genÉtica molecular e ingenierÍa genÉtica:...
TRANSCRIPT
GENÉTICA MOLECULAR E INGENIERÍA GENÉTICA: Conceptos, Técnicas y Aplicaciones
Blga: Wendy Morales Oviedo 2017
TEMA 1. ÁCIDOS NUCLEICOS: Preparación, Purificación y análisis de ácidos nucleicos
1.1. INTRODUCCIÓNIngeniería genética Manipulación DNA para obtención de DNA recombinante
Evolución de la genética:
S. XIX Mendel Leyes de la herencia biológica
1903 Sutton1910 Morgan
1944 AveryMacLeodMacCarty
1952 HersheyChase
Genes residen en cromosomas
El material genético es el DNA
1952/66 DelbrückChargaffCrickMonod
1971/73
1985 K. Mullis Cadena de reacción de la polimerasa (PCR)
1990 Secuenciación masiva de genomas
Estructura del DNACódigo genéticoProceso de transcripciónProceso de translación
Inicio de técnicas de DNA recombinante o Ingeniería genética
Conceptos:
- ds/ssDNA- ds/ssRNA- cccDNA- Genoteca- Librería de cDNA- Clones- Vector- Nick- Gap
Genoteca
Aplicaciones de la ingeniería genética:
Biofarmaceútico:- Antibióticos- Proteínas heterólogas (insulina,…)- Proteínas más operativas o con nuevas funciones - Generación de vacunas (hepatitis,…)
Agrícola y ganadero:- Modificación genética de plantas- Animales transgénicos
Clínico:- Diagnósticos (HIV, Hepatitis, etc)- Terapia génica
Forense:- Resolución de crímenes- Pruebas de paternidad- Identificación de sexo
1.2. PREPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Aislamiento y purificación del DNA procariota
Etapas:
1. Cultivo bacteriano en crecimiento máximo2. Centrifugación y lisis celular extracto celular3. Purificación del DNA4. Concentración del DNA
Rotura de células:
• Métodos físicos Poco usados• Métodos químicos
Mecanismos químicos usualmente utilizados:
- Lisozima- EDTA- SDS
Preparación del DNA total: lisis celular y centrifugación
Purificación del DNA
Extracto celular Purificación del DNA
• RNA RNAsas• Proteínas Métodos:
- Proteinasa K Proteasa de amplio espectro, poco específica- Fenolización Desnaturaliza proteínas, poco usado- Cromatografías Sistemas más utilizados
Proteinasa K
Fenolización
Cromatografía
Concentración del DNA
Alta concentración de DNA eliminación del agua biodisponible trabajo óptimo
Método Precipitación en etanol Mantener DNA resuspendido en (Tris + EDTA). Conservar 4ºC o 20ºC
Recuperación del DNA. a)Rotación con varilla de vidrio, b) Centrifugación
Aislamiento y purificación del DNA eucariota
DNA de plantas o animales clonación de genes de plantas o animalesMismos pasos básicos de purificación de DNA
Modificaciones en purificación del DNA:- Lisis celular Lisozima no tiene efectos en células vegetales
Detergentes células animalesMayor importancia a métodos físicos
- Contenido bioquímico celular es diferente a bacterias (ejemplo: carbohidratos) uso de otros métodos
Métodos de purificación de DNA eucariota:
- CTAB detergente
Método CTAB para purificación de DNA de plantas
Aislamiento de DNA plasmídico
Diferencia importante respecto a purificación de DNA total necesidad de separación de DNA plasmídico de cromosomas de DNA bacteriano
Lisis celular:
• Separación en base al tamaño EDTA y lisozima formación de esferoplasto Tritón X-100• Separación en base a la conformación Métodos:
- Método de lisis alcalina Método de Birmboin- Gradiente de Cloruro de Cesio
Separación en base al tamaño
Separación en base a la conformación
Purificación del plásmido por método de desnaturalización
alcalina
Purificación del plásmido por Bromuro de etidio –ultracentrifugación en gradiente de densidad de Cloruro de Cesio
Aislamiento de DNA vírico
Ciclo lítico Lisis de bacterias y fagos DNAsa y RNAsa Centrifugación Unión de unos fagos con otros (PEG), centrifugación Obtención de fagos Fenolización Concentración del DNA
Preparación de una suspensión de fagos de un cultivo de bacteria infectado
Recolección de las partículas de fagos por precipitación con PEG
Ejemplo: Suspensión de fago M13
1. Cultivo de células infectadas2. Centrifugación para remover células3. Añadir PEG a la suspensión de fagos, centrifugar4. Resuspender fagos en buffer5. Añadir fenol para quitar las proteínas de la cápside6. Remover fase acuosa añadiendo fenol, centrifugar7. Resuspender DNA del fago M13 en un pequeño volumen
1.3. ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS- Electroforesis en gel de agarosa Visualización de DNA migración de DNA por diferencia de carga
- Electroforesis en campo pulsante DNA mayor a 20 kb (cromosomas eucariotas) migración de DNA
Electroforesis en gel de agarosa
Electroforesis en campo pulsante
Electroforesis en gel de agarosa Electroforesis en campo pulsante
