genoma gen intrusomarcmolbiod

R. ALEGRÍA CONACYT 2002

JOSÉ ROBERTO ALEGRÍA COTODepto. de Desarrollo Científico y

Tecnoló[email protected]

San Andrés, CENTAAuditorio 2

Martes 10 de Diciembre 2002.

“INTRODUCCIÓN AL USO DE MARCADORES MOLECULARES PARA CARACTERIZACIÓN DE

BIODIVERSIDAD”

GENÓMA, GEN Y ADN RECOMBINANTE

• OBJETIVOPresentar información básica de manera comprensible sobre la Biología Molecular y sus aplicaciones técnicas.

• INTRODUCCIÓN• GENÓMA Y GEN• ADN RECOMBINANTE Técnicas del ADN recombinante

Modelos VegetalesNuevas: proteínas, plantas, animales, alimentos, fármacosBiotecnologías promisorias

CONTENIDO:


AVANCES HISTÓRICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

1941 Genes codifican las proteínas1944 Prueba que el ADN porta la información genética1953 Determinación de estructura del ADN 1961 Código Genético, ARN mensajero, regulación génica1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa1970 Smith y colegas aislaron y caracterizaron la Hind III 1972 Janet Mertz y Ron Davis cortaron y pegaron mol de ADN1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias1974 Demostración directa de delección génica humana1975 Southern Blotting1977 Fred Sanger secuenció el virus de ADN Ф X1741978 Biblioteca génica humana1979 RFPL para diagnóstico prenatal, oncogenes celulares


AVANCES HISTÓRICOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

1979-81 genes humanos clonados y secuenciados1982 Tabaco, la primera planta modificada genéticamente1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas

publican la secuencia del λ lambda1986 La secuenciación del ADN es automatizada1987 Inicia el Proyecto del Genoma Humano1995 Es secuenciado la bacteria Haemophillus influenzae1996 Es secuenciada la levadura Saccharomyces cerevisiae1998 Es secuenciado el nemátodo Caenorhabditis elegans1999 Es secuenciado el cromosoma 22 humano2000 Es secuenciada la mosca de la fruta D. melanogaster /

26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano 2000 14 de dic. secuencia de Arabidopsis thaliana 2001 26 de enero borrador genóma del arroz Oriza sativa

.

Marcadores

Ingeniería Genética

Tecnología del ADN

Fármacos Anti-cáncer

DiagnósticosCultivo de Células Vegetales

Transferencia de genes en animales

Síntesis de Sondas de

ADN

Localización desórdenes

genéticos

Clonación

Solución de crimenes

Producción de Proteínas humanas

TerapiaGénica

Bancos de ADN, ARN Proteínas

Mapas de Genomas completos

BiologíaMolecularBiología

Molecular

Cultivos

CelularesCultivos

Celulares

Anticuerpos Monoclonales

Anticuerpos Monoclonales

Síntesis de Nuevas Proteínas

NuevosAntibióticos

NuevasPlantas yAnimales

NuevosAlimentos

Recursos humanos químicos raros

BIOTECNOLOGÍA

Es el estudio del genoma y su acción. El genoma es la suma total del material genético presente en un organismo particular, incluye el ADN presente en los cromosomas y en los organelos subcelulares (ej., mitocondrias) y el genoma de ARN de algunos virus. El anuncio el 26 de junio de 2000, del borrador del genoma humano en un 90%, marcó un hito histórico para la humanidad.

Tecnología del ADNGENÓMICA

IBM SP Supercomputadora

Métodos utilizados en la genómica incluyen:

•Genómica Estructural. Estudio de que secuencias de genes están presentes dentro del ADN de un organismo.•Genómica Funcional. El estudio de que funciones son conferidas a un organismo por una secuencia génica dada.•Genómica Química. Se usa para comparar dos organismos de la misma especie (uno de los cuales tiene un gen o genes inactivados por un químico específico o una mutación puntual.•Análisis de la Expresión Génica. Se usa para determinar el producto o productos producidos (tales como una enzima u otra proteína crítica). Cuando un determinado gen es activado, se mide la fluorescencia de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) individual, cuando este ARNm hibridiza (con piezas de ADN correspondientes a las proteínas producidas/analizadas, que están adheridas a la superficie de hibridización sobre un biochip).

Tecnología del ADN: GENÓMICA


Humanos30,000 genes

GENOMAS

Chimpancé30,000 genes

A. thaliana25,000 genes

Ratón30,000 genes

C. elegans19,000 genes

D. melanogaster13,000 genes

95% idéntico

70%

20%

60%

De 289 geneshumanos implicados enenfermedades,hay 177cercanamentesimilares a los genes deDrosophila.

Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

El genoma de un organismo es el juego completo de ADN. La planificación del Proyecto Genoma Humano se inició en

1986, previsto para el 2007. En Junio de 2000 se presentó el 90% del borrador con la secuenciación de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los genes son secuencias específicas de bases que codifican instrucciones para hacer proteínas. Los genes son un 2% del genoma humano.

IDENTIDAD GENÉTICA

Tecnología del ADN

El 14 de diciembre de 2000, se presentó la secuencia del genoma completo de la primera especie vegetal la Arabidopsis thaliana. El 26 de enero de 2001, el borrador de la secuencia del arroz (Orizae sativa). El funcionamiento de los genes en el arroz se aplicaría a cultivos principales, tales como trigo (Triticum spp) y maíz (Zea mays) con genomas mas grandes y más dificiles de secuenciar. El arroz es el genoma mas simple y pequeño de los genomas de todos los cereales, tiene 50,000 genes, dos veces el de Arabidopsis, y 12 cromosomas comparado con cinco de Arabidopsis.

Tecnología del ADN: GENOMAS VEGETALES


Un punto rojo significa “expresión incrementada”, un punto amarillo “igual

expresión”, uno verde “expresión disminuida” y uno negro “ausencia de

expresión”. Unos 70a genes han variado su nivel de expresión luego del ataque

del patógeno. La información será usada para comprender los mecanismos de

defensa involucrados. El análisis se realiza mediante computadoras que

identifican los genes candidatos y proveen toda la información disponible

sobre los mismos. El microordenamiento ha sido impreso en vidrio cuyo tamaño

real es de 22 x 40mm. El inserto muestra una ampliación de tres bloques del

microordenamiento conteniendo 360 genes cada uno (www.cienciahoy.org)

Microarreglo o Biochip con secuencias de 11.500 genes hibridados con ARNm de Arabidopsis thaliana obtenidas antes (fluorescencia verde) y después (fluorescencia roja) del ataque del hongo Erysiphe cichoracearum. Las flechas indican genes que se han expresado en respuesta al patógeno.



La Compañía SYNGENTA (suiza), ha demostrado la utilidad de la genomica al utilizar la secuencia QTL 21 del cromosoma 1 del genoma del maíz (el cual fomenta la producción de la planta), encontrando un arreglo y orden de genes bastante similar con el existente en la variedad japonica o Nipponbare del arroz que ellos secuenciaron.

Pamela Ronald, Fitopatóloga Vegetal de la Universidad Davis de California, usando una secuencia de la variedad de arroz indica, secuenciada por el Instituto de Genómica de Beijing y el Centro de Genoma de la Universidad de Washington, identificó un gen de resistencia a las enfermedades en arroz, cuya característica fenotípica ha sido usada por cientos de años por los fitomejoradores sin conocer su procedencia genética.


Tecnología del ADN: GENÓMICA FUTURAEn la 14th International GenomeSecuencing and Analysis Conferen-ce (oct. 2002), US Genomics Inc., presentó un aparato que lee la doble hélice de ADN sin cortarlo. Abre la doble hélice espiral de ADN, la lineariza y la pasa por un escaner para leerla en un lector fijo (como una pélicula de carrete pasa por un proyector), las moléculas se mueven a 30 M de bases por minuto. En 40 minutos se pueden Leer 3 mil M de bases. Si el sistema se logra pasar a un biochip el tiempo bajará a menos de cinco minutos, por la habilidad de capturar un Terabyte (1024 o 1000 gigabites, un gigabite = 1024 o 1000 Megabites) de información cada pocos segundos.(Uehling, M. D, Bio-It World Nov. 12 2002).

genoma

Célula cromosomas

genes los genes

contienen instrucciones para hacer proteínas ADN

proteínas

las proteínas actúan solas o en complejos para realizar las funciones celulares

ADN ADN

ARN

PROTEÍNAS

BASES MOLECULARESDE LA VIDA


ESTRUCTURA DE UN GEN• Tradicionalmente, un gen se ha definido como un segmento de ADN que codifica para un polipéptido o para una molécula funcional de ARN.

• Recientemente, los nuevos descubrimientos han alterado radicalmente esta visión, para adoptar una definición más vaga. De acuerdo con ello, un gen es una secuencia de ADN genómico o de ARN que es esencial para especificar una determinada función. Para llevar a cabo su función el gen no necesita ser traducido a proteína, y a veces ni siquiera necesita ser transcrito.

Moléculade

ADN


ESTRUCTURA DE UN GEN•Elementos típicos:

1) región reguladorao promotor basal (caja TATA). o sitios de unión de proteinas reguladoras (upstream promoter). o Realzadores (enhancers)o Silenciadores

2) sit io de inicio de transcripción.

3) 5'UTR.

4) codón de inicio.

5) intrones y exones alternados, con sit ios de procesamiento aceptores y donadores

6) Codón de paro.

7) 3'UTR.

8) señal de poli-adenilación.

ESTRUCTURA DE UN GEN

Promotores

ExonesSitio de inicio de la Transcripción

Sitio de terminación

de la Transcripción

Realzadores

< 100 Kb

Los promotores pueden ser genéricos o tejido específico

La función del gen depende de los FACTORES de TRANSCRIPCIÓN (FT) que activan a las ARN pol. Los FT son: los Factores de Transcripción General (se unen a secuencias promotoras genéricas) y los Activadores de Transcripción (se unen a secuencias promotoras específicas).Los FT pueden activarse o desactivarse en respuesta a estímulos del entorno del organismo.

Intrones

La Ingeniería Genética o tecnología del ADNr se inició en la década de los 70s. Se refiere a un grupo de tecnologías usadas para cambiar la composición genética de las células y mover genes a través de las fronteras de las especies para producir nuevos organismos. Se pueden aislar genes, modificarlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

INGENIERÍA GENÉTICA O ADNr

INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE (ADNr)

TÉCNICA PROPÓSITOEnzimas de Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN

ADN Ligasa Une fragmentos de ADN

Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación

Plasmidos Clase común de vector

Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas

PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas

ADNc Hace una copia de ADN de ARN mensajero

Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia

Síntesis Génica Para hacer un gen de una base de datos

Gel Electroforésis Para separar fragmentos de ADN

Secuenciación de ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN


• Enzimas de restricción• ADN polimerasas• ARN polimerasas• Nucleasa• ADN ligasa• Kinasa• Fosfatasa• Transcriptasa reversa

TÉCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS PARA LA MANIPULACIÓN DEL ADN


1. Agrobacterium. Uso de la bacteriaComo "Ingeniero Genético". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética.2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula.3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN.5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópi-cas, que atraviesan las membranas con los insertos.

Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA


6. Microinyección. Una célula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN foráneo es inyectado directamente en el núcleo usando una micropipeta muy fina. Se usa cuando hay pocas células disponibles, tales como células fertilizadas de huevo animal.

7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeñas vesículas de membrana para introducir el ADN in vivo en la célula.


En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con puntas de 1μm de diámetro, bajo la guía de un microscopio para inyectar ADN directamente en cloroplastos. Dichas puntas finas no dañan la membrana del cloroplasto, pero es requerida una alta presión para sacar el ADN de la aguja. El control del flujo de ADN bajo alta presión es un problema práctico significativo, que ha sido superado introduciendo un metal líquido en la aguja atrás del ADN. Cuando la aguja es calentada el metal se expande forzando al ADN a salir de manera controlada. Los investigadores también han usado esta misma técnica para introducir ADN en bacterias individuales y núcleos de células eucarióticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).



Las plantas que se usan como modelos de aprendizaje en Ingeniería Genética Vegetal son: Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum (tabaco), Orizae sativa (arroz) y Solanum tuberosum (papa).

Estos modelos son útiles para “aprender haciendo” y ayudar a resolver problemas identificados por los agricultores nacionales, mientras se capacitan los miembros de los Centros o Unidades de Investigación que se quieran preparar.

Ingeniería Genética:MODELOS VEGETALES

ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condiciones ambientales de estrés. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa de E. Coli y un promotor tej ido específico dependiente del estrés. Los genes de trehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado por fr io, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producción en 20%. La composición química de los granos no cambia. El azúcar trehalosa ayuda a estabil izar moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés (PNAS Online, 27 nov. 2002).

Ingeniería Genética NUEVAS PLANTAS

• 1987 secreción de Beta-lactoglobulina en leche de ratón.

• Producción de proteína C humana en leche de cerdos, para desórdenes

como hemofilia.• Hormonas de crecimiento humano en tejido seminal de cerdo.

• Antitrombina humana III, anti-coagulante sanguíneo secretada en leche de cabras transgénicas. • Cabras transgénicas para producirBioSteel fibra hecha por el hombre con propiedades de tela de araña.

Ingeniería Genética NUEVOS ANIMALES

Salmón transgénico por hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. cuenta con el promotor de la proteína de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un salmón no transgénico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversión del alimento.

ARROZ DORADO con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en pro-vitamina A al ser ingeridos.ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.ARROZ con aa esenciales.

Ingeniería Genética NUEVOS ALIMENTOS

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

PAPA con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes melli tus 100 veces más poderosa que la actual vacuna. PAPA con la sub-unidad B antigénica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del cólera). FRIJOL de SOYA con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV). TABACO con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.

Ingeniería Genética NUEVOS FÁRMACOS

R. ALEGRIA CONACYT 2002

Ingeniería Genética

CLONACIONTérmino genérico para la replicación en un laboratorio de genes, células u organismos de una entidad original, con copias genéticas exactas del gen, célula u organismo original. Esta técnica ha producido avances sensacionales en medicinas y vacunas. También hay investigación en clonación de células humanas, órganos y otros tejidos. Esto puede producir el reemplazo de piel, cartilagos y hueso para victimas de quemaduras y accidentes, o de órganos.

BIOTECNOLOGÍAS PROMISORIAS

Entre las Biotecnologías promisorias para el desarrollo productivo de El Salvador están: i) Tecnologías Moleculares para diagnóstico de enfermedades infecciosas, i i) Bioinformática, i i i) Genómica, iv) Modificación Genética de Cultivos, v) Tecnologías recombinantes para hacer productos terapeúticos, vi) Bioremediación, vii) Química combinatoria (COMBICHEM) , vi i i) Bio-nanotecnología.(Top 10 Biotechnologies for Improving Health in Developing Countries: www.utoronto.ca/jcb)

www.conacyt.gob.sv

¡MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION¡

Atentamente: ROBERTO ALEGRIA

[email protected]

genoma gen intrusomarcmolbiod

Documents