Generación de trombina en sangre completa controlada con un ensayo basado en trombograma automatizado calibrado

M. Ninivaggi, R. Apitz-Castro, Y. Dargaud, B. de Laat, H.C. Hemker y T. Lindhout

Agosto de 2012

www.clinchem.org/cgi/content/article/58/8/1252.full

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Una interacción equilibrada entre vasculatura, células sanguíneas y proteínas de plasma previene hemorragia por un lado y trombosis por el otro

Hemostasis:

no sangrado no trombosis

IntroducciónIntroducción

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Introducción (cont.)Introducción (cont.)

Las células sanguíneas y proteínas de plasma interaccionan en una complicada red de circuitos de retroalimentación positiva y negativa para generar trombina (F IIa)

Ref: Tanaka KA et al. Blood coagulation: hemostasis and thrombin regulation (Coagulación sanguínea: hemostasis y regulación de trombina). Anest Analg. 2009;108:1433-46

FXI FXIaFIX

FIXaFVIII FVIIIa

FX

FXaFXaFVa FV

Protrombina

FibrinógenoFibrina

TFTFFVII

TF:FVII

TF:FVIIa

TrombinaTrombina

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La trombina es una proteasa de múltiples funciones> Juega un papel crucial en la hemostasis: más trombina, menos hemorragia pero más trombosis; menos trombina más hemorragia pero menos trombosis.> También tiene otras funciones “no hemostáticas”.

Ensayo de trombograma calibrado automatizado (CAT)

> Proporciona evaluación cuantitativa deformación de trombinaen plaquetas ricas y pobres de plasma. Puede distinguir entre estados hipoe hipercoagulable.

Introducción (cont.)Introducción (cont.)

Trombosis

tiempo

Trombina

Normal

Hemorragia

Ref: Tripodi A. The long-awaited whole-blood thrombin generation test (La nueva generación de pruebas de generación de trombina en sangre completa,grandemente esperada). Clin Chem 2012; 58: xxx-xxx.

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Introducción (cont.)Introducción (cont.)

II

IIa

ZGGR-AMC

AMC*

2. La concentración de trombina se calcula de la fluorescencia que desarrolla

1. La trombina se une al sustrato que después emite fluorescencia

El ensayo CAT

Thrombin= TrombinaPeak height= Altura del picoLag time= Desfase

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PreguntaPregunta

¿Qué es lo que hace que el ensayo CAT sea superior a las pruebas convencionales tales como el PT y aPTT?

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Introducción (cont.)Introducción (cont.) ¿Porqué realizar ensayos de generación de trombina (TG) en sangre completa?

>Es más cercano a la fisiología >Hay menos manipulación en el laboratorio (no

centrifugación, lo que reduce los errores experimentales y tiempo requerido para realizar el estudio)

>Posibilidad de realizar medición directa de sangre sin anticoagulante (pinchazo en el dedo)

Impedimentos para realizar el ensayo CAT con sangre completa

>La señal fluorescente del sustrato escindido es templada por la hemoglobina

>Los sedimentos de glóbulos rojos, se agrupan y retraen con el coágulo formado, lo que produce señales altamente erráticas.

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Introducción (cont.)Introducción (cont.)

Ensayo (WB) CAT basado en sangre completaPara superar los problemas de realizar ensayos TG en WB, se hicieron las siguientes adaptaciones:

- El uso de sustrato de trombina basado en rodamina en el que la excitación y emisión de longitudes de onda son menos afectadas por la hemoglobina que en un sustrato basado en AMC.- El uso de un filtro de papel poroso para crear una capa delgada de sangre, lo que da como resultado la compresión de glóbulos rojos.

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Materiales & métodosMateriales & métodos

40µl aceite

Papel flitro con 5µl de muestra

Sangre completa (WB) sumergida en citrato

5µl de sangre activada (50% de WB + 50% reactivos)> TG: 0.3mM P2Rho, 0.5pM factor tisular (TF), 16.7mM CaCl2> Calibración: 0.3mM P2Rho, 100nM calibrador

40µl de aceite mineral

Papel flitro

Papel filtro + muestra

Papel flitro + muestra + aceite

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ResultadosResultados

Figura 1. Perfiles de reacción. A) Los trazos de fluorescencia que muestran la respuesta del sistema WB-CAT para TG en PPP activado y sangre completa(línea discontinua) y sangre completa (línea sólida). B) Trazos de fluorescencia de la respuesta de reacción (línea punteada, n = 3) con la desviación estándar (líneas sólidas) entre sustrato P2Rho y α2M-calibrador de trombina. La línea punteada es la primera derivativa de la pendiente del

calibrador.

No hay consumo de sustrato ni en efecto del filtro interior

Fig. 1En donde: Time (min)=Tiempo en minutosFluorescence intensity (AU) = Intensidad de Fluorescencia

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Resultados (cont.)Resultados (cont.)

Figura 2. Trombograma típico. La línea punteada representa los datos sin procesar de TG, la línea discontinua con sustracción de la actividad α2M de trombina y la línea sólida es la curva TG (primera derivativa de la línea discontinua)Ref: Wagenvoord R et al. The limits of simulation of the clotting system (Los límites de simulación del sistema de coagulación). J Thromb Haemost 2006;4:1331-8.

Fig. 2 En donde:Fluorescence intensity (AU) = Intensidad de fluorescencia (AU)Thrombin (nmol/L) = Trombina (nmol/L)Time (min) = Tiempo en minutos

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Resultados (cont.)Resultados (cont.)

Tabla 1. Dependencia del factor tisular. Los parámetros del trombograma como función de la concentración del factor tisular. ETP, potencial endógeno de trombina; LT, desfase; TP, pico de trombina; TTP, tiempo del pico.

Recomendamos realizar el ensayo con una concentración baja de TF para incluir la contribución de la vía intrínseca.

La precisión intra e interensayo de la elevación del pico es suficiente para una útil aplicación del ensayo WB-CAT (respectivamente, 6.5% y 10.7% para pico de trombina) Tabla 1. Dependencia de TF recombinante de los

parámetros del WB-CATa

TF, pmol/L ETP, nmol · min/L

LT, min TP, nmol/L TTP, min

0 678 (29) 8.1 (1.2) 87 (5) 12.9 (0.6)

0.5 627 (14) 4.8 (0.1) 148 (5) 6.9 (0.1)

1.0 710 (53) 4.2 (0.2) 168 (19) 6.3 (0.2)

2.0 691 (118) 3.3 (0.1) 176 (10) 5.1 (0.3)

5.0 701 (15) 2.2 (0.1) 177 (9) 4.2 (0.1)

a Los datos son la media (SD) (N = 3).

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Resultados (cont.)Resultados (cont.)

Figura 3. Dependencia de fosfolípidos(A) TG en sangre completa (WB) con y sin la adición de vesículas de fosfolípidos (PV). (B) Dependencia de hematocrito

No hay necesidad de agregar vesículas de fosfolípidos (PV) para TG en WB

Los fosfolípidos procoagulantes son proporcionados por glóbulos rojos

B

Fig. 3 En donde:Thrombin (nmol/L) = Trombina (nmol/L)Time (min) = Tiempo en minutos

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Resultados (cont.)Resultados (cont.)

Figura 4. Dependencia del factor VIII. Correlación entre los parámetros del trombograma de sangre completa ETP (A) y el pico de trombina (B) con concentraciones de plasma FVIII de pacientes con hemofilia A.

El ensayo WB-CAT es sensible a la concentración del FVIII, que es una de los factores determinantes más importantes para la generación de trombina

Fig. 4 En donde:Thrombin peak (nmol/L) = Pico de Trombina (nmol/L)

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ConclusiónConclusión

Desarrollamos ún método que mide de manera precisa la TG en WB con el uso de una delgada capa de sangre en una placavde microtitulación con múltiples pocillos.

Pregunta: El uso de papel filtro requiere ciertas precauciones. ¿Cuáles son ellas?

Pregunta: ¿Qué trabajo posterior tendrá que realizarse para que el WB-CAT sea aplicable en la práctica clínica?

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Diapositiva editorialDiapositiva editorial

La tan esperada prueba de generación de trombina en sangre completa (TGT)

> La TGT es más adecuada que las pruebas tradicionales de coagulación (PT y APTT) para evaluar el equilibrio pro y anticuagulante en la operación in vivo.

>Hasta hace poco tiempo la TGT se realizaba en plaquetas pobres o ricas en plasma.

>Ninivaggi et al (Clin Chem, 2012), ahora describen una nueva TGT que puede ser realizada en sangre completa, por tanto se reproducen mucho mejor que la TGT previa que ocurre in vivo.

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