FISIOLOGÍA VEGETAL. TEMA 19. AUXINAS: INTRODUCCIÓN.

El descubrimiento de las auxinas surgió como algo colateral a otro tipo de investigaciones. Las observaciones sobre los tropismos contribuyeron al descubrimiento de las hormonas vegetales.

- Julius von Sachs, a finales del siglo XIX, postula la existencia de sustancias morfogenéticas, algunas sustancias químicas que eran responsables de los efectos morfogenéticos.

- Charles Darwin se interesa en la capacidad de movimiento que poseen las plantas y principalmente sobre el fototropismo (movimiento de las plantas hacia un estímulo luminoso) en coleoptilos de gramíneas.

- Boysen-Jensen provoca la curvatura en un coleoptilo decapitado, tras restituir el ápice.

Las semillas de gramíneas, al germinar, primero emiten la radícula. Tras esto desarrollan el coleoptilo, que tiene como misión proteger a la hoja primaria. Hasta que la semilla germinada no vence la barrera del suelo, el coleoptilo protege al meristemo contenido en la hoja primaria. Una vez que la semilla sobresale, el coleoptilo se rompe, y la hoja primaria sale al exterior, se desenrolla y comienza a captar la luz (autotrofía). Alguna sustancia debía sintetizarse para regular todo este proceso.

Darwin, trabajando con coleoptilos de avena, utilizó una fuente de luz lateral y vio como los coleoptilos se orientaban hacia el lado de donde provenía el foco luminoso. Cuando cortó el ápice del coleoptilo, éste no crecía hacia la luz. Lo cubrió con un material opaco, y tampoco había respuesta fototrópica hacia la luz. Sin embargo, cuando lo cubrió con un material transparente que permitía el paso de la luz, sí hubo respuesta hacia la luz. También cubrió el resto del coleoptilo, dejando libre el ápice, con un material opaco y sí había respuesta. Esto indicaba que había algo en el ápice del coleoptilo, que en presencia de luz, era responsable del movimiento dirigido hacia la luz.

Boysen-Jensen cortó el ápice del coleoptilo, pero lo mantuvo interconectado al resto de la planta con agar, sí había respuesta. Hizo lo mismo pero interponiendo una lámina de mica (impermeable) entre el ápice y el resto del coleoptilo, y no había respuesta. Esto quería decir que un compuesto sintetizado por el ápice difundía al resto del coleoptilo y producía el fototropismo.

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Ellos no sabían qué compuesto era, después se vio que eran las auxinas. La distribución de auxinas es diferente en la zona enfrentada a la luz y en la que está de cara a la oscuridad, y esta diferencia de concentración de auxinas en las células produce el fototropismo, ya que las células con más auxinas (zona oscura) se elongan más, lo que produce la curvatura.

F. W. Went elaboró, en 1928, el primer bioensayo que permitía establecer una relación entre la cantidad de estímulo aplicado y la respuesta fisiológica observada. Went decapitó un ápice de coleoptilo y lo situó sobre un bloque de agar y una fuente luminosa. Tras un tiempo, puso sólo el bloque sin ápice sobre el coleoptilo decapitado, en ausencia de luz.

En ausencia de luz pero con las sustancias que habían difundido al agar, si situaba el bloque de agar de forma que cubriera todo el coleoptilo decapitado, éste se alargaba hacia arriba uniformemente, pero no se

curvaba porque la sustancia difundía por igual en los dos lados del coleoptilo. Si lo situaba sobre un lado u otro de manera desigual, provocaba una diferencia de concentración y se producía la curvatura.

Tras varios intentos, entre 1934 y 1935, dos grupos:

- Kijgl, Haagen-Smit y Erxleben, partiendo de orina humana, y- K.V. Thimann, usando extractos de cultivos del hongo Rhizopus

Consiguieron obtener una sustancia a la que se denominó auxina, del griego “hacer crecer” o “incrementar” y cuya estructura química resultó ser la del ácido indolil 3-acético, comúnmente llamado ácido indolacético o AIA.

En 1946, el AIA se aisló por primera vez de plantas. Se detectó la presencia de AIA endógeno en el endospermo inmaduro de semillas de maíz. El compuesto presenta un núcleo indólico, derivado del Trp, con una cadena lateral de Acetato.

En las plantas existen otras hormonas con efectos similares al AIA. AIA es la más importante porque está distribuida ampliamente por todo el Reino vegetal. Otras auxinas naturales importantes, in vivo, son:

- Ácido fenilacético (detectado en tallos de tomate y girasol).- Ácido 4-cloro-indolacético (en guisante). Es un derivado clorado.- Ácido indolbutírico (IBA). Igual al AIA, pero la cadena lateral es un Butirato.

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Los laboratorios han sintetizado compuestos químicos sintéticos similares, para abastecer a la Agricultura, como son:

- Ácido naftalenacético (ANA).- Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D).

Factores que afectan a la actividad auxínica.

Concentración hormonal. Las respuestas que se producen tras la aplicación de auxinas a las plantas dependen de la concentración de hormona, así como del tipo de órgano tratado. Por ejemplo, en función de si se trata de raíz, tallo o brote, la misma concentración estimulará más o menos el crecimiento. En la raíz se estimulará más y los tallos menos. Las auxinas actúan en un rango de concentraciones hasta que llegan a un óptimo, pero superado ese óptimo (en cualquier órgano) producen un efecto contrario e inhiben la elongación. Esto implica que podemos utilizar las auxinas con dos finalidades, estimular o inhibir el crecimiento (como herbicidas). La concentración óptima de AIA para el crecimiento en la raíz es de 10-7 g/L, por encima de esa cifra se inhibe el crecimiento. Para estimular el crecimiento del tallo, el óptimo está en 10-3 g/L, más allá de esta cifra se inhibe el crecimiento.

El AIA tiene diferentes efectos a diferentes concentraciones, y tendrá diferentes efectos en órganos distintos.

Sensibilidad frente a las auxinas. Cada órgano presenta una sensibilidad diferente frente a la auxina. Las raíces son más sensibles que las yemas, y éstas más sensibles que los tallos. La sensibilidad de un tejido u órgano puede variar con la edad y con las condiciones ambientales. La sensibilidad va a depender de:

- La concentración de receptores hormonales.- La efectividad de la unión receptor-hormona. Modulado por muchos factores

ambientales.

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Métodos para cuantificar las auxinas.

Bioensayos. Hasta hace pocos años los bioensayos eran el único método para cuantificar estas hormonas. En la actualidad existen otros métodos.

Métodos físico-químicos:

- HPLC, o cromatografía líquida de alta presión (detectores: fluorimétrico, electroquímico y masas).

- GC, cromatografía de gases (detector: masas).- Inmunoensayo.

Crecimiento de segmentos de coleoptilo de avena. Bioensayo.

Primero se hace una recta de calibrado. Se hacen secciones de coleoptilo de avena. Se van incubando secciones en distintas concentraciones de AIA. Esas secciones de coleoptilo, al cabo de 24h, habrán crecido más o menos. Con esto realizamos una recta de calibrado.

Luego hacemos un extracto de la planta que queremos estudiar. Incubamos secciones de coleoptilo en ese extracto y observamos el incremento de tamaño de las secciones, y los comparamos con la recta de calibrado. La concentración de AIA que se corresponda a ese incremento en el crecimiento será la concentración de AIA presente en el extracto.

Test de la curvatura del coleoptilo de avena. Bioensayo.

Se mide el grado de curvatura que induce la auxina al estar en contacto con un coleoptilo decapitado. Al decapitar el coleoptilo, eliminamos el lugar donde se sintetiza la hormona. Para producir la curvatura, colocamos bloques de agar que contenga auxina sobre la zona decapitada del coleoptilo en posición distorsionada, es decir, que sólo difunda a un lado del coleoptilo. El grado de curvatura producido en el coleoptilo va a ser proporcional a la cantidad de AIA. Con esto realizamos una recta de calibrado.

Ahora midiendo el grado de curvatura en cualquier coleoptilo y comparando con la recta, podemos determinar el grado de AIA endógeno.

Metabolismo y transporte de AIA.

Vamos a analizar la biosíntesis, la conjugación y el catabolismo. También veremos el transporte, aunque no pertenece a la ruta metabólica. Tanto el metabolismo como el transporte van a determinar, regulando homeostáticamente, que la planta tenga las cantidades de AIA necesarias para el crecimiento vegetal adecuado a cada momento y cada lugar.

Biosíntesis de AIA.

Parece ser que la ruta mayoritaria para el AIA, que se da en la mayoría de las especies, es la de la parte central de la figura. Todas parten del Trp.

En la mayoría de las plantas, la ruta del ácido indolpirúvico parte de Trp y, por un proceso de transaminacion se convierte en Ácido Indol-3-pirúvico. Después, mediante descarboxilación, el

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Ácido Indol-3-pirúvico pasa a Indol-3-acetaldehido. Y ahora, mediante oxidación, el Indol-3-acetaldehido pasa a Ácido Indol 3-acético.

Algunas plantas presentan la ruta de la Triptamina. El Trp sufre una descarboxilación, que va a generar Triptamina. La Triptamina, mediante desaminación oxidativa, se transforma en Indol-3-acetaldehido.

Otra ruta minoritaria que sólo se da en las Crucíferas (Brasicaceae), el Trp sufre una descarboxilación oxidativa y se forma la Indol-3-acetaldoxima. Éste compuesto puede pasar directamente a Indol-3-acetonitrilo por pérdida de una molécula de H2O, o llegar a lo mismo mediante etapas intermedias. Este Indol-3-acetonitrilo, mediante una nitrilasa, pasa a Ácido Indol-3-acético.

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Conjugación de AIA.

El AIA cuando se conjuga con otras proteínas conserva su estructura, pero pierde su actividad biológica. Auxina ligada y auxina conjugada son sinónimas. Se utiliza esta terminología para determinar todos los compuestos que se forman mediante enlaces covalentes entre el AIA y otras moléculas.

Es frecuente la conjugación con aminoácidos, glucosa, oligosacáridos, péptidos, proteínas, etc.

- La unión de AIA con aminoácidos se produce mediante enlaces amida, que forman compuestos como el ácido indolacetilaspártico (AIAasp). Este nuevo compuesto no tiene actividad biológica.

- La unión con azúcares se produce mediante enlaces éster, para dar compuestos como el indolacetilglucósido (AIAglu).

Estos conjugados se dan como forma de almacenamiento de AIA, y se detectan en semillas u otros órganos de almacenamiento (reserva). Aunque estos compuestos son inactivos fisiológicamente hablando, hay enzimas que pueden hidrolizar de nuevo el AIA cuando la planta requiera niveles de AIA libre.

Catabolismo de AIA.

La oxidación del AIA es un proceso catabólico irreversible, que implica la pérdida de la actividad biológica de la hormona. La oxidación puede ser descarboxilativa o no

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En algunos tejidos, la mayor parte del AIA se encuentra en forma de conjugados. Cuando la célula detecta que necesita AIA libre para una etapa fisiológica determinada, hidroliza los conjugados, liberando AIA fisiológicamente activo. Estas estructuras conjugadas tienen otras funciones importantes, como proteger el AIA de la oxidación por peroxidasa, es decir, actúan como formas de protección del AIA frente al ataque peroxidativo. Además, las estructuras conjugadas pueden actuar como un mecanismo de detoxificación para eliminar el exceso de auxina, ya que a niveles elevados podían inhibir el crecimiento.

descarboxilativa. Estas dos rutas son irreversibles, como hemos dicho, y los productos resultantes carecen de actividad biológica.

Catabolismo de AIA. Oxidación descarboxilativa.

La oxidación descarboxilativa está catalizada por la AIA oxidasa, que tiene actividad peroxidasa. Hay compuestos que pueden modular la actividad catabólica de esta hormona, activándola o inhibiéndola.

Los compuestos que activan la reacción son, el H2O2, los monofenoles, y algunos iones

metálicos como el Mn2+. Aceleran la degradación del AIA.

Otros compuestos inhiben a la enzima, como los di- y polifenoles (Flavonoides). Estos compuestos fenólicos más complejos protegen al AIA de la AIA oxidasa. Esto es importante, ya que algunos metabolitos secundarios como son los fenoles modulan el crecimiento, de forma indirecta, modulando la actividad de la AIA oxidasa.

Los productos iniciales de la reacción son indol-3-metanol y oxindol-3-metanol, dependiendo de que la oxidación se produzca en la cadena lateral o el núcleo indólico, respectivamente. La descarboxilación siempre se produce en la cadena lateral. En ambos casos es un proceso descarboxilativo.

Resumiendo, en la ruta de la oxidación descarboxilativa, la descarboxilación se da en la cadena lateral. Además, hay una oxidación, que puede ser en la propia cadena lateral, dando como primer producto indol-3-metanol, o en el núcleo indólico, dando como primer producto oxindol-3-metanol.

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Catabolismo de AIA. Oxidación no descarboxilativa.

La oxidación no descarboxilativa se produce en el anillo indólico de AIA sin pérdida del grupo carboxilo. La reacción da lugar al ácido 2-oxindol-3-acético y, posteriormente, al ácido 7-hidroxi-2-oxindol-3-acético. A diferencia de la oxidación descarboxilativa, la oxidación no descarboxilativa sólo se ha podido comprobar en ciertas especies.

Transporte de AIA.

Todas las hormonas vegetales pueden recorrer distancias cortas entre células próximas, donde se movilizan por difusión. También pueden llegar a los diferentes órganos a través de los tejidos vasculares, por xilema o floema.

Las auxinas no se movilizan a largas distancias como el resto de hormonas, tienen un mecanismo propio que las diferencia del resto. Se movilizan por los tejidos parenquimáticos, es decir, células no vasculares, asociados a los elementos conductores (células del cambium,

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células asociadas a floema). Esta vía de transporte polar con gasto de energía se denomina transporte polar activo. Es específico de auxinas, y ninguna otra hormona lo presenta.

Las principales características del transporte polar de auxinas son:

- La dirección del transporte está polarizada, es decir, se produce desde el ápice hacia la base del tallo (transporte basípeto), y en la raíz la dirección es preferentemente acrópeta, es decir, desde la base de la raíz hacia el ápice.

- El movimiento del AIA requiere energía metabólica, ya que no se produce en ausencia de O2 ni en presencia de inhibidores de la síntesis de ATP.

Diseccionamos un trozo de tallo. Colocamos bloques de agar con AIA radioactivo en la sección que daba al ápice, y un bloque de agar receptor en la base. Se ve que, transcurrido un tiempo, todo el AIA radioactivo se encuentra en la base. Si invertimos el tallo, se observa que el transporte está bloqueado. Esto indica que el transporte está polarizado, siempre va desde el ápice al tallo. Las mismas conclusiones sacaríamos en la raíz, sólo que sería acrópeto.

Esto, a nivel celular, se ha

demostrado con la hipótesis quimiosmótica. La hipótesis quimiosmótica presupone el movimiento de AIA de una célula a la inmediatamente inferior a lo largo de una columna de células transportadoras. La entrada de AIA a las células transportadoras se produciría por toda la superficie celular, bien mediante transportadores de entrada (difusión facilitada), bien por difusión simple del AIA no disociado (AIAH). Para que el AIA entre de forma no disociada debe existir un pH que facilite que esté en forma protonada.

La difusión estaría favorecida por el gradiente de pH existente a ambos lados de la membrana plasmática. Este gradiente de pH sería generado por bombas protónicas (H+/ATPasas de la membrana plasmática) que mantendrían un pH más bajo en la pared celular (pH = 5) que en el citoplasma (pH entre 7 y 7.5). De esta manera entraría sin gasto de energía en la membrana plasmática.

La membrana plasmática, permeable al AIA no disociado (AIAH), permitiría la entrada de la molécula que, una vez en el interior de la célula, se disociaría en AIA- + H+ debido al mayor pH. La membrana es impermeable al anión AIA-, que sólo podría salir de la célula mediante transportadores específicos.

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La polaridad del transporte vendría dada por la distribución asimétrica de estos transportadores de salida que estarían localizados, exclusivamente, en la base de las células transportadoras. La energía se necesita para mantener el gradiente de pH entre la pared celular y el interior de la célula (bombeo de protones) y para el transporte del AIA- por el plasmalesma basal mediado por transportadores.

Fuera de la célula, el bajo pH de la pared regeneraría la molécula de AIA (AIAH) que, de esta forma, entraría en la célula siguiente.

Otros experimentos que avalan esta hipótesis son el uso de compuestos que pueden acoplarse con los transportadores de salida de AIA e inhibir el transporte polar. Por ejemplo, los flavonoides como Genisteína o Quercetina, u otros compuestos sintéticos. Estos compuestos pueden bloquear el transporte de forma total o parcial, dependiendo de su concentración y el número de transportadores que bloqueen. Van a inhibir el crecimiento al impedir que las auxinas lleguen al lugar donde son necesarias.

El transporte polar desempeña un importante papel en el modo de acción de las auxinas. La planta modula la velocidad e intensidad del transporte para que se sincronice con los niveles de auxinas necesarios en cada lugar de la planta y en cada momento. El transporte polar puede intervenir en procesos como:

- El crecimiento del tallo.- La dominancia apical.- La diferenciación vascular.- El enraizamiento de esquejes, etc.

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Efectos fisiológicos mediados por auxinas.

Las auxinas están implicadas en muchos procesos del desarrollo vegetal porque afectan a la división, crecimiento y diferenciación de las células. Se ha visto que controlan:

- Alargamiento o elongación de las células y, por tanto, el alargamiento de raíces y de tallos. Pero no van a necesitar la misma concentración de auxinas, ya que las raíces tienen mayor afinidad por ellas, cambian los niveles óptimos.

- División celular del cambium, la diferenciación vascular, la formación de raíces adventicias. A una rama se le corta el meristemo apical, la zona de síntesis de la auxina ha sido eliminada. A continuación se hace una hendidura que afecta a los elementos conductores (el xilema). En una yema se aplicó AIA exógeno y se vio que el xilema se diferenciaba.

- Formación de raíces adventicias. Las auxinas favorecen la formación de raíces adventicias. Se usa en invernaderos para enraizar más rápido claveles y otras plantas ornamentales

- Estimulan la partenocarpia de los frutos. Un fruto partenocárpico se ha desarrollado sin tener semillas en su interior. A veces, en el ovario de la flor se concentran altos niveles de auxinas y giberelinas y lo toma como señal de que ha sido fecundado, desarrollando un fruto sin semillas.

- Dominancia apical. Las auxinas favorecen la dominancia apical, las citokininas las yemas laterales. Al eliminar el ápice de una planta, la zona de síntesis de auxinas, la planta pierde la dominancia apical. Al poco tiempo, comienzan a crecer yemas laterales. Si tras esto, colocamos auxina exógena en el ápice amputado, se inhibe la producción de yemas axilares y vuelve a haber dominancia apical.

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- Tropismos. Movimientos para alejarse o acercarse a un estímulo. Si el estímulo es la luz, se conoce como fototropismo. Si es la gravedad, se denomina gravitropismo o geotropismo. Están controlados por auxinas. Los tallos presentan fototropismo positivo y las raíces fototropismo negativo. En el tallo, hay mayor nivel de auxinas en el lado que no recibe luz y, por eso, crecen más y se produce curvatura hacia el lado iluminado. Esto se produce por transporte lateral de auxinas desde la zona iluminada a la no iluminada.

o Geotropismo. Se hicieron estudios microscópicos. Se vio que en las raíces verticales, en la zona de la cofia había una serie de amiloplastos (plastos donde se acumula el almidón) dispuestos de forma uniforme sobre el RE, ejerciendo una presión. En las raíces obligadas a estar horizontales frente al suelo, se vio que los amiloplastos no se disponían de forma uniforme y, con lo cual, no había una presión uniforme sobre el RE. Este desequilibrio de la presión sobre el RE es una señal diferencial que hace que la auxina se distribuya de forma diferente en el espacio de la raíz. El desequilibrio en la presión ejercida sobre el RE puede originar una señal diferencial correspondiente a la gravipercepción, en la que existe una estrecha relación entre los amiloplastos y el RE. Cuando la distribución de los amiloplastos en el RE es simétrica, el AIA que llega a la raíz se distribuye homogéneamente en ambas mitades de la raíz y crecen de manera sincrónica. Si obligamos a la raíz a estar paralela al suelo, se produce una distribución desigual de los amiloplastos sobre el RE y se produce una diferencia de presión. Esto va a provocar una distribución diferente de AIA, que se distribuye a mucha mayor concentración en la mitad inferior que en la mitad superior. Niveles tan altos inhiben el crecimiento en la mitad inferior de la célula de la raíz, creciendo más la mitad superior.

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Mecanismo de acción de las auxinas.

La pared celular es un entramado de fibras de celulosa unidas a hemicelulosas, sustancias pécticas y algunas proteínas estructurales. El crecimiento implica una ruptura en algunos de estos enlaces para permitir la expansión celular. Es decir, la pared primaria debe perder parte de su rigidez para que la célula pueda elongarse.

En el caso de las monocotiledóneas parece existir una degradación en ciertos glucanos de la pared, mientras que en las dicotiledóneas probablemente tenga lugar una despolimerización en los xiloglucanos. La ruptura de puentes de hidrógeno entre microfibrillas de celulosa, mediada por las proteínas llamadas expansinas, podría ser otro mecanismo importante.

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Hipótesis ácida del crecimiento. La auxina provoca la excreción de protones en las células que crecen (crecimiento primario). También se produce una entrada masiva de H2O en la célula, aumenta el volumen de la vacuola y la presión de turgencia. La vacuola presiona a la membrana plasmática, y ésta a la pared celular. Como la pared celular ya no tiene tanta rigidez, se deforma y permite el alargamiento. La incubación de los tejidos en medios ácidos ejerce un efecto similar al de la auxina, mientras que la incubación en disoluciones reguladoras neutras contrarresta el efecto de las auxinas. Para que este mecanismo tenga lugar debe producirse la unión entre la auxina y su receptor.

Receptores auxínicos.

Una proteína se considera receptor auxínico cuando presenta una elevada especificidad para estas sustancias (naturales o sintéticas), así como una alta afinidad. La unión debe ser reversible. El receptor más aceptado, por el momento, es una ABP-1 (auxin binding protein 1) aislada en coleoptilos de maíz y consistente en un dímero con dos subunidades de 22 kDa cada una.

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La acción de la auxina es doble. Activa el bombeo de protones desde el citosol a la pared celular, es decir, activa las ATPasas. Cuando la auxina se acopla con el receptor (que no se sabe si es soluble o de membrana) hay una mayor tasa de liberación de protones del citosol a la pared. El pH en la pared baja, y se activan las enzimas hidrolíticas que van a despolimerizar a la pared. El AIA también puede activar segundos mensajeros que activarían la síntesis de mRNA para ATPasas. Es decir, estimulan la actividad y la síntesis de novo de las ATPasas.

La fuerza impulsora del crecimiento es la entrada de agua, la auxina provoca que la entrada de agua pueda alargar a la célula debilitando la pared primaria.

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