboratorio para que los disponga en el lugar destinado para el vidrio.

6. Antes de devolver el material al auxiliar de laboratorio, asegurese de que éste está limpio y en buen estado.

7. Trate el material y los equipos del laboratorio con delicadeza, si no sabe como funciona algún equipo no lo manipule.

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8. El material de laboratorio que sea desechable y que se encuentre con residuos de

muestras biológicas debe disponerse en la caneca roja de riesgo biológicos, al igual que los guantes que use durante la práctica.

9. El material que se encuentre en contacto con cultivos de microorganismos debe ser lavado con hipoclorito o su contenido debe ser autoclavado y después desechado.

10. Todo el material que se encuentre en contacto con ADN debe ser lavado con extran 1% y autoclavado antes de su uso.

Manejo de reactivos de laboratorio 1. Llegue a la práctica de laboratorio conociendo la peligrosidad de los reactivos con los

que va a trabajar. 2. En el laboratorio esta prohibido pipetear reactivos con la boca. 3. Siempre que use un reactivo asegurese de dejarlo bien cerrado cuando finalice 4. No mezcle, huela desde la botella o prueba ningún reactivo químico aún sabiendo

que éste es no peligroso. 5. Cuando trabaje con enzimas, sobre todo con la Taq polimerasa, dNTPs y ADN,

recuerde que estos son sumamente lábiles, por lo que debe tratar de mantenerlos el mayor tiempo posible en hielo y cuando terminé de usarlos de be devolverlos rápidamente a -20ºC.

6. Cuando trabajé con intercaladores de ADN, recuerde que estos son extremadamente cancerígenos.

7. Asegurese de mantenerse limpio de cualquier reactivo, en caso de derrame no trate de limpiar, llame al personal capacitado para que limpuen e inactiven la sustancia de forma correcta.

8. Concentrese cuando trabaje con reactivos químicos y este siempre alerta de cualquier salpicadura.

9. Cuando vaya desechar algún reactivo o mezclas de reactivos químicos al finalizar las prácticas, lea las etiquetas de los frascos de residuos y desechélos en el frasco correspondiente. Recuerde que ningún residuo se debe botar al desagüe sin pevia autorización del personal capacitado.

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PRÁCTICA No. 1. EXTRACCIÓN DE ADN DE TEJIDOS VEGETALES Y ANIMALES

Tipo de Práctica

Presencial X Autodirigida Remota

Otra, ¿Cuál?

Porcentaje de evaluación 27%

Horas de la Práctica 4

Temáticas de la práctica Extracción de ácidos nucléicos

Intencionalidades formativas Propósito Aplicar los conocimientos aprendidos sobre ácidos nucleícos en la extracción de ADN de tejidos vegetales y animales. Objetivo Aprender a extraer ácidos nucleícos de un tejido animal y uno vegetal teniendo en cuenta sus propiedades. Meta El estudiante pondrá en práctica los conocimientos aprendidos sobre ácidos nucleícos para la extracción y determinación de la calidad del mismo. Competencia Comprender conceptos básicos de los ácidos nucleícos por medio de la extracción de éstos.

Fundamentación Teórica

El ADN en todas las formas de vida consiste en polímeros de nucleótidos que contienen principalmente cuatro bases nitrogenadas: adenina, tiamina, guanina y citocina. Estos nucleótidos se mantienen juntos por medio de enlaces 3’,5’-fosfodiéster. El ADN existe en cadenas de doble hélice y su composición de bases nitrogenadas es característica de cada especie. En las células procarioticas el ADN se encuentra en un único cromosoma circular de doble hélice y tiene un tamaño de 500000 pb a 9000000 pb, tamaño en que en comparación con las células eucarioticas es bastante menor. Debido al gran tamaño y la frágil naturaleza del ADN es necesario tener en cuenta varios factores para asegurar obtenerlo casi intacto y en forma estable. Los factores experimentales que se deben considerar se citan a continuación:

pH: Los enlaces de hidrógeno entre las hebras complemetarias es estable a pH entre 4 y 10. Los enlaces fosfodiéster en la columna vertebral del ADN son estables a pH entre 3 y 12. Los enlaces N-glicosídicos a las bases purínicas (adenina y guanina) son hidralizados a valores de pH iguales o menores a 3.

Temperatura: Hay una variación considerable en la estabilidad a la temperatura de los puentes de hidrógeno de la doble hélice, pero en la mayoría de los casos la doble hélice empieza a desunirse en un rango de temperatura de 80 a 90ºC. Los enlaces fosodiéster y N-glicosídicos son estables hasta los 100ºC.

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Fuerza Iónica: El ADN es más estable y soluble en soluciones salinas. Concentraciones de sales de

menos de 0.05M debilitan los puentes de hidrógeno entre las hebras complementarias.

Condiciones celulares: antes de que ADN sea liberado la membrana celular debe estar lisada. Los métodos para la lisis de ésta varian según el organismo. Por ejemplo en la levadura es necesario el uso de ultrasonido, en bacterias Gram positivas suele ser necesario el uso de enzimas hidrolíticas, mientas que en bacterias Gram negativas, en la mayoría de los casos, basta con un choque térmico. También se debe tener en cuenta que al interior y en la vecindad de las células suele haber presencia de deoxiribonucleasas que degradan el ADN. Además, se debe tener en cuenta que el ADN suele estar asociado a proteínas las cuales deben ser disociadas de éste durante el proceso de extracción.

Estrés mecánico en el ADN: durante el proceso de extracción del ADN, éste no siempre es tratado con delicadeza, pues este se debe agitar y centrifigar en muchas ocasiones lo cual puede causar el rompimiento de las cadenas de ADN. Aunque esto no causa pérdida de la estructura secundaria, sí causa un acortamiento de las cadenas.

Descripción de la Práctica

En esta práctica el estudiante aprenderá a hacer una extracción de ADN de células de alimentos comunes. Para lo cual, se romperá la membrana celular por estrés mecánico y adición de una solución de un detergente tamponada. Una vez se han roto las membranas celulares, el ADN y el resto del material celular como las proteínas saldrán de la célula. Las moléculas de ADN son frágiles y se pueden romper fácilmente, por lo que deben ser tratadas suavemente. El ADN es soluble en soluciones salinas y precipita en etanol.

Recursos a utilizar en la práctica (Equipos / instrumentos)

Materiales

Baño de agua con hielo

Licuadora

Beaker de 150mL

Beaker de 250mL

Plancha de calentamiento

Agitador de vidrio

3 Tubos de ensayo para centrifuga de 16x150mm

6 Tubos de ensayo con tapa 16x150mm

6 pipetas Pasteur

1 pipeta de 10mL

1 Gradilla Reactivos

Solución buffer carbonatada: Disolver 0.75g NaCl, 2.5g de NaHCO3 y 1mL de detergente líquido de lavar la loza en 60mL de agua destilada (pH 8).

25mL de solución acuosa 3M de acetato de sodio.

100mL de agua destilada.

50mL de etanol absoluto o 96% frío.

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25mL de HCl 0.1M

10mL de Biuret

1 banano

1 cebolla cabezona

¼ lb de hígado de res

Clara de huevo

Software a utilizar en la práctica u otro tipo de requerimiento para el desarrollo de la práctica

No require software para la realización de la práctica.

Seguridad Industrial

Se referencian aspectos de seguridad en el laboratorio al inicio de la guía práctica del curso académico. Presete especial atención al trabajo con fenol, recuerde que este es muy corrosivo y puede causar quemaduras cutáneas por lo que debe tener cerca etanol para lavar con éste en caso de sufrir quemaduras. Manejelo con precaución y en cabina de extracción, pues susvapores son altamente tóxicos.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. El estudiante debe conocer las propiedades del ADN y de la célula que lo contiene para que pueda relacionar el procedimiento seguido. Además debe conocer la ficha de seguridad de los reactivos empleados durante esta práctica. Forma de trabajo: Los estudiantes organizarán grupos de trabajo según lo dispuesto en los respectivos CEAD. Una vez los grupos de trabajo se hayan conformado, el tutor, quien dirijirá el laboratorio, resolverá inquietudes sobre el laboratorio y dará indicaciones para su desarrollo. Procedimiento: Extracción de ADN 1. Enfríe los 50 mL de etanol y el buffer carbonato en un baño de agua hielo.

2. Disponga 5cm3 de hígado crudo de res y 30mL de agua destila en una licuadora, licúe por

intervalos cortos por un tiempo total de 20 a 30s.

3. Disponga el pure de hígado en un beaker y adicione la misma cantidad de solución buffer carbonato

fría y agite con un agitador de vidrio por dos minutos.

4. Transfiera de 10 a 15mL de la mezcla a un tubo de ensayo y centrifugue por 3 minutos. El material

más denso se irá al fondo del tubo y el ADN quedará en el sobrenadante.

5. Transfiera cerca de 5mL del sobrenadante a un tubo de ensayo y adicione 10 gotas de solución

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acuosa de acetato de sodio 3 M y agite suavemente la solución.

6. Cuidadosamente deje caer 10mL de etanol frío por las paredes del tubo con la mezcla anterior, de

tal manera que se generen dos capas. El ADN aparecerá en la interfase entre las dos capas. Si se

obtienen hebras largas de ADN se pueden enrrollar en una pipeta Pasteur o en una varilla de vidrio

como spaguettis.

7. Repita el mismo procedimiento con la cebolla y el banano pero incremente el tiempo de licuado.

Caracterización del ADN obtenido

1. Localice una de las hebras de ADN obtenidas en un tubo de ensayo y adiciones 2 mL de agua

destilada.

2. En otro tubo de ensayo adicione 0,5mL de clara de huevo.

3. Mezcle los dos tubos suavemente

4. Disponga los dos tubos en un baño María de agua hirviendo, dejélos por 2 min., pasado este tiempo

retírelos con las pinzas para tubo.

5. Registre las observaciones.

6. Localice una de las hebras de ADN obtenidas en un tubo de ensayo con tapa y adiciones 2 mL de

agua destilada.

7. En otro tubo de ensayo con tapa adicione 0,5mL de clara de huevo.Adicione a cada uno de los

tubos anteriores 2 mL de HCl 0.1M

8. Tape los tubos de ensayo y agite por 2 min.

9. Registre sus observaciones

10. Localice una de las hebras de ADN obtenidas en un tubo de ensayo con tapa y adiciones 2 mL de

agua destilada.

11. En otro tubo de ensayo con tapa adicione 0,5mL de clara de huevo.

12. Adicione a cada tubo 5 gotas de reactivo de Biuret, tape y agite por 1min.

13. Registre las observaciones.

14. El ADN sobrante, debe ser guardado para la siguiente práctica de laboratorio.

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Sistema de Evaluación

La nota definitiva de la práctica d elaboratorio se obtiene de la siguiente forma:

20% preinforme de la Práctica (individual): los preinformes deben contener el título de la práctica, los objetivos, el marco teórico, en el que desarrollan los conceptos que deben conocer para realizar la práctica y el diagrama de flujo de los procedimientos que se llevarán a cabo en el laboratorio con los dibujos de los montajes, si los hay, que serán usados durante la práctica y la bibliografía empleada. Además el estudiante debe presentar una carpeta con las fichas de seguridad de los reactivos que usará en el laboratorio.

30% Trabajo práctico (individual): Los laboratorios empezaran con un qüíz sobre el conocimiento previo que los estudiantes deben tener de la práctica. Además se evaluará el orden, la obediencia y el manejo de conceptos durante la misma.

50% Informe de Laboratorio (Grupal): El informe será una continuación del preinforme y se calificará uno grupal. Este debe contener título de la práctica, los objetivos, el marco teórico, diagramas de flujo de los procedimientos que se llevarán a cabo en el laboratorio con los dibujos de los montajes, si los hay; tabla de datos, cálculos y reacciones, tabla de resultados, análisis de resultados, conclusiones, preguntas y ejercicio y bibliografía. Los tutores de laboratorio estarán en la libertad de definir las fechas en las que los pre-informes e informes serán entregados, así como las fechas en las que entregarán notas a sus estudiantes, siempre y cuando éstas se encuentren dentro del calendario definido para el curso.

Informe o productos a entregar

PREGUNTAS Y EJERCICIOS 1. ¿Por qué se emplea detergente líquido para lavar loza en la solución buffer carbonatada?, explíque la

acción del detergente mediante un dibujo.

2. ¿Para qué licua los tejidos y que sucede si los licua por mucho tiempo?

3. ¿Por qué se sugiere un mayor tiempo de licuado para la cebolla que para el hígado?, Explíquelo estructuralmente.

4. ¿Por qué el etanol precipita el ADN?

5. ¿Qué tan puro se obtiene el ADN en esta práctica?, explíque que impurezas puede tener y que

procedimiento podría seguir para obtenerlo más puro.

6. ¿Qué métodos podría emplear para cuantificar el ADN obtenido? Nombre por lo menos dos y explíque su fundamento.

7. ¿Por qué el tubo que contiene el ADN tratado con calor se ve translúcido, mientras que el tubo que

contiene la clara de huevo se ve blanco?

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8. ¿Qué diferencias observó entre el tubo que contiene el ADN tratado con 1 mL de HCl 0.1M y el tubo

que contiene la clara de huevo? Explíque a que se deben estas diferencias.

9. ¿Qué diferencias observo entre el ADN y la clara de huevo al reaccionar con el reactivo de Biuret?, ¿Desde el punto de vista químico, a qué se debe esta diferencia?

Rúbrica de evaluación

RÚBRICA DE EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO (Evaluada por el tutor de laboratorio)

QÜÍZ DE ENTRADA

PUNTAJE

TOTAL

El tutor de laboratorio hará una evaluación corta de entrada sobre los temas que el estudiante debía preparar como parte del pre-informe. Esta evaluación deberá tener como mínimo dos preguntas.

2,5

TOTAL 2,5

PRE-INFORME

ÍTEM PUNTAJE MINIMO PUNTAJE MEDIO PUNTAJE ALTO PUNTAJE

TOTAL

PRESENTACIÓN GENERAL

El documento no está ordenado y presenta errores

ortográficos y/o de redacción graves

(0 puntos)

El documento está ordenada pero la

redacción y ortografía son deficientes (0,25 puntos)

El documento está ordenado y esta escrito con ortografía y buena redacción (0,5 puntos)

0,5

TÍTULO El título no corresponde a la

práctica o no tiene título (0 puntos)

Tien un título, pero es demasiado general

(0,25 puntos)

El título representa la práctica d elaboratorio

(0,5 puntos)

0,5

OBJETIVOS No hay objetivos o son

excesivamente generales (0 puntos)

Presenta objetivos pero son muy generales

(0,5 puntos)

Los objetivos corresponden a la

práctica de laboratorio a desarrollar (1 puntos)

1

MARCO TEÓRICO No presenta marco teórico o

es muy insuficiente (0 puntos)

Presenta marco teórico pero está incompleto

(0,75 puntos)

El marco teórico incluye todos los conceptos necesarios para el

desarrollo y entendimiento d ela

práctica (1,5 puntos)

1,5

PROCEDIMIENTO

No presenta procedimiento o copia el procedimiento de la guía tal cual se presenta

en ésta (0 puntos)

Presenta el procedimiento en diagrama de flujo pero esta incompleto o no es

lógico (0,75 puntos)

Se presenta el procedimiento en diagram de flujo, está completo y

sigue un orden lógico (1,5 puntos)

1,5

TOTAL 5

INFORME


TOTAL


El documento no está ordenado y presenta errores

ortográficos y/o de redacción graves

(0 puntos)


redacción y ortografía son deficientes (0,1 puntos)


0,2

14


TÍTULO El título no corresponde a la

práctica o no tiene título (0 puntos)


(0,1 puntos)


(0,2 puntos)

0,2




(0,25 puntos)


práctica de laboratorio a desarrollar

(0,5 puntos)

0,5

INTRODUCCIÓN No presenta marco teórico o

es muy insuficiente (0 puntos)


(0,25 puntos)




0,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)

Presenta el procedimiento en diagrama de flujo pero esta incompleto o no es


Se presenta el procedimiento en

diagram de flujo, está completo y sigue un

orden lógico (0,5 puntos)

0,5

TABLAS DE DATOS No se presentan tablas de

datos (0 puntos)

Se presentan tablas de datos pero no tienen título

y están incompletas (0,5 puntos)

Se presentan tablas de datos completas y con

títulos (1 puntos)

1

REACCIONES Y CALCULOS

No se presentan reacciones ni cálculos (0 puntos)

Se presentan reacciones y cálculos pero están

incompletos (0,5 puntos)

Se presentan reacciones y cálculos

completos (1 puntos)

1

TABLAS DE RESULTADOS

No se presentan tablas de resultados (0 puntos)

Se presentan tablas de resultados pero no tienen título y están incompletas

(0,3 puntos)

Se presentan tablas de resultados completas y

con títulos (0,6 puntos)

0,6

ANÁLISIS DE RESULTADOS

No presenta análisis de resultados (0 puntos)

Presenta análisis de resultados pero su

contenido no es propiamente un análisis

(1,5 puntos)

Presenta un análisis de resultados correcto

(2,5 puntos) 2,5

CONCLUSIONES

No presenta conclusiones o no corresponden a los objetivos planteados

(0 puntos)

Presenta conclusiones pero son demasiado

generales (0,5 puntos)

Las conclusiones se encuentran escritas según los objetivos

(1 puntos)

1

PREGUNTAS Y EJERCICIOS

No presenta preguntas y ejercicios

(0 puntos)

Presenta preguntas y ejercicios pero está

incompleto (1,0 puntos)

Presenta preguntas y ejercicios en su

totalidad (1,5 puntos)

1,5

BIBLIOGRAFIA No presenta bibliografía

(0 puntos)

Presenta bibliografía pero no esta citada según

normas APA (0,3 puntos)

La bibliografía se encuentra citada según


0,5

TOTAL 10

Retroalimentación

El tutor responsable del curso será el encargado de dar la retroalimentación de los estudiantes según la rúbrica de evaluación presentada en este documento.

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PRÁCTICA No. 2. EFECTO HIPERCRÓMICO DEL ADN

Tipo de Práctica


Otra, ¿Cuál?



Temáticas de la práctica Comportamiento del ADN con la temperatura

Intencionalidades formativas Propósito Mostrar el comportamiento del ADN con la temperatura y entender el impacto que este comportamiento ha tenido para el desarrollo de la vida e investigación. Objetivos

Observar el comportamiento del ADN con la temperatura y realacionar éste con su estabilidad. Meta El estudiante aplicará lo aprendido en teoría sobre el comportamiento del ADN con la temperatura, dentro de sus características más importantes. Competencia Observar experimentalmente la estabilidad del ADN con la temperatura y la relacionará con los procesos biológicos y sínteticos que se han desarrollado.


Si las soluciones de ADN son tratadas con agentes desnaturalizantes (calor, bases o solventes orgánicos) su absorción en el espectro UV se incrementa. Esto se debe a que el ADN pierde la dobre hélice y por lo tanto la absorbancia de las bases incrementa. Esto se puede evidenciar si se contruye una curva de A260(Tº)/A280(25ºC) vs. Temperatura (ºC). Si en un experimento como éste se toman datos a una temperatura entre 25 y 80ºC se evidencia que la diferencia en absorción es muy baja, mientras que a temperaturas mayores se observa una umento rápido de la absorbancia seguida por una A260 constante. El incremento normal en absorbancia en esta última zona es de un 40% y ocurre en un rango muy estrecho de temperatura. Esta curva es llamada curva de desnaturalización o de fusión. El origen en el incremento de la absorción es conocido como efecto hipercrómico y se basa en que los cambios en absorbancia resultan de la transición de una hebra ordenada en doble hélice a un estado desnaturalizado, en el que se encuentran hebras desapareadas o apareadas por fragmentos al azar.


En esta práctica se estudiará el comportamiento del ADN con la temperatura, para lo que se segurá la absorbancia de éste a 260 nm. Este valor de absorbancia será tomado como un indicativo de que tan desnaturalizado está el ADN.

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Material

Tubos de ensayo

Celdas de quarzo

Espectrofotómetro UV-Vis

Tubos Eppendorf

Termómetro de 0-110ºC


Beaker de 250 mL

Baño de hielo

Pipeta de 5mL graduada

Pipeteador

Micropipeta de 100-1000uL

Puntas azules Reactivos

ADN extraído en la anterior práctica

10 mL de buffer TE pH 7.5




Se referencian aspectos de seguridad en el laboratorio al inicio de la guía práctica del curso académico.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. El estudiante debe conocer la teoría sobre la estructura molecular del ADN y el efecto de la temperatura en la absorción de este a 260 nm en el ultravioleta o efecto hipercrómico. Forma de trabajo: Los estudiantes organizarán grupos de trabajo según lo dispuesto en los respectivos CEAD. Una vez los grupos de trabajo se hayan conformado, el tutor, quien dirijirá el laboratorio, resolverá inquietudes sobre el laboratorio y dará indicaciones para su desarrollo. Es recomendable que los estudiantes sigan en los mismos grupos de trabajo que se definieron para la primera práctica. Procedimiento: 1. Diluya una alícuota de 1mL de solución de ADN con 4.5mL de buffer TE, asegurese de que la

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solución quede bien homogénea. 2. Transfiera algo de la solución a una celda de cuarzo del espectrofotómetro y determine la

absorbancia a 260 nm. Si esta es mayor que 1, la solución debe ser disuelta hasta que se encuentre entre 0.5 y 1.

3. Determine la absorbancia de la muestra anterior a 280nm.

4. Prepare 5 mL de una solución de ADN en buffer TE pH 7.5 a una concentración cercana a 20

ug/mL. Determine la absorbancia de ésta a 260 nm, la cual debe ser cercana a 0.4.

5. Transfiera 1.5mL de la anterior solución de ADN en tubos eppendorf. Deje un tubo a temperatura ambiente y ponga los otros dos en un baño de agua a 90ºC (baño maría con agua hirviendo) por 15 minutos.

6. Remueva los tubos del baño de agua a 90ºC, enfrie uno de los tubos rápidamente en un baño de

hielo y permita que el otro se enfrie a temperatura ambiente por un periodo cercano a una hora.

7. Mida las absorbancias finales de los tres tubos a 260 nm. Tabla para registrar resultados:

Tabla No. 1.

MEDIO ABSORBANCIA A 260nm

Tubo a temperatura ambiente

Tubo calentado a 90ºC y enfriado en baño de hielo

Tubo a 90ºC y enfriado lentamente





50% Informe de Laboratorio (Grupal): El informe será una continuación del preinforme y se calificará uno grupal. Este debe contener título de la práctica, los objetivos, el marco teórico, diagramas de flujo de los procedimientos que se llevarán a cabo en el laboratorio con los dibujos de los montajes, si los

18


hay; tabla de datos, cálculos y reacciones, tabla de resultados, análisis de resultados, conclusiones, preguntas y ejercicio y bibliografía. Los tutores de laboratorio estarán en la libertad de definir las fechas en las que los pre-informes e informes serán entregados, así como las fechas en las que entregarán notas a sus estudiantes, siempre y cuando éstas se encuentren dentro del calendario definido para el curso.


PREGUNTAS Y EJERCICIOS 1. ¿Qué le sucede al ADN cuando se calienta?

2. ¿Cómo es el comportamiento del ADN con el calor? Explíquelo mediante una gráfica

3. ¿A qué hace referencia la temperatura de fusión del ADN?

4. Prediga el impacto que tendrían las siguientes condiciones sobre la temperatura de fusión de una muestra de ADN nativo:

Buffer pH 13

Agua destilada

SDS 10%

5. ¿A que se debe la diferencia en absorción a 260 nm de las muestras de ADN tratadas?

6. ¿En qué muestra se debe presentar la mayor absorción a 260 nm y por qué?

7. ¿Qué impacto tiene el descubrimiento del comportamiento del ADN con la temperatura en el desarrollo d ela investigación en el campo de la genética?



QÜÍZ DE ENTRADA

PUNTAJE

TOTAL


2,5

TOTAL 2,5

PRE-INFORME


TOTAL


El documento no está ordenado y presenta

errores ortográficos y/o de redacción graves

(0 puntos)


redacción y ortografía son deficientes (0,25

puntos)


0,5

19


TÍTULO El título no corresponde a la práctica o no tiene título

(0 puntos)


(0,25 puntos)


(0,5 puntos)

0,5




(0,5 puntos)



1

MARCO TEÓRICO No presenta marco teórico

o es muy insuficiente (0 puntos)


(0,75 puntos)




1,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)

Presenta el procedimiento en

diagrama de flujo pero esta incompleto o no es




1,5

TOTAL 5

INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,2


(0 puntos)


(0,1 puntos)


(0,2 puntos)

0,2




(0,25 puntos)


práctica de laboratorio a desarrollar (0,5 puntos)

0,5

INTRODUCCIÓN No presenta marco teórico



(0,25 puntos)

El marco teórico incluye todos los

conceptos necesarios para el desarrollo y entendimiento d ela


0,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)







0,5


datos (0 puntos)

Se presentan tablas de datos pero no tienen

título y están incompletas (0,5 puntos)


títulos (1 puntos)

1


No se presentan reacciones ni cálculos



1

20


(0 puntos) incompletos (0,5 puntos)





(0,3 puntos)



0,6





(1,5 puntos)


(2,5 puntos)

2,5

CONCLUSIONES

No presenta conclusiones o no corresponden a los

objetivos planteados (0 puntos)




(1 puntos)

1



(0 puntos)





1,5


(0 puntos)





0,5

TOTAL 10

Retroalimentación


21


PRÁCTICA No. 3. FUENTES DE ROS EN ALIMENTOS: DETERMINACIÓN DE PERÓXIDO EN

ACEITES VEGETALES

Tipo de Práctica


Otra, ¿Cuál?



Temáticas de la práctica Determinación de peróxidos en aceites vegetales como especies reactivas de oxígeno

Intencionalidades formativas Propósito Mostrar que los alimentos pueden ser fuentes de especies reactivas de oxígeno. Objetivo Determinar el contenido de peróxidos en aceite de cocina y asociar este contenido a la estructura de los acidos grasos que contienen y al número de veces que se ha usado el aceite. Asociar el consumo de peróxidos de fuentes vegetales con las consecuencias bioquímicas que estos pueden tener en el organismo. Meta Establecer asocianes entre la estructura química de un ácido graso y el tratamiento que éste ha recibido y la producción de peroxidos a partir de éste. Competencia El estudiante asocia la estructura y el número de veces que un aceite vegetal ha sido usado con la cantidad de peróxidos producidos por éste . El estudiante conoce los efectos a nivel bioquímico que los peróxidos consumidos de fuentes vegetales pueden tener.


Los organismos aeróbicos producen especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés), las cuales son producidas como consecuencia de la respiración aeróbica y la oxidación del sustrato, como por ejemplo la oxidación de ácidos grasos. Pequeñas cantidades de ROS, incluyendo radicales hidroxilo (•OH), aniones superóxido (O2

-) y peróxido de hidrógeno; son constantemente generados en organismos aeróbicos en respuesta a estímulos internos y externos. Altas dosis o una remoción inadecuada de los ROS causan estrés oxidativo, el cual debe causar malfuncionamiento metabólico severo y daño de las macromoléculas biológicas.

22


Los ácidos grasos pueden ser una fuente importante de peróxido de hidrógeno, pues son suceptibles a autoxidación, sobretodo si estos contienen insaturaciones. Para determinar si una muestra de aceite ha sufrido oxidación primaria se determina el contenido de peróxidos como valor de peróxido (POV), pues estas moléculas son intermedarios en el proceso de autoxidación. En esta determinación, la muestra a ser valorada se disuelve en una mezcla de cloroformo: ácido acético 2:3. Luego se adiciona yoduro de potasio y el yodo libre desprendido de la reacción entre los peróxidos y el yoduro, se titula con tiosulfato de sodio. La reacción se da como sigue:


Se determinará el contenido de peróxidos en seis muestras deferentes de aceite vegetal de cocina por medio de su reacción con yoduro de potasio y la posterior titulación del yodo producido con tiosulfato de sodio. Para luego determinar que muestra es mejor para consumo humano.


Materiales

Bureta 25 mL

Pinza para bureta con nuez

Soporte universal

Erlenmeyer de 250 mL

Beaker de 250 mL

Balanza analítica

Probeta de 50 mL

Agitador magnético

Plancha de agitación

Pipeta de 1 mL con pipeteador

Calculadora Reactivos

10 mL de aceite vegetal para fritar

10 mL de aceite vegetal para fritar que ha sido usado una vez

10 mL de aceite vegetal para fritar que ha sido usado dos vez

10 mL de aceite vegetal para fritar que ha sido usado tres veces

10 mL de aceite vegetal comercial rico en omegas sin usar

10 mL de aceite vegetal comercial rico en omegas usado una vez

Solución saturada de yoduro de potasio

Mezcla cloroformo - ácido acético 2:3

Agua destilada

Solución de almidón 1%P/V

Tiosulfato de sodio 0.01M

23






Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. El estudiante debe repasar conceptos sobre especies reactivas de oxígeno y su efecto en el organismo, además debe investigar cual es el POV permitido en los aceites que se encuentran disponibles comercialmente según NTC y como es el proceso de auto-oxidación y de oxidación catalizada por calor de los ácidos grasos. Forma de trabajo: Los estudiantes organizarán grupos de trabajo según lo dispuesto en los respectivos CEAD. Una vez los grupos de trabajo se hayan conformado, el tutor, quien dirijirá el laboratorio, resolverá inquietudes sobre el laboratorio y dará indicaciones para su desarrollo. Es recomendable que los estudiantes sigan en los mismos grupos de trabajo que se definieron para la primera práctica. Procedimiento: 1. Adicione 5 g de muestra en el erlenmeyer limpio y seco

2. Adicione 30 mL de la mezcla de cloroformo y ácido acético y agite hasta formar una solución

3. Adicione a la anterior solución 0.5mL de solución saturada de yoduro de potasio inmediatamente

tape el erlenmeyer y agite suavemente por un minuto.

4. Deje el frasco a la oscuridad por 5 minutos

5. Adicione 30 mL de agua destilada, ciere nuevamente y agite magnéticamente.

6. Titular con tiosulfato de potasio hasta llegar a un amarillo tenue

7. Adicione 1 mL de almidón

8. Continué la titulación con tiosulfato hasta desaparición del color azul

9. Registre el volumen gastado y reemplace los datos en la siguiente formula para obtener el POV:

24


Siga este procedimiento con las seis muestras de aceites vegetales.


La nota definitiva de la práctica del laboratorio se obtiene de la siguiente forma:



50% Informe de Laboratorio (Grupal): El informe será una continuación del preinforme y se calificará uno grupal. Este debe contener título de la práctica, los objetivos, el marco teórico, diagramas de flujo de los procedimientos que se llevarán a cabo en el laboratorio con los dibujos de los montajes, si los hay; tabla de datos, cálculos y reacciones, tabla de resultados, análisis de resultados, conclusiones, preguntas y ejercicio y bibliografía.

Los tutores de laboratorio estarán en la libertad de definir las fechas en las que los pre-informes e informes serán entregados, así como las fechas en las que entregarán notas a sus estudiantes, siempre y cuando éstas se encuentren dentro del calendario definido para el curso.


PREGUNTAS Y EJERCICIOS 1. ¿Cómo sucede la auto-oxidación de los ácidos grasos y que productos se obtienen?

2. ¿Qué factores pueden catalizar la oxidación de los ácidos grasos?

3. ¿Cómo pueden afectar los peróxidos producidos por la oxidación de los ácidos grasos el

organismo?

4. ¿Qué ácidos grasos contienen las muestras de aceite empleadas, sin usar, y cuáles de ellos pueden oxidarse más fácilmente?

5. ¿En cuál de las muestras de aceite vegetal obtuvo un mayor valor de próxidos, comparando entre

número de veces que se uso y tipo de aceite empleado?, ¿sus resultados son los esperados? Explíque sus respuestas.

6. ¿Cómo podría evitar o minimizar la oxidación de los ácidos grasos presentes en los aceites

vegetales empleados?

25


7. ¿Para qué se determina el POV en la industria y por qué es importante?

8. ¿De qué otra forma podría determinar que tan oxidado está un aceite?



QÜÍZ DE ENTRADA

PUNTAJE

TOTAL


2,5

TOTAL 2,5

PRE-INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,5


(0 puntos)


(0,25 puntos)


(0,5 puntos)

0,5




(0,5 puntos)



1




(0,75 puntos)




1,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)






1,5

TOTAL 5

INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,2

TÍTULO El título no corresponde a Tien un título, pero es El título representa la

26


la práctica o no tiene título (0 puntos)

demasiado general (0,1 puntos)

práctica d elaboratorio (0,2 puntos)

0,2




(0,25 puntos)


práctica de laboratorio a desarrollar (0,5 puntos)

0,5




(0,25 puntos)




0,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)







0,5


datos (0 puntos)




títulos (1 puntos)

1



(0 puntos)





1




(0,3 puntos)



0,6





(1,5 puntos)


(2,5 puntos) 2,5

CONCLUSIONES






(1 puntos)

1



(0 puntos)





1,5


(0 puntos)





0,5

TOTAL 10

Retroalimentación


27


PRÁCTICA No. 4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE ALGUNOS ALIMENTOS

Tipo de Práctica


Otra, ¿Cuál?



Temáticas de la práctica Determinación de compuestos antioxidantes en alimentos

Intencionalidades formativas Propósito Evidenciar las propiedades antioxidantes de algunos alimentos y vitaminas. Objetivo Determinar las propiedades antioxidantes de algunos alimentos como té, cascara de toronja y vitaminas, por medio de la reacción con el pigmento quimioluminiscente proveniente de una barra luminosa. Meta Comprobar la capacidad antioxidante de algunos alimentos y vitaminas y asociarla con su función biológica como supresores de radicales libres. Competencia El estudiante comprende la importancia de los compuestos antioxidantes como supresores del exceso de radicales libres en el organismo y reconoce que los alimentos son una buena fuente para la obtención de éstos.


Los organismos aeróbicos poseemos sistemas de defensa antioxidantes que lidian con especies

reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés). Los antioxidantes son definidos como

compuestos orgánicos que son adicionados a materia orgánica oxidable para retardar su oxidación y

en general, para prolongar el tiempo de vida útil del sustrato.

El sistema de defensa del organismo contra los radicales libres son los anti-oxidantes, estos

interactúan con los radicales libres antes de que moléculas vitales sean dañadas. Los antioxidantes

son fabricados al interior del cuerpo y también pueden ser obtenidos de los alimentos que los humanos

consumen como las frutas, vegetales, semillas, nueces, carnes y aceites. Hay un balance entre los

radicales libres y los antioxidantes producidos en el cuerpo humano, el cual debe ser entendido para

saber si los radicales libres son funcionales o disfuncionales en el cuerpo humano.

La capacidad antioxidante de los alimentos suele estudiarse por medio de reacciones que son seguidas

por compuestos quimioluminiscentes, lo que permite medir el cecrecimiento oxidativo de la

28


concentración del pigmento fotométricamente. Estos métodos suelen ser caros y dispendiosos de llevar

a cabo, por lo anterior en este laboratorio se propone un método para demostarar la capacidad

antioxidante usando la reacción de quimioluminiscencia de las barras luminosas que suelen ser usados

como objetos de seguridad y emergencia.

Cuando una barra luminiscente se rompe, ésta muestra una quimioluminiscencia brillante. Esta

luminiscencia resulta de la reacción del peróxido de hidrógeno, proveniente del vial de vidrio en la

barra, con el éster de fenil oxalato del tubo plástico. El ester es oxidado, produciendo dos moléculas de

fenol y una moléculad e 1,2-dioxoetanodiona. Esta última se descompone espontáneamente en dióxido

de carbono, liberando energía que excita los electrones del pigmento, lo cuales se relajan liberando un

foton. La longitud de onda del fotón, el color de la luz emitida, depende de la estructura del pigmento.


Se determinará la capacidad antioxidante de algunos alimentos comunes usando el contenido de las

barras luminiscentes como pigmentos quimioluminiscentes.


Materiales

Barras luminescentes (preferiblemente amarilla de 15mm X 150 mm)

Tubos de ensayo con tapa

Gradilla para los tubos de ensayo

Coladores de metal

Pipeta de 2 mL con pipeteador

Pipetas pasteur

Tijeras o cuchilla

Beaker de 250mL

Vidrio de reloj

Balanza analítica Reactivos

Té negro

Té verde

Cascara de toronja

Pastillas de un multivitamínico

Pastilla de vitamina C

Pentano



29



Los aspectos básicos de seguridad se presentan al inicio de esta guía. Como consideración adicional, se debe tener en cuenta que en esta práctica se trabajará con sustancias químicas altamente irritantes (pimentos fluorescentes d elas barras luminosas), peligrosas y nocivas (como el pentano), tóxicas (como el dibutil-ptalato, usado como solvente en las barras luminosas), corrosivas (como el peróxido de hidrógeno) y altamente inflamables (como el pentano). Por lo tanto se recomienda que los estudiantes usen los implementos de bioseguridad completos.

Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. Los estudiantes deben revisar los conceptos sobre radicales libres y antioxidantes. Además deben buscar la reacción de quimioluminiscencia que sucede entre el éster de fenil oxalato y el peróxido y deben tener claro lo que sucede con la quimioluminiscencia en presencia de antioxidantes y con el cloruro de sodio. Forma de trabajo: Los estudiantes organizarán grupos de trabajo según lo dispuesto en los respectivos CEAD. Una vez los grupos de trabajo se hayan conformado, el tutor, quien dirijirá el laboratorio, resolverá inquietudes sobre el laboratorio y dará indicaciones para su desarrollo. Es recomendable que los estudiantes sigan en los mismos grupos de trabajo que se definieron para la primera práctica. Procedimiento: 1. Destape la barra luminosa (preferiblemente amarilla de 15mm X 150 mm), quiebre el vial de vidrio

y agite el contenido. 2. Corte el extremo de la barra luminosa. 3. Filtre el contenido de la barra luminosa a travez de una malla de metal y porcionela en dos tubos

de ensayo. 4. Repita este mismo procedimiento con otros dos tubos de ensayo, de tal modo que al final tendrá 6

tubos de ensayo para hacer pruebas. 5. Adicione 2 mL de pentano a cada tubo de ensayo. 6. A un tubo de ensayo añada 1 g de muestra del alimento a probar (té negro, té verde, cascara de

toronja, pastillas de un multivitamínico y pastilla de vitamina C) y a otro tubo al mismo tiempo adicione 1g de cloruro de sodio, el cual funciona como sustancia control.

7. Tape los tubos de ensayo y agite bien. 8. Compare la diferencia en emisión de la luz después de 3 minutos, esta es más fácil de distinguir si

la determinación se hace en un cuarto oscuro. 9. Califique la intensidad de la luz de 0 a 5, siendo 5 la mayor emisión y 0 una emisión nula.


La nota definitiva de la práctica del laboratorio se obtiene de la siguiente forma:

20% preinforme de la Práctica (individual): los preinformes deben contener el título de la práctica, los objetivos, el marco teórico, en el que desarrollan los conceptos que deben conocer para realizar la práctica y el diagrama de flujo de los procedimientos que se llevarán a cabo en el laboratorio con los

30


dibujos de los montajes, si los hay, que serán usados durante la práctica y la bibliografía empleada. Además el estudiante debe presentar una carpeta con las fichas de seguridad de los reactivos que usará en el laboratorio.





PREGUNTAS Y EJERCICIOS 1. ¿Cuál es la composición química de las barras luminosas y cómo funcionan?

2. Escriba la reacción qué sucede en las barras luminosas y que es responsable de la

quimioluminiscencia producida por estas

3. ¿qué debe suceder con la quimioluminiscencia de una muestra de alimento comparada con el blanco de NaCl, si el alimento contiene sustancias antioxidantes?

4. Según los resultados obtenidos, ¿qué alimento presenta más actividad antioxidante? Explíque su

respuesta.

5. Investigue cuales moléculas en los alimentos probados tienen actividad antioxidante y relaciónelo con los resultados encontrados.

6. Por qué es importante la ingesta o fabricación de antioxidantes para el funcionamiento de nuestro

organismo.

7. ¿De qué otra forma podría medir la capacidad antioxidante de los alimentos?

31




QÜÍZ DE ENTRADA

PUNTAJE

TOTAL


2,5

TOTAL 2,5

PRE-INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,5


(0 puntos)


(0,25 puntos)


(0,5 puntos)

0,5




(0,5 puntos)



1




(0,75 puntos)




1,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)







1,5

TOTAL 5

INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,2


(0 puntos)


(0,1 puntos)


(0,2 puntos)

0,2




(0,25 puntos)


práctica de laboratorio

0,5

32


a desarrollar (0,5 puntos)




(0,25 puntos)




0,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)







0,5


datos (0 puntos)




títulos (1 puntos)

1



(0 puntos)





1




(0,3 puntos)



0,6





(1,5 puntos)


(2,5 puntos) 2,5

CONCLUSIONES






(1 puntos)

1



(0 puntos)





1,5


(0 puntos)





0,5

TOTAL 10

Retroalimentación


33


PRÁCTICA No. 5. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES EN MUESTRAS NATURALES

POR LA REACCIÓN DE TRAUTZ-SCHORIGIN

Tipo de Práctica


Otra, ¿Cuál?



Temáticas de la práctica Análisis del contenido de polifenoles en té

Intencionalidades formativas Propósito Estudiar más detenidamente la actividad antioxidante del té Objetivo Determinar la presencia de polifenoles en muestras de té para evidenciar las sustancias responsables de su activiada antooxidante Meta El estudiante evidenciará por medio de una reacción quimioluminescente la presencia de polifenoles en las hojas de té molido Competencia El estudiante reconoce la importancia de compuestos atioxidantes en alimentos consumidos cotidianamente como las hojas de té molido para hacer infusiones.


El té es una de las bebidas más ampliamente consumidas en el mundo, siendo la bebida más consumida después del agua. En general el té se puede clasificar en tres tipos, que dependen principalmente del grado de fermentación, estos son: el té verde que no está fermentado, el té oolong que está parcialmente fermentado y el té negro que está completamente fermentado. Muchos estudios han mostrado la relación entre el consumo de té y la prevención de enfermedades, las cuales se atribuyen principalmente al contenido de polifenoles y también a los metabolitos que las plantas usan como sistema defensivo contra factores ambientales como la radiación ultravioleta y los patógenos. Los polifenoles en mayor concentración en el té son los flavonoides, particularmente los flavanoles (como por ejemplo las catequinas) y los ácidos fenólicos. El té es además una fuente importante de ácido gálico, que es un ácido hidróxibenzoico. El contenido de catequinas es del 30 al 42% de los sólidos solubles en agua en el té verde molido. Una de las principals características de los polifenoles y los taninos es la presencia del grupo structural pirogalol. Los ácidos húmicos también incluyen compuestos que llevan el grupo funcional pirogalol o ácido gálico. El pirogalol fue uno de los reactivos quimioluminiscentes más olvidados, sus propiedades fueron descubiertas por J. M. Eder en 1887 cuando se usó como desarrollador fotográfico, después la reacción entre el pirogalol y el peróxido de hidrógeno alcalino en presencia de formaldehído produjo

34


una quimioluminiscencia roja relativamente fuerte. Esta reacción se conoce como la reacción de Trautz-Schorigin y su característica emisión de luz roja es debida a la generación de especies de oxígeno molecular en singlete O2

*. Por lo anterior, las reacciones en las que se desarrolla quimioluminiscencia han sido usadas por mucho tiempo usando lofina, luminol y oxalilo esteres. El oxígeno en singlete quimioluminiscente también ha sido uno de los productos buscados en química analítica, pero normalmente se llega a él por medio del uso de sustancias muy tóxicas como cloro gaseoso. La reacción de Trautz-Schorigin ofrece una forma inisual de producir el oxígeno en singlete quimioluminiscente. Sin embargo, la reacción original es una reacción vigorosa que necesita el uso de reactivos muy peligrosos tales como el pirogalol y soluciones concentradas de formaldehído y peróxido de hidrógeno.


El procedimiento descrito en esta guía lleva a cabo la reacción de Trautz-Schorigin con un sustrato mucho más seguro que el pirogalol, como lo son los polifenoles que contiene el té verde. Los ácidos gálico, tánico y húmico también pueden ser usados. En este experiemento se usa paraformaldehído y peróxido de hidrógeno al 3% p/p, lo cual hace que la reacción sea químicamente más segura que cuando se usa formaldehído concentrado y peróxido de hidrógeno 30%, pues aunque en este último caso la quimioluminiscencia producida es más brillante, la reacción produce una efervescencia violenta debida a la formación de aerosoles nocivos. Este procedimiento no sólo detecta el efecto de sustancias antioxidantes como los fenoles en el té, sino que también muestra el impacto de antioxidantes bien conocidos en el diario vivir como el ácido ascórbico que reduce el estrés oxidativo celular, el cual esta relacionado a la ocurrencia y empeoramiento de enferemedades y al envejecimiento.


Material

2 Beaker 150mL

2 Beaker 250mL

2 Beaker 400mL

Papel indicador universal de pH

Cuarto oscuro Reactivos

1.0g de ácido gálico, tánico o húmico

10g de paraformaldehído

20g de carbonato de sodio

150mL de peróxido de hidrógeno 3% p/p





35


Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. El estudiante debe revisar la teoría sobre radicales libres y debe conocer la reacción de Trautz-Schorigin, el mecanismo que este sigue y debe estudiar como se produce la quimioluminiscencia. Forma de trabajo: Los estudiantes organizarán grupos de trabajo según lo dispuesto en los respectivos CEAD. Una vez los grupos de trabajo se hayan conformado, el tutor, quien dirijirá el laboratorio, resolverá inquietudes sobre el laboratorio y dará indicaciones para su desarrollo. Es recomendable que los estudiantes sigan en los mismos grupos de trabajo que se definieron para la primera práctica. Procedimiento: Reacción de Trautz-Schorigin con el polifenol patrón 1. En un beaker de 250mL adicione 0.2g de un polifenol patrón (ácido gálico, tánico o húmico) 2. Adicione 50mL de agua hirviendo, ponga sobre una plancha de calentamiento y agite

magnéticamente hasta disolver el polifenol 3. Adicione 2g de paraformaldehído y 5g de carbonato de sodio sin detener la agitación magnética. 4. Deje enfriar la solución café resultante a temperatura ambiente en un baño de agua. 5. Verifique con el papel indicador que el pH de la solución resultante sea aproximadamente de 11. 6. Transfiera la solución café a un beaker de 400mL 7. Lleve la solución a un cuarto oscuro 8. Adicione 50mL de peróxido de hidrógeno 3%p/p 9. Observe la quimioluminiscencia que dura de 5 a 10s. Reacción de Trautz-Schorigin con los polifenoles presentes en el té 10. En un beaker de 250mL adicione una bolsa de té (de aproximadamente 2g de té molido) 11. Adicione 200mL de agua hirviendo y permita que se forme la infusión por 3 minutos, ponga sobre

una plancha de calentamiento y agite magnéticamente ocasionalmente. 12. Remueva la bolsa de té 13. Adicione 8g de paraformaldehído y 20g de carbonato de sodio sin detener la agitación magnética. 14. Deje enfriar la solución café resultante a temperatura ambiente en un baño de agua. 15. Verifique con el papel indicador que el pH de la solución resultante sea aproximadamente de 11. 16. Transfiera 50mL de la solución café a un beaker de 400mL 17. Lleve la solución a un cuarto oscuro 18. Adicione 50mL de peróxido de hidrógeno 3%p/p 19. Observe la quimioluminiscencia que dura de 5 a 10s. Efecto del ácido ascórbico 20. Lleve a cabo el procedimiento de la “reacción de Trautz-Schorigin con los polifenoles presentes en

el té”, como se describe arriba, hasta el punto 17. 21. Antes de adicional el peróxido de hidrógeno 3% p/p, disuelva 1g de ácido ascórbico en la solución

café.

36


22. Observe que la quimioluminiscencia es inhibida. Efecto del ácido bórico 23. Lleve a cabo el procedimiento de la “reacción de Trautz-Schorigin con los polifenoles presentes en

el té”, como se describe arriba, hasta el punto 17. 24. Antes de adicional el peróxido de hidrógeno 3% p/p, disuelva 1g de ácido bórico en la solución

café. 25. Observe la quimioluminiscencia que se tarda unos segundos en ocurrir.


La nota definitiva de la práctica de laboratorio se obtiene de la siguiente forma:



50% Informe de Laboratorio (Grupal): El informe será una continuación del preinforme y se calificará uno grupal. Este debe contener título de la práctica, los objetivos, el marco teórico, diagramas de flujo de los procedimientos que se llevarán a cabo en el laboratorio con los dibujos de los montajes, si los hay; tabla de datos, cálculos y reacciones, tabla de resultados, análisis de resultados, conclusiones, preguntas y ejercicio y bibliografía. Los tutores de laboratorio estarán en la libertad de definir las fechas en las que los pre-informes e informes serán entregados, así como las fechas en las que entregarán notas a sus estudiantes, siempre y cuando éstas se encuentren dentro del calendario definido para el curso.


PREGUNTAS Y EJERCICIOS 1. ¿Por qué los polifenoles tienen actividad antooxidante?

2. Escriba el mecanismo para la producción de oxígeno en singlete por la oxidación del pirogalol por el

peróxido de hidrógeno.

3. Se sabe que cuando el té negro es tratado con la reacción de Trautz-Schorigin, este no exhibe quimioluminiscencia como el té verde. ¿A qué se debe esta diferencia?

4. ¿Por qué la solución obtenida después de adicionar el paraformaldehído y el carbonato de sodio al té es de color café?

37


5. La reacción de Trautz-Schorigin, se debe llevar a cabo en medio básico, este medio se ha probado empleando hidróxido de potasio y carbonato de sodio, este último es preferido porque se logran mejores resultados. ¿Cómo podría explicar que el carbonato de sodio funcione mejor que el hidróxido de potasio?

6. ¿Cómo explica que el ácido ascórbico inhiba la quimioluminiscencia causada por los polifenoles presentes en el té?

7. ¿Por qué la quimioluminiscencia sufre un retraso cuando la muestra es tratada con ácido bórico?



QÜÍZ DE ENTRADA

PUNTAJE

TOTAL


2,5

TOTAL 2,5

PRE-INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,5


(0 puntos)


(0,25 puntos)


(0,5 puntos)

0,5




(0,5 puntos)



1




(0,75 puntos)




1,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)






1,5

TOTAL 5

38


INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,2


(0 puntos)


(0,1 puntos)


(0,2 puntos)

0,2




(0,25 puntos)



(0,5 puntos)

0,5




(0,25 puntos)




0,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)






0,5


datos (0 puntos)




títulos (1 puntos)

1



(0 puntos)



Se presentan reacciones y cálculos completos

(1 puntos) 1




(0,3 puntos)



0,6





(1,5 puntos)


(2,5 puntos) 2,5

CONCLUSIONES






(1 puntos)

1



(0 puntos)



Presenta preguntas y ejercicios en su totalidad

(1,5 puntos) 1,5


(0 puntos)





0,5

39


TOTAL 10

Retroalimentación


40


PRÁCTICA No. 6. ACTIVIDAD CATALÍTICA: IMPORTANCIA DE LOS COFACTORES

Tipo de Práctica


Otra, ¿Cuál?



Temáticas de la práctica Determinación de compuestos antioxidantes en alimentos

Intencionalidades formativas Propósito Evidenciar la importancia de los cofactores en la actividad catalítica Objetivo Determinar el efecto del cofactor grupo hemo en la reacción de descomposición del peróxido, cuando se cataliza con la enzima peróxidasa. Meta Comprobar la importancia de los cofactores y asociarla con su función biológica, específicamente en reacciones enzimáticas para descomposición de radicales libres. Competencia El estudiante comprende la importancia de los compuestos antioxidantes como supresores del exceso de radicales libres en el organismo y reconoce que algunas de estas reacciones son llevadas a cabo por enzimas. El estudiante reconoce la importancia de los cofactores en la actividad enzimática.


Las coenzimas o cofactores son moléculas orgánicas no proteícas y estables al calor, que se unen a las enzimas para formar haloenzimas, que son la forma catalíticamente activa de las enzimas. Estas moléculas suelen tener pesos moleculares bajos y son indispensables para la catálisis ya que éstas pueden donar o aceptar grupos o electrones. Los cofactores enzimáticos se diferencian de las enzimas, principalmente, en que estos último si se consumen durante la reacción. La descomposición del peróxido de hidrógeno, entre otras especies reactivas de oxígeno, es muy importante en el organismo porque éste es uno de los productos secundarios producidos durante la respiración aerobia. En el organismo, las especies de reactivas de oxígeno son descompuestas por sustancias con actividad antioxidante, como las vitaminas o por enzimas oxidoreductasas, como la catalasa. La reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno, la cual es espontánea aunque no rápida, será catalizada por la enzima catalasa y por nitrato férrico.

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Todas las enzimas oxidorreductasas requieren coenzimas. Éstas pueden actuar en forma soluble o prostéticamente. Entre las más importantes están los nucleótidos de piridina (NAD+ y NADP+), flavina (FMN y FAD), la ubiquinona, el ácido ascórbico (vitamina C), el ácido lipóico, el glutatión, los clusters de hierro-azufre y los grupos hemo. En la catalasa, el cofactor, consiste en cuatro grupos hemo porfirínicos, que son estructuras de anillos orgánicos con un cofactor hierro en el centro. En la catalasa, el hierro ayuda a acelerar el rompimiento del peróxido de hidrógeno, pues éste, como otros metales, afecta el ordenamiento electrónico de las moléculas vecinas ayudándolas a pasar al estado de transición. En el organismo, la catalasa funciona como un antioxidante, pues el hierro en ésta, la ayuda a neutralizar otras sustancias oxidantes, además del peróxido, como radicales libres.


Se estudiará la importancia de la unión enzima – cofactor en la actividad catalítica enzimática de la

catalasa en la descomposición del peróxido de hidrógeno.


Materiales

Calorimetro

Termómetro con división mínima de un grado


Agitador magnético

Pinza para bureta con nuez

Soporte universal

Probeta de 25 mL

Probeta de 100mL

Beaker de 50 mL

Balanza

Frasco lavador con agua destilada

Microespátula Reactivos

Nitrato ferrico 0.5M

Peróxido de hidrógeno 3% p/p

Buffer pH 7.00

Levadura para hornear





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Metodología

Conocimiento previo para el desarrollo de la práctica. El estudiante debe revisar el tema de enzimas y cofactores, leer sobre la actividad catílitica de la catalasa y su importancia en la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno que se encuentra presente en el organismo. Además debe investigar cual es el cofactor de la catalasa y que función cumple. Forma de trabajo: Los estudiantes organizarán grupos de trabajo según lo dispuesto en los respectivos CEAD. Una vez los grupos de trabajo se hayan conformado, el tutor, quien dirijirá el laboratorio, resolverá inquietudes sobre el laboratorio y dará indicaciones para su desarrollo. Es recomendable que los estudiantes sigan en los mismos grupos de trabajo que se definieron para la primera práctica. Procedimiento: Descomposición del peróxido catalizada por el nitrato férrico 1. Ponga la plancha de calentamiento sobre el soporte universal, asegurese de que la plancha no

está calentando y ponga sobre ésta el calorímetro 2. Ubique el agitador magnético en el calorímetro y adicione 75 mL de peróxido de hidrógeno al 3% 3. Cierre el calorímetro y ubique el termómetro, teniendo cuidado de que no pegue con el agitador

cuando empiece la agitación. Asegure el termómetro con una pinza para bureta 4. Agite a 250 rpm y tome la temperatura por 2 min, cada 30 s para asegurarse de que el peróxido

está atemperatura ambiente. 5. Adicione 15 mL de nitrato férrico 0.5M, cierre el calorimetro y mida la temperatura cada 30 s por 10

minutos. 6. Grafique los resultados obtenidos como tiempo vs. temperatura

Descomposición del peróxido catalizada por la catalasa 1. Ponga la plancha de calentamiento sobre el soporte universal, asegurese de que la plancha no

está calentando y ponga sobre ésta el calorímetro 2. Ubique el agitador magnético en el calorímetro y adicione 75 mL de peróxido de hidrógeno al 3% 3. Cierre el calorímetro y ubique el termómetro, teniendo cuidado de que no pegue con el agitador

cuando empiece la agitación. Asegure el termómetro con una pinza para bureta 4. Agite a 250 rpm y tome la temperatura por 2 min, cada 30 s para asegurarse de que el peróxido

está atemperatura ambiente. 5. Mezcle 0.50 g de levadura para hornear con 5 mL de solución buffer pH 7.00 y 10 mL de agua 6. Adicione esta solución al calorimetro, cierre el calorimetro y mida la temperatura cada 30 s por 10

minutos. 7. Grafique los resultados obtenidos en el mismo plano cartesiano del anterior procedimiento Consigne los datos recogidos en una tabla como la siguiente:

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Tabla No. 1.

REACCIÓN CATALIZADA POR CATALASA REACCIÓN CATALIZADA POR NITRATO FERRICO

Tiempo (s) Temperatura (ºC) Tiempo (s) Temperatura (ºC)








PREGUNTAS Y EJERCICIOS 1. Con los datos recolectados en la tabla 1 construya una grafica en papel milimetrado de

temperatura (ºC) vs. Tiempo (s) para la reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno catalizada por la catalasa y el nitrato férrico, construya las dos graficas en el mismo plano cartesiano.

2. De la gráfica anterior, ¿Cuál de las dos reacciones es más rápida y por qué?

3. ¿Qué otros cofactores conoce a nivel biológico, en qué reacciones intervienen y que papel desempeñan?

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4. ¿Qué le sucede a una enzima si no está acompañada de un cofactor?

5. ¿Cómo podría mejorar está práctica de laboratorio?



QÜÍZ DE ENTRADA

PUNTAJE

TOTAL


2,5

TOTAL 2,5

PRE-INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,5


(0 puntos)


(0,25 puntos)


(0,5 puntos)

0,5




(0,5 puntos)



1




(0,75 puntos)




1,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)






1,5

TOTAL 5

INFORME


TOTAL




(0 puntos)



puntos)


0,2

TÍTULO El título no corresponde a Tien un título, pero es El título representa la

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la práctica o no tiene título (0 puntos)

demasiado general (0,1 puntos)

práctica d elaboratorio (0,2 puntos)

0,2




(0,25 puntos)



(0,5 puntos)

0,5




(0,25 puntos)




0,5

PROCEDIMIENTO


en ésta (0 puntos)






0,5


datos (0 puntos)




títulos (1 puntos)

1



(0 puntos)



Se presentan reacciones y cálculos completos

(1 puntos) 1




(0,3 puntos)



0,6





(1,5 puntos)


(2,5 puntos) 2,5

CONCLUSIONES






(1 puntos)

1



(0 puntos)



Presenta preguntas y ejercicios en su totalidad

(1,5 puntos) 1,5


(0 puntos)





0,5

TOTAL 10

Retroalimentación


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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Generales

David L. Nelson, Michael M. Cox, Claudi M.Cuchillo. (2005). Lehninger - Principios de

Bioquímica. Cuarta edición. Editorial Omega.

Horton, Moran, Scrimgeour, Perry, R. Principios de Bioquímica, 4ª Edición. Pág. 11 y 12. Pearson, México 2008.

Koolman, J., & Roehm, K.-H. (2005). Color Atlas of Biochemistry. Second edition. New York: Thieme.

Boyer R. Modern Experimental Biochemistry. (2000).Third edition. Benjamin Cummings.

Práctica 1: Extracción de ADN de tejidos vegetales y animales

López-Valentín, D., Pulido-Cordoba, L., & Chavez-Reyes, A. (2012). An Easy Way To Distinguish DNA from Protein: An Experiment for General Chemistry. Journal of Chemical Education, 89(10), 1333–1335. doi:10.1021/ed200686e

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Práctica 2: Efecto hipercrómico del ADN

Boyer R. Modern Experimental Biochemistry. (2000).Third edition. Benjamin Cummings. Pág. 399-414

Práctica 3: Fuente de ROS en alimentos: Determinación de peróxidos en aceites

vegetales.

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Práctica 4: Capacidad antioxidante de algunos alimentos

Wieczorek, R. R., Sommer, K., Chemie, D. D., & Bochum, R. (2011). Demonstrating the Antioxidative Capacity of Substances with Lightsticks, 88(4).

Práctica 5: Determinación del contenido de fenoles en muestras naturales por la

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Panzarasa, G., Sparnacci, K., Michel, V. T., Orientale, P., & Avogadro, A. (2012). Glowing Teacup Demonstration: Trautz−Schorigin Reaction of Natural Polyphenols.

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Práctica 6: Actividad catalítica: Importancia de los cofactores Marzzacco C. 1999. The Enthalpy of Decomposition of Hydrogen Peroxide: A General Chemistry Calorimetry Experiment. Journal of Chemical Education. V.76(11). P. 1517-1518.

guia laboratorio reacciones quimicas naturales-20141 (1)

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