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Guía deLaboratorioPARA DIPLOMADO EN LABORATORIO CLÍNICO

1 I Guía de Laboratorio para Diplomado en Laboratorio Clínico

Agradecimientos

Para la segunda versión de las guías de laboratoriospara el Diplomado de Laboratorio Clínico del Instituto PLERUS.

La institución extiende un agradecimiento parael Diplomado Julio Palma y el Doctor Mauricio Rodríguez, por la confección

y los demás profesionales que participaron.La edición de este documento fue realizada por la Diplomado María José Oviedo

y contó con la revisión de los siguientes expertos:Doctora María Leiva, Técnico Nicol Badilla y

Diplomado Julio Palma.

Este documento rige a partir del segundo cuatrimestre del 2020.


TABLA DE CONTENIDO

I NIVEL 4Curso: Instrumentación Clínica 5

Tema 1: Uso de equipo básico de laboratorio 5Tema 2: Uso del Microscopio 7Tema 3: Flebotomía 9

II NIVEL 11Curso: Microbiología I 12

Tema 1: Uso del microscopio y tinción de Gram 12Asignación: Omnipresencia de los microorganismos 15Tema 2: Tinciones 16Tema 3: Técnicas de cultivo 21Tema 4: Toma de muestras faríngeas y cutáneas 23Tema 5: incógnitas prueba práctica 26

Curso: Métodos de Laboratorio Clínico 26Tema 1: Flebotomía 26Tema 2: Procesamiento de muestras de orina y de heces 28Tema 3: Observación del sedimento urinario 31Tema 4: Toma de muestra de hongos 32

I- Prueba práctica 33Curso: Preparación de Reactivos Clínicos 34

Tema 1: I- Uso de la pipeta y la micropipeta. 34II- Lavado, preparación y esterilización de cristalería 35

Tema 2: Preparación y esterilización de medios de cultivo 37Tema 3: Diluciones simples y seriadas 38

III NIVEL 40Curso: Control de Calidad 41

Tema 1: Control de Calidad en Medios de Cultivo 41Tema 2: Control de calidad en Química Clínica y Hematología 42Tema 3: Control de calidad en equipos de laboratorio 44

Curso: Química Clínica I 45Tema 1: Automatización y Urianálisis 45Tema 2:

I- Uso del espectrofotómetro y conceptos de espectrofotometría 47II- Análisis de glucosa y curva de calibración 48

Tema 3: Control de Calidad y Reglas de Westgard 51Tema 4:

I- Repaso de Sedimento urinario 51II- Análisis de incógnitas 51


Curso: Hematología y Análisis Hematológico I 52Tema 1: Determinación de hematocrito y hemoglobina 52Tema 2: Realización de extendidos sanguíneos y tinción de Wright 53Tema 3:

I- Diferencial leucocitario manual 55II- Recuentos celulares en cámara de Neubauer 55

Tema 4:I- Repaso de Morfología celular 57II- Prueba practica 57

IV NIVEL 58Curso: Microbiología II 59

Tema 1: Muestras faríngeas 59Tema 2: Coprocultivos y Urocultivos 60Tema 3: Serología microbiana 61Tema 4: Antibiogramas 68Tema 5: Incógnita prueba práctica 70

Curso: Química Clínica II 71Tema 1: Factores que afectan la cinética enzimática 71Tema 2: Determinación de la curva de tolerancia a la glucosa e isoenzimas 73Tema 3: Depuración endógena de creatinina 75Tema 4: Drogas terapéuticas y de abuso 76

V NIVEL 77Curso: Serología y Banco de Sangre 78

Tema 1: Pruebas rápidas 78Tema 2: Grupos sanguíneos 79Tema 3: Prueba de Coombs Directo 81

Curso: Hematología y Análisis Hematológico II 82Tema 1: Reporte de serie roja 82Tema 2: Recuento de reticulocitos 84Tema 3: Diferencial leucocitario 85Tema 4: Serie blanca patológica 86Tema 5: Repaso de hematología y quiz 87

Curso: Parasitología Clínica 88Temas 1 y 2: Examen coproparasitológico 88Tema 3: Tinción de Ziehl-Neelsen 90Tema 4: Técnica de Baermann 92

Bibliografía 94


I Nivel


Curso: Instrumentación Clínica

Competencias 1. Identifica y reconoce la instrumentación vinculada a la realización de procedimientos en el laboratorio clínico. 2. Describe y analiza los procedimientos de manejo de desechos sólidos entre otras normas de bioseguridad.

Tema 1: Uso de equipo básico de laboratorio

Objetivo específicoReconocer el equipo básico que se utiliza en el laboratorio, así como el correcto uso del mismo.

DescripciónEn la actualidad, el ámbito de la Microbiología y la Química Clínica se caracteriza por su alto potencial tecnológico. Una gran mayoría de los exámenes que se realizan de rutina e incluso exámenes especializados se encuentran automatizados. Sin embargo, todo laboratorio debe poseer siempre materiales y equipo para realizar las pruebas de forma manual, dado a un desperfecto del equipo o a que no se cuente con uno. En algunos casos incluso, se requerirán etapas de tratamiento de las muestras previas a ser procesadas por un equipo automatizado, sin mencionar que hay muchas prácticas que, por su naturaleza, se realizan de manera estrictamente manual.

Por lo tanto, el conocimiento del uso y manipulación correctos de la cristalería básica en un laboratorio son fundamentales para cualquier persona que se desempeñe en esta área. Técnicas como la medición de volúmenes, aforado de equipo volumétrico, tarar las balanzas granatarias, evitar errores de paralaje, entre otros, determina un buen ejercicio de la práctica en laboratorio, asegurando así resultados fidedignos y de utilidad para la intervención oportuna de los pacientes.

Dentro de la cristalería principal con que se cuenta en un laboratorio están:

• Beaker: Recipientes para contener volúmenes medianos o altos de líquidos, su exactitud es bastante baja. Se utiliza cuando se pueden utilizar cantidades aproximadas del líquido a contener.

• Erlenmeyer: También se utiliza para contener volúmenes medianos o altos de líquidos en volúmenes aproximados. Además, posee la ventaja de que disminuye la pérdida de líquido por evaporación al calentarlos, además de proveer una estructura que facilita la manipulación de sustancias calientes.

• Probeta: Es un equipo alargado, cilíndrico, que permite medir volúmenes con una exactitud mayor que un beaker o un Erlenmeyer. Existen desde capaces de medir pocos mililitros hasta algunos litros. Suelen venir graduados y los más utilizados son los pequeños.


• Balones aforados: Son balones con un cuello delgado alargado con una marca con el nivel de llenado o “aforo”. Proveen una gran exactitud y se utilizan para preparar soluciones de concentración conocida (estándares) de modo que se agrega el soluto de interés y luego se disuelve hasta alcanzar el nivel de aforo.

• Pisetas: Suelen ser de plástico. Se utilizan para verter líquido en pequeñas cantidades de manera controlada mediante presión.

• Tubos de ensayo: Son tubos pequeños, de vidrio o plástico que se utilizan para contener volúmenes pequeños o para realizar reacciones. Sus usos varían grandemente según la disciplina en la que se utilicen.

Materiales• Erlenmeyer• Beakers • Balones aforados • Probetas • Pisetas• Balanza granataria • Pipetas • Peras • Tubos de ensayo

Observación1. Observe los implementos de laboratorio que se encuentran en exposición y realice los dibujos y

anotaciones que consideren importantes.

Uso de la pipeta1. Tome una pipeta y la llene hasta un nivel intermedio 2. Observe desde varias alturas para notar el error de paralaje 3. Luego proceda a verter un volumen de la manera como se describe a continuación:

a. Vacíe el globo de la pera presionando la boquilla superior.b. Coloque la pera en la pipeta.c. Coloque la pipeta dentro del agua y se llene por encima de su capacidad máxima, presionando la boquilla inferior de la pera.d. Saque la pipeta del agua y afore (llevar hasta el 0) presionando la boquilla lateral de la pera.e. Recuerde que el volumen correcto se mide en la parte inferior del menisco.f. Seque cuidadosamente la punta de la pipeta para eliminar residuos externos, sin tocar el líquido en la parte interna.g. Vierta el volumen indicado en un tubo de ensayo, teniendo cuidado nuevamente en la posición del menisco


h. Vierta el volumen indicado en un tubo de ensayo, teniendo cuidado nuevamente en la posición del menisco.

Uso de la Autoclave1. Revise que el nivel de agua sea el apropiado 2. Cerciórese que la válvula de purga y la válvula de seguridad estén cerradas 3. Ponga el material en la cámara de autoclavado 4. Cierre de forma hermética girando la manija sin dejar excesivamente tallado 5. Verifique los 15 minutos del autoclavado en el Timer 6. Ponga la autoclave en modo Esterilizar 7. Encienda el equipo y presione el botón de START 8. Una vez terminado el proceso, el equipo sonará 9. Apague el equipo y espere la descompresión total en el manómetro (indicador de presión) 10. Abra la autoclave utilizando guantes y se guarda el material listo para su uso.

Tema 2: Uso del Microscopio

Objetivo específicoReconocer las partes del microscopio y su uso, así como las fases de la tinción de Gram y el uso correcto de ambos.

DescripciónEs microscopio de luz es y ha sido la herramienta principal en el ámbito de la microbiología. Su uso abarca una gran parte de las ramas de ésta ciencia, aunque en muchas áreas su utilidad se ha ido reduciendo al implementar técnicas de mayor sensibilidad y estandarización, como las técnicas serológicas y moleculares. Sin embargo, sigue constituyendo un equipo primordial en cualquier laboratorio de microbiología y sigue proveyendo gran utilidad en diversidad de áreas como la bacteriología, micología y parasitología. Para utilizar correctamente el microscopio es necesario conocer adecuadamente sus partes y sus funciones, dado que dependiendo del tipo de microorganismo con que se esté tratando, se deberán adaptar el aumento, la luz y el condensador para tener resultados que provean una visibilidad óptima para trabajar. En el caso de las bacterias, para poder visualizarlas es necesario realizar tinciones antes de observarlas al microscopio. La tinción más común es la tinción de Gram, la cual nos va a clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas.

Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular más gruesa, lo que va a favorecer la retención del cristal violeta, por lo que, al decolorar, se mantiene la coloración morada.

Las bacterias Gram negativas poseen una pared más delgada y cubierta por una segunda membrana


celular, por lo cual el cristal violeta es fácilmente removido al decolorar con alcohol – acetona, por lo cual es necesario realizar una contra tinción con safranina o fucsina para poderlas visualizar.

Materiales• Microscopio • Tijeras • Hilos de colores• Letras de periódico• Laminas teñidas

Procedimiento1. Observe el microscopio e identifique las siguientes partes:

• Lente ocular • Lentes objetivos • Revólver • Brazo • Platina mecánica • Desplazamiento de la platina• Lente condensador • Diafragma de apertura• Macrométrico • Micrométrico • Fuente de Luz

Uso correcto del microscopio1. Se debe de conectar y encender el microscopio.2. El microscopio siempre debe de tener el lente objetivo de 4x (rojo) en la posición de uso.3. Se baja la platina completamente.4. Colocar las muestras traídas en el portaobjetos y observar al microscopio.5. Comenzar a observar con el lente de 4x(rojo) y enfocar con el macrométrico hasta observar la muestra,

una vez enfocado se pasa de lente al 10x(amarillo) y se vuelve a enfocar con el macrométrico y el micrométrico, cuando ya esté enfocado nuevamente se pasa al lente de 40x(azul) si corresponde y se enfoca con el micrométrico.

6. De ser necesario aceite de inmersión, devuélvase al lente de 4X, coloque una gota grande de aceite de inmersión y pase directo al lente de 100X (blanco), sin pasar por el de 40X. Este lente no está diseñado para soportar el aceite de inmersión y lo puede dañar. De hacerlo accidentalmente, quite el lente de 40X de la posición de trabajo y proceda a limpiarlo bien con papel para lentes.

7. Al terminar, limpie también el lente de inmersión para remover remanentes de aceite de inmersión8. Al finalizar el proceso se debe de bajar totalmente la platina, retirar la muestra de la platina.9. Se debe de limpiar con un papel para lentes el exceso de aceite en el lente de inmersión, el papel se

emplea en un solo sentido y con suavidad.


10. Se vuelve a colocar el lente de menor aumento 4x (rojo) en la posición de empleo.11. El microscopio se debe de apagar y si no se va a utilizar en un tiempo prolongado se le debe de poner

la funda para protegerlo.

Precauciones1. Trabajar sobre una superficie estable, limpia y con buena iluminación2. Nunca se debe de mover el microscopio arrastrándolo ya que se puede dañar se tiene que tomar por

el brazo del microscopio levantarlo y colocarlo en el lugar deseado.3. Nunca hay que tocar los lentes y objetivos con los dedos, si los lentes están sucios utilizar ÚNICAMENTE

papel de lente y limpiarlos en un solo sentido y con suavidad, si se limpió el de inmersión cambiar de papel para no ensuciar de aceite los otros lentes.

4. El cambio de objetivos se hace girando el revólver, nunca girarlos agarrando el tubo del objetivo.5. Se debe de mantener la platina limpia y sin ningún líquido.6. Al finalizar el uso del microscopio SIEMPRE debe de quedar limpio y con el lente 4x (rojo) en la

posición de empleo con la platina totalmente abajo y con la funda puesta.

Tema 3: Flebotomía

Objetivo específicoAplicar todas las partes de una correcta técnica para la obtención de muestras sanguíneas

DescripciónLa flebotomía o toma de muestra sanguínea es una técnica imprescindible que debe ser dominada por todo personal de laboratorio, pues de ésta manera será la obtención de la mayoría de las muestras que se procesarán.

Es un procedimiento delicado ya que es invasivo, por lo cual se debe realizar con sumo cuidado y certeza, al igual que mantener los cuidados asépticos para evitar posteriores complicaciones de los pacientes.

En las muestras sanguíneas es de gran importancia considerar los tubos que se utilizarán según las pruebas solicitadas. Así tendremos, a grandes rasgos, que el tubo rojo (sin anticoagulante, con factores promotores de la coagulación) se utilizará para obtener suero y procesar química clínica y hormonas, el tubo morado (EDTA como anticoagulante) principalmente para hematología y grupos sanguíneos, los celestes (citrato como anticoagulante) se utilizarán para pruebas de coagulación, por mencionar los principales.


Materiales• Equipo de sangrado• Tubos de muestras • Tubos morados • Simulador de brazo• Torniquete • Algodones • Alcohol • Aguja • Adaptador

Procedimiento1. Tome el brazo y coloque el torniquete fuertemente en la parte superior del mismo 2. Palpe la vena que va a punzar 3. Humedezca un algodón con alcohol al 70% y limpie el área de punción en espiral hacia afuera 4. Permita que el alcohol seque 5. Coloque la aguja en el lado afuera del adaptador y un tubo en la parte interna del mismo 6. Sin volver a palpar, realice la punción de la vena en un movimiento recto, rápido y seguro 7. Sostenga firmemente el adaptador y presione el tubo para que inicie el vacío y obtenga la muestra 8. Una vez lleno el tubo, retírelo apoyando el pulgar en el adaptador y coloque otro tubo 9. Una vez finalizado, retire el tubo, retire el torniquete y coloque un algodón seco sobre el sitio de

punción 10. Presionando suavemente el algodón, retire la aguja rápidamente y en un solo movimiento11. Indique al paciente sostener el algodón durante 5 a 10 minutos posterior a la punción.

Interpretación• El torniquete debe ser colocado fuertemente para que las venas realmente sobresalgan.• El movimiento a la hora de limpiar pretende que no se arrastre contaminación hacia el sitio de punción,

sino fuera de él.• Es necesario dejar que el alcohol seque, de lo contrario el paciente puede sentir un gran ardor a la

hora de tomar la muestra y la sangre podría hemolizar, impidiendo que se puedan realizar muchas pruebas.

• El algodón se debe sostener durante 5 a 10 minutos posterior a la punción para evitar la formación de hematomas.

Tarea:Haga un cuadro de los tubos de toma de muestra con el color y aditivo correspondiente.


II Nivel


Curso: Microbiología I

Competencias Conoce y aplica los conocimientos básicos de la microbiología, bacteriología, micología, virología, parasitología, preparación de reactivos clínicos y asistencia en los métodos de laboratorio que desarrolla el Microbiólogo demostrando una alta comprensión integral del fenómeno de la Salud permitiendo desarrollar con esto, un alto sentido de la ética profesional.

Tema 1: Uso del microscopio y tinción de Gram

Objetivo específicoReconocer las partes del microscopio y su uso, así como las fases de la tinción de Gram y el uso correcto de ambos.

DescripciónLos diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas ellas pueden verse, algunas a simple vista y otras mediante instrumentos como el microscopio óptico o electrónico.

El microscopio de óptico es la herramienta principal en el ámbito de la microbiología. Su uso abarca una gran parte de las ramas de ésta ciencia, aunque en muchas áreas su utilidad se ha ido reduciendo al implementar técnicas de mayor sensibilidad y estandarización, como las técnicas serológicas y moleculares. En el microscopio óptico, la luz atraviesa de abajo a arriba el objeto a estudiar. Para ver con el microscopio un objeto, éste debe ser lo más fino posible. Si no lo atraviesa la luz se verá sólo un grumo deforme y opaco.Tiene un límite resolución, distancia mínima a la que se pueden distinguir dos objetos, de 200 nm (0.2 µm). Las células observadas bajo el microscopio pueden estar vivas o fijadas y teñidas. Las muestras son depositadas en una lámina de vidrio denominada portaobjetos, de unos 5 cm de largo por 2 cm de ancho. En el lugar del portaobjetos donde se puso la muestra puede, además, ponerse una laminilla muy fina de vidrio llamada cubreobjetos. Los oculares proporcionan un aumento de la imagen, y viene expresado 10X en el ocular. También los hay 20X. Los objetivos (generalmente cuatro), suelen tener aumentos de 4X, 10X, 40X y 100X. La ampliación de la imagen resultante al multiplicar los aumentos que proporciona el ocular.

Lo objetivos 4X, 10X y 40X, se denominan objetivos secos, porque entre la lente y la preparación, la luz atraviesa el aire proporcionando una imagen nítida. El objetivo 100, se denomina objetivo de inmersión, porque para proveer imágenes nítidas, la lente debe estar inmersa en un líquido (aceite de cedro o similar), con un índice de refracción igual al vidrio, lo que evita la dispersión de los rayos luminosos. Siempre que utilicemos el objetivo 100X debemos colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación a observar.


Partes de microscopioPara utilizar correctamente el microscopio es necesario conocer adecuadamente sus partes y sus funciones, dado que dependiendo del tipo de microorganismo con que se esté tratando, se deberán adaptar el aumento, la luz y el condensador para tener resultados que provean una visibilidad óptima para trabajar.

Sistema óptico• Ocular: son sistemas de lentes cuya función es aumentar la imagen procedente del objetivo tantas

veces como indique el número escrito en ellos. Los dos oculares pueden moverse hacia los lados y hacia el centro, de manera que se ajusten a la distancia inter pupilar de quien esté utilizando el microscopio. En algunos microscopios ambos oculares tienen inscrito lo siguiente 10X/18L. La cifra de la izquierda (10X) indica las veces que cada ocular aumenta la imagen procedente del objetivo y la derecha (18L) es el llamado número del campo, que sirve para calcular el tamaño del diámetro del campo visual, de acuerdo con el objetivo que se esté utilizando. Este número de campo puede variar según el microscopio de que se trate y normalmente está entre 12 y 36.

• Anillo de dioptrías: se ubica en uno de los oculares y sirve para ajustar la visión binocular.• Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. Sus aumentos de menor a

mayor son 4x, 10x, 40x, 100x. • Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. • Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. • Fuente de luz: proporciona la iluminación necesaria para la observación de la muestra. Algunos

microscopios no tienen incorporada la fuente de luz y se valen de un espejo para reflejar la que proviene de un bombillo o de una lámpara.

Sistema mecánico• Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. • Platina: Lugar donde se deposita la preparación. • Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular. • Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. • Tornillos de enfoque: El Tornillo Macrométrico que aproxima el enfoque y el Tornillo Micrométrico

que consigue el enfoque correcto.• Abertura numérica (AN): es la capacidad que tiene el objetivo para recibir el cono de luz que

pasa a través de la muestra, procedente de la fuente de luz. La abertura numérica es directamente proporcional al índice de refracción del medio en que se propaga la luz (aire, agua, vidrio, aceite de inmersión), pues mientras mayor sea el índice de refracción, mayor será el cono de luz, lo cual origina un mayor poder de resolución (aspecto que se explicará en la segunda práctica de laboratorio).

• Longitud mecánica del tubo: es la distancia que hay entre la parte inferior del objetivo y los oculares. Está indicada en los objetivos y generalmente tiene un valor de 160 mm. Observe cómo al lado de este número, separados por una línea oblicua, aparece un guion o la cifra 0,17. el guion indica que estas lentes pueden usarse para observar muestras sin que sea estrictamente necesario utilizar cubreobjetos; y la cifra 0.17, que solo está en la lente A40, indica que es necesario utilizar un cubre objeto de 17 mm de espesor.


• Poder de aumento (PA): es el producto del número del aumento de cada una de las lentes, el aumento del objetivo (Aob) multiplicado por el aumento del ocular (Aoc). Su fórmula se expresa así: (At) = Aob x Aoc donde At: es el aumento total; Aob: es el aumento del objetivo; Aoc: es el aumento del ocular.

• Campo visual del microscopio: es el área circular que se observa al mirar a través del microscopio. Varían según las lentes utilizadas.

• Unidades utilizadas en mediciones microscópicas: la mayoría de los organismos o estructuras que se estudian al microscopio son de tamaños muy pequeños. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas tales como el milímetro (mm), el micrómetro (µm), el nanómetro (nm) y el angstrom (A°). Las relaciones que existen entre ellas son: 1 mm = 1000µm; 1µm = 1000 nm; 1nm = 10A°.

Materiales• Microscopio • Láminas teñidas • Cultivo mixto en medio líquido• Mechero • Portaobjetos • Cristal violeta• Safranina • Solución de alcohol-acetona. • Aceite de inmersión • Papel de lentes• Asas bacteriológicas

ProcedimientoObservación 1. Observe el microscopio e identifique las siguientes partes:

• Lente ocular • Lentes objetivos • Revólver • Brazo • Platina mecánica • Desplazamiento de la platina • Lente condensador • Diafragma de apertura • Macrométrico • Micrométrico • Fuente de Luz


2. Coloque una lámina teñida en el microscopio.3. Coloque el lente de 4X (rojo) y mueva el macrométrico hasta enfocar el plano de la muestra.4. Una vez enfocado y sin mover el carro, proceda a cambiar el lente a 10X (amarillo).5. Una vez enfocado nuevamente y sin mover el carro, proceda a cambiar el lente a 40X (celeste).6. De ser necesario aceite de inmersión, devuélvase al lente de 4X, coloque una gota grande de aceite

de inmersión y pase directo al lente de 100X (blanco), sin pasar por el celeste. El lente de 40X no está diseñado para soportar el aceite de inmersión y lo puede dañar. De hacerlo accidentalmente, quite el lente de 40X de la posición de trabajo y proceda a limpiarlo bien con papel para lentes.

7. Al terminar, limpie también el lente de inmersión para remover remanentes de aceite de inmersión.

Tinción de Gram 1. Esterilice las asas bacteriológicas 2. Haga dos círculos sobre un portaobjetos con el lápiz de cera 3. Una vez frías las asas, sumerja una en el cultivo líquido. Agite bien y extraiga una gota 4. Colóquela sobre el portaobjetos, dentro de uno de los círculos y extiéndala lo más posible 5. Deje secar a temperatura ambiente 6. Fije el frotis exponiéndolo varias veces y por periodos cortos a la llama del mechero 7. Proceda a realizar la tinción de la siguiente manera:

a) Cubra la lámina con cristal violeta por 1 minuto y lave con agua el excedente. b) Cubra la lámina con lugol durante 1 ó 2 minutos y lave la lámina con agua y escurra.El siguiente paso es primordial y es el que determinará si la tinción es exitosa o no c) Decolore utilizando solución de alcohol – acetona hasta que solamente note una delgada línea de colorante saliendo (aproximadamente 10 segundos)d) Inmediatamente detenga la decoloración con agua y escurra el excedente e) Cubra la lámina con safranina durante 1 minuto y lave la lámina con agua.f) Séquela con la secadora.g) Observe la lámina al microscopio con lente de inmersión.

Asignación: Omnipresencia de los microorganismos

Objetivo específicoIdentificar la presencia de microorganismos en el ambiente natural, como parte normal de la naturaleza.

DescripciónEn la naturaleza se encuentran todo tipo de microorganismos. Se pueden encontrar desde el suelo, agua y aire, así como sobre los seres vivos y dentro de ellos. Muy pocos de ellos son capaces de causar algún tipo de enfermedad ya que, en su mayoría, son microorganismos de vida libre. En el ambiente se pueden encontrar bacterias, esporas de hongos e incluso protozoarios y muchos de éstos pueden ser aislados utilizando diversas técnicas.


Materiales• Placas de agar nutritivo

ProcedimientoAislamiento de microorganismos en el aire 1. Coloque una placa de agar nutritivo con la tapa abierta en algún sitio de su lugar de residencia. 2. Luego de 60 minutos tápela de nuevo, y selle con cinta adhesiva.3. Incube a 35°C por 24 h. de ser posible o a temperatura ambiente por 48 h.

Aislamiento de microorganismos en superficies corporales 1. Divida una placa de agar nutritivo rayando por fuera con un marcador en la parte inferior de la placa.2. En una mitad, coloque los dedos de sus manos por unos segundos.3. Proceda a lavar bien sus manos con agua, jabón y alcohol.4. Repita en la otra mitad de la placa.5. Tape la placa y selle con cinta adhesiva.6. Incube a 35°C por 24 h de ser posible o a temperatura ambiente por 48 h.

Lectura de Placas 1- Analice en el laboratorio los microorganismos que crecieron en las placas.

Tema 2: Tinciones

Objetivos específicos • Saber la importancia de las tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias. • Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas. • Observar estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cápsulas.

DescripciónEn el caso de las bacterias, para poder visualizarlas es necesario realizar tinciones antes de observarlas al microscopio. La tinción más común es la tinción de Gram, sin embargos existen otro tipo de tinciones permiten obtener mayor información por ejemplo la negativa y la selectiva.

La tinción de Gram fue propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobe el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy difícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color primario, pero tiñe a los microorganismos decolorados. Como se observa en la figura 1.


Figura 1. Esquema de tinción de Gram, fuente Tortora, 2012

Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retención o eliminación del colorante primario después del proceso de decoloración.

Las tinciones selectivas por otro lado permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son importantes criterios de clasificación taxonómica. Debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés. Las endosporas son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas temperaturas y medios adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos), formándose una espora por cada forma vegetativa.

La tinción negativa, facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del calor, así como de estructuras especiales, como la cápsula de algunas especies bacterianas. La cápsula también llamada glico-cáliz es una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o polipéptidos, que confiere protección a las bacterias contra la desecación y la fagocitosis.

La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo oscuro.


Materiales• Probeta de 100 mL• Parrilla de calentamiento.• Mechero • Cristal violeta.• Safranina • Lugol • Solución de alcohol-acetona.• Verde de malaquita.• Fenol 2%.• Aceite de inmersión.• Cultivo mixto• Papel filtro*• Asa bacteriológica*• Portaobjetos*• Tinta china*• Cepas de Escherichia coli., Streptococcus sp., Bacillus subtilis, Klebsiella sp., Aspergillus niger• Microscopio compuesto de campo claro.

ProcedimientoPreparar un frotis a partir de un cultivo sólido o de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicar la tinción necesaria.Tinción de Gram: Escherichia coli., Streptococcus sp., o Klebsiella sp. Tinción selectiva de endosporas: en un frotis fijado al calor de Bacillus subtilis Tinción negativa en un frotis de Klebsiella sp. o Aspergillus niger

Preparación del frotisCultivo de bacterias en medio líquido, tomar una o varias cargas directamente con el asa y extender sobre el portaobjetos.

Cultivo en medio sólido, depositar previamente una gota de agua sobre el portaobjetos. Tomar con el asa una pequeña parte de la colonia y dispersar en la gota de agua, realizar la extensión como en el caso anterior.

Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o el calor. Emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba, para no quemarla. Hay que procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alterarían las estructuras de la bacteria: en ningún momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano, debe quemar.

La fijación tiene por objeto provocar modificaciones en la composición físico-química de la bacteria (coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta conserve definitivamente una estructura similar


a la que tenía en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida durante la tinción. Por otra parte, la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes.

Tinción simple (se utiliza un solo colorante)1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.2. Cubrir con colorante azul de metileno o la safranina, la preparación3. Dejar actuar durante un minuto. 4. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. 5. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x) empleando el aceite

apropiado.

Tinción de Gram 1. Esterilice las asas bacteriológicas 2. Haga dos círculos sobre un portaobjetos con el lápiz de cera 3. Una vez frías las asas, sumerja una en el cultivo líquido. Agite bien y extraiga una gota 4. Colóquela sobre el portaobjetos, dentro de uno de los círculos y extiéndala lo más posible 5. Deje secar a temperatura ambiente 6. Fije el frotis exponiéndolo varias veces y por periodos cortos a la llama del mechero 7. Proceda a realizar la tinción de la siguiente manera:

a) Cubra la lámina con cristal violeta por 1 minuto y lave con agua el excedente. b) Cubra la lámina con lugol durante 1 ó 2 minutos y lave la lámina con agua y escurra.El siguiente paso es primordial y es el que determinará si la tinción es exitosa o no.c) Decolore utilizando solución de alcohol – acetona hasta que solamente note una delgada línea de colorante saliendo (aproximadamente 10 segundos)d) Inmediatamente detenga la decoloración con agua y escurra el excedente e) Cubra la lámina con safranina durante 1 minuto y lave la lámina con agua.f) Séquela con la secadora.g) Observe la lámina al microscopio con lente de inmersión.

Tinción selectiva de endosporas1. Hacer un frotis de cultivo en medio sólido (preferentemente de al menos 48 horas) de Bacillus subtilis.2. Colocar el portaobjetos sobre un trípode y cubrir la preparación con papel de filtro del mismo tamaño

que la extensión (tienen por objeto mantener húmeda la preparación y evitar que los bordes del portaobjetos se manchen de colorante). tal como se ve en la figura 2

3. Agregar verde de malaquita (solución acuosa al 2%), sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.

4. Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más si es necesario) quitar el papel de filtro y eliminar el colorante con agua destilada.

5. Cubrir con safranina durante 60 segundos, lavar nuevamente y dejar secar al aire.6. Observar al microscopio Se verá la endospora teñida de color verde y las células vegetativas de

color rojo.


Figura 3. Esquema de tinción selectiva de endosporas, fuente Manual de bacteriología clínica, 2000.

Tinción negativa para observación de cápsulas 1. Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una

gota del cultivo liquido de Klebsiella sp. Si se trata de un cultivo sólido, hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. observa la figura 3.

2. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de 45° sobre la muestra.

3. Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.

4. Dejar secar al aire.

Figura 4. Esquema de tinción negativa, fuente Manual de bacteriología clínica, 2000.


Tinción de Zielhl Neelsen1. Cubrir el extendido con fucsina2. Con la llama de un mechero humedecido en alcohol, calentar suavemente por debajo de las láminas

cubiertas con fucsina, hasta que se produzca emisión de vapores blanquecinos visibles.3. Dejar de calentar y repetir el procedimiento por 5 minutos.4. Importante: En ningún caso la fucsina debe hervir o secarse sobre las láminas. Si disminuye por

evaporación o derrame, hay que reponerla.5. Eliminar la fucsina lavándola con agua corriente6. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la mezcla alcohol-ácido.7. Se puede mover suavemente en forma de vaivén para que se vaya produciendo la decoloración.

Esta operación requiere alrededor de 1 a 2 minutos.8. Lavar con agua corriente.

Ziehl-neelsen modificado1. Cubrir el extendido con fucsina por 20 minutos.2. Eliminar la fucsina lavándola con agua corriente.3. Seguir los pasos del 5 al 9.

Observaciones al microscopio Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.1. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X,

posteriormente pasar al de 40X. para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

2. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistema.

Tema 3: Técnicas de cultivo

Objetivo específicoPracticar las técnicas básicas de cultivo de microorganismos.

DescripciónPara una correcta realización de un cultivo bacteriano son necesarias ciertas condiciones: 1. Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar

una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la esterilización. En la esterilización se utilizan dos tipos principales de esterilización: métodos físicos (calor, filtración, radiaciones) métodos químicos (empleo de soluciones químicas).

2. Que el inoculo no se contamine, modifique o destruya: normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc, antes y después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente.


3. Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Estas condiciones se resuelven con el uso de cabinas estériles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente. Un cultivo puro es aquel en el cual se encuentra únicamente una especie de microorganismo, sea bacteria u hongo, mientras que un cultivo mixto es en el cual se encuentran dos o más especies. En la naturaleza y en el cuerpo humano, es común encontrar los microorganismos conviviendo en comunidades, sin embargo, para efectos diagnósticos es de interés únicamente el agente causal de la enfermedad. Por lo tanto, es necesaria la aplicación de técnicas de aislamiento del organismo en cuestión. El método más comúnmente utilizado es el rayado. En éste método, se utiliza un asa estéril para “rayar” diferentes zonas de una placa de agar, de modo que la concentración inicial de bacterias presentes en el asa se diluya paulatinamente hasta que se logren separar las colonias, posterior a su incubación. Se asume que cada colonia proviene de una única bacteria. Existen diversos métodos de inoculación de medios de cultivo, dependiendo del objetivo, algunos de los cuales se evaluarán en la presente práctica.

Materiales• Medios de cultivo • Cultivo mixto• Asas bacteriológicas• Mechero• Cepas de:

• Escherichia coli.• Streptococcus sp.• Bacillus subtilis.• Klebsiella sp.• Candida sp

Procedimiento Rayado por estría 1. Tome un tubo de agar Sabouraud con Candida sp 2. Con un asa estéril proceda a tomar una colonia 3. Con cuidado, retire el algodón de un tubo de agar Sabouraud 4. Raye el agar por estría, realizando un movimiento zigzagueante desde el fondo hacia afuera 5. Tape el tubo nuevamente e incube a 24°C durante 7 días 6. Siempre esterilice cada asa luego de haberla utilizado


Rayado en placa a partir de medio líquido 1. Tome dos medios líquidos con diferentes bacterias (un bacilo y un coco) y dos placas de agar sangre 2. Sumerja un asa estéril en uno de los medios y proceda a rayar una placa de agar, ya sea en 3 o 4 zonas 3. Procure que la primer área sea pequeña y que la última tenga asadas largas y juntas para favorecer

la separación de las colonias 4. Repita con el segundo cultivo 5. Incube a 35°C durante 24h 6. Siempre esterilice cada asa luego de haberla utilizado

Rayado en placa a partir de medio sólido 1. Tome dos agares con diferentes bacterias y dos placas de agar sangre 2. Con un asa estéril tome una colonia bacteriana bien separada 3. Proceda a rayar la colonia en un agar sangre, en 3 o 4 zonas 4. Opcionalmente, puede realizar primero una pequeña estría y realizar el rayado con un asa diferente 5. Siempre esterilice cada asa luego de haberla utilizado

Lectura de Placas 1. Analice los microorganismos que crecieron en las placas

InterpretaciónEl agar MIO es un agar semisólido que permite la movilidad de las bacterias. Si éstas son móviles y aerobias, se desplazarán hacia donde hay mayor disponibilidad de oxígeno, es decir, hacia la parte superior del agar. Mientras que no son móviles, crecerán en la zona que tuvo contacto con el asa únicamente.

Tema 4: Toma de muestras faríngeas y cutáneas

Objetivo específicoReconocer los pasos para la toma de muestra y procesamiento correctos de muestras faríngeas y cutáneas.

DescripciónLos microorganismos son conocidos por estar presentes en todas partes, desde la naturaleza hasta el cuerpo humano. De la misma manera, en ocasiones pueden colonizar sitios anatómicos como el tracto gastrointestinal, en donde pueden actuar como comensales o simbiontes.

No obstante, en ocasiones ese crecimiento se puede volver descontrolado o invasivo, lo cual culmina en un proceso infeccioso. En estos casos, puede ser necesario la toma de muestra para aislar e identificar al patógeno, su perfil de sensibilidad a antimicrobianos y establecer una terapia efectiva para que la infección resuelva.

En la toma de muestras microbiológicas lo más importante es recolectar el microorganismo que causa la patología, acarreando la menor cantidad de flora normal. Esto con el fin de que, a la hora de identificar,


se cuente únicamente con el microorganismo de interés y no se identifiquen erróneamente la flora normal o contaminante, dado que se incurriría en un error de tratamiento que podría ser inefectivo y se podría comprometer grandemente la salud del paciente.

En el laboratorio de microbiología es muy importante mantener los microorganismos del ambiente fuera de los materiales de trabajo, para que no interfieran con el aislamiento de los agentes buscados. Esto se logra mediante una serie de medidas y cuidados en la manipulación de los medios de cultivo y de los implementos de laboratorio, es importante controlar la contaminación ambiental, así como la que pudiera aportar las manos, respiración entre otros, además la aplicación correcta de las normas de bioseguridad que garanticen un trabajo correcto de laboratorio evitará la contaminación y las posibles infecciones por accidentes de laboratorio. Todo esto en conjunto se llama “técnica aséptica”.

La muestra se debe recolectar la manera más apropiada y en condiciones asépticas, ya que el diagnóstico va a depender de esto.

En al caso de lesiones por hongos, las más frecuentes son en piel y uñas, el procesamiento de muestras abarca: la recolección de la muestra, el examen directo, los cultivos y la identificación del agente etiológico.

La cantidad es muy importante de ser suficiente para realizar exámenes directos y cultivos, que sea de la zona donde está la lesión concentrada y no se contamine ni por contacto con el paciente o con el ambiente.

Materiales• Microscopio • Portaobjetos • KOH 20% y 40%• Azul de Lactofenol• Tinción de Gram • Torundas estériles• Hojas de bisturí • Placas de agar nutritivo • Bajalenguas • Solución salina estéril

Procedimiento Las normas básicas para la recolección correcta de muestras biológicas son:1. La muestra para cultivo debe proceder, del verdadero sitio de la infección y deberá recogerse con un

mínimo de contaminación de tejidos, órganos o secreciones adyacentes.2. Se establecerán los períodos óptimos para la recolección de las muestras de acuerdo al proceso

natural de la enfermedad y del microorganismo posiblemente involucrado. Esto se realiza con la


finalidad de aumentar las posibilidades de recuperar y aislar el agente etiológico.3. Obtener la suficiente cantidad de muestra para llevar a cabo todas las pruebas.4. Utilizar dispositivos de recolección, recipientes para las muestras y medios de transporte adecuados

para asegurar el óptimo aislamiento de los microorganismos.5. Siempre que sea posible, se deberán obtener las muestras clínicas antes de la administración de

antibióticos.6. El envase o los dispositivos de recolección de muestras clínicas deberán estar correctamente rotulados

y fechados.

Toma de muestra faríngea 1. Tome dos hisopos estériles, un tubo de solución salina estéril, una placa de agar y dos portaobjetos. 2. Pida a su compañero (a) que abra la boca 3. Baje la lengua de su compañero utilizando bajalenguas 4. Con un hisopo remojado en la solución salina, proceda a raspar las paredes de la faringe rotándolo

para cubrir toda su superficie. Debe ser profundo, de lo contrario se llenará de saliva o se contaminará con la flora normal del tracto digestivo

5. Raye el agar con el hisopo utilizado y descarte el hisopo 6. Repita la toma de muestra con el otro hisopo y realice un extendido en ambos portaobjetos 7. Realice una tinción de Gram a los extendidos

Toma de muestra cutánea 1. Retire la hoja de bisturí del empaque.2. Flamee la hoja para asegurarse de su esterilidad (lo óptimo es contar con un bisturí sin filo, sin

embargo, la llama poco a poco va removiendo el filo).3. Raspe el área infectada o de interés en ángulo menor a 90 grados, para evitar cortaduras.4. El movimiento debe ser ascendente, con el fin de que las escamas de piel que se desprendan queden

retenidas en el bisturí y no se pierdan o propaguen el patógeno. 5. Después de unos raspados, introduzca el bisturí en un agar nutritivo, realizando cortes hasta el fondo

para inocularlo. 6. Continúe raspando y coloque el raspado en un portaobjetos con KOH al 20%. 7. Observe al microscopio e identifique estructuras fúngicas.

Lectura de Placas1. Analice al día siguiente los microorganismos que crecieron en las placas.


Tema 5: incógnitas prueba práctica

Materiales • Portaobjetos • Cubreobjetos • Tubos de ensayo • Microscopio• Medios de cultivo • Cultivo mixto• Asas bacteriológicas• Mechero

ProcedimientoSiga las instrucciones de su docente, y analice las muestras si es necesario realice tinciones o el cultivo de los microorganismos que le correspondieron, utilizando las técnicas estudiadas en los laboratorios vistos.

Curso: Métodos de Laboratorio Clínico

Competencias Conoce y aplica los conocimientos básicos de la microbiología, bacteriología, micología, virología, parasitología, preparación de reactivos clínicos y asistencia en los métodos de laboratorio que desarrolla el Microbiólogo demostrando una alta comprensión integral del fenómeno de la Salud permitiendo desarrollar con esto, un alto sentido de la ética profesional.

Tema 1: Flebotomía

Objetivo específico: Aplicar todas las partes de una correcta técnica para la obtención de muestras sanguíneas.

DescripciónLa flebotomía o toma de muestra sanguínea es una técnica imprescindible que debe ser dominada por todo personal de laboratorio, pues de ésta manera será la obtención de la mayoría de las muestras que se procesarán.

Es un procedimiento delicado ya que es invasivo, por lo cual se debe realizar con sumo cuidado y certeza, al igual que mantener los cuidados asépticos para evitar posteriores complicaciones de los pacientes.En las muestras sanguíneas es de gran importancia considerar los tubos que se utilizarán según las pruebas solicitadas. Así tendremos, a grandes rasgos, que el tubo rojo (sin anticoagulante, con factores promotores de la coagulación) se utilizará para obtener suero y procesar química clínica y hormonas, el tubo morado (EDTA como anticoagulante) principalmente para hematología y grupos sanguíneos, los celestes (citrato como anticoagulante) se utilizarán para pruebas de coagulación, por mencionar los principales.


El dominio de la técnica no se obtiene rápidamente, se requiere seguridad y mucha práctica, por lo que se recomiendan diversas dinámicas para familiarizarse con el equipo, por lo que en el laboratorio se cuenta con simuladores de brazos para mayor facilidad.

Drenaje venoso del BrazoEs importante conocer la anatomía venosa del brazo, aunque no hay un patrón establecido podemos ver como a nivel de la fosa del codo tenemos las dos venas, cefálica y basílica. En medio, estas se van a comunicar a través de la vena mediana del codo, la cual se usa usualmente para tomar la muestra de sangre. A nivel de la fosa cubital, las venas superficiales pueden variar.

• Forma de H: la mediana del codo (a veces llamada mediana cubital) solo une las venas cefálica y basílica.

• Forma de M: se da una v. mediana cefálica, una v. mediana basílica y una v. mediana del antebrazo. Esta última se origina de las venas del carpo y asciende por la línea media para comunicar a la cefálica con la basílica.

Materiales • Tubos rojos• Tubos morados • Torniquete• Algodones• Alcohol• Aguja• Adaptador


ProcedimientoFlebotomía1. Tome el brazo y coloque el torniquete fuertemente en la parte superior del mismo aproximadamente

10 centímetros por arriba del sitio seleccionado, para visualizar mejor las venas.2. Palpe la vena que va a punzar.3. Humedezca un algodón con alcohol al 70% y limpie el área de punción en forma de “C” hacia afuera.4. Permita que el alcohol seque.5. Coloque la aguja en el lado afuera del adaptador y un tubo en la parte interna del mismo.6. Sin volver a palpar, realice la punción de la vena en un movimiento recto con el bisel de la aguja

siempre hacia arriba, rápido y seguro7. Sostenga firmemente el adaptador y presione el tubo para que inicie el vacío y obtenga la muestra.8. Una vez lleno el tubo, retírelo apoyando el pulgar en el adaptador y coloque otro tubo.9. Una vez finalizado, retire el tubo, retire el torniquete y coloque un algodón seco sobre el sitio de

punción.10. Presionando suavemente el algodón, retire la aguja rápidamente y en un solo movimiento. 11. Indique al paciente sostener el algodón durante 5 a 10 minutos posterior a la punción.

Interpretación1. El torniquete debe ser colocado fuertemente para que las venas realmente sobresalgan.2. El movimiento a la hora de limpiar pretende que no se arrastre contaminación hacia el sitio de punción,

sino fuera de él.3. Es necesario dejar que el alcohol seque, de lo contrario el paciente puede sentir un gran ardor a la

hora de tomar la muestra y la sangre podría hemolizar, impidiendo que se puedan realizar muchas pruebas.

4. El algodón se debe sostener durante 5 a 10 minutos posterior a la punción para evitar la formación de hematomas.

Tema 2: Procesamiento de muestras de orina y de heces

I- Procesamiento de muestras de orinas

Objetivo específicoReconocer los pasos para llevar a cabo un examen general de orina

Descripción Las muestras de orina proveen gran cantidad de información acerca del funcionamiento del sistema renal de los pacientes. Tiene la ventaja de no ser invasiva, de fácil obtención y de poder ser tomada directamente por el paciente.

Como toda muestra se le debe indicar al paciente los cuidados a la hora de tomarla, como que sea la primera orina de la mañana y descartar el primer chorro antes de comenzar a recolectar.


Usualmente un examen general de orina (EGO) consta de dos fases: La utilización de tiras reactivas para determinaciones químicas básicas y la observación del sedimento urinario, con el fin de determinar la presencia de estructuras de importancia como leucocitos, eritrocitos, cristales, entre otros.

Materiales• Tubos de ensayo • Tiras reactivas • Portaobjetos • Cubreobjetos

ProcedimientoTiras reactivas 1. Homogenice la orina en el frasco 2. Trasvase una pequeña cantidad a un tubo de ensayo, cerca de unas ¾ partes de su capacidad 3. Sumerja una tira reactiva en la orina de modo que se cubran todos los cuadros reactivos, no descarte

la orina 4. Seque el excedente de orina de la tira tocando de costado sobre un papel toalla 5. Espere 1 minuto y lea los colores comparando con el frasco.

Observación del sedimento urinario 1. Tome el mismo tubo con orina utilizado anteriormente y centrifugue durante 5 minutos a 1500 rpm

(con el adecuado uso de la centrifuga)2. Decante el sobrenadante en un movimiento ágil y seguro 3. Resuspenda el sedimento con la última gota 4. Coloque una pequeña gota del sedimento resuspendido sobre un portaobjetos y coloque un

cubreobjetos encima 5. Observe con lente de 40X y observe por estructuras de interés

Interpretación • Se debe secar el excedente de las tiras reactivas con el fin de que los colorantes no se pasen entre

cuadros y no causen coloraciones indebidas.

II- Procesamiento de muestras de heces

Objetivo específicoReconocer los pasos básicos para el montaje y procesamiento de muestras de heces.

DescripciónLos parásitos intestinales están ampliamente distribuidos en el mundo, principalmente en los países en


vías de desarrollo. Éstos pueden causar una amplia gama de patologías, desde gastroenteritis, diarreas, desnutrición por malabsorción; hasta patologías más severas como hepatopatías fulminantes e incluso encefalopatías.

La mayoría de los parásitos intestinales pueden ser encontrados e identificado en muestras de heces, de lo cual radica la importancia de la técnica apropiada para su montaje y la pericia a la hora de observar al microscopio.

El montaje al fresco consta de un análisis en solución salina, en donde se pueden ver formas móviles (trofozoítos) y estructuras como cromatoidales, presentes en quistes de algunas amebas; a su vez, se realiza un montaje en lugol, el cual funciona como una tinción negativa, en donde las estructuras internas de los protozoarios se verán mejor sus estructuras internas por contraste.

El montaje al fresco tiene una mayor importancia en la observación y detección de protozoarios, sin embargo, para helmintos la técnica más adecuada es la concentración de Kato. En ésta, se coloca una pequeña porción de heces sobre un portaobjetos y se coloca sobre él una tira de papel celofán sumergido en solución de Kato (verde malaquita con glicerol). Luego se presiona contra un papel para distribuir la muestra en una capa delgada.

Se deja secar de 5 a 10 minutos, con el fin de que se decoloren los detritos de la muestra, mas no así los huevecillos de helmintos. Se observa al microscopio con lente de 10X o 40X.

Materiales• Muestras de heces• Solución salina • Lugol • Portaobjetos • Cubreobjetos • Reactivo de kato

ProcedimientoMontaje al fresco 1. Coloque una gota de solución salina y una de lugol en lados opuestos de un portaobjetos 2. Con un palillo de madera, proceda a picar varias veces la muestra de heces en diferentes zonas 3. Coloque una muy pequeña porción en la solución salina y homogenice 4. Quiebre el palillo o cámbielo y repita en el lugol 5. Coloque cubreobjetos en ambos 6. Observe al microscopio con lente de 40X en busca de amebas

Concentración de Kato1. Coloque una pequeña porción de heces sobre el portaobjetos


2. Coloque sobre la muestra, una tira de papel celofán con reactivo de Kato 3. Presione el portaobjetos contra un papel toalla para distribuir la muestra en una capa delgada 4. Deje secar durante 10 minutos 5. Observe con lente de 10X en búsqueda de huevecillos

Tema 3: Observación del sedimento urinario

DescripciónLas muestras de orina proveen gran cantidad de información acerca del funcionamiento del sistema renal de los pacientes. Tiene la ventaja de no ser invasiva, de fácil obtención y de poder ser tomada directamente por el paciente. El análisis en el laboratorio clínico tiene gran parte de acción del laboratorista ya que la observación del sedimento urinario es esencial para el reporte del Examen General de Orina (EGO).El reporte se realiza por campos de visión se deben observar al menos 15 campos para poder dar un reporte asertivo, y en aumento de 40X.Una amplia gama de elementos puede observarse en el sedimento urinario, pueden formarse a lo largo de todo el tracto urinario o desde el glomérulo hasta la uretra, pero también podemos tener contaminantes como, por ejemplo: sangre de menstruación, espermatozoides, fibras, gránulos de almidón, fluidos vaginales (mucus en exceso)

Podemos observar elementos celulares, como leucocitos y eritrocitos que se reportan en número exacto, realizando un promedio de los que se hayan observado por campo (2, 5, 10…), también tenemos las células epiteliales, estas se reportan por cantidad (escasas, pocas, muchas o abundantes).Los microorganismos oportunistas como bacterias, levaduras y trichomonas pueden estar presentes y su hallazgo no siempre es anormal, pero en cantidades abundantes si corresponden a procesos patológicos.Otros hallazgos pueden ser precipitados químicos, estos corresponden a los cristales y el sedimento amorfo, que se relacionan con el pH de la orina.Los cilindros, que se observan para poder visualizarlos de mejor forma en 10X, son formados en el lumen de los túbulos renales y se evacuan con la orina.Identificar y reportar de forma adecuada un sedimento urinario, nos ayuda a monitorear al paciente y alguna posible afectación que este presentando.

En el reporte final del EGO deben estar siempreLeucocitosEritrocitos Células epiteliales BacteriasY cualquier otro hallazgo

Materiales • Muestras de orina


• Tubos de ensayo• Tiras reactivas• Portaobjetos• Cubreobjetos• Centrifuga • Microscopio

Observación del sedimento urinario1. Tome el mismo tubo con orina utilizado anteriormente y centrifugue durante 5 minutos a 1500 rpm 2. Decante el sobrenadante en un movimiento ágil y seguro 3. Resuspenda el sedimento con la última gota 4. Coloque una pequeña gota del sedimento resuspendido sobre un portaobjetos y coloque un

cubreobjetos encima 5. Observe con lente de 40X y observe por estructuras de interés

Interpretación• No se debe centrifugar a más de 1500 rpm, pues se pueden destruir cilindros presentes en la muestra.

Tema 4: Toma de muestra de hongos

DescripciónLos hongos son organismos eucariotas que comprende gran cantidad de especies (se cree que hay más de millón y medio), las infecciones causadas por hongos de denominan micosis. Los causantes de las micosis son aproximadamente 100 especies.

En nuestras mucosas tenemos hongos endógenos, que en condiciones normales no causan afectaciones, como las candidas. Los exógenos llevan su vida fuera del ser humano y algunos son parásitos obligatorios como los dermatofitos, otros según las condiciones pueden afectar al ser humano. Los hongos exógenos y algunas levaduras se conocen como el grupo de los hongos oportunistas.

El procesamiento de muestras para micología médica contempla la recolección de la muestra, el examen directo, los cultivos y la identificación del agente etiológico.

Para asegurarse de que el trabajo de laboratorio sea de calidad, debemos recolectar la muestra de la manera más apropiada, así como su transporte y almacenaje, si fuera necesario. El primer paso es fundamental para el diagnóstico de las enfermedades micóticas, ya que muestras insuficientes, no respectivas o contaminadas, pueden causar fallos en el diagnóstico.Las muestras deben obtenerse en condiciones asépticas, luego de una limpieza apropiada del área de trabajo. La cantidad de muestra es fundamental, ya que debe ser suficiente para realizarse exámenes directos y cultivos.Toda muestra debe acompañarse con los datos del paciente, nombre, edad, sexo y uso de antimicóticos previos; además de los datos del material biológico como tipo de muestra y hora de la recolección.


Materiales• Bisturí• Placas Petri • Portaobjetos• Cubreobjetos• KOH 10% y 40%• Microscopio

ProcedimientoToma de muestra piel • Raspar cuidadosamente las lesiones con un bisturí sin filo. • Depositar en una placa de Petri estéril o se montan directamente en una lámina con 1 o 2 gotas de KOH al 10 o 20% y se coloca el cubreobjetos.

Toma de muestra uña • Antes de recolectar la muestra, se puede limpiar el área afectada con alcohol y dejar evaporar. • Raspar la zona de la uña donde se observa la lesión, obtener lo que se deposita debajo y en las orillas de las uñas afectadas, utilizando un estilete acanalado o un bisturí. • Depositar en una placa de Petri estéril o se montan directamente en una lámina con 1 o 2 gotas de KOH al 40% y se coloca el cubreobjetos.

Observación con KOH • Depositar una gota de KO al 10,20 o 40% sobre un portaobjeto limpio. • Recolectar suficiente material de la lesión, depositaria en el KOH y colocar un cubreobjetos. Nota: el KOH es caústico por lo que si se hace el montaje mientras se recolecta la muestra al paciente, se debe limpiar el bisturí luego de que entra en contacto con el KOH, antes de obtener más muestra. • Calentar ligeramente la preparación sin llegar a ebullición y presionar el cubreobjetos para distribuir la muestra en una capa fina. Para aclarar detritos y material queratinoso que pueden interferir en la observación de elementos fúngicos. • Observar en el microscopio en bajo y alto poder, cerrando el diagrama ligeramente para obtener una buena profundidad de campo.

I- Prueba práctica

Procedimiento Siga las instrucciones de su docente, y analice las muestras entregadas. Coloque en su reporte todo lo necesario.


Curso: Preparación de Reactivos Clínicos

Competencias1. Conoce y aplica los conocimientos básicos de la microbiología, bacteriología, micología, virología,

parasitología, preparación de reactivos clínicos y asistencia en los métodos de laboratorio que desarrolla el Microbiólogo demostrando una alta comprensión integral del fenómeno de la Salud permitiendo desarrollar con esto, un alto sentido de la ética profesional.

Tema 1: I- Uso de la pipeta y la micropipeta.

Objetivo específicoPracticar el correcto uso y manipulación de la pipeta y micropipeta.

DescripciónComo se ha mencionado anteriormente, la cristalería es un equipo fundamental del laboratorio. Sin embargo, es imprescindible su correcto uso, en especial en Química Clínica, en donde se requiere una exactitud analítica y no puede haber pequeños errores, ya que repercutirían grandemente en el resultado final de las determinaciones.

Los principales implementos que se utilizan son los volumétricos, ya que la mayoría de la química manual es líquida y principalmente, se utilizan las pipetas y micropipetas. Éstas requieren ciertos cuidados a la hora de utilizarlas, como aforar correctamente, evitar el error de paralaje y limpieza de la punta antes de verter. Además, si se realizan diluciones seriadas, se debe cambiar la punta o la pipeta entre cada dilución, pues éstas pueden generar arrastre a las diluciones siguientes e interferir con la concentración real final de éstas.

En Química Clínica muchas determinaciones se realizan mediante curvas de calibración, es decir, se procesan patrones con concentración conocida y se mide su absorbancia para genera una gráfica, luego se mide la muestra y se interpola el resultado de la concentración. Es de gran importancia en estos casos, la correcta manipulación del equipo, dado que cualquier error en la medición de algún patrón, causará un error en las determinaciones finales de las muestras.

Materiales• Pipetas • Micropipetas • Puntas de micropipeta • Tubos de ensayo • Kit de glucosa • Espectrofotómetro • Equipo de sangrado • Muestras en tubo rojo


ProcedimientoUso de la pipeta 1. Tome un beaker con agua, un tubo de ensayo, una hoja de papel toalla, pipeta graduada y una pera 2. Monte la pipeta y la pera, vaciar el balón de la pera 3. Sumerja la pipeta en el beaker con agua y proceda a llenarla por encima del 0mL (cero mililitros) 4. Si se forman burbujas, descarte y comience de nuevo 5. Saque la pipeta del agua y seque la punta de la pipeta con papel toalla, con cuidado de no tocar el

centro, ya que absorbería el líquido del interior de la pipeta 6. Proceda a verter agua lentamente hasta que se alcance la marca del 0mL (Aforar) 7. Vierta en el tubo de ensayo 1.5mL de agua 8. Descarte el resto del agua de vuelta al beaker

Uso de la micropipeta1. Tome un beaker con agua, un tubo de ensayo, una hoja de papel toalla, micropipeta y puntas del

tamaño adecuado para la micropipeta 2. Coloque la punta en la micropipeta 3. Gradúe la pipeta a 500uL 4. Presione la micropipeta hasta el primer paso, sumerja la punta de la micropipeta en el beaker con

agua y suelte lentamente para llenar la punta 5. Si se forman burbujas, descarte y comience de nuevo 6. Seque la punta de la micropipeta con papel toalla, con cuidado de no tocar el centro, ya que absorbería

el líquido del interior 7. Vierta el volumen lentamente en el tubo de ensayo, presionando hasta el segundo paso para “soplar”

la última gota 8. Descarte el resto del agua en el beaker y la punta en el descartador correspondiente

II- Lavado, preparación y esterilización de cristalería

Objetivo específicoPracticar los métodos de preparación, desinfección y esterilización de la cristalería.

DescripciónLa cristalería forma parte del equipo básico de trabajo en cualquier laboratorio clínico. Su uso se puede extender a prácticamente todas las ramas de la Microbiología y la Química Clínica y, dependiendo de ello, deberá cumplir con ciertas características que la hagan óptima para su uso.

En todos los casos, la cristalería deberá estar lavada y desinfectada, para reducir los riesgos infecciosos hacia el personal que lo manipula, en caso de accidente. Sin embargo, si se destinará a uso Bacteriológico o Micológico, no basta con que esté desinfectado, sino que requerirá estar también estéril.

Un material se encuentra desinfectado cuando se ha utilizado un agente, usualmente químico, para


reducir la carga microbiana viable que se encuentra sobre él. Por otra parte, un material estará estéril cuando se ha aplicado por el uno o varios métodos que permiten garantizar que hay ausencia total de microorganismos viables.

Antes de realizar el lavado de la cristalería, ésta debe estar autoclavada (en caso de que haya se haya utilizado para contener material biológico) y dejarse previamente al menos 24 horas sumergida en una solución de cloro y jabón, con el fin de que se dé una desinfección adecuada.

De ahí que el correcto lavado y preparación de la cristalería, así como de la disolución desinfectante, influyen directamente, tanto en la seguridad del personal, como en el resultado final que se obtendrá en los ensayos.

Materiales• Tubos sucios • Pipetas sucias • Puntas sucias • Jabón • Cloro • Probetas • Beakers

ProcedimientoPreparación de la solución desinfectante (de reposo) 1. Mida 10mL de jabón y 10mL de cloro al 3% y agréguelos a 1L de agua de tubo

Preparación de la solución de lavado1. Mida 10mL de detergente tensoactivo no tóxico y agréguelo en 1L de agua de tubo, ésta será la

solución de trabajo para realizar el lavado de la cristalería

Lavado de la cristalería y puntas1. Sumerja el hisopo en la solución de trabajo 2. Proceda a hisopar la cristalería para lavarla, debe repetirse al menos 5 veces 3. Enjuague en forma minuciosa para eliminar todos los restos de jabón, de lo contrario podría quedar

precipitado de jabón a la hora de secar 4. Enjuague una última vez con agua destilada 5. Coloque la cristalería en una bandeja y seque en horno a 250°C durante 20 minutos (excepto las

puntas que se dejan secando a temperatura ambiente) 6. Saque la bandeja caliente con un guante térmico y deje que los tubos alcancen la temperatura

ambiente 7. Proceda a guardar los tubos lavados y secos en el lugar correspondiente


Tema 2: Preparación y esterilización de medios de cultivo

Objetivo específicoPracticar el método de preparación correcta de medios de cultivo estériles.

DescripciónA nivel de microbiología médica, se necesita el poder aislar e identificar los microorganismos causantes de enfermedades. Dependiendo del tipo que sea, puede ser observado directamente, como los parásitos. En el caso de las bacterias y hongos, al ser tan pequeños y escasos, se requiere cultivarlos para que se multipliquen y poderles realizar pruebas bioquímicas y morfológicas con el fin de poderlos identificar.

Para favorecer esto, se cuenta con medios de cultivo. Los medios de cultivo pueden ser líquidos, como Caldo Lactosado Simple; semisólido como agar MIO o sólidos, como la mayoría de los agares, siendo algunos de ellos el Agar Sangre el cual es nutritivo y los Agares McConkey y Manitol-Sal, que son selectivos diferenciales.

Estos medios deben ser estériles, dado que la presencia de cualquier microorganismo viable en ellos causará una contaminación e interferencias a la hora de aislar e identificar. Además, se debe tener presente la naturaleza de cada agar, ya que algunos no se pueden autoclavar o se deben agregar algunos componentes luego de hacerlo, dado que la temperatura puede desnaturalizar alguno de sus componentes.

Materiales• Placas de Petri estériles • Agar nutritivo • Sangre fresca • Balanza granataria • Probetas • Agua destilada • Hornilla agitadora • Erlenmeyer • Espátulas • Embudo de papel

ProcedimientoPreparación de agar sangre 1. Verifique la fecha de vencimiento y de apertura en el laboratorio del medio deshidratado 2. Pese 40g de polvo deshidratado (TSA) en el Erlenmeyer previamente tarado 3. Vacíe suavemente agua destilada hasta alcanzar 1L, se debe agregar en 3 tractos con agitación manual

constante 4. Una vez disuelto todo el polvo, agregue el agitador magnético y verifique el pH para que calce con

el indicado por el fabricante


5. Coloque el Erlenmeyer sobre la hornilla 6. Encienda la hornilla a 300°C y el agitador magnético 7. Una vez alcanzado el punto de ebullición, deje ebullir por 1 minuto 8. Después del minuto, utilizando guantes protectores, dosifique cerca de 300mL del contenido en

botellas de 400mL 9. Coloque la cinta indicadora de esterilidad a cada una de las botellas 10. Autoclave durante 15 minutos entre 1.1 y 1.5 atm de presión y de 120 - 125°C 11. Traslade las botellas a baño maría entre 45 – 50°C 12. Espere unos 15 – 20 minutos para que las botellas alcancen la temperatura deseada 13. Saque las botellas y, de manera aséptica, agregue 4.5mL de sangre con EDTA a cada botella en la

cámara de flujo laminar 14. Mezcle suavemente y en forma de 8 para no formar burbujas 15. Chorree en placa 16. Espere a que el medio solidifique antes de almacenar

Control de calidad1. En la bitácora de medios de cultivo anote: Número de lote, fecha de vencimiento, técnico responsable,

fecha de elaboración

Prueba de viabilidad1. Seleccione 2 placas de manera aleatoria y raye con cepa conocida Gram positiva (Staphylococcus

aureus) y Gram negativa (Escherichia coli) 2. Incube durante 24h a 35°C, revise y anote en la bitácora

Prueba de esterilidad1. Seleccione 2 placas de manera aleatoria e incube 2. Incube durante 24h a 35°C, revise y anote en la bitácora

Tema 3: Diluciones simples y seriadas

Objetivo específicoComprender el principio y la técnica para la realización de diluciones simples y seriadas.

Descripción:Toda técnica de detección y cuantificación está determinada por un nivel mínimo y uno máximo. En algunos casos, las muestras pueden presentar concentraciones más elevadas de lo que el método disponible es capaz de determinar eficazmente, por lo cual es necesario realizar una dilución. En otras ocasiones, como en serología, se necesitará determinar el título de una muestra en una reacción, lo cual se entiende como la máxima dilución a la cual se da una reacción francamente positiva.

Las diluciones pueden ser directas o seriadas. Una dilución directa es cuando se realiza únicamente una


dilución, por ejemplo, 1mL de analito en 9mL de diluente (dilución 1:10, hay 1 parte de analito por 10 partes del volumen total final).

Las diluciones seriadas constan de diluciones consecutivas su propósito disminuir la concentración de un componente en una forma decreciente, mediante pases sucesivos. Por ejemplo, si se toma 1ml y se deposita en 2ml se habrá diluido 1:2, y de esta dilución ya realizada se toma 1 ml y se coloca de nuevo con 2ml diluente se diluye nuevamente 1:2, por lo que será una dilución 1:4 con respecto a la muestra inicial.

Realizando diluciones seriadas se pueden hacer reaccionar en pruebas serológicas hasta que haya ausencia de reacción, por lo tanto, la última dilución en donde la reacción fue observable, será el título. Es importante que, en las diluciones seriadas, se debe cambiar de pipeta o de punta entre una dilución y otra, dado que se puede dar arrastre de analito y causar errores.

Materiales• Solución coloreada • Tubos de ensayo • Pipetas• Micropipetas

ProcedimientoDiluciones seriadas 1. Tome 5 tubos rotulados. 2. Agregue a cada uno 600μL de agua de tubo. 3. Agregue al tubo 1, 300μL de la solución de azul de metileno y homogenice bien.

Esto es una dilución 1:24. Cambie de punta. 5. Del tubo 1, tome 300μL y agréguelos al tubo 2 y homogenice. 6. Repita hasta que llegue al tubo 5. 7. Analice como se realizan las diluciones y que dilución queda en cada tubo.8. Repita el procedimiento utilizando safranina en vez de azul de metileno. 9. Esta vez en lugar de factor de dilución 2 utilice el factor de dilución 3


III Nivel


Curso: Control de Calidad

Competencias1. Identifica los diversos procedimientos de control de calidad necesarios para el éxito de los

procedimientos de laboratorio

Tema 1: Control de Calidad en Medios de Cultivo

Objetivo específicoComprender la importancia del correcto seguimiento y registro del control de calidad en la preparación de medios de cultivo.

DescripciónLos medios de cultivo son sustancias, sólidas o líquidas, que permiten el crecimiento de microorganismos, ya sea de manera selectiva o no selectiva. La preparación de estos medios debe ser apropiada, de modo que se alcancen las características finales deseadas en sus contenidos químicos y propiedades físicas. Además, es de gran importancia el realizar control de calidad de los mismos, de modo que sea posible la verificación de la esterilidad de los mismos, así como la capacidad de los microorganismos de crecer en ellos. De esta forma se garantiza la ausencia de falsos positivos por contaminantes, así como falsos negativos por el estado inapropiado del medio.

Materiales• Placas de Petri estériles • Agar nutritivo • Sangre fresca • Balanza granataria • Probetas • Agua destilada • Hornilla agitadora • Erlenmeyer • Espátulas • Embudo de papel


ProcedimientoPreparación del medio de cultivo 1- Prepare el medio de cultivo siguiendo las instrucciones del fabric

Control de calidad1. En la bitácora de medios de cultivo anote: Número de lote, fecha de vencimiento, técnico responsable,

fecha de elaboración 2. Prueba de viabilidad: Seleccione 2 placas de manera aleatoria y raye con cepa conocida Gram positiva

(Staphylococcus aureus) y Gram negativa (Escherichia coli), incube durante 24h a 35°C, revise y anote en la bitácora

3. Prueba de esterilidad: Seleccione 2 placas de manera aleatoria e incube 4. Incube durante 24h a 35°C, revise y anote en la bitácora

Tema 2: Control de calidad en Química Clínica y Hematología

Objetivo específico Comprender la importancia del correcto seguimiento y registro del control de calidad en el uso de equipos automatizados de laboratorio.

Descripción: Los análisis de sangre son una herramienta imprescindible en la medicina moderna. Gracias a ellos se puede realizar descarte y confirmación de patologías, seguimiento de la evolución de las enfermedades y de las concentraciones de muchos medicamentos para determinar si un tratamiento surte los efectos deseados o si se debe de abordar de una manera distinta. Además, provee información sobre el estado general del paciente, de enfermedades que no padece pero que tiene riesgo de padecer, además de saber si está en condiciones óptimas para donar sangre o ser sometido a una cirugía. La mayoría de estos análisis son de carácter cuantitativo y muchos de ellos determinan analitos en concentraciones muy bajas. Por lo tanto, errores mínimos de exactitud pueden repercutir grandemente en los resultados emitidos, con lo cual no poseen la veracidad necesaria para ser de utilidad real en el seguimiento e intervención del paciente. De este modo, es necesario el control de calidad de los diferentes equipos en Química Clínica y Hematología ya que, aunque son instrumentos mecánicos, programados con métodos estandarizados, se requiere siempre el confirmar que su funcionamiento sea el óptimo para que genere resultados confiables de gran exactitud.

Materiales • Cubetas • Controles de SELECTRA PRO XS • Controles de pOCH-i 100


ProcedimientoControl de calidad en Hematología 1. Encienda el equipo y espere a que realice el enjuague inicial 2. Saque los controles y atempérelos 10 minutos a temperatura ambiente 3. En la pantalla principal del equipo seleccione QC (Quality Control) 4. Seleccione el primer control de la lista, el cual corresponde al Control Bajo (tapa roja) 5. Corrobore que el lote y fecha de vencimiento que se muestra en el equipo corresponda con el del

frasco 6. Coloque el frasco en la base verde y dentro el equipo 7. Cierre la tapa y presione Iniciar 8. Espere a que salga el resultado 9. Repita con los controles Normal (Tapa blanca) y Anormal Alto (Tapa negra) 10. Guarde los controles de vuelta en el refrigerador

Control de calidad en Química Clínica 1. Ponga a descongelar un vial de Eritrol I (marcado con un I sobre la tapa) en la incubadora a 37°C 2. Encienda el equipo y luego la computadora 3. Inicie el programa llamado Analyser 4. Seleccione “Cargar muestras” para verificar que los reactivos estén cargados y las muestras

descargadas (de lo contrario seleccione “Descargar” y proceda a retirar las copas de muestras del equipo, levantando cuidadosamente la tapa de vidrio)

5. Seleccione “Solicitud de muestra” 6. En la primera pestaña seleccione “Control” y marque la casilla de Eritrol I, en Glucosa y Triglicéridos 7. Seleccione “Cargar Muestras” y de doble click sobre el control, en el panel de la derecha en Eritrol I,

se debe marcar en amarillo la Posición 1 en el rotor 8. Trasvase el contenido del Control descongelado en una cubeta 9. Coloque la cubeta en la Posición 1 en el rotor, en el adaptador de metal 10. Baje la tapa de vidrio del equipo y de click en “Iniciar medición” 11. Una vez terminados los análisis, de click en “Evaluar resultados” 12. Revise la última entrada y verifique que el control se encuentre dentro de los rangos, para ello,

seleccione el control, luego Glucosa, y seleccione la tercer pestaña a la derecha, en el panel azul 13. Verifique que el resultado (parte superior) se encuentre dentro del Límite Inferior y Superior que se

muestran


Tema 3: Control de calidad en equipos de laboratorio

Objetivo específico:Comprender la importancia del correcto seguimiento y registro del control de calidad en el uso de equipos de laboratorio de uso cotidiano.

Descripción: Todo laboratorio requiere gran cantidad de materiales y equipos para utilizar en su labor cotidiana. La complejidad de cada equipo dependerá de las necesidades del laboratorio y del personal a cargo. De todas formas, sea simple o complejo, todo equipo requiere una verificación rutinaria que permita confirmar que las mediciones son exactas, todo en aras de ofrecer resultados fidedignos y de alta calidad.

Materiales:• Tiras reactivas de orina • Controles para autoclave • Agar sangre • Balanza granataria • Peso control para balanza

Procedimiento:Control de calidad en tiras reactivas para orina 1. Tome un tubo con reactivo control de orina 2. Sumerja la tira en la orina, extraiga y seque los excedentes 3. Espere 1 minuto 4. Lea contra el frasco de las tiras, verifique que todos los valores se encuentran como los reporta el

fabricante del control

Control de calidad de la autoclave:1. Verifique que se encuentren bien colocados los indicadores de temperatura y tiempo 2. Revise que el nivel del agua sea el correcto 3. Verifique que las válvulas y el desagüe se encuentren correctamente colocados y en buen estado 4. Autoclave un control biológico 5. Al finalizar, destape asépticamente y platee sobre un agar sangre

Control de calidad del baño maría:1. Verifique que el nivel de agua sea suficiente, de lo contrario se puede dañar el equipo. Si no es

suficiente, rellene con agua lo que sea necesario 2. Verifique que se alcance la temperatura deseada. Recuerde que se debe mantener tapado el equipo

para que se logre llegar a la temperatura meta.


Control de calidad de la cámara de flujo laminar 1. Revise la vida útil restante del filtro HEPA 2. Verifique el correcto funcionamiento de la luz ultravioleta (dejar apagada) 3. Encienda el ventilador de la cámara 4. Deje un minuto y luego suelte dentro de ella un pequeño pedazo de papel toalla 5. Éste debería devolverse en dirección a usted, con lo que se asegura que hay un flujo de aire correcto

Control de calidad de la balanza granataria 1. Encienda la balanza 2. Sin nada sobre ella, presione para calibrar el Cero 3. Coloque sobre la balanza la pesa calibrada 4. Deje presionado el botón de calibrar 5. Deje unos segundos mientras la balanza se calibra 6. Retire la pesa

Curso: Química Clínica I



Tema 1: Automatización y Urianálisis

Objetivo específicoReconocer la importancia del uso y automatización en química clínica, así como en urianálisis.

DescripciónLa automatización se define como el proceso de sustituir los métodos manuales por equipos que son capaces de realizar de manera automática los procedimientos. El equipo debe adecuarse según a las capacidades del laboratorio y el volumen de trabajo que tenga. Presenta ventajas como mayor reproducibilidad, menor incertidumbre y un ahorro de tiempo considerable, en especial cuando se requiere el mismo para realizar otras tareas.

De esta manera se han automatizado grandes cantidades de los ensayos que existen en la actualidad, sin embargo, las técnicas manuales no pierden su validez y siguen siendo de predilección en algunas ramas, como la parasitología por ejemplo.

En el caso del análisis de muestras de orina (urianálisis) existen equipos que son capaces de leer las tiras reactivas, así como otros que pueden hacer análisis de sedimento con cierto grado de precisión, sin embargo, la observación al microscopio sigue siendo óptima.


En el análisis de orina o el Examen General de Orina (EGO) se suele componer de dos partes: Análisis químico, mediante el uso de tiras reactivas; y la observación del sedimento urinario. Éstos proveen gran cantidad de información sobre el estado del sistema renal del paciente y son de gran utilidad a la hora de realizar un diagnóstico.

Materiales:• Muestras de orina • Tiras reactivas • Tubos de ensayo • Portaobjetos• Cubreobjetos

Procedimiento Automatización 1. Observe la charla sobre el funcionamiento del equipo automatizado de Química Clínica y Urianálisis.

Video2. Preste atención a cómo se corren e interpretan los resultados de los controles

Urianálisis Tiras reactivas1. Homogenice la orina en el frasco.2. Observe la muestra, realice el examen físico y anote sus observaciones.3. Trasvase una pequeña cantidad a un tubo de ensayo, cerca de unas ¾ partes de su capacidad.4. Sumerja una tira reactiva en la orina de modo que se cubran todos los cuadros reactivos, no descarte

la orina.5. Seque el excedente de orina de la tira tocando de costado sobre un papel toalla.6. Espere 1 minuto y lea los colores comparando con el frasco.

Observación del sedimento urinario1. Tome el mismo tubo con orina utilizado anteriormente y centrifugue durante 5 minutos a 1500 a

2000 rpm.2. Decante el sobrenadante en un movimiento ágil y seguro.3. Resuspenda el sedimento con la última gota.4. Coloque una pequeña gota del sedimento resuspendido sobre un portaobjetos y coloque un

cubreobjetos encima.5. Observe con lente de 4X la homogeneidad, 40X para observar las estructuras de interés: Eritrocitos,

Leucocitos, Células epiteliales, Bacterias, Cristales y Clinidros (10X)


Tema 2: I- Uso del espectrofotómetro y conceptos de espectrofotometría

Objetivos específicos 1. Aprender el uso correcto de los espectrofotómetros. 2. Conocer las bases y principios de las determinaciones espectrofotométricas. 3. Analizar la Curva de Calibración del Reactivo de Glucosa.

Descripción Las radiaciones son emisiones electromagnéticas que se transmiten a gran velocidad (unos 300.000 km/s en el vacío) y logran adoptar varias formas, una de ellas es la luz, la cual es fácilmente reconocible por nuestro sentido de la visión. Otras formas no son directamente perceptibles, como los rayos X, las radiaciones ultravioleta (UV), las radiaciones infrarrojas (IR), las microondas, las ondas de radio,

Figura 1 Espectro de luz

La longitud de onda, se simboliza por la letra griega λ, y representa la distancia en línea recta que mide un ciclo completo (entre cresta y cresta de la onda, o entre depresión y depresión de la onda), y se suele medir en nanómetros (nm).

El color de una determinada radiación se asocia con su longitud de onda, de tal manera que a cada color del espectro visible (o del invisible) le corresponda una determinada longitud de onda.

El color de una sustancia se produce porque ésta absorbe selectivamente todas las longitudes de onda procedentes de la luz blanca y transmite o refleja la longitud de onda correspondiente a sus colores. Un objeto lo vemos de cierto color, por ejemplo rojo, cuando absorbe todas las radiaciones del espectro visible, excepto la roja que es reflejada.


La radiación reflejada incide en la retina ocular y al procesarse en el cerebro produce una sensación nerviosa que llamamos “color rojo”.

Cuando la luz atraviesa un objeto sucede que ésta puede ser reflejada, difundida, absorbida, y el resto, es transmitida.

Si se considera un objeto muy transparente como, por ejemplo, un tubo de ensayo o un recipiente de vidrio especial, que contenga un líquido de cierto color, podríamos considerar que el recipiente casi no refleja ni difunde la luz que llega, por lo que, en la práctica, se considera que éstos dos fenómenos son inexistentes. Por tanto, solamente tendremos en cuenta la absorción y la transmisión.

Existen instrumentos que son capaces de proporcionarnos, de una manera directa, el valor de la absorbancia de un analito disuelto en un pequeño volumen de líquido el cual llamaremos muestra.

Estos instrumentos reciben el nombre de espectrofotómetros, los cuales poseen una doble escala en la que se relacionan valores de absorbancia con sus correspondientes valores de transmitancia (generalmente expresado en porcentaje).

Los espectrofotómetros están conformados por 5 componentes básicos 1. Fuente de energía radiante 2. Control de longitud de onda 3. Cubeta para la muestra 4. Detector 5. Sistemas de amplificación y lectura Las cubetas son los recipientes que contienen la muestra para la determinación espectrofotométrica y deben ser transparentes.

II- Análisis de glucosa y curva de calibración

Descripción La glicemia se refiere a la cantidad de glucosa que se encuentra en el torrente sanguíneo de una persona. Ésta se puede ver disminuida en casos de hipoglicemia y aumentada en circunstancias de estrés y en casos de diabetes mellitus (DM), en donde hay deficiencias en la efectividad de la insulina para integrar la glucosa a los tejidos. La glicemia en ayunas sirve como control e indicador de DM

Curva de calibración Las concentraciones desconocidas se determinan a partir de una curva de calibración en la que se gráfica absorbancia a una longitud de onda específica en función de la concentración para estándares de concentración conocida. Por lo que se refiere a las curvas de calibración que son lineales y tienen una ordenada al origen igual a cero, las concentraciones desconocidas se determinan a partir de un calibrador.


Por otro lado, no todas las curvas de calibración son lineales. Las desviaciones de la linealidad se observan casi siempre a absorbancias altas.Si diluimos progresivamente la sustancia, y en cada dilución obtenemos el valor de la absorbancia que le corresponde en la longitud de onda de la absorbancia máxima (determinada en el espectro de absorción), podemos representar otra gráfica con valores de absorbancia contra concentración de la muestra, la cual se conoce como la curva de calibración. Si obtenemos una línea recta podemos demostrar que se cumple la Ley de Lambert-Beer.

La ley de Lambert-Beer relaciona matemáticamente la intensidad de una radiación (Ii) que incide sobre un cuerpo absorbente, con la intensidad de la radiación trasmitida (It) cuando el haz atraviesa una longitud (l) de dicho cuerpo. La ley de Lambert-Beer se expresa por la ecuación:

It= Ii . e-kl

Donde k representa el coeficiente de absorción que es dependiente del tipo de sustancia, “I” la longitud del cuerpo atravesado por la radiación.

La fórmula útil de la Ley de Lambert-Beer, que nos indica que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la sustancia atravesada por la radiación es la siguiente: Donde “A” es la absorbancia, “ε” es el coeficiente de absorción molar, “c” representa la concentración del analito en la solución, y “l” la longitud del cuerpo atravesado por la radiación (ancho de la cubeta). Dado que “ε” es una constante para cada sustancia, la absorbancia depende directamente de la concentración de la sustancia.

En algunas ocasiones la muestra puede presentar componentes que interfieren directamente con la sustancia a probar, por lo que es necesario preparar un “blanco”, el cual generalmente se realiza con la solución reactivo, ajustando a cero la escala de absorbancia del espectrofotómetro. El conocimiento de la Ley de Lambert-Beer es una herramienta útil para la determinación de la concentración de sustancias como la glucosa, colesterol LDL, colesterol HDL, proteínas, entre otros. Esta práctica se pretende conocer las bases y principios de las determinaciones espectrofotométricas, siendo éstas de gran importancia en la clínica.

Materiales • Reactivo de Glucosa • Calibrador de Glucosa • Agua destilada• Espectrofotómetro • Tubos de ensayos • Micropipetas (1000 μL y 10 μL)


ProcedimientoPreparación de patrones y la curva de calibración: lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro.Si se diluye una solución de concentración conocida (patrón primario) para preparar otros patrones de diferentes concentraciones; al medir el valor de las absorbancias a una longitud de onda óptima se puede representar gráficamente estos valores (absorbancia vs concentración de la sustancia) para obtener una curva de calibración. De esta forma al tener una muestra de concentración desconocida de la misma sustancia, es posible conocer su concentración al medir su absorbancia a la misma longitud de onda e interpolar en la curva de calibración.

1. Rotular tubos con los siguientes factores de dilución 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. 2. Agregar 500 μL de agua destilada a los tubos rotulados 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16 respectivamente. 3. Tome 500uL del patrón de glucosa (suministrado por el fabricante) y dilúyalo en 500uL de agua

destilada (dilución 1:2) (tubo 1). 4. A partir del tubo 1, realice las diluciones seriadas 5. Calcular las concentraciones en mg/dL de los tubos 6. Seguidamente rotular tubos como blanco, patrón primario (suministrada por el fabricante) y los

patrones preparados (en las diluciones 1:2, 1:4 y 1:8). 7. Rotular 4 tubos: 1 2 3 y 48. Colocar 1000 μL de reactivo de glucosa a cada tubo previamente rotulado. 9. Colocar luego 10 μL de los patrones preparados (en las diluciones 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16) a cada tubo que

contiene el reactivo de glucosa. 10. Mezclar, esperar 5 min.11. Leer en el espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. 12. Grafique los resultados en Concentración v.s. Absorbancia 13. Tome una muestra incógnita y realice el mismo método 14. Grafique el punto y aproxime la concentración de la muestra (tarea)

ResultadosTabla Curva de Calibración de Glucosa

Tubo Absorbancia Concentración mg/dl

1

2

3

4Incógnita: Muestra concentración desconocida


Tema 3: Control de Calidad y Reglas de Westgard

Objetivo específicoComprender el uso e interpretación de las reglas de Westgard aplicado en el control de calidad.

DescripciónEl control de calidad es sumamente importante en cualquier práctica en el área de la Microbiología, sin embargo, en Química Clínica éste debe ser mucho más estricto y riguroso, dado que pequeñas variaciones pueden tener grandes implicaciones para un paciente. En este caso, las reglas de Westgard proporcionan una herramienta muy útil a la hora de dar seguimiento a los resultados de controles en Química Clínica, ya que con ellos podemos tener una visión más clara ante la aparición de errores sistemáticos y aleatorios, de modo que puedan ser corregidos de manera oportuna y se pueda garantizar una veracidad en los resultados que se reportan.

Materiales• Papel milimétrico • Ejercicios de Reglas de Westgard

ProcedimientoReglas de Westgard 1. Analice y grafique los datos que se le proporcionan 2. Trate de identificar todos los puntos en donde se encuentran reglas de Westgard 3. Determine si esa regla identifica un error aleatorio o sistemático

Tema 4: I- Repaso de Sedimento urinario II- Análisis de incógnitas

Materiales• Equipo de sangrado • Muestras de orina • Portaobjetos • Cubreobjetos • Tubos de ensayo • Tiras reactivas

ProcedimientoProcesamiento de incógnitas Equipo de sangrado Muestras de orina Portaobjetos


Curso: Hematología y Análisis Hematológico I



Tema 1: Determinación de hematocrito y hemoglobina

Objetivo específicoPracticar los métodos manuales para la determinación de hematocrito y hemoglobina.

DescripciónEn el cuerpo humano, los glóbulos rojos son los encargados del transporte del oxígeno a través de todo el organismo, así como de la eliminación del dióxido de carbono de los tejidos. Esto lo logran a través de una molécula llamada hemoglobina. Con ella los eritrocitos son capaces de realizar el transporte y entrega de oxígeno de manera eficiente. Sin embargo, en ocasiones puede haber una baja cantidad tanto de hemoglobina como de glóbulos rojos, los cuales pueden ser detectados mediante la cuantificación de la hemoglobina o la determinación del hematocrito.

El hematocrito no es otra cosa sino el porcentaje de sangre que corresponde a masa de eritrocitos, lo cual nos puede indicar si hay tanto una escasez de los mismos, como una disminución en su tamaño. Existen métodos como el micro hematocrito que permite realizar esta determinación con cantidades muy pequeñas de sangre. Estas herramientas son de gran utilidad en la identificación y determinación de las anemias.

Materiales• Capilares • Sangre en tubo morado • Equipo de sangrado • Tubos de ensayo • Pipetas • Micropipetas • Puntas de micropipeta • Plastilina • Microcentrífuga


ProcedimientoDeterminación de hematocrito 1. Utilice guantes en todo momento2. Tome una muestra de sangre en un tubo con EDTA 3. Homogenice y destape el tubo 4. Llene dos capilares hasta ¾ partes de su capacidad 5. Selle un extremo con plastilina y termine de compactar con el dedo 6. Coloque los capilares en la microcentrífuga, ciérrela y centrifugue durante 5 minutos 7. Realice la lectura con el lector manual y corrobore que no haya diferencia importante entre ambas

lectura

Tema 2: Realización de extendidos sanguíneos y tinción de Wright

Objetivo específicoLa realización de extendidos sanguíneos así como su tinción mediante el método de Wright.

DescripciónEn la actualidad los equipos automatizados de Hematología están ampliamente distribuidos y usualmente se encargan de realizar los hemogramas manuales en la gran mayoría de los laboratorios. Sin embargo, ante anomalías, el método ideal para la determinación de patologías hematológicas sigue siendo la observación de un extendido sanguíneo del paciente. Ésta es la mejor manera de poder identificar patologías morfológicas, funcionales, cualitativas y cuantitativas que puedan sugerir un trastorno hematológico de cualquiera de las líneas celulares.

Materiales• Portaobjetos • Sangre en tubo morado • Equipo de sangrado • Tinción de Wright

ProcedimientoExtendidos sanguíneos 1. Tome un tubo con EDTA.2. Homogenice correctamente y destape el tubo con sangre 3. Tome una gota con la esquina de un portaobjetos (inicial) 4. Coloque la gota cerca de un extremo de otra lámina (base) 5. Limpie el portaobjetos inicial, en especial los bordes 6. Coloque el portaobjetos inicial sobre la gota de sangre, con un ángulo de 30° - 45° 7. Retroceda ligeramente para que la sangre se distribuya por todo el borde del portaobjetos y luego

con un solo movimiento fluido extienda la sangre sobre la lámina base (Vea figura 1)8. Deje secar y proceda a teñir


Figura 1. Forma correcta de realizar un extendido sanguíneo.

Tinción de Wright 1. Coloque la lámina seca sobre un sostén en la pila 2. Cubra la lámina con tinción de Wright durante 2 a 3 minutos 3. Transcurrido el tiempo, agregue el Buffer sobre la lámina (sin remover el tinte) sople para mezclar

asegúrese que se forme una capa “metálica” 4. Deje con el Wright y el Buffer durante 6 a 8 minutos más.5. Lave con agua.6. Deje secar la lámina completamente.7. Observe la lámina al microscopio con lente de inmersión verifique que la tinción sea adecuada.


Tema 3: I- Diferencial leucocitario manual

Objetivo específicoReconocer la morfología de los principales tipos de leucocitos para la realización correcta de un diferencial leucocitario.

DescripciónLa revisión de una lámina de hematológica puede proveer información sobre trastornos en alguna línea celular. En el caso de leucocitos, su proliferación descontrolada se puede deber a leucemias o linfomas, dependiendo de su origen y características. Para poder determinar esto, es necesario conocer la morfología normal y patológica de los leucocitos.

El saber diferenciar una línea leucocitaria de otra, permite distinguir si hay trastornos de linajes puros o mixtos, así como determinar si las leucemias son linfocíticas o mielocíticas.

Materiales• Portaobjetos • Sangre en tubo morado • Equipo de sangrado • Tinción de Wright

Procedimiento Diferencial manual 1. Realice un extendido de una muestra de sangre y tíñalo 2. Observe al microscopio 3. Con un contador manual, vaya contando cada célula blanca que observa, según su naturaleza

(neutrófilo, linfocito, monocito, eosinófilo o basófilo) 4. Cuando el contador llegue a 100, sonará 5. Determine el porcentaje de cada linaje celular contado

II- Recuentos celulares en cámara de Neubauer

Objetivo específicoPracticar la técnica para la realización y conteo correcto de células sanguíneas en cámara de Neubauer.

Descripción:Los contadores celulares automatizados han provisto a la labor clínica de una gran herramienta que permite optimizar el tiempo y los gastos en recursos. De todas formas, los recuentos manuales de células fueron el primer método diseñado y siguen siendo de gran utilidad, particularmente a la hora de evaluar líquidos corporales como líquidos peritoneales, pericárdicos o pleurales.


Usualmente estos recuentos se realizan utilizando una cámara de Neubauer. Ésta es similar a un portaobjetos, pero cuenta con una cuadrícula para medir un área específica, a la vez que cuenta con una profundidad específica de modo que se puede reportar la cantidad de células y relacionarlas con un volumen.

A la hora de contar, usualmente los leucocitos se cuentan en los 4 cuadrantes de cada esquina de la cuadrícula, mientras que eritrocitos y plaquetas se cuentan dentro del cuadro del centro (que tiene una cuadrícula más pequeña) nuevamente en las esquinas más un cuadro del centro.

Materiales: • Cámara de Neubauer • Sangre en tubo morado • Equipo de sangrado • Micropipetas • Puntas de micropipeta • Tubos de ensayo • Solución de Turk

ProcedimientoRecuento de leucocitos 1. Realice una dilución 1:20 de la sangre total, utilizando 20uL de sangre en 380uL de solución de Turk,

ésta permite destruir los eritrocitos sin dañar los glóbulos blancos, además que permite evidenciar mejor a éstos

2. Coloque la cámara de Neubauer con un cubreobjetos sobre la cuadrícula 3. Con una micropipeta, vierta lentamente sobre el borde del cubreobjetos un poco de la sangre diluida

hasta q se llene la cuadrícula, no se exceda con el volumen 4. Observe al microscopio en alto poder (no inmersión) 5. Cuente los leucocitos de los cuadrantes de las esquinas 6. Calcule la cantidad de leucocitos por microlitro de muestra

Recuento de eritrocitos 1. Realice una dilución 1:200 de la sangre total, utilizando 10uL de sangre en 1990uL de solución salina 2. Coloque la cámara de Neubauer con un cubreobjetos sobre la cuadrícula 3. Con una micropipeta, vierta lentamente sobre el borde del cubreobjetos un poco de la sangre diluida

hasta q se llene la cuadrícula, no se exceda con el volumen 4. Observe al microscopio en alto poder (no inmersión) 5. Realice el conteo en el cuadro del centro, contando en cinco cuadrados pequeños (las 4 esquinas y

uno central) 6. Calcule la cantidad de eritrocitos por microlitro de muestra

Tema 4: I- Repaso de Morfología celular


Tema 4: I- Repaso de Morfología celular II- Prueba practica

Materiales • Equipo de sangrado • Portaobjetos • Tinción de wrigth• Aceite de inmersión• Microscopio

Procedimiento Procesamiento de incógnitas 1. Siga las instrucciones de su docente, analice y procese las incógnitas que le sonentregadas, utilizando los métodos estudiados en los laboratorios vistos.


IV Nivel


Curso: Microbiología II

Competencias1. Conoce y aplica los conocimientos básicos de la microbiología, bacteriología, micología, virología,

parasitología, y asiste en los métodos de laboratorio que desarrolla el Microbiólogo.

Tema 1: Muestras faríngeas

Objetivo específicoPracticar la correcta obtención y procesamiento de muestras faríngeas.

DescripciónLas bacterias están presentes en todo nuestro organismo, desde la piel hasta lo largo del tracto gastrointestinal. En él actúan como flora normal comensal o contribuyendo al desdoblamiento de sustancias a nivel de intestinos. En algunos casos, una proliferación descontrolada o una lesión en el epitelio puede causar una infección de los tejidos por parte de la flora normal o de patógenos adquiridos del ambiente, provocando la enfermedad.

Las faringitis o infecciones de la faringe, se caracterizan por dolor en la zona, afonía, dolor al tragar, puede cursar con fiebres y flemas amarillentas.

En estos casos, se puede obtener una muestra faríngea para teñir y cultivar, con el fin de determinar qué bacteria es la causante del cuadro y poder establecer un esquema de tratamiento eficaz para favorecer la pronta recuperación del paciente.

Se pueden utilizar medios como el Agar Sangre, al igual que el Manitol-Sal para el aislamiento de cocos Gram positivos, al igual que Agar Chocolate cuando se sospecha de un posible Haemophilus influenzae.

Materiales• Microscopio • Portaobjetos • Tinción de Gram • Torundas estériles • Solución salina estéril • Agar Sangre • Agar McConkey • Agar Manitol-Sal • Bajalenguas • Cultivo mixto de E. coli/S. aureus


ProcedimientoProcesamiento de muestras faríngeas 1. Tome una muestra faríngea de un compañero, utilizando bajalenguas y torundas estériles humedecidas,

tal y como se vio en el curso Microbiología I 2. Tome tres torundas: Dos para realizar cultivos y una para realizar tinción de Gram 3. Con una torunda raye el agar sangre y el McConkey, raye con otra el Manitol-Sal 4. Coloque una gota de agua en un portaobjetos y use la tercer torunda para realizar un frotis 5. Proceda a realizar una tinción de Gram de la muestra 6. Observe en busca de predominancia de algún morfotipo bacteriano 7. Realice tinciones del cultivo mixto como control de calidad de la tinción

Lectura de Placas 1. Analice los microorganismos que crecieron en las placas 2. Determine la presencia de bacilos Gram negativos, lactosa positivos o negativos 3. Determine la presencia de cocos Gram positivos, manitol positivos o negativos

Tema 2: Coprocultivos y Urocultivos

Objetivo específicoPracticar el método correcto para el procesamiento bacteriológico de muestras de orina y heces.

DescripciónEn ocasiones, ya sea por alimentos o por contaminaciones cruzadas, las personas pueden ingerir bacterias enteropatógenas que pueden causar casos de gastroenteritis desde leves hasta severas. Si bien, la mayoría son autolimitados, es decir, resuelven por sí mismos, cuando el cuadro es muy fuerte se puede solicitar un coprocultivo. La muestra de heces es rayada en agares selectivos, dado que está normalmente colonizado por una amplia gama de microorganismos. Los agares más utilizados suelen ser Agar Sangre, Agar McConkey y Agar SS (Salmonella/Shigella), aunque dependiendo de la sospecha se pueden adicionar otros como Agar TCBS para detección de vibrios como Vibrio cholerae o V. parahaemolyticus.

En el caso del tracto urinario, es más comúnmente asociado a infecciones por enterobacterias, principalmente E. coli, y es más común en mujeres, dada la proximidad las bacterias a zonas más profundas del tracto, como la vejiga.

En estos casos, se suele rayar con un asa calibrada un Agar Sangre, (haciendo una línea recta y luego rayando perpendicularmente) y luego se raya normalmente un Agar McConkey. El asa calibrada se debe a que permite posteriormente la cuantificación de las bacterias, lo cual es de importancia para el médico tratante.


Materiales• Microscopio • Portaobjetos • Tinción de Gram • Torundas estériles • Agar Sangre • Agar McConkey • Cultivo mixto de E. coli/S. aureus

Procedimiento Procesamiento de muestras de heces 1. Utilizando una torunda estéril, pique la muestra en varias zonas para obtener cierta uniformidad en

la recolección 2. Raye con la torunda un McConkey e incube a 35°C por 24h 3. Con un palillo, realice un extendido fino de las heces en un portaobjetos 4. Deje secar, fije y realice tinción de Gram Modificado para Campylobacter5. Observe en busca de predominancia de algún morfotipo bacteriano

Lectura de placas 1. A las 24h, revise las placas y anote las características de las colonias que crecieron. Observe si

predomina alguna colonia en particular.

Tema 3: Serología microbiana

Objetivo específico • Conocer los tipos de metabolismo bacteriano utilizando las pruebas bioquímicas. • Realizar las pruebas catalasa, oxidasa y coagulasa para identificar bacterias.

DescripciónEl metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos. Asimismo, se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son intracelulares, aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas por la célula para catalizar reacciones fuera de esta.

Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su inoculación en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes esenciales necesarios para su crecimiento.


Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de indicadores de pH para detectar la producción de ácido, con inhibidores selectivos como bilis, cianuro o con colorantes, sulfuros, etc; que facilitan la determinación de diferentes actividades metabólicas. Las actividades que se evalúan con mayor frecuencia son: capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), para catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas hidrolíticas específicas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, catalasa y coagulasa.

La importancia que tienen estas pruebas bioquímicas para la identificación de especies bacterianas en áreas de alimentos, clínica y ambiental, se han desarrollado sistemas bioquímicos miniaturizados (Api), Micro ID, Microgen que se realizan en forma más rápida y segura pero que mantienen los criterios de evaluación de las pruebas bioquímicas convencionales.

Los microorganismos pueden ser separados e identificados de acuerdo a una gran variedad de razones, tales como: Determinación de patógenos responsables de enfermedades infecciosas, selección y aislamiento de cepas de microorganismos fermentativos necesarios para la producción industrial de alcoholes, solventes, vitaminas, ácidos orgánicos, antibióticos e enzimas industriales, aislamiento y desarrollo de cepas microbianas que puedan ser utilizadas para la producción de alimentos y mejoramiento de su sabor como son el yogurt, quesos y productos lácteos y por ultimo comparación de actividades bioquímicas con propósitos taxonómicos.

Las pruebas bioquímicas sirven para detectar propiedades fisiológicas y bioquímicas, debido a que éstas demuestran la existencia de ciertas enzimas en las vías metabólicas, que son reflejo de la expresión de un determinado gen en el DNA bacteriano. La suma total de todas las reacciones químicas es definida como metabolismo celular, y las transformaciones bioquímicas que ocurren dentro y afuera de la célula se encuentran gobernadas por catalizadores biológicos llamados enzimas. Las enzimas son proteínas muy específicas que realizan sólo una reacción química en el metabolismo de la bacteria.

Las complejas reacciones químicas que debe efectuar un microorganismo son producto de la acción colectiva de grupos enzimáticos, que llevan a cabo la síntesis o degradación de cierto sustrato, por ejemplo, la oxidación de la glucosa hasta dióxido de carbono y agua es producto de enzimas encargadas de la glicólisis, el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Las enzimas son producidas en la célula, pero de acuerdo al lugar donde efectúan su acción se pueden clasificar en endoenzimas y exoenzimas. Las primeras son intracelulares y su función está relacionada con las reacciones de degradación y síntesis de sustratos en el interior de la célula, en tanto que las exoenzimas son excretadas a través de la pared celular con el fin de producir los cambios necesarios en los nutrientes del medio ambiente y así permitir el ingreso de éstos a la célula.

Según sus propiedades, las pruebas bioquímicas se pueden clasificar en: Enzimas extracelulares como: hidrólisis del almidón, hidrólisis de los lípidos, hidrólisis de la caseína, hidrólisis de la gelatina y en Enzimas intracelulares como: fermentación de los carbohidratos, producción de sulfuro de hidrógeno, reducción de los nitratos, reacción de la catalasa, test de la ureasa, test de la oxidasa, test de la coagulasa, hidrólisis


de la sangre, Pruebas IMVIC, (Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer, Utilización del Citrato)y Agar tres azúcares. Un ejemplo es la Prueba del indol la cual se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol +) de los otros coliformes (indol -). Esta enzima degrada el aminoácido triptófano a indol, que es el compuesto que se detecta en este ensayo

CatalasaLos peroxisomas son orgánulos citoplasmáticos muy comunes en forma de vesículas pequeñas de 0,15 a 1,5 um. Delimitadas por una membrana sencilla que usualmente contiene una fina matriz granular, así como las enzimas oxidasas y catalasas. Estas enzimas cumplen funciones de detoxificación celular. La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrogeno (H202) en oxígeno y agua. El peróxido de hidrogeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos pero por su toxicidad debe transformarse rápidamente en compuestos no peligrosos para las células (oxígeno y agua). La deficiencia de catalasa produce acatalasia, esta enfermedad se caracteriza por la ausencia de catalasa en los glóbulos rojos y se asocia con lesiones orales ulcerantes. Gracias a la existencia de catalasa en los tejidos animales podemos utilizar el agua oxigenada como desinfectante, al aplicarla sobre una herida las bacterias patógenas que son anaeróbicas mueren porque no pueden vivir con oxígeno (que se produce cuando la catalasa actúa sobre el agua oxigenada).

OxidasaPrueba de la citocromo c oxidasa: Los citocromos son proteínas que forman parte de algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo respirador. Esta prueba permite diferenciar bacterias como por ejemplo Entero bacterias (carecen del citocromo c) del género Pseudomonas (poseen citocromo c).

Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromo C oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa. Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son: Tetrametil-p-fenilendiamina, Dimetil-p-fenilendiamina y Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo.


CoagulasaLa coagulasa es una proteína producida por varios microorganismos que permite la conversión del fibrinógeno en fibrina. En el laboratorio, se usa para distinguir entre diferentes tipos de Staphylococcus. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra contiene Staphylococcus aureus. Esta proteína también es producida por Yersinia pestis. La coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre. El complejo resultante se llama estafilotrombina, y permite que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina. Esto hace que se coagule la sangre, está estrechamente relacionada con la superficie de la bacteria S. aureus y puede revestir su superficie con fibrina al entrar en contacto con la sangre.

S.aureus posee dos tipos de coagulasa: endocoagulasa o coagulasa ligada o “clumping factor” que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos o grumos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado (test en lámina); exocoagulasa o coagulasa libre que actúa mediante la activación de un factor (CRF), formándose un complejo coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibrinógeno produciéndose un coágulo de fibrina (test en tubo).

Materiales• Microscopio • Portaobjetos • Solución salina estéril• Torundas estériles • Reactivo de catalasa (agua oxigenada)• Reactivo oxidasa• Reactivo coagulasa• Cepas de bacterias en placa• Hojas de bisturí • Placas de agar nutritivo • Baja lenguas estéril• Asa bacteriológica


ProcedimientoOxidasa1. Añadir en un papel unas gotas del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio (incoloro). 2. Coger con un palillo unas cuantas colonias aisladas en placa de Pseudomona aeruginosa y mezclar

con el colorante. 3. El colorante se oxida rápidamente en presencia del citocromo c produciendo formas coloreadas (azul).

Si la prueba es negativa no habrá viraje (conviene utilizar controles positivo y negativo). 4. Repetir la prueba con Escharichia coli.

Catalasa1. Colocar una gota de H2O2 al 3% sobre un portaobjetos2. Transferir una porción de colonia de Staphylococcus aureus sobre el reactivo realizando una

emulsión. 3. Debe tomarse la colonia a partir de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de

catalasa y pueden falsear los resultados.4. Detectar la formación de burbujas5. Esta prueba también puede realizarse en un aislamiento en tubo, simplemente colocando unas

gotas de H2O2 dentro del mismo. Figura 1. prueba de catalasa

6. Repetir la prueba con la cepa Streptococcus sp7. El desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva. 8. Anotar el resultado Coagulasa


CoagulasaPrueba en portaobjetos1. Colocar una gota de la colonia Sthaphilococcus aureus y emulsificar en una gota de plasma de

conejo2. Esperar 1 minuto.3. Anotar el resultado4. El resultado es positivo cuando se ve un precipitado en el portaobjetos, ver figura 25. Si el resultado es negativo realizar la prueba en tubo.6. Repetir el procedimiento con una cepa de Staphilococcus epidermidis.

Prueba en tubo1. Mezclar un asa cargada con el microorganismo obtenido de un cultivo en medio sólido, ó 0,1 mL de

un cultivo en un medio líquido, con 0,5 mL de plasma de conejo, contenido en un tubo pequeño de aproximadamente 7 mm de diámetro. Figura 3. Interpretación de la prueba coagulasa en tubo.

2. Incubar en baño de agua a 37°C y examine periódicamente. 3. Se considera que la prueba es positiva si el plasma es coagulado en 3 a 4 horas, aunque algunas cepas con

escasa producción de coagulasa sólo coagulan el plasma después de 24 horas de incubación.


Resultados

Prueba de Oxidasa

1. Tome un cultivo de E. coli y Pseudomonas sp 2. Saque una tira reactiva de Oxidasa y pártala a la mitad 3. En cada mitad de la tira, utilizando un palillo de madera, coloque una o dos colonias de una de las

bacterias (una bacteria en cada mitad) 4. Si el papel cambia a un color azul en el transcurso de 10s, la prueba se considera positiva 5. En caso de no cambiar de color o cambiar luego de los 20s, se considera negativa

Prueba de Catalasa 1. Tome un cultivo de S. aureus y Streptococcus sp 2. Asegúrese que los cultivos NO provengan de Agar Sangre 3. Coloque varias colonias sobre un portaobjetos 4. Agregue una gota del reactivo de Catalasa (Peróxido de Hidrógeno al 15%) 5. La formación inmediata de burbujas indicará una reacción positiva, de lo contrario será negativa 6. La formación de burbujas luego de 20 a 30s NO se considerará positiva

Cepa

Pseudomonas aeruginosa

Escherichia coli

Gram Oxidasa

Cepa

S. aureus

S. epidermidis

Steptococcus sp.

Gram Catalasa Coagulasa


Tema 4: Antibiogramas

Objetivos específicosReconocer la importancia y los pasos para el montaje e interpretación de pruebas de resistencia a los antibacterianos.

DescripciónLas infecciones bacterianas pueden atacar prácticamente cualquier tejido en el cuerpo humano. Dependiendo de su severidad, pueden ser auto limitadas ya que el sistema inmune es capaz de responder efectivamente y resolver el proceso infeccioso. Sin embargo, en muchos casos es necesaria una terapia de apoyo con antibióticos de modo que ataquen a las bacterias patógenas y se pueda resolver más fácil y eficazmente la infección, dado que en muchos casos, podrían comprometer la vida de los pacientes. A pesar de ello, muchas cepas bacterianas han desarrollado mecanismos de resistencia a los distintos antibióticos, principalmente por el abuso en el tratamiento de éstos, así como el poco apego de los pacientes a los esquemas prescritos. Esto genera la proliferación de cepas bacterianas con características selectivas que le favorecen su crecimiento en presencia de ciertos antibióticos, con lo cual el uso del mismo se torna ineficaz.

La resistencia a un antimicrobiano se define como la capacidad de un microorganismo a resistir las concentraciones terapéuticas del medicamento sin alcanzar dosis tóxicas para el paciente.

Para determinar si hay o no resistencia a los antibióticos se han diseñado innumerable cantidad de técnicas, como por ejemplo, el método de Kirby-Bauer. En éste, se colocan sobre un cultivo de la bacteria de interés, discos impregnados de diferentes antibióticos. El antibiótico difunde a través del agar, diluyéndose al alejarse y creando un halo de inhibición alrededor, según sea la sensibilidad de la bacteria al agente. Por tanto, mientras más grande sea el halo, mayor será la sensibilidad de la bacteria a ese antibiótico en particular. Posteriormente se mide con regla el diámetro del halo de inhibición y se compara con lo reportado por el fabricante para determinar el grado de sensibilidad. Cabe destacar que éste método es meramente cualitativo, pues no ofrece manera de conocer la concentración mínima inhibitoria (MIC) del antibiótico.

Éste método siempre debe contar con un control de calidad correspondiente a cepas ATCC (American Type Culture Collection) estandarizadas que generan un halo de tamaño conocido, de modo que se pueda controlar que el método funciona correctamente.


Materiales• Portaobjetos • Tinción de Gram • Placas de agar Mueller-Hinton • Cepas ATCC• Hisopos estériles • Soluciones de McFarland 0.5 • Agua destilada • Tubos de ensayo

Procedimiento Antibiograma 1. Realice una tinción de gram de las cepas disponibles 2. Seleccione una bacteria para ser trabajada 3. Coloque una a una, colonias de la bacteria seleccionada en un tubo con 3mL de agua destilada hasta

alcanzar una turbidez de McFarland 0.5 4. Sumerja una torunda estéril y escurra el exceso de líquido en la pared del tubo 5. Raye en 3 direcciones toda la placa, asegurándose de cubrir toda su superficie 6. Deje secar 5 minutos y, utilizando pinzas, coloque los discos con antibióticos equidistantemente

entre ellos y el borde del plato 7. Entre cada cambio de disco sumerja las pinzas en alcohol y quémelas con la lámpara de alcohol 8. Incube a 35°C por 18h 9. Mida el diámetro de la zona de inhibición alrededor de cada uno de los discos con antibiótico 10. Consulte los valores normales de diámetros de inhibición de las cepas ATCC y determine si funcionó

adecuadamente 11. Determine si su cepa es suceptible, intermedia o resistente a los antibióticos utilizados

Lectura de Placas 1- Analice los microorganismos que crecieron en las placas


Tema 5: Incógnita prueba práctica

Materiales • Portaobjetos• Tubos de ensayo • Microscopio• Medios de cultivo • Cultivo mixto• Asas bacteriológicas• Mechero• Cubreobjetos• Solución salina estéril• Torundas estériles • Reactivo de catalasa (agua oxigenada)• Reactivo oxidasa• Reactivo coagulasa

ProcedimientoSiga las instrucciones de su docente, y analice las muestras si es necesario realice tinciones o el cultivo de los microorganismos que le correspondieron, utilizando las técnicas estudiadas en los laboratorios vistos.


Curso: Química Clínica II

Competencias1. Conoce y aplica los conocimientos básicos de microbiología, parasitología y química clínica, interviene

en la preparación de reactivos, aprende e identifica los diversos conocimientos de control de calidad en asistencia integral al profesional en microbiología.

Tema 1: Factores que afectan la cinética enzimática

Objetivo específicoComprender los procesos que pueden afectar la cinética enzimática y las repercusiones que puede tener en un análisis de química sanguínea.

DescripciónLas enzimas son proteínas capaces de actuar como catalizadores de reacciones. Mediante ellas se suelen dar la mayoría de las reacciones químicas del organismo en tiempos cortos, de modo que se puede mantener un ritmo que permite al cuerpo metabolizar, almacenar, modificar y excretar sustancias. A nivel de laboratorio las enzimas se pueden utilizar para catalizar reacciones con sustratos sintéticos de modo que, en presencia de un analito particular, se genere una sustancia coloreada, cuya concentración se puede determinar mediante espectrofotometría.

Sin embargo, cada enzima tiene condiciones particulares que optimizan su rendimiento y actividad, así como condiciones que pueden disminuir su desempeño o alterar la velocidad de conversión de los sustratos en productos. Entre estas condiciones se pueden mencionar el pH, temperatura, cantidad de sustrato y cantidad de enzima.

Materiales• Equipo de sangrado • Centrifuga • Micropipetas • Tubos de ensayo • Reactivo de ALP• Espectrofotómetro • HCl • NaOH • Baño María


Procedimiento1. Tome tres tubos de ensayo y rotúlelos como 1, 2 y 3 2. Agregue al tubo 1 una gota de HCL, al tubo 2 una gota de NaOH y al tubo 3 una gota de agua 3. Siga el procedimiento con cada tubo para realizar una prueba de ALP utilizando la misma muestra en

los 3 casos

Temperatura1. Tome tres tubos de ensayo y rotúlelos como 1, 2 y 3 2. Siga el procedimiento con cada tubo para realizar una prueba de ALP utilizando la misma muestra en

los 3 casos, pero realice la incubación del tubo 1 en refrigeración, el tubo 2 a temperatura ambiente y el tubo 3 en baño maría a 37°C

Cantidad de sustrato 1. Tome cinco tubos de ensayo y rotúlelos como 1, 2, 3, 4 y 5 2. Siga el procedimiento con cada tubo para realizar una prueba de ALP utilizando la misma muestra en

los 5 casos 3. En el tubo 1, siga las instrucciones al pie de la letra 4. En el tubo 2 agregue el doble de la cantidad de sustrato indicada 5. En el tubo 3 agregue el triple de la cantidad de sustrato indicada 6. En el tubo 4 agregue cuatro veces la cantidad de sustrato indicada 7. En el tubo 5 agregue cinco veces la cantidad de sustrato indicada

Cantidad de enzima 1. Tome cinco tubos de ensayo y rotúlelos como 1, 2, 3, 4 y 5 2. Siga el procedimiento con cada tubo para realizar una prueba de ALP utilizando la misma muestra en

los 5 casos 3. En el tubo 1, siga las instrucciones al pie de la letra 4. En el tubo 2 agregue el doble de la cantidad de suero indicada 5. En el tubo 3 agregue el triple de la cantidad de suero indicada 6. En el tubo 4 agregue cuatro veces la cantidad de suero indicada 7. En el tubo 5 agregue cinco veces la cantidad de suero indicada


Tema 2: Determinación de la curva de tolerancia a la glucosa e isoenzimas

Objetivo específicoReconocer los pasos para la realización de una curva de tolerancia a la glucosa, así como el proceso para la determinación de isoenzimas de fosfatasa alcalina.

Descripción: La glicemia se refiere a la cantidad de glucosa que se encuentra en el torrente sanguíneo de una persona. Ésta se puede ver disminuida en casos de hipoglicemia y aumentada en circunstancias de estrés y en casos de diabetes mellitus, en donde hay deficiencias en la efectividad de la insulina para integrar la glucosa a los tejidos.

La glicemia en ayunas sirve como control e indicador de esta última patología, aunque existen métodos de menor complejidad, como son el uso de glucómetros.

El glucómetro utiliza sangre total obtenida de un capilar, usualmente la punta de un dedo de la mano, para realizar una determinación de glucosa rápida y poco invasiva. Sin embargo, ésta es de mayor utilidad en pacientes diabéticos para realizar el seguimiento diario, mas no así para pacientes sanos o para diagnóstico, ya que el margen de error de estos métodos puede alcanzar hasta un 20%. De todas formas, es de utilidad en el seguimiento de pacientes diabéticos ya que éstos, al descompensarse suelen tener picos altos o bajos que son muy marcados y superan con creces este margen de error.

Sin embargo, no solo la glicemia es de importancia a nivel clínico, sino que se pueden determinar gran cantidad de otros analitos, incluyendo enzimas. Las enzimas son proteínas que catalizan diversas reacciones en el organismo y el aumento en sus niveles en sangre puede relacionarse directa o indirectamente con patologías. En algunos casos es necesario una interpretación o pruebas adicionales más allá del resultado total, dada la presencia de isoenzimas. Las isoenzimas son enzimas que cumplen la misma función, es decir, catalizan la misma reacción, pero son distintas estructuralmente. Esto favorece que, al determinar las isoenzimas presentes, se sepa de qué parte del cuerpo proviene cada una. Por ejemplo, en el caso de la ALP (Fosfatasa alcalina) se puede determinar si el origen del aumento es óseo o hepático al realizar una prueba de resistencia térmica.

Materiales • Equipo de sangrado • Micropipetas • Tubos de ensayo• Reactivo de ALP • Espectrofotómetro


Procedimiento Uso del glucómetro 1. Revise que las tiras no se encuentren vencidas 2. Para el control de calidad introduzca en el glucómetro una tira sin usar, si funciona correctamente

debe: aparecer la pantalla completa, hora y el símbolo de gota parpadeando 3. Control (si hay disponible): Lávese bien las manos, deje atemperar las tiras y el control. Verifique que

el control no esté caduco. 4. Coloque la tira en el medidor 5. Homogenice suavemente el control y descarte una gota, luego deje caer una gota en el extremo de

la tira reactiva 6. Quite la tira cuando el glucómetro suene 7. Espere el resultado y compare con la lista de control

Curva de tolerancia a la glucosa 1. Para realizar la curva deberá tomar una medición de glucosa de un compañero a la hora de entrar,

luego el compañero beberá de la solución de glucosa (Gluco-Cola) y se le repetirá la medición 1h después y 10 minutos antes de terminar la sesión

2. El compañero debe lavarse bien las manos y secarlas 3. Coloque la punta de la lanceta en la yema del dedo y realice la punción 4. Pida a su compañero que baje la mano por debajo de la cintura y masajee suavemente la mano para

promover la formación de la gota (no “ordeñe” el dedo) 5. Coloque la gota en la tira y previamente colocada en el glucómetro, debe aparecer el símbolo de gota

parpadeante

Isoenzimas de ALP 1. Tome dos tubos de ensayo y rotúlelos como 1 y 2 2. Agregue una parte de la muestra en un tubo aparte 3. Incube a 65°C durante 30 min 4. Siga el procedimiento con la muestra con y sin tratamiento térmico para realizar una prueba de ALP

utilizando la misma muestra en ambos casos


Tema 3: Depuración endógena de creatinina

Objetivo específicoPracticar el procedimiento para la realización de pruebas de depuración endógena de creatinina.

DescripciónEl sistema renal es aquel encargado de la depuración y descontaminación de la sangre, al filtrarla y separar las impurezas para finalmente ser descartadas en la orina. Además el riñón cumple funciones endocrinas al secretar eritropoyetina, la cual favorece la producción de glóbulos rojos; así como regular el equilibrio ácido-base del organismo.

En ocasiones los riñones pueden ser afectados por traumas y patologías, por ejemplo, la diabetes y la hipertensión generan mucha presión sobre los vasos del glomérulo, causando que colapsen ya que son muy frágiles, por lo que el riñón pierde paulatinamente su funcionalidad. En el caso de pacientes hospitalizados por una patología ajena a los riñones, el compromiso de los mismos puede jugar un papel determinante en la mejoría en incluso la supervivencia del paciente.

Para medir la funcionalidad del riñón existen muchas pruebas, siendo la depuración endógena de creatinina la más utilizada. Ésta consiste en el cálculo de un índice entre la creatinina sérica y la creatinina secretada en orina de 24 horas (1440 minutos) por el paciente, además del volumen total recolectado. De ésta manera se puede calcular el volumen filtrado por los riñones por unidad de tiempo y determinar si hay algún compromiso en su funcionalidad de modo que pueda ser intervenida a tiempo y prevenir su evolución.

Materiales• Micropipetas • Tubos de ensayo• Reactivo de creatinina • Espectrofotómetro • Muestras de suero • Muestras de orina

ProcedimientoDepuración endógena de creatinina 1. Seleccione una muestra de orina de 24h o un frasco obtenido de una 2. Seleccione un suero. Suponga que fue tomada la muestra en el transcurso de las 24h 3. Realice la prueba de creatinina en el suero y en la orina como indica el kit. Preste principal atención a

la dilución de la muestra de orina 4. Realice el cálculo de la depuración endógena de creatinina de la siguiente manera:


Flujo de orina (mL/min): Volumen de orina (mL) 1440 minutos Depuración de creatinina (mL/min): creatinina en orina (mg/dL) x Flujo de orina (mL/min) creatinina sérica *En caso de utilizar frasco con orina y no galón, asuma que el volumen total fuese 880 mL/24h

Tema 4: Drogas terapéuticas y de abuso

Objetivo específicoReconocer las técnicas básicas del uso de pruebas rápidas en la determinación de drogas de abuso.

DescripciónEn la actualidad el consumo de drogas de abuso con fines recreacionales se ha establecido como una práctica común, principalmente en los estratos jóvenes de la sociedad. Esto puede llevar no solo a los efectos agudos que producen estas sustancias, sino a sobredosis que pueden comprometer la vida de quien los consume, así como genera dependencias, síndromes de abstinencia y adicciones. Por tanto, en muchos ámbitos como el deportivo y en algunos campos laborales se ha hecho común el tamizaje de las personas por distintas drogas, las cuales se pueden utilizar tanto como dopaje para mejorar el rendimiento, así como recreación, pero que puede comprometer la seguridad en su labor, por ejemplo, en un piloto de avión.

Por ello, se han desarrollado gran cantidad de técnicas de diversas sensibilidades para la detección de las mismas, pero quizás la más común es la prueba de drogas de abuso en orina. Actualmente se cuentan con versiones comerciales de frascos de orina que incluyen tiras reactivas que presentan líneas de positividad para diversos analitos. La cantidad de analitos puede variar según la marca, pero usualmente cuentan con detección de THC (tetrahidrocanabinol, compuesto activo de la marihuana), cocaína y barbitúricos, aunque pueden incluir también MDMA (éxtasis) y anfetaminas.

A pesar de ello, no todas las drogas detectadas en el laboratorio son de abuso. En casos de terapias con ciertos fármacos cuyo rango de toxicidad es estrecho, se suele llevar control de la concentración plasmática de la droga en el paciente, por ejemplo, con los inmunosupresores en personas con enfermedades autoinmunes o trasplantes. De esta manera se garantiza que la droga se encuentre en el rango terapéutico, es decir, en la concentración suficiente para ser eficaz, pero sin ser tanta que sea tóxica.

Materiales• Frasco de orina para drogas • Muestras de orina positivas

ProcedimientoDeterminación de drogas en orina 1. Siga las instrucciones provistas por el fabricante para el uso del frasco


V Nivel


Curso: Serología y Banco de Sangre

Competencias1. Colabora en términos asistenciales en la realización de procedimientos especializados de la

microbiología y química clínica.

Tema 1: Pruebas rápidas

Objetivo específicoPracticar el uso e interpretación de pruebas rápidas en serología.

DescripciónLa serología se basa en la detección de anticuerpos o el uso de los mismos para la detección de antígenos. Mediante este principio se puede realizar detección de microorganismos, así como detección e incluso cuantificación de analitos. Las técnicas van desde metodologías muy complejas hasta sencillas, tal es el caso de las pruebas rápidas. Éstas suelen constar de un sistema de inmunocromatografía el cual consta de un sistema similar al ELISA que se va desarrollando conforme la muestra va fluyendo a través del papel. La interpretación de un positivo podrá ser de 1 o 2 líneas dependiendo si el sistema es de captura o de inhibición, por lo que es importante siempre revisar el kit con el que se cuenta.

Estas pruebas generalmente logran descartar los negativos, sin embargo, en muchos casos los positivos se deben confirmar con un método más sensible y específico, dado que la mayoría de éstas pruebas no tienen valor concluyente por sí solas. En la actualidad se cuentan con pruebas rápidas para heces, orina y suero y se pueden detectar analitos (pruebas de embarazo), bacterias (Helicobacter pylori), virus (VIH), drogas (THC), entre otros.

Materiales• Muestras positivas• Kits de pruebas rápidas

ProcedimientoPruebas rápidas 1. Según sea el kit que le corresponda, siga las instrucciones proporcionadas por el fabricante


Tema 2: Grupos sanguíneos

Objetivo específicoComprender y practicar el procedimiento para la realización e interpretación de grupos sanguíneos.

DescripciónLa sangre es un tejido que puede ser pasado de una persona a otra mediante transfusiones. Con ello se salvan miles de vidas al año, ya que se logra estabilizar a pacientes durante cirugías o luego de algún accidente. Para poder realizar una transfusión se requiere que el receptor no rechace la sangre que se le administra, es decir, que ésta sea compatible.

Existen una gran cantidad de grupos sanguíneos como Duffy, Kidd, Lewis, Kell, Lutheran, por mencionar algunos, sin embargo, los de mayor importancia dada la frecuencia e intensidad de las reacciones adversas provocadas por incompatibilidad son los grupos ABO y Rh.

El grupo ABO está compuesto por tres genotipos en los cuales A y B son codominantes y O es recesivo. En el caso del grupo A, los eritrocitos estarán recubiertos por moléculas de N-acetilgalactosamina, mientras que el grupo B transcribe para moléculas de galactosa. El grupo sanguíneo O, no es otra cosa que la ausencia de antígenos A y B, es decir, no hay un antígeno O.

Sin embargo, un grupo sanguíneo no se define únicamente por los antígenos que recubren al eritrocito, sino también por los anticuerpos que presenta el paciente. Los anticuerpos son moléculas con forma de “Y” las cuales reconocen antígenos específicos y se adhieren fuertemente a ellos, para posteriormente ser reconocidos por el sistema inmune. En el caso de los eritrocitos, cuando se adhieren gran cantidad de eritrocitos mediante anticuerpos se forman mallas o “botones” que se pueden ver a simple vista, a causa de un fenómeno de aglutinación. La aglutinación es una forma sencilla de determinar que un antígeno y un anticuerpo reaccionaron entre sí. Así, al haber reacción antígeno-anticuerpo habrá aglutinación, formándose un botón fuerte; de lo contrario, con una leve agitación se deshace el botón, siendo negativa la reacción.

Los anticuerpos que el paciente tenga serán todos aquellos que NO posea en sus eritrocitos, es decir, una persona con eritrocitos A no puede tener anticuerpos anti-A, dado que atacarían al mismo paciente (esto solo sucede en enfermedades autoinmunes). Los grupos se describen en la siguiente tabla:

Grupo Antígenoen eritrocitos

Anticuerposen suero

A A Anti-B

B B Anti-A

AB AB Ninguno

O Ninguno Anti-A, Anti-B


Los anticuerpos se encuentran en el suero o plasma, de modo que para realizar un grupo sanguíneo se requiere centrifugar el tubo para separar los eritrocitos del plasma y utilizarlos por separado para ambas determinaciones. Es de vital importancia que siempre se realicen ambos grupos, dado que se pueden encontrar discrepancias sérico-eritrocitarias que pueden dar pie a diagnóstico de condiciones relevantes del paciente.

En el caso del grupo Rh sólo se evalúa presencia o ausencia (positivo/negativo) y su principal antígeno es el antígeno D.

Materiales• Tubos morados con sangre • Tubos de ensayo • Células A y B • Suero anti-A, anti-B, anti-D • Centrífuga

ProcedimientoGrupos sanguíneos ABO/Rh 1. Tome 6 tubos de ensayo y rotúlelos de la siguiente manera:

Anti-A Anti-B Anti-D Células A Células B Autocontrol 2. Agregue a los tubos los reactivos como se indica en el cuadro:

R e a c t i v o /Tubo

Anti-A Anti-B Anti-D Cél A Cél B Autocon-trol

Suero Anti-A2 gotas

X

Suero Anti-B2 gotas

X

Suero Anti-D2 gotas

X

Células A1 gota

X

Células B1 gota

X

Eritrocitos del paciente

X X X X

Suero del paciente

X X X


3. Centrifugue 30s a 3000rpm los tubos y agite suavemente para evaluar la presencia de aglutinación 4. Clasifique con cruces la fuerza de la aglutinación: un solo botón (4+), botones medianos o uno grande con pequeños (3+), muchos grumos medianos (2+), muchos grumos pequeños (1+), sin grumos (0/negativo) 5. Los tubos de Anti-A, Anti-B y Anti-D determinan la presencia de los antígenos en eritrocitos del paciente 6. Los tubos de Cel A y Cel B determinan la presencia de anticuerpos en el plasma del paciente 7. El tubo de Autocontrol ayuda a determinar que los eritrocitos del paciente no aglutinen con el suero del paciente y cause falsas lecturas en los demás tubos

Tema 3: Prueba de Coombs Directo

Objetivo específicoReconocer el procedimiento para la realización de la prueba de antiglobulina humana directa.

DescripciónLa determinación de los grupos sanguíneos requiere de gran atención, a pesar de ser una práctica relativamente sencilla. En este proceso es importante siempre el realizar un autocontrol, para determinar si hay algún factor intrínseco al paciente que causa que se den aglutinaciones falsas, con lo cual se obtendrían falsos resultados, comprometiendo la salud del receptor a la hora de ser transfundido.

Cuando el autocontrol da positivo se debe estudiar la causa, ya que puede ser por fenómeno de Rouleaux, paraproteinemias, enfermedades autoinmunes, entre otros.La observación macroscópica del tubo de sangre puede evidenciar grumos desde el tubo, lo que indica que hay aglutinación. Además, existe la prueba de Coombs directo.

Con esta prueba se puede evidenciar la sensibilización de los eritrocitos, es decir, el hecho de que tengan anticuerpos adheridos a su superficie, ya sea por autoinmunidad como por transfusión previa incompatible, con lo cual el sistema inmune ataca los glóbulos rojos y éstos son recubiertos por anticuerpos.

El reactivo de Coombs no es otra cosa que un suero con anticuerpos anti-IgG (inmunoglobulina G), IgM y complemento humanos. Así, al ser los eritrocitos sensibilizados expuestos a éste reactivo, se producirá aglutinación al reaccionar con los anticuerpos adheridos a los hematíes, evidenciando así la condición de sensibilización, con lo que se procedería a tratar de eliminar las interferencias para realizar un diagnóstico de grupo sanguíneo certero.


Materiales• Tubos morados con sangre• Tubos de ensayo• Células A y B • Suero anti-A, anti-B, anti-D• Centrífuga• Reactivo de Coombs

ProcedimientoDeterminación de grupo sanguíneo 1. Realice grupo sanguíneo a las muestras que tiene para determinar la presencia de muestras con

autocontrol positivo 2. Separe las muestras positivas y realice prueba de Coombs

Prueba de Coombs directo 1. Tome la preparación de eritrocitos del paciente y coloque una gota en un tubo rotulado 2. Coloque 2 gotas de suero de Coombs, deje reposar 5 minutos y centrifugue 3. Utilice una muestra negativa como control 4. Determine la presencia de eritrocitos sensibilizados

Curso: Hematología y Análisis Hematológico II



Tema 1: Reporte de serie roja

Objetivo específicoReconocer las morfologías eritrocitarias atípicas para la correcta confección de reportes en trastornos de serie roja.

DescripciónLas anemias, como síndrome, pueden ser causadas por una gran variedad de factores, desde malnutrición hasta deficiencias enzimáticas congénitas o defectos genéticos en la producción de las cadenas de hemoglobina. Estas condiciones se suelen evidenciar al estudiar un extendido de la sangre del paciente, en el cual se pueden observar muchas morfologías eritrocitarias atípicas, sugestivas de algún trastorno o grupo de trastornos en particular.

De tal manera, es de gran importancia conocer no solamente la morfología normal de un eritrocito, sino también las distintas formas en que se puede alterar para determinar los casos en los que hay anomalías, de modo que su reporte sea de utilidad en el diagnóstico.


El reporte de serie roja suele constar de 5 partes:Cromía: se refiere al contenido de HB en el eritrocito, si es normal el reporte es normocrómico si baja el contenido de Hb se observa poca pigmentación, el centro palido se ve agrandado esto es la Hipocromía. Se reporta en cruces (de 1+ a 4+)

Anisocitosis: Se refiere a diferencias en el tamaño de los eritrocitos. En esta categoría se suelen reportar presencia macrocitos eritrocitos grandes como lo son los megalocitos los cuales son grandes y ovalados. Y los eritrocitos pequeños que se denominan microcitos como los eferocitos. Se reporta en cruces (de 1+ a 4+)

Poiquilocitosis: Quizás la más compleja. Describe las diferentes formas que puede tener un eritrocito. Entre ellas se encuentran: eliptocitos, dacriocitos, esquizocitos, equinocitos, drepanocitos, estomatocitos, queratocitos, acantocitos. Se reporta en cruces (de 1+ a 4+)

Codocitos: eritrocitos con alteración en la disposición del contenido de Hb, se observa con pigmentación “en forma de sombrero mexicano”. Poseen borde rosado, un anillo blanco y un punto rosado en el centro. No es una alteración de la forma de erirocito por lo que no es parte de la pioquilocitosis. Se reporta en cruces (de 1+ a 4+)

Inclusiones: Son estructuras que se pueden observar dentro de los eritrocitos. Así tenemos punteado basófilo, cuerpos de Howell-Jolly, basofilia difusa y anillos de Cabot. También es posible encontrar inclusiones parasitarias como lo son trofozoítos y gametocitos de Plasmodium sp, causante de la malaria. Todas estas estructuras se deben reportar de manera semi cuantitativa, descritas por cruces según su abundancia por campo de visión.

Materiales • Equipo de sangrado• Tubos EDTA • Portaobjetos• Tinción de Wright • Láminas patológicas • Microscopio

Procedimiento Reporte de fórmula roja 1. De contar con muestras patológicas, tome una y realice un extendido y tíñalo con tinción de Wright 2. De lo contrario, utilice láminas patológicas provistas por el profesor 3. Revise el extendido utilizando lente de inmersión y confeccione el reporte respectivo de la serie roja


Tema 2: Recuento de reticulocitos

Objetivo específicoPracticar la técnica de reconocimiento y conteo de reticulocitos.

DescripciónLos síndromes anémicos son condiciones en las cuales no se cuenta con una buena oxigenación del organismo. Éstas pueden ser leves o graves, agudas o crónicas. En general, se categorizan bajo dos grandes ramas: anemias regenerativas y arregenerativas.

Esto define si el cuerpo es o no capaz de responder ante la baja presión de oxígeno, lo cual se puede determinar por el conteo de reticulocitos. Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros, en la fase final previo a ser hematíes maduros estos tienen restos de ARN y ribosomas y corresponden a los macrocitos con basofilia difusa.

Éstos se suelen elevar en sangre ante respuesta a hipoxemia, dado que la médula ósea sobreproduce células y son liberadas rápidamente al torrente sanguíneo por lo que se encuentran en gran cantidad. Usualmente se considera que una anemia es regenerativa si el paciente presenta reticulocitos mayores a 100 000/uL y arregenerativa si se encuentran por debajo de 75 000/uL.

Para realizar un recuento se debe utilizar una tinción de azul cresil brillante, el cual tiñe los reticulocitos de celeste con puntos negros, que corresponden a restos nucleares sin degradar.

Materiales • Equipo de sangrado• Tubos EDTA • Portaobjetos• Tinción de azul cresil brillante • Microscopios

Procedimiento Recuento de reticulocitos 1. Tome una muestra de sangre de su compañero 2. Mezcle en un tubo de ensayo 50 ul de sangre con 50 ul de reactivo azul cresil brillante3. Deje en reposo 20 minutos a temperatura ambiente4. Mezcle y realice un extendido como lo hace siempre5. Elegir el campo de visión adecuado (igual que en el extendido convencional)6. Proceda a contar 1000 eritrocitos, contando aparte los reticulocitos (los reticulocitos cuentan también

como eritrocitos) 7. Saque el porcentaje de reticulocitos en la muestra 8. Suponiendo un recuento de eritrocitos de 3 millones/uL, calcule la cantidad de reticulocitos en la

muestra utilizando la siguiente formula


Cálculos para la corrección y reporte1. Reporte el porcetaje y absoluto de los reticulocitos2. Si el valor es elevado y tiene anemia se realice la siguiente corrección, Se considera el Hto normal,

45% hombres y 42% mujeres

3. Si se observa macrocitosis y basofilia difusa leve en el extendido calcule el índice de producción reticulocitario que se obtiene al dividir entre dos el porcentaje de reticulocitos corregido

Tema 3: Diferencial leucocitario

Objetivo específicoPracticar el reconocimiento de leucocitos, así como la realización de un diferencial leucocitario.

DescripciónLa hematología es el estudio de la sangre y sus componentes, así como la funcionalidad de los mismos. Ésta utiliza usualmente la observación de la morfología de las células sanguíneas para determinar anomalías y poder identificar características patológicas que guíen a un diagnóstico certero. Las patologías hematológicas pueden ir desde anemias leves o anisocitosis hasta leucemias agudas, las cuales pueden acabar con la vida del paciente en cuestión de pocas horas.

Para la realización del diagnóstico hematológico es necesario conocer los índices hematológicos, así como los recuentos totales y porcentuales de los diferentes linajes celulares. Es necesario también el observar las células para determinar si hay anomalías morfológicas que indiquen enfermedad.

En este caso, es necesario realizar un extendido de sangre en lámina para luego ser fijado y teñido para realizar la observación correspondiente. Cabe destacar que la fijación debe ser química, de preferencia con metanol, ya que el calor afecta y altera las células y puede generar falsas anomalías.

Materiales:• Equipo de sangrado• Tubos morados con sangre • Portaobjetos • Tinción de Wright • Microscopios • Contadores celulares


Procedimiento Extendidos sanguíneos 1. Tome una muestra de sangre de un compañero en tubo morado 2. Homogenice la muestra de sangre de 5 a 8 veces.3. Destape el tubo y, utilizando un portaobjetos, coloque una gota de sangre en una esquina del mismo 4. Coloque la gota a un par de centímetros de un extremo de otro portaobjetos (2), de forma centrada 5. Limpie el portaobjetos (1) y coloque el borde sobre la gota, en 45° para que se distribuya por el borde 6. En un solo movimiento, esparza la gota hacia el otro extremo del portaobjetos (2) 7. Un buen extendido debe quedar con forma ovalada, de modo que se evidencie una cabeza, cuerpo y

cola del extendido8. Deje secar a temperatura ambiente, NO utilice calor para secar ni fijar

Tinción de Wright 1. Coloque la lámina con el extendido sobre una base en la pila 2. Cubra la lámina con tinción de Wright y deje por 2 minutos 3. Agregue sobre el tinte, un volumen igual de Buffer de Wright y deje por 8 minutos más 4. Limpie los excedentes con agua y limpie la parte trasera de la lámina con papel toalla 5. Deje secar y vea al microscopio con lente de inmersión

Recuento celular manual 1. Identifique los diferentes tipos de células, note las características de la cromatina.2. Una vez logrado, proceda a tomar un contador celular 3. Vea el extendido de manera sistemática y cuente cada tipo de célula con el contador: cuente

neutrófilos, linfocitos, eosinófilos, basófilos y monocitos4. Continúe hasta alcanzar 100 células5. Revise el contador, el número de cada célula indica su porcentaje en sangre 6. Partiendo de un total de 9000 leucocitos calcule el valor absoluto de cada una de la células contadas

Tema 4: Serie blanca patológica

Objetivo específicoReconocer la morfología básica de células blancas patológicas correspondientes a trastornos hemáticos.

DescripciónEl leucograma es una herramienta útil para el diagnóstico de enfermedades hematológicas de serie blanca. Con él se puede determinar la presencia de leucemias en donde el recuento total de estas células está muy aumentado. Además, es de gran valor diagnóstico la identificación y clasificación de células inmaduras.

Las células hemáticas se originan a partir de células madre progenitoras, que poco a poco evolucionan y maduran hasta convertirse en el leucocito final, usualmente en médula ósea. No obstante, cuando hay


síndromes linfoproliferativos o condiciones en donde se da una sobreproducción de glóbulos blancos, se liberan a torrente sanguíneo y se pueden observar. Es importante el identificar la presencia de estas células para que puedan ser clasificadas por un especialista, dado que no es normal el hallazgo de células inmaduras en sangre periférica.

Las diferencias con una célula normal son bastante claras: Las células inmaduras suelen tener el citoplasma más basófilo (azulado), pueden presentar granulaciones finas o gruesas anormales, núcleo más laxo, tamaño marcadamente grande.

Las células inmaduras se presentan con mayor frecuencia en leucemias agudas, dada su alta tasa de replicación rápida, mientras que en las leucemias crónicas suelen predominar las formas maduras, pero con la cantidad total marcadamente aumentada (recuento de leucocitos mayor a 50 000/uL).

Materiales• Láminas patológicas • Microscopio • Aceite de inmersión

ProcedimientoObservación de leucocitos inmaduros 1. Tome una lámina patológica provista por el docente 2. Observe los leucocitos de forma detallada y compare las diferencias con una célula normal 3. Trate de identificar: Blastos, promielocitos, metamielocitos, mielocitos, bandas y neutrófilos4. Realice un conteo con la células que observe, cuente aparte las células inmaduras.

Tema 5: Repaso de hematología y quiz

Objetivo específicoPracticar todas las técnicas vistas a lo largo del curso para reforzar cualquier carencia que el estudiante considere que posee.

Materiales• Láminas patológicas • Microscopio • Equipo de sangrado • Tubos EDTA• Tinción de Wright • Portaobjetos • Tinción de azul cresil brillante • Contadores celulares


Procedimiento1. Utilice los materiales a su disposición para practicar las técnicas hematológicas estudiadas hasta el

momento y revisar morfologías leucocitarias y eritrocíticas.

Curso: Parasitología Clínica

Competencias1. Colabora en términos asistenciales en la realización de procedimientos especializados de la

microbiología y química clínica.

Temas 1 y 2: Examen coproparasitológico

Objetivo específicoPracticar el montaje de muestras de heces, así como el reconocimiento de protozoarios y helmintos en las muestras.

DescripciónLa parasitología es una rama que ha perdido auge en el país en los últimos años. Las políticas de salud, así como las campañas de información y los cambios de hábitos de los habitantes ha causado una disminución drástica en la incidencia y prevalencia de las parasitosis. Sin embargo, continúa siendo un examen de rutina ya que es de muy bajo costo y puede proveer gran información sobre el estado del paciente y evidenciar la presencia de microorganismos que pueden causar desde diarreas hasta obstrucciones intestinales, así como disenterías.

A pesar de que las técnicas comunes como el montaje directo y la técnica de Kato son sencillas y de bajo costo, el expertiz que se requiere para el hallazgo y diferenciación de los parásitos es el que limita la utilidad de la técnica, pues en ocasiones puede ser difícil la diferenciación de los microorganismos. El examen coproparasitológico va a permitir el diagnóstico de gran cantidad de protozoarios (usualmente quistes) y helmintos, dentro de los que se pueden mencionar:

Entamoeba coli: Es una ameba relativamente grande y fácil de identificar. El quiste suele medir entre 17 y 20 um y puede ser uni, bi u octonucleado, según su estado de maduración y no presenta cromatoidales.

Entamoeba histolytica/ E. dispar: Son amebas morfológicamente idénticas, por lo cual su hallazgo se debe reportar como E. histolytica/ E. dispar, dado que E. histolytica es patógena y puede causar cuadros invasivos, que cursan con diarrea sanguinolenta e incluso puede penetrar a hígado y entrar a torrente sanguíneo hasta alcanzar el cerebro. Por otra parte, E. dispar no es patógena. Por esto se deben reportar juntas, ya que puede ser de gran importancia en salud o ser irrelevante, según sea la especie de que se trate. El único caso en que se reporta E. histolytica como tal es en casos de diarrea sanguinolenta donde se encuentren los trofozoítos gigantes característicos.


Los quistes de estas amebas suelen medir de 8 a 15 um, y son tetranucleados generalmente, aunque se pueden presentar casos uni y binucleados. Pueden tener cromatoidales en forma de barras con extremos romos.

Endolimax nana: Es una ameba comensal, al igual que Entamoeba coli, cuyo quiste ovalado mide entre 8 y 12 um. No presenta cromatoidales y sus núcleos no se definen bien, sino que se observan como círculos refringentes en lugol.

Iodamoeba butschlii: Es una ameba comensal cuyo quiste uninucleado mide de 8 a 15 um, no presenta cromatoidales y tiene una característica patognomónica observable en lugol: Una gran vacuola de glucógeno, muy bien definida, la cual se observa como un círculo u óvalo café.

Giardia intestinalis: También conocida como Lamblia intestinalis. Es un flagelado cuyo trofozoíto y quiste son muy particulares. En el caso del trofozoíto, mide de 10 a 20 um, es binucleado y posee 8 flagelos, posee forma de gota. El quiste mide de 8 a 19 um, es ovalado y tetranucleado, tiene una característica patognomónica que es la presencia de cuerpos mediales, los cuales se ven en forma de cuña de martillo.

Ascaris lumbricoides: Se puede encontrar en las muestras de heces tanto los huevecillos como el verme. El adulto mide de 15 a 30 cm, de un color blanquecino amarillento. Los huevecillos miden de 45 a 75 um usualmente, son de pared doble gruesa, en ocasiones se puede ver la larva en su interior, al igual que mamelones en la cobertura (proyecciones redondas). Los huevecillos infecundos suelen ser ovalados y más grandes y tienden a indicar la presencia de solo hembras en el hospedero.

Trichocephalus trichiurus: El adulto suele medir de 30 a 45 mm de longitud. El huevecillo tiene forma de barril, con un tapón mucoide translúcido en cada extremo. Se suele ver de un color rojizo.

Uncinarias: Comprenden microorganismos de los géneros Ancylostoma y Necator. Se pueden encontrar las larvas y los huevecillos. Las larvas deben ser diferenciadas de las de Enterobius vermicularis, mientras que los huevecillos tienden a confundirse con artefactos y con huevecillos de Ascaris lumbricoides. Los huevecillos miden de 40 a 60 um, tienen cápsula delgada y ovoide.

Materiales • Muestras de heces• Portaobjetos• Cubreobjetos • Microscopio• Reactivo de Kato• Palillos de madera • Solución salina• Lugol


Procedimiento:Revisión de muestras de heces 1. Realice el montaje de las muestras de heces, tanto en directo en solución salina y lugol, como Kato 2. Observe la muestra en lente de 40X en busca de amebas y quistes (directo) así como huevecillos de

helmintos (kato).

Montaje directo 1. Coloque una gota de solución salina y una de lugol en lados opuestos de un portaobjetos 2. Con un palillo de madera, proceda a picar varias veces la muestra de heces en diferentes zonas 3. Coloque una muy pequeña porción en la solución salina y homogenice 4. Quiebre el palillo o cámbielo y repita en el lugol 5. Coloque cubreobjetos en ambos 6. Observe al microscopio con lente de 40X en busca de amebas

Concentración de Kato 1. Coloque una pequeña porción de heces sobre el portaobjetos 2. Coloque sobre la muestra, una tira de papel celofán con reactivo de Kato 3. Presione el portaobjetos contra un papel toalla para distribuir la muestra en una capa delgada 4. Deje secar durante 10 minutos 5. Observe con lente de 10X en búsqueda de huevecillos

Tema 3: Tinción de Ziehl-Neelsen

Objetivo específicoReconocer la aplicación, realización y observación de la tinción de Ziehl-Neelsen.

Descripción:En microbiología es común la aplicación de tinciones para la visualización de microorganismos. Ésta práctica está principalmente en el área de la Bacteriología, pero la parasitología también hace uso de ella. Tenemos, por ejemplo, las tinciones para helmintos adultos de utilidad para colecciones, así como otras más aplicadas a la práctica clínica. Entre ellas se encuentra la tinción de Ziehl-Neelsen.

Ésta se basa en la capacidad de ciertas estructuras de absorber el tinte en presencia de calor, a tal punto que son capaces de retenerlo aún al desteñir con alcohol-ácido. Ésta técnica se utiliza en bacteriología para teñir bacterias como Mycobacterium tuberculosis, que son ácido - resistentes; al igual que se utiliza en parasitología para observar ooquistes de coccidios.

Entre los coccidios de interés se encuentran:


1. Cryptosporidium spp: Presenta un ooquiste redondo de 4 a 6um, sin esporoquistes y con 4 esporozoítos (0:4).

2. Cyclospora cayetanensis: Presenta un ooquiste redondo, muy similar a Cryptosporidium spp, pero de mayor tamaño (7 a 10um), el cual contiene dos esporoquistes con dos esporozoítos cada uno (2:2)

3. Cystoisospora belli: El más grande de los tres. El ooquiste es ovalado y puede medir hasta 28um. Contiene dos esporoquistes con cuatro esporozoítos cada uno (2:4)

Materiales• Muestras de heces • Portaobjetos • Cubreobjetos • Microscopio • Palillos de madera • Fucsina • Alcohol-ácido • Azul de metileno• Láminas de coccidios

Procedimiento 1. Realice un frotis de la muestra de heces 2. Fije el frotis utilizando alcohol metílico o la llama suavemente

Tinción de Ziehl-Neelsen 1. Cubrir el extendido con fucsina2. Con la llama de un mechero, calentar suavemente por debajo de las láminas cubiertas con fucsina,

hasta que se produzca emisión de vapores blanquecinos visibles.3. Dejar de calentar y repetir el procedimiento por 5 minutos.Importante: En ningún caso la fucsina debe hervir o secarse sobre las láminas. Si disminuye por evaporación o derrame, hay que reponerla.4. O cubrir el extendido con fucsina por 20 minutos (Modificado)5. Eliminar la fucsina lavándola con agua corriente.6. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la mezcla alcohol-ácido de 1 a 2 minutos.

Se puede mover suavemente en forma de vaivén para que se vaya produciendo la decoloración.7. Lavar con agua corriente.8. Realice la contratinción utilizando azul de metileno por un minuto 9. Lave con agua y seque 10. Observe al microscopio con lente de inmersión (100X) en busca de coccidios

Observación de láminas:1. Observe las láminas fijas provistas por el profesor e identifique los coccidios presentes


Tema 4: Técnica de Baermann

Objetivo específico:Practicar la técnica de concentración de Baerman para la determinación de Enterobius vermicularis en muestras de heces.

Descripción: El análisis coproparasitológico es una herramienta muy útil para la detección de parásitos intestinales. En algunos casos, las cargas parasitarias pueden ser muy bajas y pueden ser difíciles de detectar por estos métodos, así que se han diseñado técnicas de concentración de huevecillos y larvas.

Para huevecillos existen técnicas de sedimentación (se suspenden las heces en medio líquido y se hace precipitar los huevecillos, para luego analizar el precipitado concentrado) y de flotación (se utilizan soluciones hipertónicas para producir que los huevecillos floten y se analiza la superficie superior del líquido).

Para larvas, la más utilizada es la técnica de Baermann, la cual se usa principalmente en la detección de Strongyloides stercoralis. En ella se suspende una cantidad de heces en un embudo con agua caliente y una gasa. Estas larvas salen al agua tibia y caen hacia la parte delgada del embudo, porción que es posteriormente recolectada y centrifugada a baja velocidad para sedimentar y utilizar ese sedimento para buscar larvas vivas.

Materiales:• Muestras de heces • Portaobjetos • Cubreobjetos • Microscopio • Palillos de madera • Embudo • Manguerilla con prensa • Gasa • Base con anillo


Procedimiento:Técnica de Baermann 1. Coloque el embudo en una base o trípode 2. Llene hasta un poco más de la mitad con agua tibia 3. Coloque suavemente una gasa 4. Tome una porción grande de muestra de heces y macérela sobre la gasa 5. Déjela media hora para favorecer la salida de las larvas 6. Libere la prensa de la manguerilla y recolecte una pequeña porción en un tubo 7. Centrifugue a baja velocidad para concentrar 8. Descarte el sobrenadante y coloque una gota del sedimento entre portaobjetos y cubreobjetos 9. Revise al microscopio en 40X para determinar la presencia de larvas. En algunos casos pueden estar

vivas, por lo que el movimiento facilita su hallazgo.

Revisión de huevecillos de helmintos: 1. Revise las láminas o muestras con huevecillos de helmintos. Reconozca a qué helminto pertenece

cada huevecillo.


BibliografíaArenas, R. (2011) Micología médica ilustrada. Editorial McGraw-Hill.

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Roback, J. D., Combs, R. M., Grossman, J. B., & Hillyer, C. D. (2008). AABB technical manual. Bethesda, MD: American Association of Blood Banks (AABB).

Sáenz, G. (2005). Hematología analítica, Tomo II. Editorial EDNASSS. San José, Costa Rica.

Silverthorn, D. U. (2008). Fisiología humana. Ed. Médica Panamericana

Agradecimientos

Para la segunda versión de las guías de laboratoriospara el Diplomado de Laboratorio Clínico del Instituto PLERUS.

La institución extiende un agradecimiento para:

el Diplomado Julio Palma y el Doctor Mauricio Rodríguez, por la confeccióny los demás profesionales que participaron.

La edición de este documento fue realizada por la Diplomado María José Oviedoy contó con la revisión de los siguientes expertos:

Doctora María Leiva, Técnico Nicol Badilla yDiplomado Julio Palma.

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