UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

GUA DE PRCTICA BIOQUMICA APLICADA

AUTORES:Dr. Ing. Ral Omar Gallegos JaraIng. Marcia Juana Quequezana BedregalIng. Karina Moran MedinaMg. Liz Andrea Gutierrez QuequezanaMg. Jakeline Zanabria Galvez

AREQUIPA PER

2012

9

PROLOGO

Se ha desarrollado la presente Gua de Prctica con el objeto de hacer llegar al interesado los alcances actuales de la bioqumica aplicada en el laboratorio.Los agigantados pasos del avance del conocimiento humano tienen como base el desarrollo de la biologa molecular, lo que a su vez ha generado el desarrollo de la bioqumica como consecuencia natural.La aplicacin de los nuevos conocimientos de la bioqumica han determinado el gran impulso que la bioqumica aplicada ha dado a la nueva tecnologa de los bioprocesos.Todos los avances de la biotecnologa tienen como sustento el conocimiento previo de la biologa y de la bioqumica aplicada.La presente Gua de Prcticas brinda a los estudiantes de Ingeniera Qumica las destrezas bsicas para el empleo de los diferentes instrumentos requeridos para el estudio prctico de la bioqumica.

Los AutoresNDICE

PROLOGONDICEPRCTICA 1:DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS.PRCTICA 2:CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DILISIS.PRCTICA 3:DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHL.PRCTICA 4:SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOS.PRCTICA 5:REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS.PRCTICA 6:DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS.PRCTICA 7:METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIN.PRCTICA 8:INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR Saccharomyces cerevisiae INMOVILIZADA.PRCTICA 9:EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALES.PRCTICA 10:DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASA.PRCTICA 11:CINETICA ENZIMATICA EN UREASA.PRCTICA 12:EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLO.

PRCTICA 1

DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE PROTENAS

I. OBJETIVODeterminar la concentracin de una solucin de protenas mediante la reaccin de Biuret y el espectrofotmetroII. FUNDAMENTO:

La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo Biuret contiene CuSO4 en solucin alcalina. La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu (+2) y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

Los compuestos que contienen 2 o ms enlaces peptdicos producen un color violeta Caracterstico con soluciones diluidas de sulfato de cobre (CuSO4) en solucin alcalina. El color se debe al compuesto de coordinacin formado al existir enlaces qumicos entre los pares de electrones libres del tomo de nitrgeno presente en los enlaces peptdicos de las cadenas proteicas con el ion cobre.

Los espectros de absorcin de los complejos entre los iones de Cu+2 y las diferentes protenas son similares pero no idnticas por lo tanto, se puede utilizar una protena como patrn de calibracin. La curva de calibracin obtenida por este mtodo, se har utilizando como patrn solucin de peptona, cuya concentracin es de 8 mg/mL preparada con agua destilada.

Espectrofotometra. Principios bsicos La reaccin de biuret es cuantificable, es decir a mayor concentracin de protenas, mayor intensidad de color violeta, estas reacciones en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimtricas.

Midiendo la intensidad de color se podra conocer la concentracin de la sustancia que lo produce. Para ello se aplican tcnicas fotomtricas, empleando un aparato llamado colormetro (si mide slo un determinado color) o espectrofotmetro (si realiza una medida de todo el espectro de colores).La luz es parte de la radiacin electromagntica, que se propaga de forma ondulatoria. Las distintas radiaciones luminosas se diferencian unas de otras por sus longitudes de onda que se mide en nm. La luz visible engloba las radiaciones comprendidas entre 380-750 nm, que corresponden a los colores del arcoris, de tal forma que cada color corresponde a una radiacin con una longitud de onda especfica. El espectrofotmetro dispone de una lmpara que emite luz monocromtica, de una longitud de onda determinada, que incide y atraviesa la muestra coloreada a medir, y de un detector, que medir la cantidad de luz que no es absorbida por la muestra. Para cada sustancia determinada, se utilizar la radiacin de longitud de onda a la que absorba ms cantidad de luz (a la longitud de onda de mxima absorbancia).

Su funcionamiento se basa en la ley de Beer-Lambert: la fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre luz incidente (Io) y la reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absorbida por la muestra. Esto es lo que se denomina Absorbancia (Abs) Densidad ptica (DO)

La ley de Beer-Lambert se formula como:

Abs (DO) =e x C x 1

Siendo e el coeficiente de extincin molar (especfico para cada sustancia a una longitud de onda y en unas condiciones determinadas (M-1, cm-1), C es la concentracin de la muestra a medir (M), 1 el espesor de la muestra. La mayora de los espectrofotmetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor, por lo que 1 se puede ignorar. As la concentracin desconocida de la sustancia ser:

C = Abs /e

III. MATERIALES Y EQUIPO Espectrofotmetro Gradilla para tubos de ensayo Tubos de ensayo Vasos de precipitado Probetas, Pipetas Materiales: peptona, reactivo biuretIV. PROCEDIMIENTORealizacin de una curva patrn: Como se desconoce el coeficiente de extincin molar () de las protenas coloreadas con el reactivo biuret, se proceder a construir una curva patrn, midiendo la absorbancia de soluciones con concentraciones conocidas de protena, para sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin problema y determinar su concentracin grficamente y tambin por regresin lineal. Para ello se dispone de una solucin de 10 mg/ml de protena (peptona) a partir de ella se realizan diluciones conocidas aplicando la frmula:

Ci x Vi = Cf x VfDonde:Ci = concentracin de la solucin madre inicialVi = volumen a tomar de la solucin madre inicialCf= concentracin final de la solucin a prepararVf= volumen total final de la solucin a prepararEn 8 tubos de ensayo se preparan, a partir de la solucin madre (Ci=10 mg/ml) las soluciones de la tabla.

Conc.Fnal.Sol.a prepararVolumen Sol. Madre inicialVolumen aguaVolumen Rx.BiuretVolumen Final Abs 570nm

TuboMg/mlmlmlmlml

Blanco00,04,048

10,53,548

21,03,048

31,52,548

42,02,048

52,51,548

63,01,048

73,50,548

84,00,048

Muestra4,00,048

Al aadir el reactivo biuret dejar reposar 10 minutos y leer la absorbancia.Medicin de la absorbancia en el espectrofotmetro:a) Seleccionar la longitud de onda, 570 nm ( longitud de mxima absorbancia para la reaccin del biuret)b) Poner en la cubeta del espectrofotmetro el contenido del tubo blanco, secarla y limpiarla bien por fuera e introducirla en el espectrofotmetro.c) Ajustar la lectura a 100 de transmitancia y 0 de absorbancia.d) Se devuelve el contenido al tubo original y se mide la absorbancia de las soluciones de los otros tubos, comenzando por el de menor concentracin.e) Limpiar con agua la cubeta, secarla por fuera y medir la Abs del tubo muestra.f) Con las medidas obtenidas de los tubos 1 al 8 y el blanco (Abs=0), se construye una recta en papel milimetrado, representando las concentraciones en el eje de abscisas y las Abs. en las ordenadas.g) Interpolar la Abs de la protena problema en la grfica y calcular su concentracin.h) Considerando que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin y que la relacin es lineal: Y = a + b X (Y = A + B x Conc.). Utilizando regresin lineal se obtiene el valor de los coeficientes A y B y se puede despejar concentracin que en este caso es de la muestra desconocida.

V. CUESTIONARIO5.1 Cul es la concentracin de protenas de la muestra?

5.2 Se podra determinar la concentracin de cualquier muestra de protenas con esta curva patrn?

5.3 Los aminocidos y los dipptidos daran positiva la reaccin del Biuret?

5.4 Investigue si existe alguna protena en la que no este presente ninguna aminocido con anillo bencnico en su cadena lateral, e indique que consecuencias tendra sobre la determinacin espectrofotomtrica

VI. OBSERVACIONES__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII. CONCLUSIONES__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VIII. BIBLIOGRAFA______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRCTICA 2

CONCENTRACIN DE EXTRACTOS PROTEICOS POR DILISISI. OBJETIVOAumentar la concentracin de las protenas en un extracto o solucin que las contenga.II. FUNDAMENTOLa dilisis es una tcnica que separa las molculas de acuerdo a su tamao usando membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones menores que las macromolculas que se deseen separar como las protenas, los poros permiten la difusin de las molculas de solventes, sales y otras molculas pequeas, pero bloquean el paso de protenas por su gran tamao.Se usan membranas de celofn (acetato de celulosa), nitrocelulosa, colodin, u otras de naturaleza semipermeable.Los mecanismos de transporte son: osmosis, y difusin por diferencia de concentracin.III. MATERIALES Y EQUIPOS 01 pliego de papel celofn. 1Kg de azcar. Solucin de extracto proteico al 0.5%. Pipeta de 10 ml. Vaso de precipitados. Piceta.IV. MTODO Preparar una bolsa con el papel celofn, de modo que no se presenten fugas al llenarla con una solucin. Preparar en el vaso de precipitados 50 ml de una solucin de protena al 0.5%. Comprobar la concentracin de protena con el espectrofotmetro a 280 nm. Llenar la bolsa de celofn con 50 ml de solucin proteica, usando para tal fin la pipeta de 10 ml., y sellar luego la bolsa de modo que no presente fugas. Preparar un tazn con azcar, y colocar all la bolsa de celofn conteniendo la solucin proteica. Untar toda la bolsa de celofn, con el azcar, cubrindola por completo. Esperar 15 a 30 min y retirar la bolsa del azcar, observando los cambios ocurridos. Medir el volumen de lquido que qued en la bolsa de celofn y comparar con el volumen inicial. Mediar nuevamente la concentracin de protenas en el espectrofotmetro a 280 nm.V. CUESTIONARIOSeale las principales tcnicas de separacin de solutos por membrana, y las principales aplicaciones de cada una de ellas.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Investigue la composicin qumica de la membrana utilizada y explicar las razones de su porosidad.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Efecte los clculos de variacin en el volumen y la concentracin de la protena en solucin.

Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de solventes por osmosis._____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Indique el principio y la ecuacin bsica del transporte de solutos por difusin debida a diferencias de concentracin.___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI. OBSERVACIONES__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII. CONCLUSIONES__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VIII. BIBLIOGRAFA_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRCTICA 3

DETERMINACIN DE PROTENAS POR MICRO-KJELDAHLI. OBJETIVO.Determinar indirectamente el contenido de protenas totales en una muestra desconocida.II. FUNDAMENTOEl mtodo de micro-kjeldahl es una simplificacin hecha por HACH en el proceso Kjeldahl tradicional. Realizando el mismo anlisis en un tiempo corto y con pequeas muestras.Se funda en la transformacin del nitrgeno presente en las protenas a nitrgeno inorgnico. Para ello se siguen tres etapas claramente diferenciadas1. En la primera, se digiere el material por accin del cido sulfrico en presencia de oxidantes fuertes (peroxido de hidrgeno), de esta manera todo el carbono presente se libera como CO2 y nitrgeno como NH3, luego este se combina con el exceso de cido sulfrico para dar sulfato de amonio.2. En la segunda se destila el amonio, previamente liberado por la accin de un lcali fuerte Na(OH), el amoniaco liberado se recibe en una solucin de cido dbil en presencia de colorante indicador.3. En la tercera se titula la solucin con un cido fuerte cuantificando el nitrgeno presente.Luego se aplica la relacin siguiente:%N = ml.N.fc.meq.100peso de muestra donde: ml.N.fc.meq = peso de nitrgeno en la muestraml = gasto de cido sulfrico en la titulacin (ml)N. normalidad del cidoFc. Factor de correccin del cidomeq.= peso del miliequivalente del nitrgenoSuponiendo que la muestra solo contiene protenas simples con 16% de N, el porcentaje de protenas ser:Protena = 6.25xNIII. PROCEDIMIENTOEl proceso de determinacin se hace en tres etapas:

DIGESTIN. Medir 4 ml de muestra liquida (o 0.25 g si es slido) y colocar en el matraz de digestin Agregar 4 ml de cido sulfrico concentrado al matraz Verificar que el control automtico del digestor este en 440C y que haya succin en la columna de fraccionamiento. Digerir la muestra por 4 min despus de haber alcanzado la temperatura indicada. Aadir 10 ml de peroxido de hidrgeno al 50% a la muestra a travs de un embudo de la columna de fraccionamiento. Si el digesto no se torna incoloro, aadir porciones adicionales de 5 ml hasta que el digesto se aclare. Retirar el matraz del calentador y dejarlo enfriar. Quitar la columna de fraccionamiento, y colocar el matraz sobre un bloque y tapar hasta que se haya enfriado. Diluir el digesto con 50 ml de agua destilada.DESTILACIN El digesto obtenido y diluido a 50 ml se traslada a un baln de destilacin. Preparar un vaso de 100 ml que contenga 12.5 ml de cido borrico al 4% ( en volumen) adicionndole indicador azul de metileno y rojo de metilo, dando una coloracin violeta. El baln de destilacin que contiene el digesto se aade 13 a 15 ml de hidrxido de sodio al 50% v/v y 2 a 3 granallas de zinc. Conectar el equipo de destilacin y destilar el digesto durante unos 10 a 20 min (hasta que el vaso receptor tenga una coloracin verdusca y su volumen sea mas o menos 3 veces del volumen inicial)TITILACIN. Preparar una solucin de cido sulfrico 0.1 N y valorizarla. Titular el contenido del matraz receptor hasta que vire de verde a violetaIV. CUESTIONARIOExplique la diferencia entre protenas simples y conjugadas.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Indique ejemplos y estructuras primarias de dos protenas simples y dos protenas conjugadas

Escriba las ecuaciones de las reacciones de cada una de las etapas durante el proceso de determinacin del nitrgeno

Efectu los clculos y determine el contenido de protenas en la muestra

Indique que tipo de enlaces de una protena se rompen durante la etapa de digestin

Explique el objetivo de la etapa de destilacin._________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Explique porque la titilacin se hace con cido sulfrico y no con un lcali._________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________V. OBSERVACIONES______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI. CONCLUSIONES_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII. BIBLIOGRAFA

PRCTICA 4

SEPARACIN EN CAPA FINA DE UNA MEZCLA DE AMINOCIDOSI. OBJETIVO:Aplicar la tcnica de cromatografa en capa fina para la identificacin de aminocidos presentes en una muestra biolgica.II. FUNDAMENTO TERICO:AMINOCIDOSLos aminocidos son las unidades estructurales de las protenas.Por lo tanto, si a una determinada protena se le somete a una hidrlisis ya sea cida o alcalina; ste proceso rendir una mezcla de sus aminocidos constituyentes, los cuales pueden ser susceptibles de ser analizados o identificados por mtodos cromatogrficos. Todas las protenas son polmeros y los monmeros que se cambian para formarlos son los a -aminocidos.

Los diferentes aminocidos se diferencian por sus cadenas laterales. In vivo el pH fisiolgico es prximo a la neutralidad. El pKa de los grupos carboxlo y amino de los alfa -aminocidos es aproximadamente 2 y 10 respectivamente. Por lo tanto, en la proximidad del pH neutro, el grupo carboxilato habr perdido un protn y el grupo amino habr captado un protn para dar la forma ZWITTERION. En los genes, de todos los organismos estn codificados 20 aminocidos que se incorporan a las protenas. Todos los aminocidos son enantimeros (L) Existen otros aminocidos (no proteicos) y tambin hay aminocidos modificados que se hallan en las protenas. La variedad de las cadenas laterales (hidroflicas, hidrfobas, cidas, bsicas, neutras) permite una gran complejidad funcional en las protenas.CROMATOGRAFA Mtodo de Separacin Permite separar, aislar e identificar componentes estrechamente relacionados presentes en mezclas complejas. En estos mtodos se emplea:- Fase estacionaria: Slido/lquido- Fase mvil: liquido/gas Los componentes de una mezcla se transportan a travs de una fase estacionaria por medio de una fase mvil que fluye. Las separaciones se basan en las diferencias de velocidad de migracin entre los componentes de la muestra.Cromatografa en Capa Fina Tiene 2 partes: Fase mvil y Fase estacionaria. El soporte o Fase Estacionaria.Es un slido poroso capaz de retener solvente y slido pueden ser.

El soporte poroso est adherido a la base, est pegado gracias a la presencia de SO4Ca que ayuda a pagar el soporte.En las leyendas de las placas de slica se encuentran como:

El ZnS bajo luz UV la placa de silica gel se torna verde y si hay alguna marcha de la migracin de muestra o estndares esta marcha ya no es verde sino violeta.III. PROCEDIMIENTO:Primer Proceso: Sembrado de la muestra Se siembra los estndares y la muestra con un capilar bastante fino. Tener precaucin de que en el sembrado se intenta tener una mancha entre 1 y 2 mm de dimetro. La distancia entre las siembras puede ser no menor de 6-7mm aproximadamente.Segundo Proceso: Elusin Una vez sembrada la muestra se procede a la fase mvil con la ayuda de un solvente de elusin. Para ello se coloca dentro de una cmara de elusin

El solvente debe estar por debajo del sembrado de la muestra. El solvente comienza a subir por capilaridad. Las muestras se comportan diferente segn el solvente utilizado y sus componentes algunos migrarn rpidamente otros no.Tercer Proceso: Visualizacin o ReveladoEl producto puede verse: Por s mismo porque tiene color. Por incidencia de UV (254 nm/365 nm) porque no se ve a simple vista. Utilizando vapores de iodo, el iodo se impregna donde est la mancha dando coloraciones amarillas profundas. Usando mtodos qumicos, usando una sustancia qumica como revelado, ( en este caso ninhidrina en butanol)Cuarto Proceso: Reporte de los Resultados

Se describe la trayectoria de un soluto particular en funcin de su factor de retardo RF que se define como:

La distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia patrn en idnticas condiciones.La razn de estas distancias se designa por Rstd IV. PARTE EXPERIMENTAL: Sembrado de estndares de aminocidos y muestras Corrida cromatogrfica. ElusinMezcla solvente entre fenol: agua (75:25)Tapar hermticamente y dejar que proceda el desarrollo de la separacin cromatogrfica, hasta que el solvente haya alcanzado el frente trazado en la parte superior de la placa. Revelado del cromatograma Una vez que haya alcanzado el frente del solvente. Destapar la cmara y retirar con cuidado la placa de vidrio. - Secar la placa con ayuda de una secadora de cabello. Con la ayuda de un spray aplicar Ninhidrina 0.1% en butanol sobre la placa. Secar la placa con una secadora. IdentificacinLuego proceder a identificar las manchas existentes que debern corresponder a aminocidos para ello se debern hacer los clculos de los Rfde los estndares y luego los Rf correspondientes a las manchas de las muestras.Rx. Ninhidrina es la reaccin que identifica aminocidos a travs de una coloracin azul violeta.V. CUESTIONARIO:5.1. Haga un esquema de los resultados observados.

5.2. Calcular los Rf de los estndares y muestras.

5.3. Identificar que aminocidos estn presentes en las muestras problemas.

5.4.

5.5. Qu es la cromatografa de exclusin molecular y la cromatografa de intercambio inico y cules son sus aplicaciones._________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________5.6. Qu mtodos existen para el anlisis de aminocidos de las protenas._____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________5.7. Indicar tipos de solventes de elusin para la fase mvil tanto para silica y almina. _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________5.8. Haga el mecanismo de reaccin de la Ninhidrina con los aminocidos.

5.9. La cromatografa en capa fina separa las sustancias segn su peso molecular.? Fundamente._____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI. OBSERVACIONES_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII. CONCLUSIONES______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

VIII. BIBLIOGRAFA__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRCTICA 5

REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOSI. OBJETIVOS: Reconocer los principios inmediatos de los carbohidratos. Diferenciar experimentalmente monosacridos, disacridos y polisacridos. Familiarizarse con la clasificacin de los hidratos de carbono en reductores y no reductores. Estudiar las propiedades del almidn. II. FUNDAMENTO TERICO:Se denominan carbohidratos o glucsidos los derivados aldehdicoscetnicos, reales o potenciales de alcoholes polivalentes o sus productos de condensacin segn la cantidad de glucsidos o azcares sencillos que se obtengan por hidrlisis de los policarbohidratos.Se les clasifica como:Polisacridos (celulosa, almidn)Trisacridos (rafinosa)Disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa), y MonosacridosLos monosacridos por el grupo carbonilco pueden ser aldosas o cetosas por el. nmero de tomos de oxigeno, pueden ser hexoaas (glucosa, galactona, manosa, fructosa), pentosa (arabinosa, xilosa, ribosa, lixosa), terrosas (treosa y eritrosa).Los carbohidratos poseen algunas propiedades de las funciones carbonilo y oxhidrilo y, adems, algunas especficas. Todos son ptimamente activos. Por el calor y la accin de cidos fuertes se deshidratan, dando en algunos casos derivados del furfural.Los hidratos de carbono ms abundantes de la bisfera estn constituidos por el almidn y celulosa que son polmeros de glucosa presentes en plantas.El almidn est distribuido ampliamente en las plantas que lo almacenan en granos y en tubrculos como reserva alimenticia para el momento de la germinacin. Todos los tipos de almidn producen un color azul con el yodo, lo cual sirve de indicador cualitativo sensible, tanto para ensayar el yodo como el almidn.La hidrlisis del almidn catalizada por cidos lo convierte en varias clases de dextrinas, en maltosa y por ltimo en D (+) glucosa.El ensayo con yodo se utiliza para seguir la marcha de la hidrlisis puesto que la coloracin va cambiando de azul a rojo a medida que decrece el peso molecular delcompuesto orgnico.Los grupos funcionales existentes en el almidn y en la celulosa son los grupos hidroxilo y acetal. Estos polisacridos tienen diferente configuracin, siendo el almidn un glucsido y la celulosa un f -glucsido. Tambin difieren en el tamao teniendo lacelulosa un peso molecular medio mucho mayor que el del almidn.III. MATERIALES Y REACTIVOS Reactivo Molisch Reactivo Fehling Reactivo Tollens Reactivo Seliwanoff Reactivo Barfoed Sol. glucosa 1% Sol. fructuosa 1% Sol. sacarosa 1 Sol. lactosa 1% Sol. almidn 1% Sol. sacarosa 5% Sol. HCl10% Sol. NaOH 10% Sol. yodo - yodurado Tubos de ensayo Pipetas Bao de agua hirviente Pinzas Bao hirviente Vaso de precipitados Luna de reloj

IV. PROCEDIMIENTO:Reacciones genricas de los carbohidratos Reaccin de MolischEn 6 tubos de ensayo ponga respectivamente 1 ml. de una solucin de glucosa al1%, 1 ml. de solucin de fructuosa o levulosa al 1%, 1 ml. de una solucin de sacarosa al 1%, 1 ml. de una solucin de lactosa al 1%, 1 ml. de una solucin de almidn al 1% y en el ltimo 1 ml. de agua (testigo). A cada una agrguele 2 gotasde reactivo de Molisch; inclinando el tubo, deje resbalar por las paredes 2 ml. de cido sulfrico concentrado.Observe el color violceo del anillo formado en la interfase entre los dos lquidos. Anote aquellas soluciones que den positiva la prueba.Reacciones Especficas Reacciones de FehlingEn 5 tubos de ensayo mezclar en cada uno 0.5 ml. de solucin A de Fehling con 0.5 ml. de la solucin B de Fehling, agrgueles 1 ml. de la solucin de los carbohidratos utilizados en el experimento anterior.Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay cambios de color, formacin de precipitados.

Reaccin de TollensEn 5 tubos de ensayo colocar a cada uno 1. ml. de Reactivo de Tollens recientemente preparado, aadir a cada uno 2 ml. de las soluciones de carbohidratos utilizados anteriormente.Introducir los tubos en un bao hirviente, observe si hay formacin de espejo de plata y cuales carbohidratos dan negativa esta reaccin.Realice una comparacin de estos resultados con los de la prueba de Fehling. Reaccin de SeliwanoffEn 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Seliwanoff, luego aada 3 gotas de solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego lleve los tubos a bao hirviente. Anote el tiempo en que se colorea cadaa tubo y el color adquirido. Reaccin de BarfoedEn 5 tubos de ensayo coloque 1 ml. del reactivo Bartoed luego aada 1 ml. de solucin de los carbohidratos utilizados anteriormente, luego llevar los tubos a bao hirviente y observar la formacin de un precipitado de color rojo ladrillo, lo que indicar la presencia de monosacridos.Los disacridos tambin precipitan xido cuproso, pero muy lentamente. Hidrlisis de la SacarosaEn 3 tubos de ensayo coloque 5 ml. de solucin de sacarosa al 5%, llvelos a bao hirviente y a cada tubo aada volmenes iguales de agua para el primer tubo, cido clorhdrico al 10% en el segundo tubo, e hidrxido sdico acuoso al 10% en el tercero.Calentar los tubos durante cinco minutos y ensaye a continuacin la reaccin de una porcin de cada mezcla con la solucin de Fehling. Qu conclusiones deduce? Ensayo del Almidn frente al IodoEn un tubo de ensayo coloque 6 ml de solucin de almidn al 1%, aada una gota de solucin de Iodo - lodurada, observe el color de la solucin. Luego caliente la solucin coloreada a ebullicin y observe el efecto, observe tambin qu efecto produce el enfriamiento de la solucin. Hidrlisis del AlmidnEn un vaso de precipitados coloque 50 ml de solucin de almidn al 1%, aada 1 ml de cido dorhdrico concentrado. Hierva la solucin y retire muestras de Y ml. a intervalos prximos, ensayando su reaccin frente al iodo. Anote el color en los diferentes ensayos.Cuando la solucin ya no produzca coloracin con el iodo, neutralcela y ensaye la reaccin de una muestra frente al Fehling. Formule estructuralmente los productos finales de la hidrlisis del almidn (un disacrido y un monosacrido).

V. CUESTIONARIO:5.1. Indique la composicin de los reactivos utilizados en la prctica (R. Molish, R. Seliwanoff, R Barfoed, R Fehling).

5.2. Elabore un diagrama de flujos del proceso de produccin de la glucosa a nivel industrial.

5.3. A qu se debe la coloracin azul del iodo sobre las muestras de almidn?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________5.4. Cmo se utiliza el ensayo del iodo para seguir la hidrlisis del almidn?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI. OBSERVACIONES___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII. CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VIII. BIBLIOGRAFA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRCTICA 6

DETERMINACIN DE LAS PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENASI. OBJETIVOS:Al trmino de esta prctica, el alumno ser capaz de describir y demostrar de manera cualitativa las propiedades qumicas de las protenas en base a los siguientes aspectos:Solubilidad de las protenas.Las propiedades electroqumicas de las protenas.El efecto cido-bsico en la solubilidad de las protenas.II. PRERREQUISITOS:1. Salting In y Salting Out.2. Agentes precipitantes de protenas.3. Propiedades fisicoqumicas del agua.4. Ecuacin de Henderson-Hasselbach.III. INTRODUCCIN:Se considera a las protenas como polmeros biolgicos de aminocidos. En las protenas existen 20 tipos de aminocidos diferentes los cuales estn en un nmero y secuencia determinados por el cdigo gentico.Con respecto a su tamao, las protenas van desde un peso molecular de 6000 Dalton hasta varios millones de Dalton con una considerable variacin de formas y estructuras. Para su estudio se consideran cuatro niveles de complejidad estructural; siendo la ms simple la estructura primaria y la ms compleja la estructura cuaternaria cuya conformacin depende de diferentes fuerzas qumicas de atraccin y repulsin que son ejercidas sobre la estructura molecular de la protena y por lo tanto son responsables de su estabilidad.Por convencin se acepta dividir a las protenas en dos grupos: protenas simples y conjugadas, las cuales presentan diferencias en sus propiedades qumicas y fsicas. Sin embargo, para los fines que se persiguen en esta prctica se les mencionara en forma general.Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son: La fuerza inica del medio, el pH. la temperatura y la constante dielctrica del solvente. Cuando hay un cambio de cualquiera de estos factores, la protena responde con una intensidad proporcional al cambio, esto es, que puede afectar la estructura proteica de una manera superficial o lo hace tan drsticamente que desnaturaliza a la protena. Por fortuna, en nuestro organismo, la variacin de tales factores es mnima por lo que son imperceptibles los cambios en la protena.IV. MATERIAL:13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm1 pipeta de 10 ml5 pipetas de 5 ml1 pipeta de 5 ml1 gradillaV. METODOLOGA:En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en protenas que se encuentran en el organismo, mediante la modificacin las propiedades de los solventes, para establecer una relacin con los efectos que se pueden presentar en el organismo.Fundamento Qumico:Las protenas poseen cargas positivas y negativas dependiendo del pH de la solucin en la cual se encuentran; cuando se neutralizan, se presenta precipitacin proteica. La adicin de una sal a una solucin proteica modifica la constante dielctrica del solvente permitiendo una mayor solubilidad de la protena. Sin embargo, cuando se aade exceso de una sal, se neutralizan las cargas de la protena y sta tiende a precipitar. Este mismo efecto ocurre al aadir sales metlicas cargadas electropositivamente. Con la adicin de un cido o una base a una solucin proteica se alcanza un estado en que hay el mismo nmero de aniones que de cationes. Este efecto, neutraliza la carga de la protena y tiende a precipitar. El pH que determina el nmero igual de cargas de signos opuestos se denomina punto isoelctrico.Experimento No. 1Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.Preparar una solucin de caseinato de sodio, tomando 250 mg de casena, 20 mLde agua destilada y 5 mL de NaOH 1N. Cuando la solucin sea perfecta, se agregan 5 mL de cido actico 1 N. Mezclar bien, diluir a 50 mL con agua destilada. Si la solucin no est suficientemente clara, se puede filtrar. Preparar los siguientes tuboscomo se indica a continuacin

TubopHAgua destiladaAc. Acetico 0.01NAc. Acetico 0.1Ac. Acetico 1.0NCaseinato de Sodio

18.380.62001.0

27.751.25001.0

38.7500.2501.0

48.500.501.0

58.001.001.0

67.002.001.0

75.004.001.0

81.008.001.0

97.4001.61.0

105.8003.21.0

Mezclar bien , esperar 30 minutos y observar los cambios que presente la solubilidad de la casena en cada tubo. Reportar el punto isoelctrico correspondiente al tubo donde se presenta la mayor precipitacin.Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Hendersosn-Hasselbach. Experimento No. 1Determinacin del punto Isoelctrico de la casena por adicin de un cido.TubopHSolubilidad

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Cul es el punto isoelctrico de la protena ?____________________________________________________________________VI. CUESTIONARIO:6.1. De qu factores depende la solubilidad de una protena en el agua.___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________6.2. Explique en trminos fisicoqumicos el efecto que provoca la adicin de un cido o una base fuerte.___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6.3. Explique cmo afecta un cambio en la constante dielctrica del agua a la solubilidad de una protena.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________6.4. Qu es el Salting in y qu tipo de compuestos pueden promoverlo.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________6.5. Qu es el Saltingout y qu tipo de compuestos pueden promoverlo.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________6.6. Qu relacin existe entre el punto isoelctrico y la solubilidad de una protena.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________6.7. Qu es la ecuacin de Henderson-Hasselbach y en que casos est indicado utilizarse.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________6.8. Mencione que propiedades fisicoqumicas de la albmina le permiten interaccionar y transportar cualquier compuesto incluyendo hidrofbicos a travs de un medio acuoso.____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

VII. OBSERVACIONES______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VIII. CONCLUSIONES_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________IX. BIBLIOGRAFA____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRCTICA 7

METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: FERMENTACIN.I. OBJETIVOS1) Observar experimentalmente los fenmenos de respiracin celular anaerbica (fermentacin) en levaduras.2) Comprobar el efecto de inhibidores de la gliclisis y de la respiracin celular.3) Aplicar los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivos, oxido-reduccin, modificacin de pH e inhibidores en la interpretacin de sus resultados.II. ACTIVIDADESFermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin:C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2.III. PROCEDIMIENTOS.3.1. Complete la siguiente batera de tubos:

Tubos1234

Suspensin de levadura 7%1 ml1 ml1 ml1 ml

Sol. Glucosa01 ml1 ml1 ml

Sol. NaF001 ml0

Agua destilada(43C)2 ml1 ml00

Sol.Rojo Neutro0001 ml

Agitar por inversin para homogenizar el contenido de cada tubo.3.2. Tapar cada tubo con un frasco de penicilina invertido, presionndolo girar rpidamente de manera que el tubo quede invertido dentro del frasco. Marcar el nivel de la burbuja en la parte superior del tubo y amarrando con un elstico los 4 frascos, ponerlos a incubar en un bao de agua a 43C.3.3. Al cabo de 30 min. Marque el nivel final de la solucin en el tubo y mida el volumen de gas producido con una pipeta con agua.3.4. Cul es el objetivo del tubo 4? Verifique el pH en el tubo 2 con papel pH.3.5. Anote y discuta sus resultados.

Soluciones:4. Solucin de levadura: disolver a homogeneidad 7 g de levadura en 10 ml de agua destilada a 43C y completar a 100 ml con agua destilada a 43C.4. Solucin de glucosa 0,1 M4. Solucin de NaF0,1 M4. Solucin rojo neutro 0,02 MPapel pH.IV. OBSERVACIONES______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

V. CONCLUSIONES______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI. BIBLIOGRAFA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRCTICA. 8

INMOBILIZACION DE ENZIMAS Y CELULAS. PRODUCCION DE ETANOL POR SACCHAROMYCES cerevisiae INMOVILIZADA.I.- OBJETIVOS1. Inmovilizar S. cerevisiae en soporte de agar- agar.1. Obtener etanol a partir de levaduras inmovilizadas.1. Evaluar por refractometra el grado alcohlico del producto de la fermentacinII.- ACTIVIDADESFermentacin alcohlica en levaduras (Saccharomycescerevisiae).La fermentacin alcohlica en levaduras ocurre de acuerdo a la reaccin:C6H12O6 2CO2 2 C2H5OH (etanol)El etanol se acumula en el medio y el CO2 es liberado como gas, por lo que se puede medir la fermentacin por la produccin de CO2 y por la concentracin del producto formado o por la disminucin de la concentracin del sustrato (en grados Brix)

III.- MATERIALES.

Material biolgico: Levadura S. cerevisiae, mosto de uvas Reactivos: Agar-agar, solucin de glucosa 5% Material: balones, probetas, pipetas, baguetas, hipodrmicas de 20cc, esptulas, picetas, papel toalla. Equipos: Balanza, refractmetro, bao mara.

IV.- PROCEDIMIENTO

Acondicionamiento de materiales:Solubilizar la levadura comercial de panificacin en 50 ml de agua destilada. En un matraz disolver 5g de agar-agar en 250 ml de agua destilada, con calentamiento y agitacin constante.Calibrar el bao de mara a 40C, para mantener dentro del agar licuado.Colocar en una probeta de 100ml, 50ml de aceite vegetal y ponerla en refrigeracin (aproximadamente 4C), por 30 minutos.Inmovilizacin de la enzima:Mezclar 50 ml de la suspensin de levaduras y 50 ml de agar agar licuado y homogenizar.Tomar con una hipodrmica de 20 ml un volumen de la mezcla y dejar caer gota a gota en la probeta que contiene el aceite vegetal refrigerado.Repetir el paso anterior hasta agotar la mezcla.Decantar los pellets y lavarlos tres veces con agua destilada con movimientos rotatorios suaves.Secar los pellets en papel toalla.

Obtencin del mosto de uva:Obtener por prensado 50ml de mosto de uva.Filtrar con una gasa el jugo obtenido.Tomar una alcuota y leer los grados brix o porcentaje de azcar en el refractmetro.Obtencin de etanol:Colocar los pellets en un vaso de precipitados con 50ml de mosto de uva, (o 50ml de una solucin de glucosa al 5%). To0mar una alcuota, considerando la muestra a tiempo cero y leer los grados brix o porcentaje de azcar en el refractmetro.Agitar la mezcla por 45 minutos. Tomar alcuotas cada 15 minutos. Leer los grados brix en el refractmetro para cada alcuota.

V .- CUESTIONARIO.

1.-Indique la importancia de la inmovilizacin de enzimas y/o clulas.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________2- Cul es el fundamento de la inmovilizacin de levaduras en agar?.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________3.- Explique las caractersticas coagulantes del agar-agar.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________4.- Como explica que la glucosa llegue a tener contacto con las clulas de levadura, si estas estn atrapadas en la matriz de agar-agar._______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________5- Presente al menos un caso detallado de aplicacin de la inmovilizacin de enzimas.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6- Qu otros mtodos para la inmovilizacin se utilizan?________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI.- OBSERVACIONES Y COMENTARIOS ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI.- CONCLUSIONES_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VIII.- BIBLIOGRAFA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRCTICA 9

EXTRACCIN DE ENZIMAS VEGETALESI. OBJETIVO.Extraer la enzima Ureasa de la cscara de frejol y comprobar su actividad cataltica.II. FUNDAMENTO.Las enzimas son protenas con accin cataltica.Las protenas se encuentran en el interior de las clulas en un estatus particular, a pH fisiolgico, y con estructura nativa estabilizada por diversas mezclas de sustancias.La extraccin de enzimas debe realizarse de modo que conserven las caractersticas estructurales y las propiedades funcionales de las mismas.Las leguminosas son conocidas por su alta actividad uresica, debido a la enzima ureasa presente en la cscara.La enzima ureasa al actuar sobre el sustrato rea provoca la hidrlisis de esta con la consiguiente liberacin de amoniaco y anhdrido carbnico, segn la siguiente reaccin. NH2 O=C + H2O ---------- 2NH3 + CO2 NH2La actividad uresica se puede comprobar haciendo reaccionar el amoniaco liberado con el Reactivo de Nessler (K2Hg14). Este reactivo es el Yoduro doble de Mercurio y Potasio, que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino da productos de color amarillo-anaranjado (complejo cuya frmula se supone sea HgONH2I), cuya intensidad de color puede medirse a longitudes de onda de 405 a 420 nm.III. MATERIALES Y EQUIPOS 150 gr. De cubierta de frejol, solucin de rea0.3 M, agua destilada Buffer fosfato 0.005 M de pH=7.4, reactivo Nessler. Espectrofotmetro, Bao Mara, Balanza, Equipo de filtracin, papel filtro, Gradilla de tubos, 02 fiolas de 100ml,04 tubos de ensayo de 10 ml. Baln de 500ml. Vaso de precipitados de 500 ml.IV. PROCEDIMIENTO.Extraccin de la Enzima. Remojar 200 gr. De frejol en 500ml de agua destilada o (agua hervida fra) , despus de 24 horas remover la cscara por friccin, y proceder a escurrir el agua. Preparar 200 ml. De buffer fosfato de sodio 0.005 M.( PO4HNa2) , y 200ml. De solucin EDTA 0.001 M. Usando en ambos casos agua destilada fra, mezclar ambas soluciones, y enfriar a 4C. En un baln de 500 ml. Pesar 20 gr de cscara de frejol y colocarlo en un vaso de precipitados de 500 ml. Agregar 90 ml. De buffer fosfato previamente preparado, y licuar cuidando se mantenga baja la temperatura. Filtrar la mezcla con una gasa y enjuagar con 10 ml. De agua destilada. Centrifugar la suspensin a 14,000 g. Por 10 min. o pasar la solucin por un filtro rpido y enjuagar el papel filtro con 10 ml. De agua destilada. Separar el sobrenadante y medir el volumen final del extracto obtenido, llevar a refrigeracin. Preparar un cuadro de resultados.CASCARABUFFERAGUAEXTRACTOFINAL (ml)

Determinacin de presencia de protenas en el extracto por espectrofotometra.Preparar tubo blanco: tomar 4ml de agua destilada y 4 ml de reactivo biuret.Preparar tubo muestra: tomar 3 ml de extracto decantado, 1 ml de agua y 4 ml de reactivo biuret. Calibrar el espectrofotmetro y leer la absorbancia a 570 nm. Para comprobar la presencia de protenas.Anotar la lectura de Absorbancia.Comprobacin de La actividad enzimtica. Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como tubo de blanco. En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M y 1.5 ml de buffer fosfato. Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min. Agregar al tubo muestra 1.0 ml. del extracto y 4.8 ml de agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar. Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por 15 min. Despus de incubar los tubos, adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo. Volumen total 8 ml. Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente. Calibrar el espectrofotmetro a 420 nm. Medir la absorbancia. La muestra de extracto dar coloracin y un alta absorbancia por el amoniaco liberado.V. CUESTIONARIO.Explique por qu es necesario licuar la cscara durante la extraccin de la enzima ureasa.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Diga que pruebas se tienen de haber extrado realmente enzimas vegetales.__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Haga los clculos de reactivos para las soluciones que se prepararon.

Explique el papel que juegan en la extraccin el buffer fosfato y la refrigeracin.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Haga un diagrama de flujo cuantitativo del proceso de extraccin utilizado en laboratorio.

VI. OBSERVACIONES_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII. CONCLUSIONES______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VIII. BIBLIOGRAFA____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRACTICA 10

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMATICA EN UREASAI. OBJETIVODeterminar la capacidad cataltica o actividad enzimtica de la enzima ureasa.(enz. Urea-amidohidrolasa EC.3.5.1.5)II. FUNDAMENTO.La actividad enzimtica (U) es la expresin del poder cataltico de la enzima y se obtiene midiendo la velocidad de la reaccin que cataliza.La actividad enzimtica (U) se define como la cantidad de enzima contenida en 1 ml de solucin que transforma o produce 1 mg de sustrato producto por minuto medidas en las condiciones optimas de operacin de la enzima.La ureasa es una enzima que se encuentra en diversos organismos vivos, mas no en el organismo humano. Algunas fuentes comunes son las bacterias, o la cscara de frejol.La ureasa cataliza la descomposicin de la rea segn la reaccin:NH2CO+ H2O2NH3 + CO2NH2La velocidad de una reaccin enzimtica como la velocidad de cualquier reaccin puede ser determinada midiendo:1. la cantidad de sustrato transformado en un determinado tiempo de reaccin1. la cantidad de productos formados. Cualquiera de ellos.Para el caso de la reaccin catalizada por ureasa se puede hacer el ensayo midiendo la cantidad de urea en el tiempo, o midiendo cualquiera de los productos (CO2 NH3) producidos en un tiempo determinado.Por facilidad se medir la cantidad de amoniaco formado, lo cual se hace por medios espectrofotomtricos utilizando el reactivo Nessler que es un ioduro doble de mercurio y potasio que al reaccionar con el amoniaco en medio alcalino forma un complejo de color anaranjado castao.2K2HgI4 + NH3 + 3KOHHgONH2I + 7KI + 2H2OLa intensidad del color formado ser directamente proporcional a la cantidad de amoniaco presente en cada tubo y se medir la absorbancia de cada tubo a 420 nm (filtro morado).III. DESARROLLO EXPERIMENTAL.Materiales. Preparar 50 ml de solucin de urea 0.3 M. Preparar 100 ml buffer fosfato 0.05M de pH=7.4, con EDTA 0.001M Reactivo Nessler. 50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/ml en buffer fosfato pH, 7.4 ( a 4C) 100 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M (5x10-4milimoles/ml)Material de vidrio. 02 fiolas de 50 ml. 02 fiola de 100ml. 08 tubos de ensayo. 01 gradilla para tubos. 01 espectrofotmetro. bao de hielo. Incubadora a bao mara.Determinacin de la curva de calibracin.Se preparan en los tubos de ensayo soluciones de sulfato de amonio segn la tabla siguiente:

Patrn NConcentracin (NH3) mol/mlSO4(NH3)2 nmol/mlml de SO4(NH3)2Buffer (ml)Nessler (ml )Volumen final mlAbsorbancia420 nm.

Blanco000.00.07.500.58.0

15.00.017.490.58.0

2100.027.480.58.0

3150.037.470.58.0

4200.047.460.58.0

5250.057.450.58.0

6300.067.440.58.0

Con los datos obtenidos se construye la curva de equivalencia o curva de calibracin.Medida de la actividad ureasica.Preparar dos tubos de ensayo y rotular uno como tubo muestra y el otro como tubo de blanco.En ambos tubos agregar 0.2 ml de solucin de rea al 0.3 M y 1.5 ml de buffer fosfato. Llevar ambos tubos a pre-incubacin a 37C por 3 min.Agregar al tubo muestra 1.0 ml. de solucin de ureasa y 4.8 ml de agua, al tubo blanco 5.8 ml de agua, agitar suavemente, para lograr mezclar.Llevar ambos tubos a incubacin en bao mara a 37C por 15 min.Despus de incubar los tubos,Sacar el tubo de incubacin e introducir en bao de hielo para detener la reaccin. Adicionar el Reactivo Nessler a los tubos; (0.5 ml a cada tubo). Volumen total 8 ml, agitar.Dejar reposar por 4 min. Para atemperar al medio ambiente.Leer la absorbancia a 420 nm.IV. CUESTIONARIO1.- Efecte los clculos para completar los datos de la tabla.

2.- Calcule la cantidad de NH3 producido en la reaccin enzimtica.

3.- Calcule la actividad enzimtica de la solucin de ureasa en nmol de NH3 producido/min.

4.- Explique por qu durante la reaccin debe incubarse a 37C

5.- Realizar los clculos de micromoles de sulfato, amoniaco, y urea para cada tubo patrn usados en la construccin de la curva de calibracin.

6.- Encontrar la equivalencia por el clculo del factor de equivalencia y por la determinacin analtica de la ecuacin de la curva.

7.- Diga si la curva de calibracin obtenida obedece a la ley de Beer. Explique por qu.

8.- Explique por qu es necesario contar con un blanco en las determinaciones de actividad enzimtica.

9.- Explique la diferencia entre actividad enzimtica y actividad especfica.

I. OBSERVACIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________II. CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________III. BIBLIOGRAFA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

PRACTICA 11

CINETICA ENZIMATICA EN UREASAI. OBJETIVO.Verificar la variacin de la velocidad de las reacciones enzimticas con la concentracin del sustrato.II. FUNDAMENTO.La rea puede descomponerse por accin de la enzima Ureasa, para formarse amoniaco y bixido de carbono segn la siguiente ecuacin.NH2CO + H2O 2NH3 + CO2 NH2Luego el Amoniaco liberado puede ser cuantificado por espectrofotometra a = 420 nm, si previamente se le compleja con reactivo Nessler.Cintica de MichaelisMenten.La velocidad de las reacciones enzimticas varan con la concentracin del sustrato segn una cintica autosaturante que se describa por la Ec. DeMichaelis-Menten.

V = Vmax. [S] Ks + [S]La representacin grfica de tal ecuacin tiene la forma:

La ecuacin de Michaelis-Menten se puede resolver haciendo uso de la Linearizacin de Lineweaver-Burk, en cuyo caso toma la forma.

Donde los parmetros anteriores se relacionan por la ecuacin de una recta.1 = 1 + [S]vVmaxKsIII. MATERIALES Y EQUIPOSMateriales. 20 ml de solucin de sulfato de amonio al 5x10-4 M 50 ml de solucin de ureasa 0.6 mg/l. En buffer fosfato de pH=7.4, con EDTA, 0.5 nM. Agua destilada. reactivo Nessler. Bao de hielo.Equipos y material de vidrio. fiolas de 50 y 100 ml. 07 tubos de ensayo de 10 ml. 02 matraz de 100 ml. pipetas de 1, 2, 5, y 10 ml. Equipo de bao mara. 01 espectrofotmetro Espectronic 20D+ 01 termmetro de 0- 100 CIV. PROCEDIMIENTO.Preparacin de muestras. Hacer los clculos y preparar la solucin patrn de sulfato de amonio al 5x10-4 M Hacer los clculos y preparar la solucin de urea 0.3 M

Calibracin del Espectrofotmetro.A fin de transformar los valores de intensidad de color en valores de concentracin del producto formado (NH3), y por tanto de actividad de la enzima se trazar una curva de equivalencia de Densidad ptica (Abs) vs. Concentracin. Con ese fin se preparan soluciones de amoniaco de concentracin conocida, las que se neutralizan con reactivo Nessler, para obtener diversas intensidades de color. Por la dificultad del uso del NH3 se usar soluciones de sulfato de amonio. Preparar solucin madre de SO(NH4)2, al 5x10-4 M

Preparar 6 muestras que contengan de 5 a 30 nanomoles de Sulfato de Amonio, calcular las nmol de NH3 que liberan cada una y su equivalencia con nmol de rea. Completar la siguiente tabla.Tabla N 1PATRON nSol. de sulfato(ml)Contenido nmol de sulfatoContenido nmol de NH3Equivalencia en nmol de rea

150

2100

3150

4200

5250

6300

Utilizar los datos obtenidos de la curva de calibracin de la prctica anterior. Completar la siguiente tabla.Tabla N 2Muestra NVolumen de sulfato tomado ( ml)NH3 en la muestra (nmol) Absorbancia

Blanco

1

2

3

4

5

6

Construir la curva de equivalencia y encontrar la ecuacin que relaciona DO vs [NH3], haciendo los tratamientos estadsticos que sean necesarios.Pruebas cinticas. A partir de la muestra madre de urea 0.3 M. preparar 6 muestras y un blanco para completar la tabla 3 como se muestra. Preparar solucin madre de ureasa 6gr/l en buffer fosfato

Tabla N 3

TuboUreaMolUrea o.3M mlBuffer fosfato mlIncubar 37C 3 minUreasamlIncubar 37C 15 minBao hieloNesslermlReposar5 min.Volumen finalmlAbs420 nm.

Blanco007.00.50.58

1600.26.80.50.58

21200.46.60.50.58

31800.66.40.50.58

42400.86.20.50.58

53001.06.00.50.58

63601.25.80.50.58

Calcular la cantidad de NH3 formado y de urea que reacciona ( de la curva de calibracin), y completar la tabla 4

Tabla N 4Muestra[urea] en nmol/ml x10-2Densidad ptica(Abs)Nmol de NH3 producidosNmol de urea que reaccionan

10.1

21.0

33.0

44.0

55.0

66.0

Blanco-

Tratamiento de datos. Para cada muestra calcular la velocidad de reaccin mediante la relacin v = P/t, donde (p) es nmol de NH3 producidos, y (t) es el tiempo de reaccin enzimtica ( 15 min.) y completar la siguiente tabla.

Tabla 5Muestra[S] nmol/ml.1/[S]V(nmol/min.)1/v

1

2

3

4

5

6

Graficar v vs. [S], y ajustar a una curva autosaturante.

Estimar el valor de Vmax.

Graficar 1/v vs. [S] y ajustar a una lnea recta.

Determinar grficamente los valores de Vmax. Y Ks.

Escribir la ecuacin que representa a esta reaccin enzimtica.

V. OBSERVACIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VI. CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________VII. BIBLIOGRAFA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________PRACTICA 12

EXTRACCION DE ADN DE HIGADO DE POLLOI. OBJETIVOExtraer ADN de un tejido animalII. MARCO TEORICOEl ADN y ARN son biomolculas que intervienen en el almacenamiento y la transferencia de la informacin gentica. Son componentes fundamentales de la clula y constituyen en conjunto, entre el 5 y el 10% del peso seco.Normalmente no se encuentran solos sino que se hallan formando ncleo protenas, ya que suelen unirse a determinados tipos de estas, como las histonas.El ARN se localiza tanto en el citoplasma celular como en el ncleo , mitocondrias y cloroplastos, mientras que el ADN se sita fundamentalmente en el ncleo de la clula y tambin cloroplastos y mitocondrias en pequeas cantidades.Poseen una importancia manifiesta por el hecho de que ellos dirigen y llevan a cabo la sntesis de protenas, y por tanto de las enzimas necesarias para el funcionamiento celular.Por otra parte el ADN es el vehculo de la herencia que se transmite de padres a hijos de generacin en generacin.III. FUNDAMENTO:El ADN se puede aislar mediante una tcnica relativamente sencilla, consiste en primer lugar en romper las membranas celulares para liberar los ncleos, para ello se tritura el hgado de pollo en un mortero.Al aadir una solucin hipertnica, como el NaCl 2M, se produce el estallido de los ncleos, el detergente forma un complejo con las protenas y las separa del ADN, El alcohol tiene como funcin precipitar el ADN que se va agrupando para dar lugar a la formacin de unas fibras blancas visibles a simple vista, que se pueden colorear mediante un colorante selectivo para ADN como el anaranjado de acridina.

IV. MATERIALES Hgado de pollo 10 gr Cloruro de sodio 2M Etanol 96| SDS 20% Arena Varilla de vidrio vasos de precipitados Mortero Embudo Pipetas Probetas GasaV.METODOLOGA1.-Triturar 10 gr de hgado de pollo, dentro de un mortero, con la adicin de 5gr de arena lavada, para promover el rompimiento de las membranas celulares.2.-Aadir al triturado de hgado 50 ml de agua destilada hasta obtener una papilla.3.- Filtrar varias veces, en una probeta de 100 ml, logrando separar los restos de tejido que quedaron sin romper membranas.4.-Medir el volumen del filtrado final.5.-Aadir al filtrado un volumen igual de NaCl 2M., verterlo todo a un vaso de precipitados.6.-Aadir 1 ml de SDS 20%.7.-Aadir mediante una pipeta 25 a 50 ml de etanol fro, por las paredes, logrando se formen dos capas, en la interface precipita el ADN.8.- Con la ayuda de una varilla de vidrio, ir removiendo en la misma direccin tratando de hilar las fibras de ADN; sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas de ADN visibles a simple vista, que es el resultado de la agrupacin de muchas fibras de ADN.VI.CUESTIONARIO1. De qu est formada la cromatina?2. Durante la extraccin del ADN Cul es la razn de triturar el hgado?, para qu aadimos arena al triturado?3. Por qu crees que estallan los ncleos al aadir NaCl 2M?4. Qu accin tiene el ADN sobre la cromatina?5. Durante la extraccin del ADN se utiliza un detergente y etanol, con que finalidadVIII. OBSERVACIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________IX. CONCLUSIONES________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________X. BIBLIOGRAFA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________