GESTIÓN DE COLONIAS DE RATONES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE

LEGISLACIÓN DE RMGs

• La gestión de una colonia de ratones puede definirse como la provisión de todos los recursos materiales, humanos, y temporales, necesarios para conseguir unos objetivos preestablecidos.

Gestión en general

• recursos materiales: – Modelo animal – Instalación, equipamiento – Espacio – Financiación – Registros de datos

• recursos humanos: – Formación

– Personal suficiente

• recursos temporales:

– Tiempo necesario

Gestión en RMG

Redactar PROYECTO

• Cual es el objetivo científico

• Qué RMG espero obtener

– Genotipos, edades, sexos, etc.

• Qué datos espero obtener

– Muestras, experimentos, técnicas, etc.

• Cuales serán los controles

• Establecer una cronología

Queremos traer ratones Apoe Vamos a estudiar ateroesclerosis en diferentes genotipos con dietas ricas en grasa Se crían bien. Necesitaremos grupos de 10 machos y hembras

• Información sobre el gen – Publicaciones – MGI

• Información sobre la modificación – Mutantes espontaneos – Mutantes inducidos (químico, radiaciones)

– Mutaciones dirigidas (técnicas de recombinación) – Mutantes condicionales (Cre-lox, Tet-on, etc.)

– Transgénicos

Recoger información

All alleles(39) : Targeted(18) Gene trapped(19) Transgenic(1) Spontaneous(1) Mutations at this locus cause diet-induced hypercholesterolemia and atherosclerosis.

• Información genética: “Apoe” nomenclatura

– B6.129P2-Apoetm1Unc/J

– B6.129P2-Apoetm1(APOE*2)Mae

– B6.129P2-Apoetm1(APOE*3)Mae

– B6.Cg-Tg (APOE-Cyp7a1)1Rjd/Mmcd

– SHL/StmRbrc

Recoger información

“Apo E”

• Información genética: fondo genético

– 129S6/SvEv-Apoetm4Mae/J

– B6.129P2-Apoetm1Unc/J

– AKR.129P2(B6)-Apoetm1Unc/J

– D2.129P2(B6)-Apoetm1Unc/J

– B6.Cg-Apoetm1Unc (D12Mit182-D12Mit2)/Pgn

Recoger información

• Información genética: fondo genético

DBA/2J

SUSCEPTIBILIDAD A DIETAS ALTAS EN GRASAS

AKR/J

C57BL/6J

C57BLKS/J

Recoger información

Mouse Phenome Database

http://phenome.jax.org/

• Información genética: genotipo

Recoger información

– Muestras para genotipado e identificación.

– Edad de genotipado

– Técnicas de genotipado

NO INICIAR LA PRODUCCIÓN SIN TENER LA TÉCNICA

TESTAR SIEMPRE LOS FUNDADORES

TESTAR SIEMPRE LOS FONDOS GENETICOS

• Información genética: genotipo

FELASA guidelines for the production and nomenclature of transgenic rodents

Recoger información

• Información genética: genotipo

– alelo “wild type”

– alelo KO

– transgén

– homocigoto

– heterocigoto

– hemicigoto

Recoger información

• Información genética: genotipo

B6.Apoe KO -/-, +/-, +/+

B6.Apoe Tg

-/-, +/-, +/+

B6.Tg Apoe KO

(+/+) (-/-) (+/-) (+/-) (+/+) (-/-) (-/-) (+/-) (+/+)

Recoger información

B6.129P2-Apoetm1Unc/J

B6.Cg-Tg(GFAP-APOE*3)37Hol Apoetm1Unc/J

B6.Cg-Tg (APOE-Cyp7a1)1Rjd/Mmcd

• Información genética: genotipo

B6.Apoe KO -/-, +/-, +/+

B6.Apoe Tg

-/-, +/-, +/+

B6.Tg Apoe KO

(+/+) (-/-) (+/-) (+/-) (+/+) (-/-) (-/-) (+/-) (+/+)

Recoger información

B6.129P2-Apoetm1Unc/J

B6.Cg-Tg(GFAP-APOE*3)37Hol Apoetm1Unc/J

B6.Cg-Tg (APOE-Cyp7a1)1Rjd/Mmcd

“Apo E”

– Alteraciones reproductivas

– Fenotipo esperado en el tiempo

• Fertilidad, • Desarrollo, • Prolificidad, • Parto, • Destete,

• Cancer • Neurodeg., • Endocrinas, • Metabólicas, • Cardiovascular

Recoger información

• Información genética: fenotipo

Bases de datos

Id. ratón/Marcaje

Trazabilidad

Id. de la muestra Id. en la cubeta Genotipo

Base de datos

Datos: reproductivos, cruces, muestras, etc.

Establecer la producción

• ¿Cuántos animales necesitamos?

• ¿Cada cuanto tiempo?

• ¿De qué edad?

• ¿De qué sexo?

• ¿De qué genotipos?

• ¿Qué información del cruce necesitamos?

• ¿Cuántos animales por camada produce la cepa?

• ¿Cuántos cruces fértiles tiene la cepa?

Establecer la producción

6.8

4.8

Factores a tener en cuenta

• Factores ambientales (Luz, Tª, HR %, Ruido, etc..)

• Instalación

• Alojamiento

• Manejo y experiencia

• Enriquecimiento

• Estado sanitario

Sistemas de cruces

• Discontinuo Vs. Continuo

• Monogamia-Trios Vs. Poligamia

• Programado Vs. Al azar

• Pubertad 6-8 semanas

• Ciclo estral: 4-5 días

• Sincronización de ciclos

• Monta 1-3 hembras

• Tapón ≠ Gestación

• Efecto Whitten / Lee-Boot / Bruce

• Gestación 18-22 días

Sistemas de cruces

Homocigosis (A/A)

• Menor coste (genotipos)

• Niveles de expresión (transgénicos)

• Toda la producción puede utilizarse para experimentos

Heterocigosis (A/a)

• Se obtienen controles “wild type”

• Se evita la creación de sub-estirpes

Mantenimiento del fondo genético

• Stocks no consanguíneos

• Estirpes Consanguíneas

• Estirpes híbridas

• Establecimiento de congénicos (Speed Congenics)

Sistemas de cruces

RMGs-stocks no consanguíneos

Ventajas • Isogenicidad

• Homocigosidad

• Uniformidad genotípica

• Estabilidad en el tiempo

• Individualidad

• Distribución internacional

• Identificables

• Sensibilidad

RMGs-estirpes consanguíneas

Desventajas • Baja capacidad de reproducción

• Caras

• Sensibles a factores ambientales

• 129X1/SvJ • A/J • BALB/cByJ • BALB/cJ • C3H/HeJ • C57BL/6J • C57BL/6NJ • C57BL/10J

RMGs-estirpes híbridas

B6 BALB/c B6CF1

x F1

F2 B6CF1 B6CF1

x

B6CF2

RMGs-Congénicos

• No consanguíneas

– Parentales en heterocigosis

– Los WT CONTROLES

Elecciones de controles

• Consanguíneas

– Parentales en ambos

– La CEPA es CONTROL

• Híbridos

– Primera generación

– Los F1 son CONTROL

– Parentales en ambos – La CEPA es CONTROL – Los WT CONTROLES

• Congénicos

Mantenimiento de RMGs

X X

Núcleo fundador Colonia de expansión

Congelación de embriones

Congelación de esperma

Técnicas de reproducción asistida

A tener en cuenta

A tener en cuenta

• Recabar información genética

• Recabar información del fenotipo

• Identificar los animales (genotipado)

• Plantear los cruces dependiendo de las necesidades y la instalación

• Analizar los animales

• Evitar la variabilidad (3Rs)

RESUMEN

• http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/gene.shtml

• http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/index.shtm

Bases de datos

Legislación RMGs

Legislación RMGs • Legislación sobre animales de experimentación

– RD 1201/2005, de 10 de octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos

– Ley 32/2007, de 7 de noviembre, para el cuidado de los animales, en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio, incorpora un régimen sancionador.

– Directiva 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos

• Legislación sobre OMGs – Ley 9/2003 sobre régimen jurídico de la utilización confinada, liberación

voluntaria y comercialización de OMGs. – RD 178/2004 con el reglamento para el desarrollo y ejecución de la ley 9/2003.

• Legislación sobre bioseguridad – RD 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los trabajadores contra los

riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo – NTP 468: Trabajo con animales de experimentación

• Hasta ahora, necesaria la aprobación del CEEA y comunicar a la autoridad para hacer un RMG: explicar objetivos, técnicas a realizar, nº de animales, eliminación del dolor, etc. NO ES NECESARIO PARA SU MANTENIMIENTO.

• A partir de ahora, además, siempre que haya un fenotipo potencialmente dañino, incluso en mutaciones espontaneas, para el mantenimiento de RMGs será necesario autorización expresa de la autoridad competente .

Legislacion RMGs

• Objetivo: la protección de la salud humana y del medio ambiente.

• Designa a la Administración General del Estado o Autonomías,

dar la autorización para utilización confinada o liberación controlada.

– Incluye la producción de nuevos OMGs como la multiplicación

de OMG ya existentes con técnicas naturales. – El transporte de animales queda expresamente encuadrado en

el concepto de utilización confinada de OMGs

Legislacion OMGs

• Debe registrarse antes de iniciar la actividad por primera vez . • Debe evaluar y clasificar las actividades que se vayan a

realizar. I, II, III, IV • Posteriormente evaluar cada actividad. Si son de tipo I, es

decir de riesgo nulo o insignificante, no deberán ser comunicadas a la autoridad competente.

• Cualquier otro tipo precisa comunicación de cada

experimento a realizar en los términos que especifica el reglamento.

Requisitos de un animalario con RMGs

• Evaluación de riesgos para la salud humana y el medio ambiente (Anexo I) – Tipo I: Riesgo nulo o insignificante – Tipo II: Bajo riesgo – Tipo III: Riesgo moderado – Tipo IV: Alto riesgo

• Llevar un registro de la evaluación • Cumplir las normas específicas de higiene y seguridad en el

trabajo. • Aplicar las normas de confinamiento especificadas por el

reglamento para cada tipo de actividad.

Evaluación de un animalario con RMGs

• OMGs que sea poco probable que el organismo de origen o el receptor causen enfermedades a seres vivos (humanos, plantas, o animales)

• Aquellos en los que la naturaleza del vector y el material

incorporado no originen en el OMG resultante un fenotipo que pueda causar enfermedad a seres vivos.

• Aquellos en que el OMG resultante sea poco probable que pueda

causar enfermedad en el ser humano animales o plantas en caso de exposición accidental en el medio ambiente o efectos nocivos sobre el medio ambiente

Evaluación de RMGs-Tipo I

Especificaciones Grado de confinamiento

1 2 3 4 Aislamiento de la unidad de animales Opcion. Exigida Exigida Exigida

Locales separados con puertas bloqueables

Opcion. Exigida Exigida Exigida

Locales descontaminables y faciles de lavar (jaulas)

Opcion. Opcion. Exigida Exigida

Suelos y paredes fáciles de

lavar Opcion.

Exigida (suelo)

Exigida Exigida

Confinamiento de animales en jaulas corrales o cajas

Opcion. Opcion. Opcion. Opcion.

Filtros en las cajas de aislamiento o habitaciones aisladas

Opcion. Opcion. Exigida Exigida

Medidas de confinamiento animalario con RMGs

Medidas de confinamiento animalario con RMGs

• Prácticamente todos los RMGs son de tipo I

• Todos los animalarios cumplen tipo I

• Es necesario registrarse

• Es necesario llevar un registro

• Es necesario evaluar

• El transporte es más complejo

MARTIN J. EVANS

Gracias

José Manuel Sánchez Ernesto de la Cueva Bueno Belén Pintado The Jackson Laboratory

MARIO CAPECCHI OLIVER SMITHIES