La fotoqumica en el estudio de las interacciones bioticas

La fitoqumica en las interacciones biticasBiol. Yolanda M. Garca Rodrguez

Laboratorio de Ecologa Qumica, CIEco UNAM

Interacciones biticas y abiticasEn los cultivos, la incidencia de plagas y patgenos se ha explicado principalmente en trminos de variacin ambiental, variacin gentica y recientemente variacin qumica natural de las plantas.

Fitoqumica

Los perfiles qumicos pueden mantenerse en una poblacin a pesar de la variacin ambiental, debido a que algunos compuestos secundarios tienen control gentico.

FitoqumicaLa investigacin de perfiles qumicos en las poblaciones naturales contribuye a explicar su resistencia natural a la herbivora y en poblaciones cultivadas genera informacin para el manejo agronmico de plagas.

La fitoqumica se estudia con diferentes tipos de cromatografa.

CromatografaMtodo fsico para separar, cuantificar, aislar e identificar los componentes de una mezcla.

Cromatografa

Adsorcin: El soluto se adsorbe en la superficie de la fase estacionaria slida.

Absorcin, particin o reparto: El soluto se reparte entre la fase estacionaria lquida y la fase mvil por diferencia de solubilidad.

Las compuestos de la mezcla se separan debido a su afinidad con la fase estacionaria y con la fase mvil. Cromatografa en columna

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10Revelado de luz UV (=254nm) de las fracciones obtenidas por cromatografa en columna, del extracto hexnico de T. lucida.Cromatografa en TLC8Intercambio InicoLos aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones (resina con carga)Exclusin Molecular, filtracin o permeacin en gel No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto, se separa por tamao de partcula.Cromatografa en columna

Similar a la cromatografa en columna, con columna 5-25 cm y partcula entre 3- 10mm.

Cromatografa HPLC

Gran presin en el flujo de la fase mvil (6000 psi). HPLC High Pressure Liquid, High Performance Liquid.

Fase reversa la mas usada

Cromatografa HPLC

Separacin de compuestos NO voltiles y termolbiles: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratoses la mas usada.Los compuestos se distribuyen en una fase mvil gaseosa, interaccionan con la fase estacionaria por cambios de temperatura.Cromatografa de gases GC

Cromatografa de gasesLos compuestos son separados en base a su volatibilidad: los compuestos deben ser voltiles y trmicamente estables (10-20 %)Sin embargo los compuestos se pueden derivatizar

colectorjetaireH2columnaCromatografa de gasesAnlisis rpido, requiere poca muestra (0.5ml)Monitoreo ambiental, investigacin de nuevos compuestos con actividad biolgica, cuantificacin de sustancias prohibidas y metabolitos en sangre.

CromatografaLquida (HPLC)Tipos de cromatografaCromatografade gases (GC)VolatilidadPolaridad15

Grupos de compuestosAnlisis de datos

Anlisis de datosrea, Estndar internoAnlisis de datosPKRTArea mgLibrary/ID13.68470850.02159743-Penten-2-ol23.85844070.0387166Bicyclo[3.1.1]heptane, 6,6-dimethyl-2-methylene-, (1S)-33.96326550.0149785Benzene, 1-ethyl-3-methyl-44.19348290.0159757Benzene, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-54.23445640.020441Limonene64.45314790.01443911-Pentanol, 5-cyclopropylidene-75.524534230.2079801Benzene, 1-methoxy-4-(2-propenyl)-86.8721801271Tetradecane97.182215340.1016152CaryophylleneCaryophyllene19Estndar externo Anlisis de datosforbol-12-miristato 13-acetato por HPLC

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Solanum lycopersiconPersea americana var. drymifoliaPersea americana var. HassLippia graveolensJatropha curcasMikania micranthaTagetes lucidaCosmos bipinnatusEupatorium glabratumTithonia tubiformisOenothera roseaCULTIVOSMALEZAS

Variacin fitoqumica en aguacate (Persea americana) y su relacin con herbvoros.Variacin fitoqumica de la defensa indirecta inducida por herbvoros.Prospeccin de compuestos tiles para el ser humano.Causas y efectos de la variacin fitoqumica.

36 compuestos con nueve grupos funcionales

4cidos grasos 25.2%5triterpenos 20.8%2fenilpropanoides 14.4% 6furanos 11.6% 7esteres 5.6% 8triterpenos 5.3% 3sesquiterpenos 3.5% 9alcanos 2.8% 1monoterpenos 2.0%

Voltiles foliares de P. americana var Hass

Se puede caracterizar quimiotipos foliares: comunes,perfiles qumicos que abundan en la zona; y raros a los que se desvan del promedio.Correlacin de quimiotipos raros con incidencia de barrenador de las ramas y quimiotipos comunes con incidencia de mosquita blanca y araa roja

(Espinosa-Garca, 2001)

Persea americana var Hass

Voltiles foliares de P. americana var Hass

Los componentes mayoritarios de quimiotipos comunes y raros son: estragol, b-cariofileno y eugenol, en los quimiotipos comunes constituyen el 26% y en los raros ms del 70 % de su composicin.

Los compuestos que separan los grupos de quimiotipos son p-cimeno, camfeno, xido de cariofileno, limoneno, b-mirceno, g-terpineol, b-cis-ocimeno, a-farneseno compuestos que han sido reportados con actividad contra herbvoros generalistas. La susceptibilidad de P. americana var. drymifolia a la incidencia del agallero Trioza ancepsesta relacionada con grupos de compuestos secundarios foliares, segn trabajos realizados en bancos de germoplasma.

(Torres-Gurrola et al., 2011)Persea americanaSolanum lycopersicum

Comparar la respuesta inducida por herbivora en plantas

Cmo ha alterado la domesticacin a la emisin constitutiva e inducida de voltiles?

Bautista-Lozada A. 2014. Tesis de Doctorado. UMSNH.

Cmara de vidrioFibra SPMEHeadspace estticoCromatgrafo de Gases-Masasn= 40 plantas por variedad Solanum lycopersicum27El mtodo de colecta de voltiles consisti en concentrar estos compuestos para capturarlos, para esto encerr a las plantas en cmaras de vidrio aislando la parte superior de la planta mediante discos de tefln. Los voltiles fueron colectados usando fibras SPME hechas con un material afin a la estructura qumica de los voltiles que permite que stos se adhieran a su superficie. En cada toma de muestra se pona un pedazo de papel filtro con un estandar para la cuantificacin de los voltiles. Despus de 30 minutos de colecta, las fibras se inyectaron directamente en el cromatgrafo de gases para identificar los compuestos.

Compuestos voltiles: hexanal3-hexanol-pineno-mircenoo-cimeno(+)-4-careno-felandreno-terpinenop-cimeno-felandrenolimoneno nonanal decanal (y-)/1,241.7671.25 pg/hr1,203.1463.07 pg/hr840.2545.84 pg/hr825.7730.27 pg/hr478.2618.76 pg/hr2,560.29118.54 pg/hrCULTIVADASSILVESTRESPerfil constitutivo Solanum lycopersicum28Se identificaron 13 compuestos voltiles y se determin su concentracin en pg/hr . Este grfico muestra la concentracin media estandarizada del perfil qumico de cada variedad que reduce la media de todos los compuestos a cero y nos muestra nicamente la desviacin de cada compuesto por arriba o por debajo de esta. Tambin se muestran la concentracin total de voltiles en pg/hr para cada variedad. De los 13 compuestos, diez eran comunes para todas las variedades. De estos slo 10 son comunes para todas y donde el beta mirceno no se detect en dos variedades silvestres y el alfa terpineno no se detect en la variedad cultivada Ro FuegoZea mays

29Jatropha curcasIncorporar la variacin fitoqumica y gentica de Jatropha curcas a programas de manejo integrado de plagas y enfermedades.Se prob la toxicidad de los steres de forbol contra Phytium ultimun y Phytophthora capsici, hongos patgenas en plantaciones de Jatropha curcas y Phoma herbarum, Fusarium moniliformedos hongos generalistas, que atacan diferentes cultivos.

Mayo-Hermenegildo H. 2014. Tesis de Licenciatura. UMSNH.

forbol-12-miristato 13-acetato Tiempo de Retencin (min)Absorbancia (mAU)Cuantificacin de EF con estndar externo por HPLC ABCArranque60%40%10 min50%50%40 min25%75%55 min0%100%70 min100%DetectorLongitud de onda variableColumnaEclipse XDDC18 (4.6mm x 156mm x 5mm Agilent Technologies)Jatropha curcasTiempo de Retencin (min)Absorbancia (mAU)Cuantificacin de EF en la muestra de J. curcas por HPLC ABCArranque60%40%10 min50%50%40 min25%75%55 min0%100%70 min100%DetectorLongitud de onda variableColumnaEclipse XDDC18 (4.6mm x 156mm x 5mm Agilent Technologies)

Jatropha curcas

Jatropha curcasLos steres de forbol tienen actividad fungiestatica in vitro en hongos generalistas y dos especies de hongos fitopatgenas de J. curcas.

La inhibicin del crecimiento micelial es mayor al aumentar la concentracin.

El efecto fungisttico de los steres de forbol se observa a partir de 0.250 mg/mL, mayor a la reportada en otros trabajos con hongos fitopatgenos. Tagetes lucidaPropiedad antifngica de compuestos voltiles de tres plantas medicinales (Nurite, Santa Mara y Toronjil) sobre hongos patgenos de fresa. Fulgencio-Negrete, R. Tesis de Maestra. UMSNH.

Efecto antifngico de Tagetes lucidaF1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 Tecto 60 EtanolColletotrichum acutatum

F1 F2 F3 F4 F5 Botrytis cinereaF6 F7 Tecto 60 EtanolCompuestoTiempo de retencin (min)Concentracin (% de rea)IKExt.Hex.F1F2F3F4F5F6F7Mirceno8.222.15.92.20.80.8NP0.6NP992o-cimeno9.761.32.91.40.50.5NPNPNP1048-Linalol11.192.3NP2.02.82.81.62.0NP1101Estragol14.1329.469.632.027.527.54.110.4NP1206Acetato de geraniol18.950.91.00.91.01.0NPNPNP1383Metil eugenol19.6764.010.260.367.567.594.486.9NP1414Cuantificacin de compuestos activos de Tagetes lucidaNP=no presente; IK= ndice Kovats.Aqui presento la concentracin con porcentaje de area de cada uno de los compuestos y para el extracto exanico tenemos a todos los compuestos en diferentes concentraciones variando la cantidad en cada una de las fracciones en particular la fraccion 5 que es la activa encontramos a tres compuestos en una mayor proporcion a aqu se presentan los indices covats que son los que nos confirman a cada uno de los compuestos 36

Composicin de la Fraccin 5 de Tagetes lucidaCromatograma donde se corrobora que el metileugenol es el compuesto que se encuentra en ua mayor cantida y para comprobar se muestasu espectro de masas y donde se observa al metileugenol37Los copuestos mayoritarios del extracto hexnico de T. lucida son metil-eugenol y el estragol. La fraccin F5 contiene 94.4% de metil-eugenol, por lo que se le atribuye ser el responsable de la actividad fungicida.

Tagetes lucidaGracias !!Ecologa QumicaCIEco, UNAM