caracterizacion fitoquimica y evaluacion de la actividad fungicida de material elicitado y no...
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CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD
FUNGICIDA DE MATERIAL ELICITADO Y NO ELICITADO DE Solanum
tuberosum (PAPA) Y SU CORRELACIÓN CON LA RESPUESTA FITOALEXINA
Trabajo de Grado para Optar al Título de Químico
Por:
SINAR DAVID GRANADA GARCÍA
Asesor:
Walter Murillo (candidato Ph.D.)
Coasesores:
Antoni Rueda (candidato Ph.D.)
Carlos Peláez (Ph.D.)
Universidad de Antioquia
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Instituto de Química
Medellín, Ant.
2009
2
CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 5
1. MARCO CONCEPTUAL……………………………………………………….. 6
1.1 MECANISMOS DE DEFENSA EN PLANTAS……………………………….9
1.2 GRANDES RUTAS METABÓLICAS Y LA BIOSÍNTESIS
DE METABOLITOS DE ESTRÉS……………………………………………..11
1.2.1 Alcaloides……………………………………………………………………… 13
1.2.2 Fenilpropanoides………………………………………………………………. 14
1.2.3 Terpenoides……………………………………………………………………. 15
1.3 METABOLITOS SECUNDARIOS Y EL HOMBRE…………………………..17
1.4 FITOALEXINAS Y METABOLITOS DE ESTRÉS…………………………...20
2. OBJETIVOS…………………………………………………………………….. 28
2.1 OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………28
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS…………………………………………………...28
3. MATERIALES Y METODOLOGÍA…………………………………………...29
3.1 TRATAMIENTO Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL
ELICITADO Y NO ELICITADO………………………………………………. 29
3.1.1 Materiales …………………………………………………………………….. 29
3.1.2 Metodología…………………………………………………………………… 29
3.1.2.1 Tratamiento del material elicitado y no elicitado……………………………. 29
3.1.2.2 Extracción de metabolitos secundarios……………………………………… 29
ii
3
Página
3.2 EVALUACIÓN in vitro DE LA ACTIVIDAD
FUNGICIDA Y FRACCIONAMIENTO BIOGUIADO
DE LOS EXTRACTOS…………………………………………………………. 30
3.2.1 Materiales …………………………………………………………………….. 30
3.2.2 Metodología…………………………………………………………………… 30
3.2.2.1 Evaluación in vitro de la actividad fungicida
de los extractos………………………………………………………………. 31
3.2.2.2 Fraccionamiento del extracto crudo elicitado……………………………….. 32
3.2.2.3 Evaluación in vitro de la actividad fungicida
de las fracciones Fr1, Fr2 y Fr3……………………………………………... 32
3.2.2.4 Fraccionamiento del extracto Fr2…………………………………………… 32
3.2.2.5 Fraccionamiento del extracto Fr3…………………………………………… 33
3.3 CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA DEL
EXTRACTO ELICITADO………………………………………………………33
3.3.1 Materiales …………………………………………………………………….. 33
3.3.2 Metodología…………………………………………………………………… 33
3.3.2.1 Prueba de Flavonoides………………………………………………………. 34
3.3.2.2 Prueba de Leucocianidinas…………………………………………………... 34
3.3.2.3 Prueba de compuestos Fenólicos…………………………………………….. 34
3.3.2.4 Prueba de Taninos…………………………………………………………… 34
3.3.2.5 Prueba de Cardiotónicos……………………………………………………... 35
3.3.2.6 Prueba de Quinonas…………………………………………………………. 35
3.3.2.7 Prueba de Terpenoides………………………………………………………. 35
3.3.2.8 Prueba de Alcaloides………………………………………………………… 35
3.4 MÉTODO DE BIOAUTOGRAFÍA PARA
LA FRACCIÓN FR 2…………………………………………………………… 35
3.4.1 Materiales …………………………………………………………………….. 36
3.4.2 Metodología…………………………………………………………………… 36
3.4.2.1 Cromatografía en capa delgada……………………………………………… 36
3.4.2.2 Inoculación y revelado de la placa ………………………………………….. 37
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS……………………………………………………38
4.1 TRATAMIENTO Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL
ELICITADO Y NO ELICITADO……………………………………………….38
iii
4
Página
4.2 EVALUACIÓN in vitro DE LA ACTIVIDAD
FUNGICIDA Y FRACCIONAMIENTO BIOGUIADO
DE LOS EXTRACTOS………………………………………………………….38
4.2.1 Evaluación in vitro de la actividad
fungicida de los extractos……………………………………………………... 38
4.2.2 Fraccionamiento del extracto Fr2……………………………………………... 45
4.2.3 Fraccionamiento del extracto Fr3……………………………………………... 46
4.3 CARACTERIZACIÓN FITOQUÍMICA
DEL EXTRACTO ELICITADO………………………………………………... 47
4.4 MÉTODO DE BIOAUTOGRAFÍA PARA
LA FRACCIÓN FR2……………………………………………………………. 48
5. CONCLUSIONES………………………………………………………………... 52
REFERENCIAS
ANEXOS
iv
5
INTRODUCCIÓN
Las fitoalexinas son metabolitos secundarios sintetizados de novo, los cuales cuentan
con actividad antibiótica y se acumulan en plantas bajo la influencia de un estrés, ya sea
por microorganismos o factores del ambiente. Su expresión puede generarse mediante
dos tipos de elicitores: bióticos y abióticos. La elicitación biótica consiste en generar
esta respuesta mediante la acción de microorganismos como hongos o bacterias,
mientras que la abiótica implica el uso de agentes químicos (metales pesados) y físicos
(luz UV).
Aun cuando la hipótesis de las fitoalexinas se encuentra en su séptima década, mucha
de la información al respecto es desconocida o debatible, lo que ha generado nuevas
alternativas en la forma de estudiar el fenómeno y ha reenfocado la atención en la
explotación potencial de los mecanismos de resistencia endógena para la protección de
un cultivo. El objetivo biotecnológico se centra en el uso de extractos elicitados, los
cuales poseen una carga considerable de metabolitos con actividad antibiótica, en el
control biológico de un cultivo. Otra de las alternativas consiste en diseñar una
resistencia multimecanística contra plagas, lo que implica el uso de herramientas
interdisciplinarias con las que se posibiliten aplicaciones de alto impacto. Sin embargo,
este objetivo solo puede lograrse a través de un entendimiento completo de la respuesta
fitoalexina.
Es posible facilitar la correlación de la actividad con la biosíntesis de metabolitos que
cumplen con las características necesarias para ser llamados fitoalexinas, a través de
fraccionamientos bioguiados y el diseño de herramientas como la bioautografía en la
cual se observa, directamente, cuáles compuestos están implicados en la actividad
biocida hacia microorganismos fitopatógenos.
6
1. MARCO CONCEPTUAL.
Biodiversidad es un término comúnmente usado para denotar la variedad de especies y
la multiplicidad de formas de vida. Sin embargo este concepto es más profundo de lo
que generalmente imaginamos, por lo que se hace necesario abordarlo a partir de
conceptos mucho más generales. El Metabolismo es uno de los aspectos generales o
comunes a todos los seres vivos que forman parte de esa biodiversidad. El metabolismo
es definido como el conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en las células y
que conforman la base de la vida. Estos procesos permiten a la célula realizar funciones
vitales como crecer y reproducirse, mantener el sistema alejado del equilibrio químico y
generar respuestas de adaptación hacia el entorno las cuales son de gran importancia
para la supervivencia del organismo del que estas forman parte. Es así como todos los
organismos necesitan proveerse a sí mismos con energía en forma de ATP para obtener
los bloques con los que construyen sus propios tejidos [1].
Existen dos tipos principales de metabolismo: primario y secundario [2]. En el primario
se incluyen todas las rutas y productos que son esenciales para la célula. Además,
algunas de ellas son comunes en todos los organismos. Es decir, son procesos que
involucran esencialmente la misma química a través de los grandes reinos de la vida,
hecho que prueba que había ya un grado de evolución enorme antes de que se diera la
diversificación en los diferentes tipos de células y organismos [1].
Por otra parte, el metabolismo secundario comprende los procesos químicos que no son
universales o que son únicos para un sistema dado. El metabolismo secundario
representa el conjunto de las reacciones químicas que da lugar a la formación de un
metabolito secundario, también llamado producto natural. Estos generalmente se
encuentran en cantidades relativamente pequeñas y su producción usualmente está
confinada a un grupo particular de organismos o a una única especie (aun a una misma
cepa cultivada bajo ciertas condiciones). Es decir, la biosíntesis de ciertos metabolitos
secundarios puede ser extendida o restringida a familias, géneros, o especies
7
particulares, pero el resultado obtenido generalmente difiere de una especie a otra. Es
así como precursores químicos comunes pueden producir resultados diferentes [2].
La definición estricta para los metabolitos secundarios es que éstos no forman parte de
la estructura molecular básica de la célula, se encuentran presentes sólo en órganos o
tejidos particulares, o en etapas definidas del desarrollo. La definición más moderna
que puede encontrarse es en la que se los considera como compuestos orgánicos que no
tienen ningún rol en la asimilación o en el crecimiento y desarrollo del organismo. Sin
embargo, aunque en la mayoría de los casos los metabolitos secundarios no parecen ser
necesarios para la supervivencia de la planta, pueden conferirle una ventaja
competitiva. A pesar de no ser bien conocido el rol biológico que juega determinado
compuesto, en muchos casos consigue convertirse en un tesoro químico. Es decir,
adquiere un interés particular o es de beneficio para el hombre [2].
El apelativo de “producto natural” resulta algo inapropiado ya que, estrictamente
hablando, cualquier molécula biológica es un producto natural. Sin embargo el término
está reservado para los metabolitos secundarios, es decir, moléculas pequeñas (peso
molecular menor a 1500 Da) producidas por un organismo, pero que no es
indispensable para la supervivencia del mismo, como sí lo son algunas macromoléculas
tales como proteínas, ácidos nucléicos y polisacáridos, los cuales conforman la
maquinaria básica de los procesos fundamentales para la vida [5].
Como se mencionó con anterioridad, los niveles de los metabolitos secundarios están
estrechamente relacionados con el estado nutricional y de desarrollo del organismo.
Más crítico aún es el hecho de que su producción o biosíntesis se vea fuertemente
afectada por varios tipos de estrés que se encuentran presentes en el ambiente en el cual
se desarrolla el organismo [2].
A través de los años se han considerado varias hipótesis para la existencia de los
metabolitos secundarios. Una de ellas los considera como productos de exceso en el
metabolismo, como respuesta a niveles de sustrato superiores a los requeridos para el
8
metabolismo primario, o como resultado a una limitación en la cantidad de nutrientes
que pueden ser absorbidos. Otra de las hipótesis afirma que son productos de
desviación de rutas menores, que involucran, en un primer paso, la formación de una
enzima de bifurcación, la cual dirige una cierta cantidad del sustrato destinado al
metabolismo primario, hacia el secundario [3]. También podrían representar productos
de secreción o detoxificación [2,4].
Probablemente la explicación más convincente para la existencia del metabolismo
secundario fue la propuesta por Zähner [1], quien lo describió como un “comodín
evolutivo”. El esclarecimiento de este hecho se encuentra estrechamente ligado al
mecanismo mediante el cual un compuesto es fijado en la expresión génica del
metabolismo secundario en un organismo. Este proceso evolutivo incluye, en primer
lugar, el hecho de que el compuesto no tenga efectos adversos en el mismo
metabolismo que lo produce, en ninguno de sus niveles de diferenciación,
morfogénesis, transporte, regulación o en el metabolismo intermediario. A partir de ese
punto, el compuesto puede seguir expresándose por un largo periodo de tiempo durante
el cual consigue encontrar un rol que le confiere una ventaja selectiva al organismo que
lo produce [2]. Esta es la explicación al hecho de que la biosíntesis de ciertos
metabolitos secundarios esté restringida a un grupo de organismos o incluso a una
especie en particular. Sin embargo, como se había citado antes, mientras muchos actúan
como antialimentarios, atrayentes sexuales o agentes antibióticos; muchos otros
parecen no tener un rol biológico obvio.
Una de las principales funciones de los metabolitos secundarios en las plantas es la de
disuadir o repeler a los organismos que se alimentan de ellas. No obstante, debido al
continuo proceso de evolución y a la especialización de las plantas en la
implementación de nuevas rutas biosintéticas, los herbívoros y microorganismos se
volvieron tolerantes a sus efectos y desarrollaron la capacidad de utilizarlos para sus
propios fines [5].
9
Cabe agregar que, curiosamente, muchos metabolitos secundarios parecen ser dañinos
para la planta que los produce [4], es por ello que a menudo los terpenos, por ejemplo,
deben ser almacenados en glándulas o en compartimentos celulares especializados para
evitar que la misma planta sufra los efectos citotóxicos del compuesto [5].
1.1 Mecanismos de defensa en las plantas.
Existe una gran cantidad de trabajos, realizados a partir de extractos de plantas, en
donde se hace alusión a la importancia de los metabolitos secundarios en el control de
patógenos [4, 5]. En ellos se ha evidenciado actividad antifúngica, antibacteriana,
además de otras propiedades como la estimulación en el desarrollo fisiológico de la
planta, activación de mecanismos de defensa contra plagas y enfermedades, respuesta
hipersensible directa contra patógenos, control de especies reactivas de oxígeno (ERO)
generadas en la respuesta de defensa [5], entre otras.
Cuando en una planta se produce un estrés, ya sea por una interacción con agentes
bióticos (microorganismos), agentes abióticos (como luz UV) o daños mecánicos
(heridas de insecto), todas estas condiciones se traducen en una respuesta de defensa de
la planta la cual involucra la activación transcripcional de diversos genes de proteínas
necesarias para la cicatrización de la herida y/o la prevención de la invasión de
microorganismos patógenos. Estos genes codifican para proteínas involucradas en: a)
fortificación de la pared celular como son la formación de calosa, lignina y proteínas
ricas en hidroxiprolina. b) la producción de inhibidores de proteasa y de enzimas líticas
tales como las quitinasas y glucanasas, y c) la síntesis de metabolitos secundarios con
actividad antimicrobiana y antioxidante [6].
La respuesta de defensa contra el ataque de microorganismos patógenos está
coordinada, tanto espacial como temporalmente, para una contención rápida de la
infección, por lo que puede ser local o en sitios lejanos al daño. Esta es conocida como
respuesta sistémica. Por otra parte, la respuesta local está asociada a una respuesta
10
hipersensible caracterizada por una muerte rápida de las primeras células infectadas y la
restricción de la expansión del patógeno, aislándolo del resto de la planta [7].
Entre los eventos tempranos que se desencadenan en la respuesta hipersensible están: a)
la producción de especies reactivas de oxígeno tales como: super óxido (O2-), hidroxilo
(OH-) y el peróxido (H2O2), b) la apertura de canales iónicos, y c) los eventos de
fosforilación y desfosforilación de proteínas. Posteriormente se da un aumento en los
niveles de ácido jasmónico, ácido salicílico y etileno, la acumulación de proteínas
relacionadas a la patogénesis (RP), un aumento de la producción de metabolitos
secundarios con actividad antimicrobiana o antioxidante y el fortalecimiento de la pared
celular. Estos eventos conducen al establecimiento de la respuesta local, mientras que
en la respuesta sistémica se induce la producción de proteínas RP similares a las de la
respuesta local y de otras proteínas RP. En la figura puede apreciarse un diagrama
general de la respuesta de defensa en plantas (figura 1) [5].
En general, la expresión de los genes de defensa se regula por moléculas tales como el
ácido salicílico, etileno, ácido jasmónico y las ERO. En particular, el ácido jasmónico
modula la síntesis de las proteínas de la pared celular, como son las proteínas ricas en
prolina, y activa la expresión de los genes de las enzimas involucradas en la síntesis de
metabolitos secundarios tales como la acetil-CoA carboxilasa, la chalcona sintasa, la
fenilalanina amonio liasa, la hidroximetil-glutaril-CoA reductasa, y las polifenol
oxidasas, entre otras [8].
Por su parte, las ERO pueden tener dos funciones. En la primera, pueden aumentar el
daño producido por el estrés debido a su toxicidad, mientras que en la segunda, pueden
actuar como una señal para la activación de las respuestas de defensa. En la respuesta
hipersensible, las ERO pueden limitar la expansión del microorganismo patógeno
causando la muerte de la célula vegetal huésped y/o actuando directamente sobre el
microorganismo [9].
11
De igual manera, los metabolitos secundarios están involucrados en la respuesta de
defensa de las plantas mediante la restricción de la invasión y/o matando directamente
al microorganismo patógeno, o bien, por su capacidad antioxidante, contribuyen al
mantenimiento del estado de oxido-reducción de la célula vegetal [10].
1.2 Grandes Rutas Metabólicas y la biosíntesis de metabolitos de estrés.
Se había mencionado con anterioridad que las rutas para la modificación y síntesis de
carbohidratos, proteínas, grasas y ácidos nucléicos son iguales en todos los organismos
vivos, excepto por algunas variaciones menores. Del mismo modo, la biosíntesis de la
mayoría de los metabolitos secundarios se da a partir de un grupo de precursores
relativamente pequeño, los cuales se han modificado para formar un incontable número
de compuestos a través de varias rutas sintéticas. Las rutas de mayor importancia son:
la acetil coenzima A (acetil-CoA), ácido shikímico y ácido mevalónico; más conocidas
como la ruta del acetato, shikimato y mevalonato respectivamente. Estos intermediarios
se forman como subproductos de rutas como la glicólisis e intermediarios de la misma
Figura 1. Representación esquemática de las respuestas de defensa, tanto locales como sistémicas, desde
el inicio de la invasión de un microorganismo patógeno.
12
(figura 2.) [11]. Por otra parte, una amplia variedad de antibióticos, péptidos, proteínas y
alcaloides son modificaciones de aminoácidos derivados de la acetil-CoA vía ciclo de
Krebs [12] o por medio de la ruta del shikimato.
Figura 2. Esquema general de la biosíntesis de los diferentes grupos de metabolitos secundarios.
A partir de estas rutas se derivan varios grupos de metabolitos secundarios de los cuales
tres son los más importantes y extensamente estudiados: los terpenoides, los alcaloides,
y fenilpropanoides, todos ellos implicados, mediante infinidad de mecanismos, en la
respuesta de defensa de los organismos que las producen.
13
1.2.1 Los alcaloides
Los alcaloides son compuestos heterocíclicos que generalmente se sintetizan a partir de
aminoácidos tales como triptofano, tirosina, fenilalanina, lisina, arginina y ornitina,
solos o combinados con terpenoides. También se pueden derivar de purinas y de
policétidos del acetato. Los alcaloides pueden dividirse en varios grupos tales como:
alcaloides isoquinoléicos, quinolizidínicos, pirrolizidínicos, tropánicos e indólicos [13].
Por su similitud química a moléculas que participan en la transmisión de las señales del
sistema nervioso, el efecto toxico de los alcaloides radica en su capacidad de bloquear
neurorreceptores intermediarios de la transducción de la señal neuronal y canales
iónicos de vertebrados e insectos. Por otra parte, sus efectos inhibitorios del
crecimiento de microorganismos patógenos están dados por su capacidad de
intercalarse con el DNA, de detener la síntesis de proteínas, inducir la apoptosis e
inhibir las enzimas del metabolismo de carbohidratos [14].
En general, la síntesis constitutiva de alcaloides se incrementa en respuesta a la herida
producida por insectos depredadores; sin embargo otros alcaloides son sintetizados de
novo, es decir, en el momento en que se produce la herida. Estos reaccionan con grupos
aniónicos y grupos nucleofílicos de aminoácidos o de otras moléculas como receptores
y enzimas, inhibiendo su función. Los receptores adrenérgicos, nicotinérgicos,
muscarinérgicos y de la serotonina son blancos de unión de estos compuestos. Así
mismo, inhiben a las enzimas necesarias para la síntesis y el rompimiento del
neurotransmisor acetilcolina, impidiendo la transducción de la señal neuronal de
insectos y vertebrados. La interacción de estos alcaloides con el DNA, las proteínas y
enzimas de transcripción; contribuye a los efectos aleloquímicos y tóxicos contra
bacterias, hongos, virus, insectos, vertebrados y otras plantas [15].
Como se mencionó anteriormente, algunos alcaloides se sintetizan como parte de una
respuesta general de defensa de las plantas. Sin embargo, se conocen insectos parásitos
que evitan esta respuesta de defensa asimilando, transportando y almacenando estos
compuestos para su propio beneficio. Estos insectos se especializan en utilizar los
14
alcaloides de la planta en la síntesis de sus ferohormonas o de compuestos que tienen
actividad contra sus propios depredadores [16].
1.2.2 Los Fenilpropanoides
Estos compuestos se caracterizan por tener en su estructura un anillo aromático con uno
o más grupos hidroxilo y se sintetiza a partir de un precursor común, el ácido cinámico,
derivado de la fenilalanina por la actividad de la enzima fenilalanina amonio liasa.
Debido a su fitotoxicidad, por lo común son almacenados en su forma glicosilada en las
vacuolas o bien pueden conjugarse con otros componentes de la pared celular [17].
En la respuesta hipersensible, los fenilpropanoides simples pueden contribuir a limitar
el desarrollo de la infección. Algunas formas insolubles de fenilpropanoides aunados a
otros compuestos como la cutina, suberina, lignina y polisacáridos refuerzan la pared
celular como respuesta de las plantas a la herida y al ataque de microorganismos
patógenos. Estos compuestos, además, reducen la digestibilidad de la pared celular por
las enzimas digestivas del microorganismo patógeno [18].
Los flavonoides, tales como la naringenina y el kaempferol del arroz, inhiben el
crecimiento de Xanthomonas oryzae y la germinación de las esporas de Pyricularia
oryzae, que son importantes microorganismos patógenos de este cereal [19].
Otro aspecto de relevancia en los flavonoides es que pueden limitar la invasión del
microorganismo en respuesta a la infección. Estos pueden acumularse en forma de
inclusiones en las primeras células epidérmicas que fueron atacadas por el patógeno. En
el momento en que se penetra el tejido micelar, estas inclusiones viajan hasta el lugar
liberando su contenido y matando, tanto al patógeno, como a las células infectadas que
sintetizaron estos flavonoides para finalmente detener la infección [20].
Por otra parte, los fenilpropanoides simples y los flavonoides tienen una actividad
amplia dependiendo del sustituyente del hidroxilo de su anillo fenólico. Estos
compuestos pueden actuar como agentes quelantes de los iones hierro y cobre, como
15
cosechadores de radicales, como es el radical hidroxilo, o reaccionar con moléculas
como el ácido hipocloroso o nitroso y producir compuestos con una menor capacidad
oxidativa. Algunos fenilpropanoides simples son poderosos antioxidantes capaces de
consumir el H2O2 y contribuir con el ajuste del estado de oxido-reducción celular
desencadenado durante el estrés [21].
1.2.3 Los terpenoides
Los terpenos (terpenoides) son un grupo de compuestos lipídicos diverso y numeroso
de los cuales se estima que existen alrededor de 30,000. Son inmiscibles o parcialmente
miscibles en agua. Su biosíntesis se realiza a partir del acetil-CoA o intermediarios de
la glicólisis [22] y se derivan de la unión de unidades isopreno de 5-carbonos (C5H9).
Los terpenos se conocen también como isoprenos o isoprenoides. La gran
disponibilidad de estos compuestos, en conjunto con sus aplicaciones, erigió un
incentivo para ser investigados por los químicos, quienes dilucidaron la estructura de
muchos de los más simples de ellos durante el siglo pasado.
Los terpenos se clasifican por el número de unidades isopreno (figura 5), además existen
dos posibles rutas para su biosíntesis. Una de ellas es la ruta del ácido mevalónico
donde tres moléculas de acetil-CoA se unen para formar ácido mevalónico [23] la cual
es llevada a cabo en el citosol. El intermediario de seis carbonos allí producido es
fosforilado con 2 grupos fosfato (pirofosfato) para luego sufrir una descarboxilación y
posterior deshidratación generándose el isopentenil pirofosfato (isopentenil difosfato –
IPP), al cual se le denomina “building block”. La otra ruta, independiente del
mevalonato, utiliza intermediarios de la glicólisis para sintetizar IPP (figura 4) [31] y se
da en los plastidios (figura 3) [24].
Entre los terpenos pueden encontrase gran cantidad de compuestos con actividad
biológica potencial que intervienen en la respuesta de defensa de las plantas que los
producen. Algunos de ellos poseen actividad bactericida, otros son repelentes de
insectos. Sesquiterpenos tales como la rishitina y lubimina de la papa son compuestos
con actividad antimicrobiana [39].
16
CH2
CH3
OPP CH3
CH3
OPP
Isopentenil PP Dimetilalil PP
(IPP) (DMAPP)
Isomerización
Metabolismo Primario Metabolismo Secundario
OPP
Triterpenos
C30
Sesquiterpenos
C15
OPP OPP
IPP DMAPP
FDP
2X
Citoplasma
OPP OPP
IPP DMAPP
OPP
OPP
DiterpenosTetraterpenos
GDP
GGDP
Monoterpenos
C40 C20
C10
1X
3X
Plastidios
Figura 3. Biosíntesis de terpenos: rutas biosintéticas posibles en plantas.
Figura 4. Equilibrio de interconversión entre isopentenil pirofosfato y dimetilalil pirofosfato.
17
Por su parte, los terpenos en combinación con otros compuestos como las oxilipinas y
los indoles, forman mezclas volátiles que funcionan como señales químicas para atraer
a los enemigos naturales de insectos herbívoros. Estudios sobre la respuesta de la planta
a esta interacción, demostraron que hay inductores (elicitores) en la saliva de los
insectos herbívoros, que estimulan la síntesis de tales terpenos volátiles [25]. De otro
lado, por su capacidad antioxidante, los terpenoides son de vital importancia para las
plantas [26]. Los carotenoides no solo son componentes estructurales esenciales de los
sistemas fotosintéticos, sino que también son protectores del daño causado por la foto-
oxidación [27].
1.3 Metabolitos secundarios y el hombre
A través de la historia, los productos naturales, y particularmente los de origen vegetal,
han sido los principales recursos para la obtención de sustancias medicinales,
proveyendo a la industria farmacéutica de una importante variabilidad química con
Ph NH O
PhO
CH3
O
O
AcOOHOBz
OOAcOH
H
HOH
n
MeO
O
O
MeO
OH
CAROTENOIDES
MONOTERPENOS
SESQUITERPENOS
POLIMEROS
POLIPROPENOIDES
ESTEROIDES
DITERPENOS
β caroteno-
α - Pineno
Humuleno
Caucho
Ubiquinona Coenzima Q
Colesterol
Taxol
Isopreno
Figura 5. Diversidad en terpenos.
18
distintas aplicaciones específicas. Con el avance de las ciencias involucradas se han ido
perfeccionando las técnicas de estudio lográndose, no sólo mejorar la utilización de los
productos nativos obtenidos de los recursos naturales, sino también utilizarlos como
puntos de partida para la síntesis de nuevas sustancias con mejores propiedades que las
que les dieron origen. Hasta el presente, los principales agentes farmacéuticos han sido
descubiertos a través del “screening” de productos naturales obtenidos a partir de
material vegetal, organismos marinos, animales y microorganismos. Un ejemplo
concreto lo constituye el hecho de que más del 50 % de todos los principios activos
utilizados y con eficacia comprobada clínicamente en el tratamiento de distintos tipos
de cáncer son productos naturales o sus derivados.
Esto llevó a que, a partir de estudios puramente químicos y biológicos, se avanzara
progresivamente y que en la actualidad se focalice particularmente en la potencial
aplicación de aquellos recursos, especialmente en el tratamiento de enfermedades. Cabe
agregar, que en los últimos años se ha incrementado la utilización de estos recursos
naturales en el saneamiento agroindustrial y/o fitorremediación, y en la
descontaminación de aguas y suelos.
A lo largo de la historia, los metabolitos secundarios de las plantas han sido utilizados
por la humanidad debido a sus importantes aplicaciones como productos medicinales,
colorantes, esencias, alimentos, materia prima para la industria, etc. A partir de este
hecho se creó la necesidad de aislar aquellos compuestos de interés, con el fin de
estudiar su estructura y actividad. Sin embargo, una de las complicaciones más grandes
que acarrea consigo el estudio y aislamiento de los productos naturales es que, a
diferencia de las macromoléculas que prevalecen a través de los seres vivos, los
primeros son mucho más pequeños y químicamente más diversos que las
macromoléculas como proteínas, ácidos nucléicos y polisacáridos; las cuales son
relativamente más homogéneas. Por tanto estos procesos no están ajustados a un
manual práctico en el cual se encuentra detalladamente la receta o el protocolo, son
simplemente el resultado de un uso adecuado del criterio químico y las herramientas
con las que se cuenta [1].
19
La cromatografía es probablemente la técnica más poderosa y versátil para la
separación de una mezcla en sus componentes individuales. Aunque en la actualidad es
empleada en su mayoría como una herramienta de análisis químico, esta resulta útil en
la separación de cantidades relativamente pequeñas de materiales que poseen un valor
intrínseco apreciable [28].
El método fue desarrollado por el botánico ruso Mikhail Tswett en 1906. Tswett llevó a
cabo la extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de
petróleo, un solvente no polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al
hacer pasar el extracto a través de un sistema que consistía un tubo de vidrio relleno
con carbonato de calcio (tiza). Debido a que los compuestos que separó tenían color,
Tswett observó bandas o zonas de composición distintas en la columna, demostrando
que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos presentes en las plantas.
A pesar de que el método cromatográfico prometía simplificar la separación de
sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la década de los 30 y
principio de los 40 cuando se empezó a desarrollar la técnica teniendo este método
diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografía se emplea principalmente para
separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier
técnica que se base en los mismos principios [28].
En la cromatografía, los componentes de las mezclas se separan a medida que son
transportados por una fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o
líquida, la separación de las moléculas se logra debido a que la movilidad de cada
soluto depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria.
Esta separación se puede realizar en función de tamaños moleculares, relación
carga/masa, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc [29].
Entre las técnicas más comúnmente usadas para el aislamiento y purificación de
metabolitos secundarios se encuentran: cromatografía de columna, cromatografía de
20
capa delgada (TLC) y cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en fase
preparativa.
1.4 Fitoalexinas y metabolitos de estrés.
Cuando la espora de un hongo entra en contacto con la superficie de una planta, el
microclima (temperatura, exposición a la luz, humedad, etc.) debe ser apropiado para
que pueda darse la germinación. A partir de allí, el hongo debe superar una gran
cantidad de barreras de defensa antes de acceder a una célula de la planta. Estas
barreras pueden ser mecánicas, como cutículas delgadas; o químicas, como compuestos
que se liberan para inhibir el crecimiento de esporas y microorganismos. Estos
constituyentes de la planta hacen parte del arsenal de defensa contra hongos y son
llamados metabolitos de preinfección, prohibitinas o fitoanticipinas [30].
Sin embargo, dado el caso en el que todas estas armas constitutivas no sean suficientes
para detener la germinación de la espora del hongo y la posterior penetración de la hifa
en la epidermis, la planta usualmente responde bloqueando o retardando el avance del
invasor. Para esto se generan señales de alerta que se traducen en varios tipos de
reacciones como: refuerzos estructurales de las paredes celulares, respuestas
hipersensibles (muerte celular programada), desarrollo de resistencia sistemática
adquirida y la acumulación de sustancias químicas producidas de novo las cuales
cuentan con actividad biocida llamadas fitoalexinas [31, 32, 33, 34, 35, 36].
El termino fitoalexina está restringido a compuestos con actividad antibiótica que
requieren expresiones de novo de los enzimas involucrados en su ruta biosintética.
Energéticamente hablando, este mecanismo resulta ser una económica forma para
neutralizar agentes patógenos, ya que los recursos energéticos de la planta se desvían
para la síntesis de las fitoalexinas únicamente en los instantes recientes a la infección y
en el sitio de la misma.
En 1911, Noel Bernard, botánico francés, descubrió que las plantas podían producir
sustancias que eran específicamente formadas cuando se daba un estrés generado por el
21
ataque de un hongo. Bernard encontró que los tubérculos de dos especies de orquídeas
se volvían resistentes a ataques posteriores de un hongo luego de haber sido infectados
con Rhizoctonia repens. Mediante el cultivo de tejidos de tubérculo infectados y la
introducción del hongo en el medio (agar), él demostró que este tejido producía un
inhibidor del crecimiento del hongo. No obstante, los compuestos involucrados fueron
identificados décadas después [36].
Más tarde, Müller y Börger (1940) observaron el mismo fenómeno en tubérculos de
papa infectados con Phytophthora infestans, a estas sustancias inducidas las llamaron
“fitoalexinas” [37] (del griego futon=planta; alexein= defensa). Müller y Börger
definieron las fitoalexinas como “compuestos químicos producidos como resultado de
la invasión de células vivientes por un parásito”. La definición dada por Müller y
Börger exigía que, para que un compuesto con actividad antimicrobiana fuera
considerado una fitoalexina, no podría ser ni prefabricado en el tejido, ni liberado a
partir de constituyentes preexistentes en la planta [38]. Es decir, estos antibióticos
debían producirse en respuesta a un elicitor microbiano, y su producción exigía un
gasto energético de la planta, generalmente debido a la necesidad de una nueva
actividad transcripcional y/o traduccional.
Otro de los requerimientos de la definición original de Müller, era que el compuesto en
cuestión debía ser base de un mecanismo de resistencia a la enfermedad. Aunque la
resistencia a una enfermedad se asume como función de todos los antibióticos de la
planta, es difícil verificar esta función experimentalmente para cualquier constituyente
de la planta con una determinación de actividad in vitro, debido al sinergismo que
puede presentarse entre ellos. Por este motivo, la definición de Müller y Börger ha sido
modificada a medida que se han ido encontrando nuevas evidencias y revisado
conceptos. Ejemplos de ello fue la detección de fitoalexinas luego de la aplicación de
otros tipos de estrés no biológico, como la irradiación con luz del rango del UV, o el
tratamiento con iones metálicos pesados como sales de cobre y mercurio. A estos
factores que pueden generar respuestas tanto fisiológicas como morfológicas y la
acumulación de fitoalexinas, en un sentido amplio, se les denomina elicitores. Estos
22
pueden provenir de diferentes fuentes y entre ellos se encuentran los elicitores abióticos
como son algunos iones metálicos, radiación U.V., y elicitores bióticos como hongos,
bacterias, virus y herbívoros, etc. Se sabe que el tratamiento de plantas con elicitores, o
el ataque de patógenos incompatibles, desencadena una serie de reacciones de defensa,
incluyendo la acumulación de metabolitos secundarios de defensa como son las
fitoalexinas, tanto en plantas intactas como en cultivos celulares [35, 39]. Muchos
elicitores como la quitina, xiloglucanos, quitosan, h-glucanos y oligogalacturónidos
exhiben actividad elicitora entre las diferentes especies de plantas e inducen la
producción de fitoalexinas, sugiriendo que diferentes plantas poseen algunos receptores
comunes para ese tipo de señales [40].
Debido a la existencia de estas nuevas evidencias, Ingham (1973) redefinió las
fitoalexinas como “antibióticos producidos por las plantas mediante rutas metabólicas
inducidas tanto por factores biológicos como químicos y del ambiente”. Además, el
término fitoalexina está, en general, limitado a metabolitos secundarios de bajo peso
molecular, usualmente menor a 1000 g/mol, por tanto no aplica a péptidos y proteínas
con actividad biocida producidos por las plantas [14].
A menudo es difícil determinar si una sustancia es constitutiva o inducida, ya que
podría presentarse en cantidades difícilmente detectables pero que se incrementan
dramáticamente luego de una infección. Estrictamente este tipo de sustancias no se
consideran como fitoalexinas debido que no son sintetizadas de novo. Por este motivo,
Stoessl (1980) propuso una definición más pragmática: “Productos del metabolismo
superior de las plantas, ausente en tejidos sanos o presente solo en trazas despreciables,
los cuales se acumulan en cantidades significativas en respuesta a un estrés por hongos
o bacterias”. La importancia de esta definición radica en que se evita asignar al
compuesto un rol en la resistencia de la planta, y que además se excluyen aquellos
compuestos con actividad antibiótica que están presentes en el tejido de la planta antes
de una infección por microorganismos, o que son producidos a partir de constituyentes
preformados y que aparecen durante la infección.
23
De las muchas defensas potenciales en las plantas que se activan después de la
infección (postinfeccionales), ninguna otra ha sido estudiada tan a fondo y generado
tanta controversia a través de los años como la elicitación y la acumulación de
fitoalexinas [41]. Esto se debe a que el mecanismo que emplean las fitoalexinas para
detener el desarrollo del patógeno en el tejido hospedero, se encuentra aún muy
nublado para muchas de las interacciones planta-patógeno conocidas. Se ha obtenido
resultados importantes en sistemas donde ha sido posible cuantificar la fitoalexina en el
sitio de la infección, sin embargo existen pocos trabajos al respecto [41].
La producción de mutaciones biosintéticas en plantas podrían representar la mejor
herramienta para estudiar el rol de estos compuestos, pero existen una gran cantidad de
limitaciones ya que, hasta ahora, solo ha sido posible llevarse a cabo en el modelo
Arabidopsis. Por medio de esta se ha evidenciado que la acumulación de camalexina es
importante en la resistencia de Arabidopsis a Alternaria brassicicola pero no a
Bortrytis cinerea [42].
Otra de las aproximaciones que pueden resultar útiles para evaluar el rol de las
fitoalexinas, consiste en buscar variaciones naturales en la habilidad de una planta para
producir fitoalexinas y luego determinar si esta capacidad está relacionada a la
producción de fitoalexinas. En el sorgo, la resistencia a Colletotrichum sublineolum no
solo está relacionada a la producción de altas concentraciones de fitoalexinas en
interacciones no compatibles, sino también a la acumulación compuestos más tóxicos
por parte de genotipos específicos [43]. Es decir, esta variabilidad genotípica puede
proveer una herramienta para estudiar el rol de las fitoalexinas si se comparan las
diferencias en la resistencia y se correlacionan con la producción de fitoalexinas [44].
En 1994, en el simposio celebrado en honor al 50 aniversario del concepto de
fitoalexina (“Phytoalexin Hypothesis and Beyond” Dannenfels, Alemania), se propone
el término “fitoanticipina” (nombrado por J.W. Mansfield) definiéndose como:
“Compuestos de bajo peso molecular con actividad antimicrobiana, los cuales se
encuentran presentes en plantas antes de un estrés por microorganismos o que son
24
producidos luego de la infección, únicamente a partir de constituyentes preexistentes”.
De esta manera se quiso reemplazar e incluir todo tipo de metabolitos biocidas de bajo
peso molecular, además de las fitoalexinas, a los cuales no es posible correlacionárseles
como parte de un mecanismo de defensa o que, en efecto, aparentan jugar un rol en la
resistencia de las plantas [45].
Vale la pena aclarar que la diferenciación entre fitoalexina y fitoanticipina no está
basada en su estructura química sino en el evento y la forma como se producen. Sin
embargo, ha surgido otro tipo de confusiones acerca de compuestos constitutivos e
inducidos. Esta va dirigida a que, una misma sustancia puede ser preformada en una
especie de planta, es decir tener las características de una fitoanticipina, y ser una
fitoalexina en otra. Aún más complejo es el hecho de que, algunos compuestos, pueden
ser fitoalexinas en un órgano de una planta determinada y constitutivos en otras partes
de la misma. Ejemplo de ello es el trébol rojo (Trifolium pratense), cuyas raíces
contienen un derivado de flavonoide (maackiain) con actividad antimicrobiana,
presente como la aglicona de un glicósido preformado, el cual se libera del tejido herido
de la planta por acción de una glucosidasa durante la desfragmentación del mismo [46].
En este caso, el compuesto puede ser considerado como fitoanticipina. Sin embargo,
este flavonoide también puede ser sintetizado de novo en esta planta en respuesta a una
infección microbiana, u otro tipo de elicitores, tomando el papel, en este caso, de una
fitoalexina [47].
Distinguir los antibióticos de las plantas con base a cómo son producidos puede parecer
un poco arbitrario. No obstante, esta distinción se basa en diferencias fundamentales en
las respuestas de las plantas en la interacción planta patógeno [45]. Es decir, para que
una fitoalexina funcione como base del mecanismo de resistencia a una enfermedad,
debe ser una respuesta activa en un tejido determinado de la planta, en el cual la
interacción de la planta con el microorganismo, genere un cambio en la actividad
metabólica de la planta. Mientras que, en el caso de una fitoanticipina, para que estos
funcionen como base del mecanismo de resistencia, la planta debe “confiar” en estos
compuestos preformados los cuales pueden jugar un papel pasivo en su interacción con
25
patógenos potenciales [45]. Es importante agregar que, en la mayoría de los casos, no es
posible conocer si el compuesto producido de novo es sintetizado únicamente en el sitio
de infección, si se acumula en todo el tejido de la planta o en un tejido en particular, e
incluso se desconoce si su producción está íntimamente relacionada a un fenómeno
específico que ocurre en una etapa particular de la enfermedad [48].
Como se mencionó con anterioridad, las fitoalexinas han sido consideradas como parte
de los mecanismos con los que las plantas responden al ataque de parásitos. Sin
embargo, algunos patógenos poseen una tolerancia, que puede ser moderada o alta, a
estos compuestos tóxicos (fitoalexinas), mientras otros son sensibles a ellos. Ha sido
posible demostrar, en unas pocas enfermedades, que los microorganismos que resultan
ser patógenos para la planta, logran metabolizar estos compuestos tóxicos mediante
mecanismos propios de detoxificación [34]. El estudio de tales mecanismos resulta ser
de gran interés debido a que: 1.) la patogenicidad de un organismo puede depender de
su habilidad para detoxificar los compuestos producidos por el hospedero y 2.) el
control de los mecanismos de detoxificación puede ayudar a mejorar la resistencia a la
enfermedad [37].
Las fitoalexinas se pueden encontrar tanto en Angiosperma como en Gimnosperma y,
tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Aunque existe una gran diversidad
estructural en estos compuestos, muchas familias de plantas producen fitoalexinas que
pueden agruparse en una misma clase química. Es por esto que las fitoalexinas se han
usado para examinar relaciones quimiotaxonómicas. Se ha reportado fitoalexinas
pertenecientes a la familia de los sesquiterpenoides, que son obtenidas a partir de
plantas de papa, tabaco y tomate, tanto en tejidos infectados como en cultivos celulares
en suspensión [39]. En tomate, la Rishitina (figura 6-1) es la principal fitoalexina
identificada en frutos infectados y fragmentos de tallo, aunque no ha sido detectada en
hojas. Sin embargo, la respuesta en células de tomate tratadas con extractos de
levadura, los cuales han demostrado actividad elicitora, se incrementa linealmente con
26
el aumento de la concentración de levaduras. No obstante es posible detectar trazas de
rishitina en cultivos no elicitados [39].
De esta forma, es posible demostrar la relación quimiotaxonómica que existe entre estas
especies pertenecientes a la familia de las Solanáceas (papa (Solanum tuberosum),
tabaco (Nicotiana tabacum), tomate (Lycopersicon esculentum), ya que los reportes de
fitoalexinas producidas convergen a compuestos sesquiterpenoides en su mayoría.
La papa tiene un especial interés en la historia ya que, como se mencionó
anteriormente, a partir de esta se iniciaron los experimentos que dieron las bases de la
CH2
CH3
CH3
OH
OH
CH3
CH2
CHOOH
CH3
CH2
CH3
CH3O
CH3
O
O
CH3
OAc
CH3
CH3
CH3
CH2
CH3
CH3
OHCH3
OH
(1)(2)
(3)(4)
(5)
Figura 6. Algunas fitoalexinas sesquiterpenoides de la papa. Rishitina (1), lubimina (2), solavetivon (3),
fituberina (4) y capsidiol (5).
27
hipótesis de las fitoalexinas [32]. Para esta se reportan metabolitos de estrés como la
rishitina (1), lubimina (2), solavetivon (3), fituberina (4), capsidiol (5) (figura 6) y otras 15
estructuras más [49].
Se puede encontrar una excepción en el tomate debido a que entre sus fitoalexinas se
detecta un compuesto acetilénico (cis-pentadeca-6-eno-1,3-diin-5,15-diol (figura 7)), sin
embargo éste no afecta la uniformidad de la respuesta fitoalexina en esta familia, ya que
el compuesto se produce en menor cuantía con relación a los demás.
Aun cuando la hipótesis de las fitoalexinas se encuentra en su séptima década, mucha
de la información al respecto es desconocida o debatible [50] lo que ha cambiado la
forma de estudiar el fenómeno y ha reenfocado la atención en la explotación potencial
de los mecanismos de resistencia endógena para la protección de un cultivo. El objetivo
biotecnológico se centra en el uso de extractos elicitados, los cuales poseen una carga
considerable de metabolitos con actividad antibiótica, en el control biológico de
cultivos. Otra de las alternativas consiste en diseñar una resistencia multimecanística
contra plagas, lo que implica el uso de herramientas interdisciplinarias con las que se
posibiliten aplicaciones de alto impacto. Sin embargo, este objetivo solo puede lograrse
a través de un entendimiento completo de la respuesta fitoalexina.
C CH
OH
CHC CH CH2 CH2OH
Figura 7. Cis-pentadeca-6-eno-1,3-diin-5,15-diol.
28
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Caracterizar la producción de metabolitos secundarios de estrés, obtenidos a partir de
Solanum tuberosum bajo elicitación abiótica, y evaluar su actividad contra
microorganismos fitopatógenos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener metabolitos secundarios de estrés a partir de Solanum tuberosum (papa)
mediante inducción abiótica con CuCl2.
Realizar una evaluación preliminar del perfil fitoquímico de los extractos elicitados
y no elicitados, con respecto a su actividad contra microorganismos fitopatógenos.
Obtener fracciones a partir del extracto elicitado y evaluar el efecto en la actividad
hacia microorganismos patógenos.
Desarrollar un método de bioautografía y correlacionarlo con metabolitos
posiblemente asociados en la respuesta de estrés.
29
3. MATERIALES Y METODOLOGÍA.
3.1 Tratamiento y extracción del material Elicitado y No elicitado.
3.1.1 Materiales
Se utilizó papa (Solanum tuberosum) variedad capira, proveniente de la Plaza
Minorista de Medellín. El cloruro de cobre pentahidratado (CuCl2.5H2O) usado fue
grado analítico proveniente de Sigma®. El metanol y el diclorometano usados fueron
grado comercial proveniente de Protoquímica, los cuales se sometieron a redestilación.
Para la molienda se utilizó un molino eléctrico de discos y la extracción se realizó en
un shaker.
3.1.2 Metodología.
3.1.2.1 Tratamiento del material Elicitado y No elicitado.
Se tomaron 15 kg de papa (Solanum tuberosum) variedad capira, los cuales se cortaron
en rodajas entre 0.6 y 1 cm de espesor. Estos se dispusieron en canastas plásticas en
porciones de dos kilogramos aproximadamente y se asperjaron con una solución de
cloruro de cobre a una concentración de 10 mM cada 24 horas durante 48 horas. Las
rodajas fueron secadas en estufa a 45ºC por 48 horas, para más tarde ser sometidas a
molienda en un molino de discos.
En el tratamiento del material No elicitado, se tomaron 15 kg de papa de la misma
variedad y se les realizó el procedimiento anteriormente descrito, omitiendo esta vez la
aspersión con solución de cloruro de cobre 10 mM.
3.1.2.2 Extracción de metabolitos secundarios.
A una cantidad aproximada de 0.5 kg del material seco y molido se le agregó un litro
de metanol y se dejó en agitación con shaker por 24 horas, al cabo de las cuales se
30
filtró en algodón. El filtrado se recogió y el residuo se sometió nuevamente al mismo
proceso por dos ocasiones más. La solución metanólica obtenida se filtró nuevamente
con papel de filtro y se sometió a evaporación con vacío hasta eliminar por completo
el solvente. A la suspensión acuosa resultante se le realizó una partición líquido-
líquido con tres porciones de 30 mL de diclorometano por cada 100 mL de la misma.
Se recogió la fase orgánica y se sometió a evaporación hasta sequedad.
3.2 Evaluación in vitro de la actividad fungicida y fraccionamiento
bioguiado de los extractos.
3.2.1 Materiales.
Los ensayos de actividad fungicida in vitro se llevaron a cabo con una cepa de
Fusarium oxysporum proporcionada por la línea de microbiología del laboratorio
GIEM. Los cultivos se realizaron en cajas de Petri de 5.3 cm de diámetro, se usó agar
malta marca OXOID®, aceite de Neem proporcionado por Biotropical, Tween 20 y un
saca bocados. La emulsificación se realizó con la ayuda de un sistema de dos jeringas
conectadas una llave de triple paso y la homogeneización se realizó con vortex. Se usó
autoclave para la esterilización de los instrumentos y los volúmenes fueron medidos
con pipetas volumétricas y micropipetas. Todos los procedimientos se llevaron a cabo
en una cámara de flujo laminar vertical Engelab. Para las cromatografías se utilizó
sílica gel 60 Merck® (0.063-0.200 mm), Sephadex
® G-10 medium, sílica H 60F marca
Merck® y sílica fase reversa C-18. El acetato de etilo y el hexano marca Merck
® grado
análisis, metanol destilado y una solución reveladora de vainillina marca Sigma®. Se
empleó una columna de 5.5 cm de diámetro por 70.0 cm de largo, rotavapor Büchi,
liofilizador, cromatofolios AL TLC de sílica gel 60 F254 Merck®, lámpara UV 254/366
y pistola de calentamiento.
3.2.2 Metodología.
31
3.2.2.1 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de los
extractos.
El agar fue preparado según las especificaciones del fabricante agregando 50 g de agar
malta en un litro de agua destilada y calentando luego hasta su completa disolución.
Posteriormente se sometió a esterilización en autoclave por 15 minutos a 121ºC.
Se prepararon emulsiones de los extractos crudos, tanto elicitado como no elicitado,
mezclando 720 mg de extracto, 2 mL de aceite de Neem, 0.2 mL (4 gotas) de Tween
20. La mezcla se llevó a un volumen total de 10,0 mL y se emulsificó haciendo pasar la
mezcla entre dos jeringas conectadas por una llave de tres pasos, para finalmente
obtener una emulsión madre con una concentración de extracto de 72000 ppm. Todos
los procedimientos se llevaron a cabo al interior de una cámara de flujo laminar y todos
los materiales usados fueron esterilizados en autoclave o bajo radiación UV.
Para cada emulsión se realizaron diluciones a 9000, 6000 y 3000 ppm, tomando 1000,
666 y 333 µL, respectivamente, de las emulsiones madre, 7.0 mL de agar malta y se
completó cada una de ellas, a un volumen total de 8,0 mL con agua estéril.
Posteriormente la mezcla se homogenizó con vortex, para luego ser vertida en una caja
de Petri estéril de 5.3 cm de diámetro.
Con la ayuda de un saca bocados se cortó un trozo de agar de una cepa de Fusarium
oxysporum, el cual se ubicó en el centro de la caja una vez solidificado el medio de
cultivo. Las cajas se sellaron con vinilpel y se incubaron a temperatura ambiente. Se
realizaron tres repeticiones de cada una de las concentraciones y se midió el radio del
halo de crecimiento del hongo cada 24 horas.
La emulsión empleada en el control se preparó como se describió anteriormente, esta
vez sin agregar extracto alguno. Para el control de la emulsión se tomó 1000 µL de esta
emulsión, se mezcló con 7,0 mL de agar malta y se homogenizó en vortex. Para el
control absoluto, a 7,0 mL de agar se le agregó 1000 µL de agua estéril para completar
el mismo volumen total. Ambos controles se realizaron por triplicado y de igual manera
se midió el radio del halo de crecimiento cada 24 horas.
Inicialmente se evaluó únicamente la actividad de los extractos crudos Elicitado y No
elicitado.
32
3.2.2.2 Fraccionamiento del extracto crudo elicitado.
Se tomaron 11.30 g de extracto crudo elicitado y se preparó una cabeza de columna
mezclando 70 g de sílica gel y 150 mL de diclorometano con el extracto. El solvente se
evaporó con la ayuda de una pistola de calentamiento. Se pesaron 400 g de sílica gel y
se empacaron en una columna de dimensiones 5.5 cm de diámetro por 50.0 cm de
largo. La fase móvil empleada fue un sistema isocrático hexano:acetato de etilo en
proporción 1:1, la cual se determinó como la más conveniente mediante inspecciones
previas por cromatografía en capa delgada (TLC). Se recogieron 113 fracciones de
aproximadamente 100 mL y se realizó un monitoreo mediante TLC. Se reunieron las
fracciones con perfil cromatográfico similar, obteniéndose 3 grandes fracciones
denominadas Fr1, Fr2 y Fr3.
3.2.2.3 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de las
fracciones Fr1, Fr2 y Fr3.
A los extractos obtenidos en el fraccionamiento del extracto crudo Elicitado se les
evaluó su actividad fungicida usando la metodología descrita anteriormente. Con base a
los resultados obtenidos se continuó con el fraccionamiento de los extractos Fr2 y Fr3.
3.2.2.4 Fraccionamiento del extracto Fr2.
Se llevó a cabo una cromatografía de columna con sílica gel usando un gradiente de
4:1, 3:1, 2:1 y 1:1 del sistema hexano:acetato de etilo. Se recogieron 83 fracciones de 2
mL aproximadamente. Luego de observar su perfil por TLC se reunieron 8 fracciones
totales, las cuales se denominaron como A, B, C hasta H, respectivamente.
Con base a los reportes de la literatura se seleccionó la fracción B y se le realizó una
cromatografía de columna usando sílica fase reversa con soporte C-18 como material
de empaque y un gradiente de isopropanol:agua como fase móvil, el cual se varió desde
una proporción 20:80 hasta 70:30, agregando 10 mL de fase móvil cada vez que se
cambiaba de una proporción de solventes a otra. Se recogieron 20 fracciones de las
cuales se tomaron las número 16 y 17, debido a que se observó como una sola banda en
33
la placa cromatográfica cuando se corrían por TLC. Se eliminó el solvente orgánico
mediante evaporación con vacío, el agua restante mediante liofilización y se corrió el
respectivo espectro 1HRMN.
Se unieron las fracciones F y G, y se les aplicó una cromatografía en fase reversa
siguiendo un procedimiento similar al descrito recientemente. En este caso la
composición de la fase móvil se varió desde una proporción inicial 10:90
isopropanol:agua, hasta 60:40. De igual manera se colectaron 20 fracciones,
escogiéndose la 12 y 13 debido que se observaron como una sola banda que mostró
fluorescencia al irradiarse con luz UV de onda larga. Esta muestra fue secada mediante
evaporación con vacío y liofilización, y enviada para la toma de su respectivo espectro
1HRMN.
3.2.2.5 Fraccionamiento del extracto Fr3.
Se le realizó una cromatografía de exclusión por tamaño al extracto Fr3 usando una
fase estacionaria de Sephadex® y un sistema triple de solventes compuesto por
hexano:acetato de etilo:metanol como eluente, en proporciones 3:2:1. Se recogieron 16
fracciones de 5 mL cada una y a partir de monitoreo por TLC se determinó reunir las
fracciones 1-5. Posteriormente se realizó una cromatografía de columna con sílica H,
cuyas dimensiones fueron de 2 cm de diámetro por 11cm de largo, en un sistema de
hexano:acetato de etilo (2:1). De las 15 fracciones obtenidas se decidió unir las número
10 y 11. Posteriormente, el solvente fue evaporado y la muestra fue dispuesta para la
toma del espectro 1HRMN.
3.3 Caracterización fitoquímica del extracto Elicitado.
3.3.1 Materiales.
Todos los reactivos y materiales empleados para la marcha fitoquímica provinieron del
laboratorio de fitoquímica de la Universidad de Antioquia.
3.3.2 Metodología.
34
La metodología seguida en la marcha fitoquímica fue tomada del manual de laboratorio
de fitoquímica de la Universidad de Antioquia. El esquema general se muestra en la
figura 1 del anexo No1. Las pruebas para los diferentes grupos de metabolitos se
realizaron como sigue:
3.3.2.1 Prueba de Flavonoides.
A un mililitro de extracto, dispuesto en un tubo de ensayo, se le agrega una limadura de
magnesio y una o dos gotas de HCl al 37% por la pared del tubo. La aparición de
coloraciones naranja, violeta, magenta indican que la prueba fue positiva.
3.3.2.2 Prueba de Leucocianidinas.
A un mililitro de extracto en un tubo de ensayo se la agregan 0,5 mL de HCl al 37% y
se calienta por 10 minutos a 100ºC. Luego de que alcanza la temperatura ambiente se le
agregan 0,5 mL de alcohol amílico y se agita suavemente. La reacción es positiva
cuando aparecen coloraciones magenta a carmesí.
3.3.2.3 Prueba de compuestos Fenólicos.
En un tubo de ensayo que contiene un mililitro de extracto se agrega una gota de FeCl3
al 1% y se agita suavemente. La prueba se considera positiva con la aparición de
coloraciones violeta, verde, azul y negro.
3.3.2.4 Prueba de Taninos.
En un tubo de ensayo se dispone un mililitro del extracto y se agrega un mililitro de
solución gelatina:sal. Se centrifuga a 2500 rpm por cinco minutos, se toma el
precipitado y se redisuelve en dos mililitros de urea 10 M. Se agregan dos o tres gotas
de FeCl3 al 10% y se agita suavemente. La aparición de coloraciones azul, verde o
violeta indican que la prueba fue positiva.
35
3.3.2.5 Prueba de Cardiotónicos.
En un tubo de ensayo se adiciona un mililitro de solución etanólica del extracto, 0.5 mL
de Kedde A y 0.5 mL de Kedde B. La prueba es considerada positiva cuando aparecen
coloraciones violeta o púrpura.
3.3.2.6 Prueba de Quinonas.
A cinco mililitros de solución de extracto en etanol se le agrega un mililitro de agua
oxigenada, un mililitro de H2SO4 concentrado y se calienta por 15 minutos en baño
maría. Luego de que se alcanza la temperatura ambiente se le agregan cinco mililitros
de tolueno y se retira la fase de orgánica. A esta fase se le agrega un mililitro de
NaOH/NH4OH (5%:2%). La aparición de coloraciones magenta en la fase alcalina
indica la presencia de quinonas.
3.3.2.7 Prueba de Terpenoides.
A 0.5 mL de solución diclorometanólica de extracto dispuestos en un tubo de ensayo,
se le agregan 0.5 mL de anhídrido acético y una gota de H2SO4 concentrado por la
pared del tubo. La prueba es positiva cuando aparecen coloraciones azul, verde o
violeta.
3.3.2.8 Prueba de Alcaloides.
Prueba de Mayer: a 0.5 mL de extracto en HCl al 5% se le agrega una gota de reactivo
de Mayer.
Prueba de Dragendorff: a 0.5 mL de extracto en HCl al 5% se le agregan dos gotas de
reactivo de Dragendorff.
La aparición de un precipitado amarillo indica la presencia de alcaloides en la muestra.
3.4 Método de bioautografía para la fracción Fr 2.
36
3.4.1 Materiales.
La suspensión de levaduras fue proporcionada por la línea de microbiología del
laboratorio GIEM. El acetato de etilo y el hexano usados fueron grado análisis marca
Merck®. Se utilizó medio para levaduras cuyos componentes fueron Merck
®, con
excepción del extracto de levadura el cual era marca OXOID® y la fuente de carbono
fue azúcar comercial. Los reveladores vainillina y MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-
2,5-difenil tetrazolio), al igual que el tritón X-100, fueron Sigma®. Se emplearon
cromatofolios AL TLC de sílica gel 60 F254 Merck®, micropipetas, lámpara UV
254/366, estufa de incubación y autoclave. Todos los procedimientos se llevaron a cabo
en una cámara de flujo laminar vertical Engelab.
3.4.2 Metodología
3.4.2.1 Cromatografía en capa delgada
Se tomaron 115,1 mg de extracto Fr2 y se diluyeron con 220 µL de acetato de etilo y
220 µL de hexano para una concentración de 0,26 mg/µL. Se cortaron placas
cromatográficas de 4 x 7.5 cm las cuales fueron activadas a 105ºC por 2 horas. Se
sembraron 20 µL de solución de extracto (5 mg/placa) a 1 cm de altura de la placa,
distribuidos a lo ancho de la misma, evitando alcanzar los bordes laterales. Se llevó a
cabo el corrido en un sistema de solventes hexano:acetato de etilo 1:1 hasta que el
frente del solvente estuvo a una distancia aproximada de 1 cm del borde superior.
Luego se dejó secar el solvente y se observó la placa bajo la lámpara UV para
garantizar un desarrollo apropiado del corrido. Además, se realizó un revelado con
vainillina para posteriores comparaciones.
3.4.2.2 Inoculación y revelado de la placa
Se preparó medio para levaduras usando una fuente de carbono (azúcar comercial) a
una concentración de 100 g/L, KH2PO4 2.0 g/L, (NH4)2SO4 3.0 g/L, MgSO4.7H2O 1.0
g/L, extracto de levadura 4.0 g/L, peptona 3.6 g/L y agua destilada. Luego se sometió a
esterilización en autoclave por 15 minutos a 121ºC. El revelador se preparó mezclando
37
una solución de 0.8 g/L de MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) y
tritón X-100 al 0.1% en agua.
Se tomaron 20,0 mL de medio para levaduras y se le agregaron 5,0 mL de suspensión
de levaduras a una concentración de 6.4x107células/mL. La mezcla se homogeneizó en
vortex y se vertió en una caja de Petri estéril. Luego se tomó la placa desarrollada por
TLC y se sumergió en el medio inoculado por 20 segundos. Seguidamente se dispuso
en una caja de Petri de 9.1 cm de diámetro, se selló con vinilpel y se incubó a 37ºC por
4 horas. Transcurrido este tiempo, se sumergieron las placas en el revelador MTT por
10 segundos para nuevamente ser introducidas en la caja de Petri e incubarse a las
mismas condiciones iniciales por 12 horas más. Se realizaron controles de solvente y
absoluto. En el primero se realizó el corrido de las placas de TLC a las mismas
condiciones pero sin sembrar extracto alguno, mientras que en el control absoluto el
único proceso previo realizado a la placa fue la activación a 105ºC. Cada
procedimiento se llevó a cabo por triplicado.
38
4. RESULTADOS Y ANÁLISIS.
4.1 Tratamiento y extracción del material Elicitado y No elicitado.
Con el fin de mantener las condiciones lo más homogéneas posible entre el material
Elicitado y No elicitado, se optó por asperjar cada 24 horas por 48 horas antes de
someter el material a secado en estufa. De esta manera se pudo evitar la podredumbre
del material por acción bacteriana, que pudiera afectar la eficiencia de la extracción
mediante la degradación de los metabolitos de estrés usando mecanismos de
detoxificación. La porción No elicitada no corría el riesgo de sufrir podredumbre, ya
que en este caso, luego de ser rebanado el material se sometía a secado de forma
inmediata.
Las masas de papa usadas en cada porción a ser extraída, tanto de la parte Elicitada
como la No elicitada, y la respectiva masa del material seco y molido se muestran en la
tabla 1 del anexo No1.
Luego de realizárseles la partición líquido-líquido con diclorometano a los extractos, y
someterlos de nuevo a evaporación con vació, se obtuvieron 18.215 g y 18.850 g de
extracto crudo Elicitado y No elicitado, respectivamente, para un rendimiento del
0.71% en el Elicitado y 0.62% en el No elicitado, ambos con base a la masa del
material seco.
4.2 Evaluación in vitro de la actividad fungicida y fraccionamiento bioguiado
de los extractos.
4.2.1 Evaluación in vitro de la actividad fungicida de los extractos.
En la realización de los ensayos comparativos de actividad fungicida, la colonización
completa del hongo en la caja de Petri se logró a las 144 horas para los controles, tanto
de la emulsión como absoluto, observándose una pigmentación violácea en el micelio
para ambos casos (ver figura 8).
39
Se realizó una prueba ANOVA para comparar las medias del halo de crecimiento de los
controles mediante el paquete estadístico STAT GRAPHICS, encontrándose que no hay
diferencias significativas en la rata de crecimiento del hongo (P = 0.373901). Esto
sugiere que el aceite, el cuya concentración final máxima en el medio es de 2.5%, no
tiene ningún efecto en el desarrollo normal del hongo. Sin embargo, a pesar de este
hecho, y de contar con emulsiones estables en el tiempo, se siguió evaluando el control
de la emulsión en los experimentos subsiguientes para controlar cualquier posible
variable.
Para el extracto No elicitado, aunque visualmente hay diferencias sutiles en la
pigmentación del micelio, con respecto a el control, estas solo se observan en la
concentración más alta de extracto. De la misma manera que en los controles, por
medio de la prueba ANOVA no se encontraron diferencias significativas con respecto
al control para ninguna de las concentraciones (P > 0.05) (ver figura 8). En todos los
casos se observó una rata de crecimiento similar entre si y una coloración violácea con
apariencia algodonosa en el halo del hongo.
Por otro lado, el extracto Elicitado sí presentó diferencias apreciables con respecto a los
controles, mostrando además efectos sobre el hongo que se incrementaban a medida
que se aumentaba la concentración del mismo. El efecto del extracto Elicitado en el
desarrollo del hongo se manifestó en un decoloramiento del micelio y una disminución,
Figura 8. Ensayo de actividad fungicida para el extracto No elicitado a las 120 horas, donde se muestran los controles absoluto y de
emulsión, y las diferentes concentraciones evaluadas C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm
respectivamente.
40
aunque sutil, en la rata de crecimiento. Estos datos se encuentran consignados en la
tabla 3 del anexo No 1. Los datos del radio de crecimiento a las diferentes
concentraciones de extracto Elicitado fueron sometidos a una prueba ANOVA
mostrando diferencias significativas con respecto al control para todas las
concentraciones (P=0.00067 entre Elicitado C1 y el control). Los datos adquiridos a
partir de los controles se encuentran consignados en las tablas 4 y 5 del anexo No1.
A partir de estos ensayos pudo demostrarse que hubo un efecto evidente del extracto
Elicitado en el hongo, lo cual puede atribuirse a la presencia de metabolitos con
actividad que estaban ausentes en el extracto No elicitado, indicando que, en efecto,
hubo una elicitación en el tejido del tubérculo causada por el cloruro de cobre (ver figura
9).
Otro hecho importante es que, bajo las mismas condiciones de extracción, se obtuvo un
rendimiento ligeramente mayor para el extracto Elicitado, lo cual puede indicar que el
estrés generado en el tejido aumentó la producción del metabolismo secundario. Sin
embargo, aun no puede atribuirse este aumento de metabolitos a la síntesis de
compuestos activos por parte de las células de papa. Para ello es necesario un soporte
estadístico en el cual se comparen las medias de varias extracciones a materiales
Figura 9. Ensayo de actividad fungicida para el extracto Elicitado a las 144 horas, donde se muestran los controles absoluto y
de emulsión, y las diferentes concentraciones evaluadas C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm
respectivamente.
41
Elicitados y No elicitados para demostrar que, en efecto, la elicitación induce una
mayor producción de metabolitos en el material.
La evidencia de metabolitos con actividad presentes en el extracto Elicitado y ausentes,
o presentes en muy baja concentración, en el extracto No elicitado, generó la necesidad
de realizar un fraccionamiento del extracto Elicitado para evaluar la actividad de
fracciones obtenidas y, de igual manera, observar el carácter de polaridad de los
metabolitos más activos en una partición donde se obtuviesen tres fracciones, una de
baja polaridad, otra de polaridad intermedia y otra de mayor polaridad. La masa de las 3
fracciones obtenidas y sus respectivos rendimientos se encuentran consignados en la
tabla 6 del anexo No1. Los criterios para conformar estas fracciones fueron los
resultados arrojados por TLC, al igual que la obtención de una cantidad suficiente del
extracto para la realización de los respectivos ensayos de actividad fungicida y los
subsecuentes particionamientos.
Se realizaron los ensayos de actividad de los extractos Fr1, Fr2 y Fr3 obtenidos en el
fraccionamiento del Elicitado. En la evaluación de la fracción Fr1 la apariencia del
micelio del hongo, al igual que el radio del halo de crecimiento, fue similar a la del
control, sugiriendo que no hubo ningún efecto de este extracto en el desarrollo normal
del hongo. Este hecho se demostró posteriormente comparando, mediante un análisis
ANOVA, la rata de crecimiento radial del hongo en el control y en el extracto Fr1 (ver
anexo No1, tabla 7) concluyéndose que no hubo diferencias significativas entre ellos (P =
0.4918). De igual manera se realizó la comparación del extracto Fr1 con el No elicitado
obteniéndose en el mismo resultado. Esta se convierte en una evidencia de que el
extracto No elicitado está compuesto, en su gran mayoría, de metabolitos poco polares
los cuales no presentan efectos notorios sobre el hongo a las, relativamente, altas
concentraciones evaluadas. Se confirma además el resultado obtenido en el ensayo
comparativo de actividad entre el extracto Elicitado y No elicitado, en el cual puede
concluirse que, efectivamente, hubo elicitación.
Por otra parte, para los extractos Fr2 y Fr3 se observó un efecto inhibitorio del
crecimiento del hongo, además de cambios evidentes en la apariencia del micelio (ver
figura 10). Estos cambios en la apariencia se manifestaron como un decoloramiento del
42
micelio, el cual era más pronunciado para el Fr2 que para el Fr3. Esto demuestra que,
en su mayoría, los metabolitos implicados en la actividad se concentraron en las
fracciones Fr2 y Fr3, lo cual da indicios de un carácter polar importante en estos
compuestos, debido a que los sistemas de solventes usados para su elusión (Fr2 y Fr3)
son de carácter polar.
Aunque la inhibición fue mucho más marcada para la Fr2 que para la Fr3, el hecho más
importante se observó para la concentración de 9000 ppm de la primera (Fr2), en la
cual se inhibe por completo el crecimiento del hongo. Es decir, a diferencia del extracto
Fr3 y las demás concentraciones evaluadas del Fr2 donde el efecto es fungistático, para
la concentración más alta del Fr2 se observa un efecto fungicida.
Teniendo en cuenta este hecho, se plantea la posibilidad de desarrollar una formulación
de un agente fungicida preparado a partir de este extracto, ya que los agentes fungicidas
comerciales son preparados en concentraciones entre el 1-2%. Para el caso del extracto
Fr2 se tiene una inhibición total con una concentración cercana al 1%, sin embargo,
sería necesario analizar factores como la estabilidad, biodegradabilidad, fitotoxicidad y
costos, entre otros, para evaluar la viabilidad del proceso.
Figura 10. Ensayo de actividad fungicida para los extractos Fr2 y Fr3 a las 144 horas, donde se muestran las diferentes
concentraciones evaluadas para ambos extractos C1, C2 y C3 las cuales corresponden a 3000, 6000 y 9000 ppm
respectivamente.
43
R2 = 0,6877
R2 = 0,9942
R2 = 0,7295
R2 = 0,9208
R2 = 0,3659
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0,018
2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
Concetración (ppm)
Ra
ta d
e c
rec
imie
nto
(c
m/h
)
Fracción 2
Fracción 3
No elicitada
Elicitada
Fracción 1
Los datos del halo de crecimiento del hongo con respecto al tiempo para los extractos
Fr2 y Fr3 se encuentran en las tablas 8 y 9 del anexo No1. Los datos de los controles
para este experimento se encuentran en las tablas 10 y 11 de esta misma sección.
Se realizaron gráficos del radio del halo de crecimiento promedio del hongo con
respecto al tiempo y se observó que, tanto para los controles como para los extractos en
las tres concentraciones evaluadas, las curvas obtenidas se ajustaron de forma
satisfactoria a un modelo lineal (P<0.05 y R>0.92) (VER ANEXO 3) usando el paquete
estadístico STAT GRAPHICS. De esta manera se pudo probar que cada una de las
pendientes tenía una relación de proporcionalidad directa con la rata de crecimiento del
hongo en un medio determinado. Estos valores se pueden encontrar en la tabla 12 del
anexo No1.
Se quiso comparar la inhibición entre los diferentes extractos evaluados para lo cual se
graficaron los valores de las pendientes de las curvas de crecimiento con respecto a la
concentración del extracto (figura 11). En este gráfico se puede observar que luego del
fraccionamiento del extracto Elicitado la actividad de la fracción Fr2 se incrementa, ya
que presenta la menor rata de crecimiento para todas las concentraciones. Sin embargo,
un detalle importante es el incremento en la actividad de los extractos Elicitado y Fr3
Figura 11. Gráfico de la rata de crecimiento, representada por la pendiente, para cada uno de los
extractos a las diferentes concentraciones evaluadas.
44
con el aumento de la concentración. Es decir, a pesar de que el extracto Elicitado
presenta un efecto inhibitorio mayor que el Fr3 para las concentraciones de 3000 y
6000 ppm, mientras que para la concentración de 9000 ppm la tendencia se invierte,
demostrando que el incremento en la concentración para el extracto Fr3 genera un
aumento más dramático en la actividad. Suponiendo que la tendencia se conserva a
medida que se aumenta la concentración, a partir de las ecuaciones de las rectas,
mediante extrapolación, podría calcularse de forma aproximada el valor de la
concentración de estos extractos para que el efecto observado sea fungicida y no
fungistático. De esta manera se encuentra que son necesarias concentraciones de 48300
y 21100 ppm para el extracto Elicitado y el Fr3, respectivamente. No obstante, el efecto
más dramático en el aumento de la concentración lo muestra el extracto Fr2, para el
cual se observó experimentalmente que se necesitaba, como máximo, una
concentración de 9000 ppm para observar un efecto fungicida en Fusarium oxysporum.
En términos comparativos, la inhibición generada por el extracto Fr2 es un poco más
del doble que la del Fr3, y esta a su vez, es tres veces mayor que la del extracto crudo
Elicitado (ver figura 11).
Ahora, analizando los extractos No elicitado y Fr1, se observa una gran similitud en la
forma de sus curvas (figura 11) lo cual se había demostrado estadísticamente mediante el
análisis ANOVA. Sin embargo, otro hecho para resaltar es que, debido a que se
presentan pendientes positivas al aumentar la concentración de extracto, se puede
afirmar que hay un efecto benéfico en el crecimiento del hongo, expresado en un
aumento en la rata de crecimiento al incrementar la concentración de extracto. A pesar
de ello, el efecto positivo mostrado es bastante bajo debido a que, como se había
mencionado, no hay una diferencia estadísticamente significativa con respecto al
control. En la figura 12. se comparan gráficamente el efecto inhibitorio total de los
diferentes extractos evaluados, a partir de las pendientes obtenidas en el gráfico de rata
de crecimiento vs. concentración de extracto (figura 11).
45
4.2.2 Fraccionamiento del extracto Fr2.
A partir de los resultados obtenidos en los ensayos, en los que el extracto Fr2 mostró
una mayor actividad que las demás fracciones, se decidió continuar con su
fraccionamiento. Se le aplicó cromatografía de columna usando sílica H, como se
describió en la metodología, ya que se requería una mayor resolución que la
proporcionada por la sílica gel. Se obtuvieron ocho fracciones de acuerdo a los perfiles
de TLC (A, B, C hasta H respectivamente).
Se continuó con el fraccionamiento de B al cual se le aplicó cromatografía en fase
reversa, debido a que no era posible separar más esta fracción usando cromatografía en
fase normal. Además, se contaba con poca cantidad de muestra para lo cual la
cromatografía en fase normal ofrece la ventaja de que la gran mayoría de la muestra
sembrada en la columna sea eluida. De las 20 fracciones recogidas se eligieron las
fracciones 16 y 17, y se sometieron a evaporación con vacío y liofilización para secar
por completo la muestra. Luego de revelar por varios métodos entre los que se incluían
luz UV y revelador vainillina, se observo una sola banda por TLC, la cual se presumía
como un compuesto puro. Se obtuvieron 5 mg de una sustancia con apariencia de
cristales blancos. A esta muestra se le nombró MB y se envió para obtener su espectro
1HRMN. Los resultados obtenidos no fueron satisfactorios lo cual se atribuyó a la poca
cantidad de muestra. El espectro se muestra en el anexo No2, figura3.
Debido a la poca cantidad de muestra, se reunieron las fracciones E, F y G y se les
aplicó un procedimiento similar al de la fracción B. Se eligieron las fracciones 12 y 13,
las cuales revelaban como una sola banda que emitía una coloración azul fluorescente
bajo la luz UV de onda larga. Se evaporó el solvente y se obtuvieron tan solo 3 mg de
compuesto, motivo por el cual los resultados no fueron legibles en el espectro 1HRMN
(ver anexo No2, figura 4) y de la misma forma no se pudo obtener otro tipo de evidencias
espectroscópicas como 13
CRMN que permitieran la elucidación completa de la
estructura. Además, dado el caso de que se hubiese podido llevar a cabo la elucidación,
y esto aplica para cualquier compuesto con actividad fungicida que se hubiese podido
aislar a partir de un extracto elicitado, si esta estructura obtenida mediante
46
No elicitadoElicitado
Fraccion 1
Fraccion 2
Fraccion 3
-2,20E-06
-1,70E-06
-1,20E-06
-7,00E-07
-2,00E-07
3,00E-07
Pen
die
nte
Extractos evaluados
espectroscopía no estuviese reportada en la literatura como un compuesto que está de
hecho implicado en la base de la defensa de una planta, la conclusión de si es o no una
fitoalexina hubiese estado pobremente sustentada.
4.2.3 Fraccionamiento del extracto Fr3.
Se decidió someter esta fracción a una cromatografía de exclusión por tamaño usando
Sephadex® debido la poca resolución lograda por cromatografía en fase normal, la cual
se evidenció por TLC. Las cinco primeras fracciones eluidas se reunieron ya que
aparecían como una sola banda con un Rf de aproximadamente 0.2 en TLC. El hecho
de que eluyeran primero indicaba que se trataba de la molécula, o mezcla de moléculas,
de mayor tamaño en la mezcla. Se le realizó una purificación usando una columna de
sílica H con la cual se obtuvo un compuesto (MA) que se presumía puro gracias a su
perfil de TLC. No obstante, la información arrojada por el espectro 1HRMN no fue lo
suficientemente concluyente, hecho que se atribuye a la cantidad de muestra “pura”
Figura 12. Gráfico de la pendiente obtenida en la figura 5 para cada uno de los extractos evaluados.
47
obtenida (8 mg) la cual impide obtener un espectro 13
CRMN confiable. El espectro se
encuentra adjunto en el anexo No 2, figura 2.
4.3 Caracterización fitoquímica del extracto Elicitado.
Se realizó una partición del extracto crudo Elicitado usando agua caliente y filtrando de
igual manera sobre papel de filtro para remover material insoluble. El filtrado acuoso
resultante mostró los siguientes resultados:
PRUEBA CONCENTRACIÓN
APARENTE COLORACIÓN
Flavonoides (+) Naranja
Leucocianidinas (++) Magenta
Fenólicos (+) Negro
Taninos (-) NA
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
Se tomó nuevamente el extracto crudo Elicitado, se le agregó HCl al 5%, se calentó a
60ºC por 15 minutos y se filtró de la misma manera. El sólido recogido en el papel fue
redisuelto en diclorometano y filtrado nuevamente sobre Na2SO4. En esta fracción se
encontró lo siguiente:
PRUEBA CONCENTRACIÓN
APARENTE COLORACIÓN
Flavonoides (-) NA
Cardiotónicos (+) Violeta
Quinonas (-) NA
Terpenoides (+++) Violeta oscuro
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
El filtrado acuoso ácido se alcalinizó (pH 10-11) y se particionó con diclorometano. En
la fase orgánica filtrada sobre Na2SO4 se obtuvo:
48
PRUEBA CONCENTRACIÓN
APARENTE COLORACIÓN
Terpenoides (++) Verde
Cardiotónicos (+) Magenta
Alcaloides (+++) Amarillo
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
En la fase acuosa, luego de neutralizar con HCl al 5% se encontró lo siguiente:
PRUEBA CONCENTRACIÓN
APARENTE COLORACIÓN
Alcaloides (-) NA
Flavonoides (-) NA
Leucocianidinas (-) NA
Fenólicos (++) Negro
Taninos (-) NA
Donde: (-) negativo, (+) concentración baja, (++) media, (+++) alta, (NA) No aplica.
4.4 Método de bioautografía para la fracción Fr2.
Se desarrolló un método de bioautografía para el extracto Fr2, el cual resultó ser el de
mayor actividad entre todos los que fueron evaluados. Se contó con una buena
reproducibilidad en los corridos de las placas cromatográficas, además se obtuvo una
resolución que permite la correlación aproximada entre factores de retención (Rf) y
bandas en diferentes placas corridas a las mismas condiciones, bandas que pueden
representar compuestos puros o mezcla de compuestos. En la figura 13a se muestra una
placa de TLC del extracto Fr2 revelada con vainillina.
Se logró una saturación parcial de la sílica con el fin de garantizar que los metabolitos
adsorbidos en esta, estuvieran disponibles para interactuar con el microorganismo y no
se enmascarara la actividad. Igualmente en las figuras 13b y 13c se observan placas,
corridas a las mismas condiciones, reveladas bajo la lámpara UV a longitudes de onda
corta y larga respectivamente. De nuevo se destacan las bandas lo suficientemente
resueltas para los fines requeridos sin sacrificar la saturación de la sílica.
49
a) b) c)
En la figura 14 se muestra la placa de la bioautografía luego del revelado con MTT,
además de los controles absoluto y de solvente, donde puede apreciarse que no hay una
diferencia notable entre estos. Es decir, en ambos se tiene una coloración violeta pálida
en la sílica acompañada de puntos con una tonalidad un poco más oscura y que
proliferan más en el control absoluto. Esto indica que no hubo ningún efecto evidente
del solvente en el desarrollo de las levaduras ni en el revelado de las placas.
Por otra parte, en la placa de la bioautografía (figura 14, ensayo Fr2) pueden observarse
varios detalles importantes: 1) una banda oscura en el lugar de siembra lo cual podría
indicar que había uno, o varios compuestos de la muestra de carácter altamente polar,
los cuales se adsorbieron fuertemente a la sílica. Sin embargo, la intensa coloración que
presenta esta zona podría indicar que se trataba de compuestos no solo no tóxicos a las
levaduras, sino que al parecer le ofrecían una afinidad al microorganismo para alojarse
y desarrollarse en este sitio específico de la placa. 2) Próxima a la banda en el lugar de
siembra se haya una zona con una coloración similar a la del control, en la cual parece
no haber ningún tipo de inhibición. Mediante comparaciones con la placa revelada con
Figura 13. Placas de TLC para el extracto Fr2 donde a) corresponde a la placa revelada con vainillina, b) bajo luz
UV de onda corta y c) luz UV de onda larga.
50
vainillina y la revelada con luz UV de onda corta, podría atribuirse esta inhibición a una
baja concentración de compuestos en esta área de la placa.
3) A un Rf de 0.21 se encuentra una primera zona de inhibición cuya coloración, en
comparación con el control, parece indicar una delgada y marcada banda inhibición. La
placa revelada con vainillina, a este mismo Rf muestra una banda delgada de color
violeta que no se observa en las placas reveladas bajo luz UV. 4) A partir de un Rf de
0.24 hasta aproximadamente 0.48 se encuentra una zona de poca claridad en donde
aparenta darse una inhibición, sin embargo se observan unas manchas de color intenso
en la base de esta área que podrían indicar proliferación del microorganismo.
Realizando comparaciones de esta misma zona en la placa revelada con vainillina se
aprecia una concentración importante de compuestos que no aparecen bajo la luz UV,
lo que podría indicar que sí hay inhibición y que además puede deberse a compuestos
terpénicos debido a la coloración violácea que adquieren al ser reveladas con vainillina.
5) A partir de un Rf de 0.66 se observa nuevamente una clara zona de inhibición que
llega hasta un Rf de 0.8, de nuevo esto se establece comparando cualitativamente la
tonalidad de la coloración de esta zona con la del control. Esta gruesa banda es seguida
Figura 14. Resultados de la bioautografía luego del revelado con DTT, donde se muestra la bioautografía para el extracto Fr2 y
los controles de solvente y absoluto.
51
por una serie de bandas coloreadas de tonalidades verdes a amarillas en donde podría
haber inhibición. El sustento de esta hipótesis es que, debido a la poca proliferación de
levaduras y la reactividad de los compuestos implicados, posiblemente se dio una
reacción entre el revelador (MTT) y los compuestos allí presentes, evidenciándose con
la aparición de estas bandas coloreadas que van hasta donde se alcanza el frente del
solvente.
52
5. CONCLUSIONES
La aspersión de tubérculos de papa con solución de CuCl2 a una concentración de
10 mM genera una respuesta en los tejidos de papa, que se manifiesta en un
aumento de la biosíntesis de metabolitos de estrés los cuales cuentan con actividad
fungicida.
El extracto elicitado muestra un efecto fungistático contra el hongo Fusarium
oxysporum que no se observa en un extracto sin elicitación.
Los resultados de los ensayos de actividad aplicados a las fracciones obtenidas a
partir del extracto elicitado, indican que los extractos de mediana y alta polaridad
proporcionan una mayor inhibición, lo que a su vez da idea de un carácter polar
importante en los metabolitos implicados en la actividad, ya fuera fungicida o
fungistática.
A una concentración del 1% es posible observar un efecto fungicida para una
fracción de polaridad intermedia, obtenida a partir de un extracto elicitado de papa.
Sin embargo, antes de buscar aplicaciones en fitorremediación, es necesario
analizar factores como la fitotoxicidad, estabilidad, entre otros.
Mediante la caracterización fitoquímica se evidencia una gran diversidad de
metabolitos presentes en el extracto elicitado, entre los cuales se resalta una
importante presencia de alcaloides y terpenoides. La alta concentración de estos
metabolitos puede deberse a la biosíntesis de fitoalexinas de tipo terpénico, grupo al
que pertenecen los compuestos de estrés reportados en Solanum tuberosum, y
fitoalexinas tipo alcaloides, reportadas en la cáscara de estos tubérculos.
53
El método bioautográfico posibilita la correlación directa de bandas de inhibición
con la actividad mostrada en las fracciones evaluadas. Además, de este modo se
facilita la separación y aislamiento de compuestos activos en el extracto, a partir del
factor de retención de las bandas de inhibición observadas en la bioautografía. Estos
compuestos pueden ser de interés para su elucidación estructural y, eventualmente,
su correlación como compuestos que cumplen las características necesarias para ser
llamados fitoalexinas.
54
ANEXO No1.
Tablas.
Tabla 1. Cantidad en masa del material Elicitado y No elicitado empleado en cada porción a ser extraída.
Material No elicitado Material Elicitado
Porción
Masa
material
húmedo (g)
Masa
material
seco (g)
Masa
material
húmedo (g)
Masa
material
seco (g)
1 2002 391 2007 415
2 2021 420 2004 454
3 2024 435 2051 417
4 2029 454 2055 443
5 2027 431 2049 408
6
7
2003
2044
444
456
2015 436
Tabla 2. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto No elicitado. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) C11 C12 C13
Prom
C1 C21 C22 C23
Prom
C2 C31 C32 C33
Prom
C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,6 0,6 0,60 0,4 0,4 0,3 0,37 0,3 0,2 0,2 0,23
120 1,8 1,9 1,9 1,87 1,9 1,9 1,8 1,87 1,8 1,8 1,7 1,77
144 2,3 2,3 2,2 2,27 2,2 2,2 2,2 2,20 2,2 2,2 2,2 2,20
Tabla 3. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Elicitado. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) C11 C12 C13
Prom
C1 C21 C22 C23
Prom
C2 C31 C32 C33
Prom
C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,7 0,6 0,63 0,5 0,5 0,5 0,50 0,5 0,4 0,4 0,43
72 1,0 1,1 1,0 1,03 0,9 0,9 0,9 0,90 0,9 0,9 0,8 0,87
144 ------ 1,9 1,8 1,85 1,6 1,6 1,6 1,60 1,5 1,7 1,6 1,60
55
Tabla 4. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control absoluto del
primer ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) CtrlA1 CtrlA2 CtrlA3
Prom
CtrlA
0 0,2 0,2 0,2 0,2
48 1 0,8 0,8 0,867
72 1,4 1,3 1,4 1,367
144 2,4 2,4 2,4 2,4
Tabla 5. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control de la emulsión
del primer ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) CtrlE1 CtrlE2 CtrlE3
Prom
CtrlE
0 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,6 0,7 0,63
72 1,2 1,1 1,1 1,13
144 2,3 2,3 2,2 2,27
Tabla 6. Masas y rendimientos de las fracciones obtenidas del extracto Elicitado. El rendimiento se
calculó con base a la cantidad de extracto crudo Elicitado empleado (11.30 g)
Fracciones Masa (g) Rendimiento (%)
Fr 1 5,726 50,67
Fr 2 2,825 25,00
Fr 3 1,652 14,62
Tabla 7. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Fr1. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) C11 C12 C13
Prom
C1 C21 C22 C23
Prom
C2 C31 C32 C33
Prom
C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,5 0,6 0,57 0,4 0,4 0,3 0,37 0,3 0,2 0,2 0,23
120 1,8 1,8 1,9 1,83 1,9 1,8 1,8 1,83 1,8 1,8 1,7 1,77
144 2,3 2,1 2,3 2,23 2,3 2,3 2,2 2,27 2,2 2,2 2,2 2,20
56
Tabla 8. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Fr2. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) C11 C12 C13
Prom
C1 C21 C22 C23
Prom
C2 C31 C32 C33
Prom
C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,4 0,4 0,5 0,43 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
72 0,7 0,8 0,9 0,80 0,4 0,4 0,4 0,40 0,2 0,2 0,2 0,20
96 1,2 1,0 1,2 1,13 0,8 0,8 0,8 0,80 0,2 0,2 0,2 0,20
120 1,7 1,6 1,7 1,67 1,1 1,1 1,1 1,10 0,2 0,2 0,2 0,20
144 1,8 1,8 1,9 1,83 1,4 1,5 1,5 1,47 0,2 0,2 0,2 0,20
Tabla 9. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo a diferentes concentraciones de
extracto Fr3. Se realizaron tres repeticiones de cada concentración y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) C11 C12 C13
Prom
C1 C21 C22 C23
Prom
C2 C31 C32 C33
Prom
C3
0 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,7 0,6 0,63 0,5 0,4 0,4 0,43 0,3 0,3 0,3 0,30
72 1,0 1,1 1,0 1,03 0,8 0,7 0,8 0,77 0,5 0,5 0,5 0,50
96 ------ 1,7 1,5 1,60 1,3 1,2 1,2 1,23 0,9 0,9 0,9 0,90
120 ------ 2,1 2,0 2,05 1,7 1,7 1,7 1,70 1,2 1,4 1,3 1,30
144 ------ 2,4 2,4 2,40 2,1 2,1 2,0 2,07 1,7 1,6 1,6 1,63
Tabla 10. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control absoluto en el
segundo ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) CtrlA1 CtrlA2 CtrlA3
Prom
CtrlA
0 0,2 0,2 0,2 0,20
48 1,2 1,2 1,0 1,13
120 2,0 2,0 2,1 2,03
144 2,3 2,2 2,4 2,30
Tabla 11. Datos del radio del halo de crecimiento del hongo en el tiempo para el control de la emulsión
en el segundo ensayo. Se realizaron tres repeticiones y se calculó el promedio.
RADIO (cm)
Tiempo
(h) CtrlE1 CtrlE2 CtrlE3
Prom
CtrlE
0 0,2 0,2 0,2 0,20
48 0,6 0,6 0,4 0,53
120 2,0 1,9 2,0 1,97
144 2,4 2,3 2,4 2,37
57
Tabla 12. Datos de la pendiente obtenidos a partir del análisis estadístico para cada uno de los extractos a
las diferentes concentraciones evaluadas.
Concentración
(ppm)
No
elicitado Elicitado Fracción 1 Fracción 2 Fracción 3
3000 0,0148352 0,0138622 0,0146368 0,01234130 0,0161210
6000 0,0150336 0,0118590 0,0152625 0,00930556 0,0136905
9000 0,0150183 0,0119124 0,0150183 0 0,0105159
58
ANEXO No2
Figura 1. Esquema general de la
marcha fitoquímica.
59
Figura 2. Espectro 1HRMN para la muestra MA.
Figura 3. Espectro 1HRMN para la muestra MB.
60
Figura 4. Espectro 1HRMN para la muestra MC.
61
Plot of Fitted Model
Prom CA_2 = 0.320513 + 0.0182692*CONTROL ABS.Tiempo _h_2
0 20 40 60 80 100 120
CONTROL ABS.Tiempo _h_2
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4
Pro
m C
A_2
Plot of Fitted Model
Prom CA_1 = 0.171429 + 0.0132937*CONTROL ABS.Tiempo _h_1
0 30 60 90 120 150
CONTROL ABS.Tiempo _h_1
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4
Prom
CA_
1
ANEXO No3.
Curvas de crecimiento del hongo Fusarium oxysporum en los diferentes medios.
Pvalor = 0.045
R = 0.947
Pvalor = 0.0416
R = 0.958
Rata de crecimiento del hongo para el control absoluto 1
Rata de crecimiento del hongo para el control absoluto 2
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
62
Plot of Fitted Model
Prom CE_1 = 0.0333333 + 0.015812*CONTROL EMUL.Tiempo _h_1
0 30 60 90 120 150
CONTROL EMUL.Tiempo _h_1
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4P
rom
CE
_1
Plot of Fitted Model
Prom CE_2 = 0.0782051 + 0.0152244*CONTROL EMUL.Tiempo _h_2
0 20 40 60 80 100 120
CONTROL EMUL.Tiempo _h_2
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Pro
m C
E_2
Rata de crecimiento del hongo para el control emulsión 1
Pvalor = 0.0148
R = 0.985
Rata de crecimiento del hongo para el control emulsión 2
Pvalor = 0.0159
R = 0.984
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
63
Plot of Fitted Model
Ext No Elicitado.PROM C1 = 0.0761905 + 0.0148352*Ext No Elicitado.Tiempo
0 30 60 90 120 150
Ext No Elicitado.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4Ex
t No
Elic
itado
.PR
OM
C1
Plot of Fitted Model
Ext No Elicitado.PROM C2 = -0.0142857 + 0.0150336*Ext No Elicitado.Tiempo
0 30 60 90 120 150
Ext No Elicitado.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4
Ext N
o El
icita
do.P
RO
M C
2
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto No
elicitado
Pvalor = 0.0092
R = 0.991
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto No
elicitado
Pvalor = 0.0276
R = 0.972
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
_h_
_h_
64
Plot of Fitted Model
Ext No Elicitado.PROM C3 = -0.0714286 + 0.0150183*Ext No Elicitado.Tiempo
0 30 60 90 120 150
Ext No Elicitado.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4Ex
t No
Elici
tado
.PRO
M C
3
Plot of Fitted Model
Ext Elicitado.PROM C1 = 0.0974359 + 0.0138622*Ext Elicitado.Tiempo
0 20 40 60 80 100 120
Ext Elicitado.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
Ext
Elic
itado
.PR
OM
C1
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto No
elicitado
Pvalor = 0.0413
R = 0.958
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto
Elicitado
Pvalor = 0.0133
R = 0.986
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
_h_
_h_
65
Plot of Fitted Model
Ext Elicitado.PROM C2 = 0.0884615 + 0.011859*Ext Elicitado.Tiempo
0 20 40 60 80 100 120
Ext Elicitado.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6Ex
t Elic
itado
.PR
OM
C2
Plot of Fitted Model
Ext Elicitado.PROM C3 = 0.0602564 + 0.0119124*Ext Elicitado.Tiempo
0 20 40 60 80 100 120
Ext Elicitado.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
Ext E
licita
do.P
RO
M C
3
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto
Elicitado
Pvalor = 0.0216
R = 0.978
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto
Elicitado
Pvalor = 0.0330
R = 0.967
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
_h_
_h_
66
Plot of Fitted Model
FRACCION 1 PROM C2 = -0.0238095 + 0.0152625*FRACCION 1 Tiempo _h_
0 30 60 90 120 150
FRACCION 1 Tiempo _h_
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4
FRA
CC
ION
1 P
RO
M C
2
Plot of Fitted Model
FRACCION 1 Prom C1 = 0.0666667 + 0.0146368*FRACCION 1 Tiempo _h_
0 30 60 90 120 150
FRACCION 1 Tiempo _h_
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4FR
ACC
ION
1 P
rom
C1
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 1
Pvalor = 0.0277
R = 0.972
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto Fr 1
Pvalor = 0.0109
R = 0.989
67
Plot of Fitted Model
FRACCION 2.PROM C1 = 0.0238095 + 0.0123413*FRACCION 2.Tiempo
0 30 60 90 120 150
FRACCION 2.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
FRAC
CIO
N 2
.PR
OM
C1
Plot of Fitted Model
FRACCION 1 PROM C3 = -0.0714286 + 0.0150183*FRACCION 1 Tiempo _h_
0 30 60 90 120 150
FRACCION 1 Tiempo _h_
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4F
RA
CC
ION
1 P
RO
M C
3
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto Fr 1
Pvalor = 0.0413
R = 0.958
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto Fr 2
Pvalor = 0.0010
R = 0.974
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
_h_
68
Plot of Fitted Model
FRACCION 2.PROM C2 = -0.05 + 0.00930556*FRACCION 2.Tiempo
0 30 60 90 120 150
FRACCION 2.Tiempo
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5FR
ACC
ION
2.P
RO
M C
2
Plot of Fitted Model
FRACCION 3.PROM C1 = 0.0297619 + 0.016121*FRACCION 3.Tiempo
0 30 60 90 120 150
FRACCION 3.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4
FRA
CC
ION
3.P
RO
M C
1
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 2
Pvalor = 0.0073
R = 0.929
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 3000 ppm de extracto Fr 3
Pvalor = 0.0003
R = 0.986
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
_h_
_h_
69
Plot of Fitted Model
FRACCION 3.PROM C2 = -0.0285714 + 0.0136905*FRACCION 3.Tiempo
0 30 60 90 120 150
FRACCION 3.Tiempo
0
0.4
0.8
1.2
1.6
2
2.4FR
ACC
ION
3.P
RO
M C
2
Plot of Fitted Model
FRACCION 3.PROM C3 = -0.0357143 + 0.0105159*FRACCION 3.Tiempo
0 30 60 90 120 150
FRACCION 3.Tiempo
0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
FRAC
CIO
N 3
.PR
OM
C3
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 6000 ppm de extracto Fr 3
Pvalor = 0.0012
R = 0.971
Rata de crecimiento del hongo para la concentración de 9000 ppm de extracto Fr 3
Pvalor = 0.0040
R = 0.947
Rad
io (
cm)
Rad
io (
cm)
_h_
_h_
70
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