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Santiago de Querétaro, Qro., México, marzo del 2018.
CENTRO DE INVESTIGACION Y DESARROLLO TECNOLÓGICO EN ELECTROQUÍMICA, S.C.
EFECTO DEL AGENTE ESTABILIZANTE EN LAS PROPIEDADES
MORFOLÓGICAS, ANTIMICROBIANAS Y CITOTÓXICAS DE
NANOPARTICULAS DE AgBr
Tesis
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE
Maestro en Ciencia y Tecnología
en la Especialidad de Ingeniería Ambiental
PRESENTA
Ferdinanda Aguilera Molina
Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en
Electroquímica
REALIZADO POR:
ING. FERDINANDA AGUILERA MOLINA
DIRIGIDO POR:
DR. WALTER NOÉ VELÁZQUEZ ARJONA
Y CO-DIRIGIDO POR:
DRA. LORENA ÁLVAREZ CONTRERAS (CIMAV)
SINODALES
Dr. Francisco Javier Rodríguez Valadez
Presidente Firma
Dr. Abraham Ulises Chávez Ramírez
Secretario Firma
Dr. Ernesto Alonso Beltrán Partida
Vocal Firma
Dr. Francisco M. Cuevas Muñiz
Suplente Firma
Este trabajo se realizó en el Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica
(CIDETEQ) bajo la dirección del Dr. Walter Noé Velázquez Arjona con financiamiento otorgado para
el desarrollo de esta investigación a través del proyecto CONACYT-SENER-Sustentabilidad
Energética INNOVATE UK proyecto 269546.
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN ................................................................................................................................. 1
ABSTRACT ............................................................................................................................... 2
AGRADECIMIENTOS............................................................................................................. 3
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 6
JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................... 7
HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 8
OBJETIVOS .............................................................................................................................. 9
A. Objetivo general ............................................................................................................... 9
B. Objetivos específicos ....................................................................................................... 9
CAPÍTULO I. ANTECEDENTES ......................................................................................... 11
SECCIÓN 1. Resistencia microbiana ................................................................................... 13
1. Agentes antimicrobianos ............................................................................................. 13
2. Resistencia microbiana ............................................................................................... 13
3. Nanopartículas de AgBr como alternativa .................................................................. 14
SECCIÓN 2. Nanopartículas ................................................................................................ 16
1. Definición ................................................................................................................... 16
2. Método de reducción química para la síntesis ............................................................ 16
3. Técnicas de caracterización ........................................................................................ 24
SECCIÓN 3. Microbiología y biología celular..................................................................... 29
1. Microbiología .............................................................................................................. 29
2. Biología celular ........................................................................................................... 33
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA ........................................................................................ 35
1. Síntesis de las nanopartículas de AgBr .......................................................................... 38
2. Caracterización de las nanopartículas de AgBr ............................................................. 41
a. Difracción de Rayos-X ............................................................................................... 41
b. Microscopía de Transmisión Electrónica .................................................................... 42
c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo ................................... 42
d. Espectrometría de Dispersión de Energía ................................................................... 43
e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido ........................... 43
f. Potencial Zeta.............................................................................................................. 44
g. Espectrometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis ......................................................... 44
3. Actividad antimicrobiana ............................................................................................... 45
a. Determinación de la CMI ............................................................................................ 45
b. Determinación de la CMB .......................................................................................... 48
c. Observación microfotográfica .................................................................................... 48
4. Evaluación de la citotoxicidad ....................................................................................... 49
CAPÍTULO III. RESULTADOS ........................................................................................... 51
1. Caracterización de las nanopartículas de AgBr ............................................................. 53
a. Difracción de Rayos˗X ............................................................................................... 53
b. Microscopía de Transmisión Electrónica .................................................................... 54
c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo ................................... 58
d. Espectrometría de Dispersión de Energía ................................................................... 60
e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido ........................... 62
f. Potencial Zeta.............................................................................................................. 64
g. Espectrofotometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis .................................................. 65
2. Actividad antimicrobiana ............................................................................................... 66
a. Determinación de la CMI ............................................................................................ 66
b. Determinación de la Concentración Mínima Biocida ................................................. 69
c. Observación microfotográfica .................................................................................... 70
3. Evaluación de la citotoxicidad ....................................................................................... 74
CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES ....................................................................................... 75
SECCIÓN I. Sobre el efecto del agente estabilizante en la síntesis de las AgBr NPs ......... 76
SECCIÓN II. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su actividad
antimicrobiana ................................................................................................................ 76
SECCIÓN III. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su citotoxicidad
76
CAPÍTULO V. APÉNDICE ................................................................................................... 77
CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................... 83
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPÍTULO I. ANTECEDENTES
Fig. 1 Diagrama de LaMer: Grado de saturación en relación al tiempo. .................................. 18
Fig. 2 Tipo de estabilidad de los agentes estabilizantes: a) PVP, estérica; b) CTAB,
electroestática positiva; c) SDS, electrostática negativa. .......................................................... 22
Fig. 3 Molécula de PVP, polímero no iónico. ........................................................................... 23
Fig. 4 Molécula de CTAB, surfactante catiónico. ..................................................................... 23
Fig. 5 Molécula de SDS, surfactante aniónico. ......................................................................... 24
Fig. 6 Diferencias estructurales en la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram
negativas. ................................................................................................................................... 30
Fig. 7 Esquema de la pared celular de una levadura. ................................................................ 31
Fig. 8 Metodología del proyecto................................................................................................ 37
Fig. 9 Reactivos empleados en la síntesis de las AgBr NPs ...................................................... 38
Fig. 10 Esquema del sistema de síntesis. ................................................................................... 39
Fig. 11 Coloraciones de las soluciones de síntesis con PVP, CTAB y SDS. ............................ 40
Fig. 12 Instalaciones de CIMAV y CIDETEQ-Tijuana. ........................................................... 41
Fig. 13 Equipo de XRD, Bruker, D8 Advance .......................................................................... 41
Fig. 14 Equipo TEM, HITACHI, HT7700. ............................................................................... 42
Fig. 15 FE-SEM, JEOL JSM-7401F ........................................................................................ 42
Fig. 16 SEM, ZEISS EVO-MA15 ............................................................................................. 43
Fig. 17 Equipo de TGA˗DSC, TA Instruments, SDT˗Q600 ..................................................... 43
Fig. 18 Equipo para medir Potencial Zeta, Horiba Scientific, SZ˗100 ...................................... 44
Fig. 19 Espectrofotómetro Thermo Scientific, Varioskan Lux ................................................. 44
Fig. 20 Metodología de diluciones seriadas. ............................................................................. 46
Fig. 21 Inoculación de las dispersiones de los agentes antimicrobianos. .................................. 47
Fig. 22 Resiembra en medio de cultivo libre de agente antimicrobiano. .................................. 48
Fig. 23 Difractogramas de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, SDS y CTAB. ...................... 53
Fig. 24 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB. ............................................. 55
Fig. 25 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS. ................................................ 56
Fig. 26 TEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP. .................................................................... 57
Fig. 27 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB. ....................................... 58
Fig. 28 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS. .......................................... 59
Fig. 29. Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP. ......................................... 59
Fig. 30 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con CTAB, en el inserto se indican
las zonas analizadas. .................................................................................................................. 60
Fig. 31 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con SDS, en el inserto se indican
las zonas analizadas. .................................................................................................................. 60
Fig. 32 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con PVP, en el inserto se indican
las zonas analizadas. .................................................................................................................. 61
Fig. 33 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con PVP. ........................................................ 62
Fig. 34 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con SDS. ........................................................ 63
Fig. 35 Termograma de AgBr NPs syntetizadas con CTAB. .................................................... 63
Fig. 36 Potencial ζ de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y SDS. .............................. 64
Fig. 37 Espectros de absorbancia de luz UV˗Vis de AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y
SDS. ........................................................................................................................................... 65
Fig. 38 Instalaciones UABC, Facultad de Odontología.. .......................................................... 66
Fig. 39 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans
después de un ciclo de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB ...... 67
Fig. 40 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans
después de un ciclo de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con SDS ......... 68
Fig. 41 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans
después de un ciclo de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con PVP. ........ 68
Fig. 42 Crecimiento microbiano después de un ciclo de incubación en medio de cultivo libre
de AgBr NPs. ............................................................................................................................. 69
Fig. 43 Micrografías FE-SEM de E. coli a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs
sintetizadas con b) CTAB, c) PVP y d) SDS. ............................................................................ 71
Fig. 44 Micrografías FE-SEM de S. aureus a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr
NPs sintetizadas con b) CTAB, c) PVP y d) SDS. .................................................................... 72
Fig. 45 Micrografías FE-SEM de C. albicans a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr
NPs sintetizadas con b) CTAB, c) PVP y d) SDS. .................................................................... 73
Fig. 46 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con CTAB contra
viabilidad celular. ...................................................................................................................... 74
Fig. 47 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con SDS contra
viabilidad celular. ...................................................................................................................... 74
Fig. 48 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con PVP contra
viabilidad celular. ...................................................................................................................... 74
CAPÍTULO IV. APÉNDICE
Fig. 49 Esquema de una celda unitaria. ..................................................................................... 78
ÍNDICE DE TABLAS
CAPÍTULO I. ANTECEDENTES
Tabla 1. Resumen de trabajos relacionados a nanomateriales de AgBr, con distintas variables y
efectos evaluados. ...................................................................................................................... 20
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA
Tabla 2. Concentraciones microbianas de los inóculos. ............................................................ 47
CAPÍTULO III. RESULTADOS
Tabla 3. Composición atómica de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP como
agentes estabilizantes. ................................................................................................................ 61
Tabla 4. Concentraciones microbianas de los inóculos. ............................................................ 66
Tabla 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS
y PVP evaluadas contra E. coli, S. aureus y C. albicans........................................................... 67
Tabla 6. Concentraciones Mínimas Biocidas de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y
PVP evaluadas contra E. coli, S. aureus y C. albicans.............................................................. 69
CAPÍTULO IV. APÉNDICE
Tabla 7. Sistemas cristalinos y redes de Bravais. ...................................................................... 78
Tabla 8. Ecuaciones de distancia interplanar para siete sistemas cristalinos. ........................... 82
1
RESUMEN
En este trabajo se sintetizaron nanopartículas de AgBr (AgBr NPs) mediante un método de
reducción química evaluando el efecto de difertentes agentes estabilizantes:
Polivinilpirrolidona (PVP), Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB) y Dodecilsulfato de
Sodio (SDS). Las nanopartículas sintetizadas se caracterizaron mediante Difracción de Rayos-
X (XRD), Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM), Microscopía de Barrido de
Electrones de Emisión de Campo (FE-SEM), Espectrometría de Dispersión de Energía (EDS),
Análisis Termogravimétrico-Calorimetría Diferencial de Barrido (TGA-DSC), Potencial Zeta
y Espectrofotometría de Absorbancia de Luz UV-Vis. El efecto de la variación del agente
estabilizante se analizó no sólo en las características morfológicas de las AgBr NPs, sino
también a través de los cambios en la actividad antimicrobiana probada sobre Escherichia coli
(bacteria Gram negativa), Staphylococcus aureus (bacteria Gram positiva) y Candida albicans
(levadura). A partir de este estudio se determinó que, las nanopartículas sintetizadas con
CTAB manifestaron mayor actividad, resultando su Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
en 62 μg/mL, 4 μg/mL y 4 μg/mL, respectivamente, y su Concentración Mínima Biocida
(CMB) en 125 μg/mL, 4 μg/mL y 31 μg/mL, respectivamente. De la misma manera, la
citotoxicidad consecuente de la variación de agente estabilizante empleado en la síntesis de las
nanopartículas se evaluó sobre líneas celulares de fibroblastos gingivales mediante ensayos
MTT, donde se encontró que ésta no es significativamente nociva en relación a ninguno de los
materiales.
2
ABSTRACT
In this work, AgBr nanoparticles (AgBr NPs) were synthesized through an aqueous chemical
reduction method varying the capping agent: Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB),
Sodium dodecyl sulfate (SDS), and Polyvinylpyrrolidone (PVP). The as synthesized
nanoparticles were characterized through X-Ray Diffraction (XRD), Transmission Electron
Microscopy (TEM), Field-Emission Scanning Electron Microscopy (FE-SEM), Energy-
Dispersive Spectroscopy (EDS), Thermogravimetric Analysis-Differential Scanning
Calorimetry (TGA-DSC), Zeta Potential, and UV-Vis Light Spectrophotometry. The effect of
the capping agent variation was investigated not only through the morphological
characteristics of the AgBr NPs, but also through changes in their antimicrobial activity, which
were essayed against Escherichia coli (Gram negative bacteria), Staphylococcus aureus (Gram
positive bacteria), and Candida albicans (yeast). From this work, it was found that the
nanoparticles synthesized with CTAB manifested the highest activity, with Minimal Inhibitory
Concentrations (MIC) of 62 μg/mL, 4 μg/mL, and 4 μg/mL, respectively, and Minimal
Biocidal Concentrations (MBC) of 125 μg/mL, 4 μg/mL, and 31 μg/mL, correspondingly.
Likewise, the consequential cytotoxicity yielded by the variation of the capping agent during
the syntheses of the nanoparticles was valued on cell lines of gingival fibroblasts through
MTT essays, where no considerable damage was caused by any of the materials.
3
AGRADECIMIENTOS
Después de haber pasado por el momento de tomar una decisión sería en un momento de
comodidad e inseguridad (si las dos pueden ser posibles juntas), pero con objetividad y
enfoque puesto sobre un mejor futuro; y de haberla ejecutado. Con ejecutarla, me refiero a
incorporarme (como pude, con esfuerzo, pero con el flujo de la vida a mi favor) a una
institución muy bonita dedicada a la ciencia y a provocar admiración de los que saben y más
de los que no sabemos. Y después de haberme sumergido en un proyecto sobre un tema
totalmente desconocido. Los nanomateriales.
Después de haber tardado mucho en comprender siquiera la nanopunta del iceberg de la
nanociencia. Y con tardar, me refiero a muchísimo tiempo, una infinidad, leer mucho, de
muchos temas, de muchos autores, en muchos espacios y otros tiempos.
Después de haber trabajado con mis manos en el laboratorio con mucha paciencia, dedicación,
pericia y delicadeza, y otras veces como desquiciada perdida en la esfera del tiempo, y en otras
tantas en la del espacio también.
Porque después de haber viajado mucho a varios laboratorios del país igualmente dignos de
admiración y respeto.
Y después de haber pasado por todos los obstáculos inherentes a la vida.
Y después de haber sido casi pulverizada por la famosa tesis. No es exageración, nunca había
vivido semejante miedo, ansiedad, desolación, tribulación, jamás había sido tan abrumada sin
posibilidad de escape, casi sola o prácticamente sola. Perseguida por la perfección, por el
miedo al fracaso, ante todos, ante mí. Pero sin renunciar en el suicidio (por no encontrar mejor
analogía), por el aprecio a la vida como más digna contrincante que la muerte. Después de caer
lo más bajo posible, de haber estado a punto de darme por vencida, de renunciar y tirar todo
por la borda.
Después de todo el vía crucis (con sus dos interpretaciones), lo más difícil es ser agradecidos
abiertamente y con sinceridad.
Agradezco a las circunstancias que me condujeron a tomar ciertas decisiones.
4
Agradezco a mi hermana Nora Liz por el apoyo económico para emprender esta tarea.
Agradezco a las personas que me recibieron en CIDETEQ como si ya nos conociéramos o con
la sospecha de que llegaríamos a coexistir, a estas personas que viven con la ciencia y con
consciencia, y aún con espíritu suficiente para ser amables y generosos. Agradezco a la Dra.
Teresita Oropeza, quien fue la primera en recibirme y de quien siempre conservaré una imagen
de líder moral, al Dr. Alejandro Medel, que me hizo creer en la realidad de una posibilidad, a
Abigail de Jesús y a Claudia Nava por su atención conmigo siempre, a los profesores que tuve
en CIDETEQ-Querétaro por compartir su tiempo y conocimientos: Dr. Francisco Rodríguez,
Dra. María Yolanda Reyes Vidal, Dr. Adrián Rodríguez García, Dr. Ricardo Picos, Dr.
Fabricio Espejel y Dra. Irma Robles y en CIDETEQ-Tijuana: Dra. Ana Bertha Castro, Dr.
Eduardo Maldonado, Dr. Ricardo Valdez por saber responder a absolutamente todas mis dudas
y de tener la paciencia de explicarme, a mi asesor externo en la UABC en la Facultad de
Odontología el Dr. Ernesto Beltrán Partida por su inconmensurable apoyo durante tiempo de
vacaciones, a mi asesora externa en CIMAV-Chihuahua la Dra. Lorena Álvarez de quién
siempre conservaré la imagen de una mujer con autoridad y seguridad, al Dr. Erasmo Orrantia
por permitirme hacer uso de su laboratorio con total libertad y de enseñarme lo que es ser
eficiente y disciplinado, a la Dra. Hilda Piñón por haberme concedido algo de su tiempo tan
saturado.
También quiero agradecer profundamente y con la totalidad de mi ser a todos los expertos (no
quiero a llamarlos técnicos) que hicieron su parte en este proyecto y que también me tuvieron
mucha paciencia: a Ernesto G. Lestarget con XRD, a Raúl en TEM, a Wilber en FE-SEM, a
Manuel Román por compartir su laboratorio y deliciosos postres, en TGA-DSC y por hacerme
sentir en casa y una amistad lejos de casa a César Leyva.
Lamentablemente no cuento con una memoria perfecta y muy seguramente estoy olvidando
mencionar a otros tantos, pero sepan que, en momentos difíciles, siempre se agradece hasta su
sola presencia.
Quiero agradecer a todos los que han compartido este camino conmigo, a mis amigos del
curso propedéutico y después amigos de CIDETEQ, Mayorela, Valeria, Reyna, Rosario,
5
Andrés, Ana Karen, Marlon (no supe si incluirte en Querétaro o Tijuana). En Tijuana a Gil y
todos sus co-trabajadores, a los Impetuosos y otros amigos.
Obviamente también quiero agradecer a mi familia, a mi mamá Nora Liz Molina Vélez por su
apoyo invaluable en la culminación de este proyecto, a mi hermana Ana Victoria por su
sentida compañía en los momentos más difíciles de desesperación y por comprarme cositas
para satisfacer mi ansiedad, a mi hermano Víctor Manuel por ser el único de mi familia con
quien puedo compartir el tema ambiental, a mis hermanas Yari y Lissette por darme mi
espacio, y sobre todo a mi sobrino favorito del mundo, Ares, por ser lo que más feliz me hace
en todo el universo y lo que mayor motivación me da para ser un buen ejemplo.
También quiero agradecer a mis amigos de Tecate (a Fernando por el diseño de la portada) y a
todos los demás amigos que hice en mi paso por Tijuana, Mexicali, Querétaro y Chihuahua, a
Sandra y Paola, mis roomies/hermanas, que me recibieron en sus casas, no sé qué hubiera sido
de mí sin ustedes dos, gracias. A Isaac y Danny por su amistad tan sincera y apreciable, e igual
por recibirme en su hogar.
También quiero reiterar mi agradecimiento al Dr. Ricardo, que como ya mencioné siempre ha
estado para aclarar mis dudas, pero sobre todo por haber atendido a mi llamado de auxilio
cuando estaba a punto de renunciar, gracias.
Por último, pero no menos meritorio, parecía que lo estaba omitiendo con deliberación, quiero
agradecer intensa y abismalmente (es imposible encontrar el adjetivo más expresivo) al Dr.
Walter Arjona, mi asesor, por haber mantenido la integridad de este proyecto, por haberme
comprendido y tenido paciencia, por haber creído e invertido en mí, por haber sabido cómo
tratarme para no rendirme y mejor aún por la sutileza con la que evitó que me tornara en
contra de este proyecto y terminado peleando con todos, salvándome de la desilusión a mí
misma y a los que tienen expectativas buenas de mí. Gracias, Dr. Walter por guiarme en este
camino para subir un peldaño más adelante. Gracias nuevamente por tu paciencia y firmeza en
el objetivo, gracias.
He invertido mucho de mí en este proyecto, a mis posibilidades, pero lo dedico a todas estas
personas con las que estaré eternamente agradecida.
6
INTRODUCCIÓN
Los antibióticos y otros agentes antimicrobianos han salvado un sinfín de vidas a partir de su
descubrimiento, incluso contribuyeron al éxito de las cirugías. Sin embargo, el uso excesivo e
indiscriminado de ellos, ha inducido a los microorganismos a desarrollar resistencia ante su
efecto, resultando en la pérdida de susceptibilidad a su actividad inhibitoria o biocida. Esto ha
conducido a una grave situación donde cada vez es más difícil tratar ciertas infecciones
resultando en enfermedades más prolongadas y de costos de tratamiento más elevados. De
aquí que resulte imperativo buscar alternativas para tratar dichas infecciones [1].
Desde antes del descubrimiento de los antibióticos, la Plata fue utilizada como agente
antimicrobiano desde la desinfección y preservación del agua y alimentos hasta como
tratamiento de ciertos padecimientos [2].
En la actualidad, con el surgimiento de la nanotecnología, se ha retomado el uso de la Plata y
sus derivados para atender los problemas infecciosos. Se han realizado estudios para lograr
implementar los nanomateriales de compuestos de Plata como agentes antimicrobianos.
En este trabajo se pretende contribuir a tal finalidad al proponerse una metodología de síntesis
de nanopartículas de AgBr basado en un método de reducción química en fase acuosa donde
se varía el agente estabilizante (CTAB, SDS y PVP) para evaluar el efecto que éste tiene en
sus características morfológicas finales y consecuentemente su actividad antimicrobiana y
citotóxica. De esta manera, en la presente tesis se muestran los resultados fisicoquímicos y
antimicrobianos de nanopartículas de AgBr sintetizadas a través de una estabilización
electrostática (CTAB, SDS) y una estabilización estérica (PVP).
7
JUSTIFICACIÓN
El empleo de nanomateriales como alternativas de agentes antimicrobianos es limitado debido
a que es un área novedosa que no ha sido dilucidada en su totalidad. A pesar de ello, los
nanomateriales se han perfilado como una opción viable a los antibióticos y agentes
antimicrobianos clásicos. Aún queda mucho que explorar para sintetizar nanomateriales con
propiedades idóneas para esta aplicación.
En literatura se encuentra reportado el uso de nanopartículas de AgBr y su efecto
antibacteriano, sin embargo, no existen estudios formales del efecto del control que ejercen
durante la síntesis los agentes estabilizantes sobre las características morfológicas de las
nanopartículas de AgBr que se reflejan en las propiedades intrínsecas de éstas. De esta manera,
en este trabajo se explora una ruta de síntesis de nanopartículas de AgBr que permite obtener
materiales con características morfológicas (de cristalinidad y tamaño de cristal y de partícula)
con actividad antimicrobiana significativa y baja citotoxicidad a células mamíferas.
8
HIPÓTESIS
La obtención de nanopartículas de AgBr a través del uso de CTAB como surfactante resultará
en el material con mayor actividad antimicrobiana hacia E. coli (bacteria Gram negativa), S.
aureus (bacteria Gram positiva) y C. albicans (levadura), debido a un efecto sinérgico CTAB-
AgBr NPs.
9
OBJETIVOS
A. Objetivo general
Evaluar el efecto del agente estabilizante (CTAB, SDS y PVP) en la morfología, actividad
antimicrobiana y citotoxicidad de nanopartículas de AgBr.
B. Objetivos específicos
1. Sintetizar nanopartículas de AgBr variando el agente estabilizante (CTAB, SDS y PVP).
2. Realizar la caracterización fisicoquímica de las nanopartículas obtenidas mediante
difracción de rayos-X (XRD), microscopía (TEM y FE-SEM), espectroscopía de
dispersión de energía (EDS), análisis termogravimétricos (TGA-DSC), análisis de
potencial-Zeta y espectrofotometría UV-Vis.
3. Evaluar la actividad antimicrobiana de las nanopartículas mediante la determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) sobre E. coli, S. aureus y C. albicans.
4. Realizar mediante FE-SEM un estudio del efecto de las AgBr NPs sobre la estructura
celular de los microorganismos evaluados en la actividad antimicrobiana.
5. Evaluar la citotoxicidad de las AgBr NPs sobre fibroblastos gingivales.
10
11
CAPÍTULO I. ANTECEDENTES
12
13
SECCIÓN 1. Resistencia microbiana
1. Agentes antimicrobianos
Pasteur (1877) fue el primero en observar y mostrar que la infección ántrax causada por
Bacillus anthracis en animales susceptibles era suprimida por la presencia de otros
microorganismos, y que a su vez éste presentaba antagonismo hacia otros microorganismos
[3].
Otros investigadores trataron de aclarar este fenómeno, encontrándose que no solamente se
inhibía el crecimiento de los microorganismos objetivo, sino que también era posible provocar
su muerte.
Sin embargo, no fue hasta 1914 que el Dr. Selman A. Waksman utilizó por primera vez la
palabra “antibiótico” para describir sustancias producidas por microorganismos, que
manifestaban la capacidad de antagonizar el crecimiento de otros microorganismos y/o de
poder provocar su destrucción [4]. Siguiendo la lógica de que los microorganismos patógenos
para los seres humanos y animales deberían de estar presentes en el suelo vía excretas o sus
cuerpos en descomposición, él y su grupo de investigación realizaron estudios para dilucidar la
razón de porqué esto no era así. Observaron que, al llegar al suelo, el crecimiento de los
patógenos era inhibido o que éstos eran “consumidos” por la microbiota viviente en el suelo.
Fue así como aislaron a los microorganismos antagonistas y de ahí la subsiguiente purificación
de las sustancias antibióticas producidas. Hoy en día se conocen distintos agentes
antimicrobianos: antibióticos para combatir bacterias (comenzando desde la penicilina hasta
los antibióticos de última generación), antifúngicos contra hongos, o antisépticos y
desinfectantes empleados para inhibir o destruir microorganismos sobre superficies.
2. Resistencia microbiana
La teoría de evolución presentada por Rosenberg et al., [5] considera en conjunto a los
animales o plantas y sus microorganismos asociados como una sola unidad evolutiva. “Esta
teoría está basada en cuatro generalizaciones: (1) todos los animales y plantas establecen
relaciones simbióticas con microorganismos, (2) los microorganismos simbióticos son
transmitidos entre generaciones, (3) la asociación entre hospedero y los simbiontes afecta el
14
estado de la unidad evolutiva dentro de su ambiente y (4) una variación en la suma genética
del hospedero y su microbiota puede ser causada por cambios ya sean en los genomas del
hospedero o de la microbiota; la comunidad microbiana simbiótica puede cambiar rápidamente
bajo estrés ambiental [5].” La variación genética es la base fundamental de la evolución. La
evolución del genoma del hospedero se lleva a cabo mediante la reproducción sexual,
reacomodos de cromosomas y por mutación. El genoma de la microbiota cambia por
recombinación, mutación y otros tres procesos: amplificación microbiana, adquisición de
nuevas cepas y transferencia genética horizontal entre diferentes especies. En respuesta a la
demanda ambiental, estos últimos tres procesos pueden ocurrir muy rápidamente debido al
hecho de que el ciclo de vida de los microorganismos es mucho más veloz, manifestando una
rápida adaptación y subsecuente herencia a las generaciones posteriores.
Esta evolución se puede manifestar a través de varios mecanismos: inactivando los
medicamentos por hidrólisis o su modificación, alterando sus receptores o evitando el acceso a
ellos [6].
Los microorganismos (patógenos y no) pertenecientes a la unidad evolutiva del ser humano,
han sido expuestos al estrés ambiental constante de antibióticos empleados por las personas y
el uso excesivo e indiscriminado de antisépticos y desinfectantes en superficies, hospitales,
geles de higiene personal, etc. Algunos de ellos, patógenos, han respondido manifestando
resistencia ante los agentes antimicrobianos, resultando en un grave problema cuando éstos
provocan infecciones que implican una amenaza a la salud difícil de combatir. Esta frágil
situación ha impulsado y obligado a los investigadores de varias áreas de la ciencia a
empeñarse en el camino de la búsqueda de agentes antimicrobianos más potentes, más
específicos o innovadores que logren darse a la tarea de luchar contra los microorganismos
resistentes y multirresistentes.
3. Nanopartículas de AgBr como alternativa
Los mecanismos de acción de los antibióticos convencionales aprovechan las rutas
metabólicas de los microorganismos o actúan sobre su estructura biológicamente, induciendo
así la evolución de los microorganismos para resistir y adaptarse ante el antagonismo. Es por
esto que los nanomateriales (materiales con medida de 1 a 100 nm por lo menos en alguna de
sus dimensiones) muestran ser una alternativa atractiva que, aunque no se ha dilucidado
15
totalmente su mecanismo de acción, se ha observado que su principal característica o la que,
en dado caso, sucede en primer instancia, es el daño que causa a la integridad de la pared
celular de los microorganismos y por lo tanto, su muerte; evitando así la trayectoria
subsiguiente metabólica incluida la adquisición o desarrollo de resistencia [7].
Además, otra característica atractiva de los nanomateriales es su gran área superficial relativa a
su tamaño, y en consecuencia una alta actividad en relación a la dosis empleada.
De aquí que el siguiente paso lógico sea implementar la Plata con dimensiones nanométricas,
dado que la Plata ha sido utilizada tradicionalmente como agente antimicrobiano desde
tiempos remotos. Inicialmente, se empleaba como ayuda para mantener el agua y alimentos
libres de contaminantes microbianos (vasijas y utensilios de Plata), así como era utilizada con
aplicación médica como ungüento para los ojos de los bebés recién nacidos para evitar
infecciones transmitidas por la madre, en amalgamas dentales y como tratamiento para
quemaduras (estas últimas aplicaciones siguen estando en uso hoy en día) [2]. A pesar de ser
la Plata un agente antimicrobiano efectivo, su uso se vio opacado por el surgimiento y
atención que se dio a los antibióticos propiamente definidos como tales; sin embargo, se han
retomado las investigaciones y trabajos con este material aunado a los conocimientos de
nanociencia presentes en la actualidad.
Se ha planteado que la actividad antimicrobiana de los nanomateriales de Plata se debe
principalmente a la acción de los iones Ag+ que son liberados a través de un proceso de
oxidación de dos pasos siguiendo las ecuaciones que se presentan a continuación:
4Ag + O2 = 2Ag2O (1)
2Ag2O + 4H+ = 4Ag+ + 2H2O (2)
La cinética de disolución del ión Ag+ es dependiente del tamaño de partícula, funcionalización
de superficie, concentración de oxígeno, temperatura, pH y composición química del medio
circundante resultando en un proceso muy lento si las condiciones no son las adecuadas, pero
teniendo a su favor una efectividad a largo plazo [8].
Por otro lado, las sales de Plata como el AgNO3 presentan una alta solubilidad alcanzando una
alta concentración de Ag+, pero con la desventaja de ser altamente tóxicas para las células del
tejido donde son aplicadas.
16
Consecuentemente, en este trabajo se buscó sacar provecho de los beneficios de cada escenario
y trabajar con nanopartículas de AgBr con solubilidad más baja que las sales de Plata y la
disponibilidad de una alta concentración de iones Ag+ a mayor plazo.
SECCIÓN 2. Nanopartículas
1. Definición
La nanociencia engloba varias disciplinas tales como química, física, biología, ciencia de
materiales, entre otras, para estudiar la materia a escala nanométrica. Un material nanométrico
se considera como tal cuando por lo menos una de sus dimensiones es menor de 100 nm. Esta
ciencia ha atraído la atención de investigadores y desarrolladores industriales debido a las
posibilidades prometedoras que ofrecen las características que manifiestan estos materiales.
Los nanomateriales exhiben actividades físicas, químicas, electrónicas, biológicas y otras más
pronunciadas o novedosas que sus contrapartes masivas (orden de micrómetros), favoreciendo
aplicaciones en catálisis química, electrónica, fotografía, almacenamiento de información,
energía, imagenología, medicina y otras. En el rango menor a 1 nm se encuentran las
moléculas, átomos, partículas elementales y demás (con su propia rama científica) que al
encontrarse individualmente dispuestas presentan diferentes comportamientos de colisión con
otras moléculas. Otra diferencia importante relativa a su análogo másico en misma dosis y
composición es el aumento en proporción de átomos disponibles o la relación área
superficial:volumen que se presenta cuando los materiales comienzan a reducir su tamaño por
debajo de los 100 nm [9] [10]. Los nanomateriales se emplearon empíricamente desde la
antigüedad en tinciones para cristales, como agentes curativos chinos y tinturas medievales,
por nombrar algunos; pero fue hasta 1857 que Michael Faraday realizó el primer estudio
científico documentado sobre nanopartículas metálicas, donde se sintetizaron nanopartículas
de Oro a partir de la reducción química de sales de Au. En este trabajo él concluyó que estos
materiales debían de ser de un tamaño menor a la longitud de onda de luz visible, ya que
mostraban colores diferentes a los incididos sobre ellos [11].
2. Método de reducción química para la síntesis
Existe una diversidad de metodologías para la síntesis de nanomateriales debido a la existente
necesidad e interés por obtener productos de composición específica, con morfologías
17
definidas y tamaños de partícula con baja dispersión mediante metodologías fácilmente
escalables y de buena eficiencia y productividad económica. La síntesis de los nanomateriales
se puede generalizar en dos categorías principales: top-down y bottom-up, es decir, de arriba
hacia abajo y de abajo hacia arriba.
Las metodologías top-down consisten principalmente en reducir el tamaño de la materia prima
bulk o másica ya sea a través de molienda, desgaste o volatilización del sólido para su
posterior condensación. Los métodos más representativos de este último incluyen: depósito
físico en fase vapor (physical vapor deposition, PVD, por sus siglas en inglés), depósito
químico en fase vapor (chemical vapor deposition, CVD), depósito por capas atómicas
(atomic layer deposition, ALD) y depósito por láser pulsado (pulsed layer deposition, PLD)
mediante laser pulsado de alta potencia [9] [12].
Las técnicas dentro de la categoría bottom-up son las más utilizada por ofrecer un mayor
control sobre los factores de síntesis y así una producción de nanomateriales más apegados a
lo planeado; además de que ofrecen el beneficio de utilizar equipos menos costosos y
sofisticados que los empleados en tecnologías de arriba hacia abajo.
Dentro de los métodos de abajo hacia arriba los más empleados son los que utilizan
procedimientos químicos; algunos de ellos son: reducción fotoquímica y radioquímica,
irradiación con microondas, utilización de dendrímeros, método sol-gel, síntesis solvotermal y
método coloidal o método de reducción química en fase líquida.
En este trabajo se siguió el método de reducción química en fase líquida para la síntesis de
nanopartículas de AgBr. En él los parámetros de reacción: precursor (sales metálicas por lo
general), agente reductor (donador de electrones para reducir las sales metálicas en átomos
metálicos), agente estabilizante (para evitar la agregación de los nanomateriales, pueden ser
surfactantes o polímeros), agente direccionador (pueden coadyuvar en la obtención de ciertas
morfologías) y temperatura de síntesis (sin exceder el punto de fusión del solvente), pueden
ser manipulados independientemente para controlar la forma, tamaño y composición de los
productos. En este caso, se decidió variar solamente los agentes estabilizantes, mientras que se
mantienen constantes los demás factores durante la síntesis.
El mecanismo de síntesis generalizado para todos los nanomateriales no ha sido elucidado por
completo, pero se han logrado avances significativos. En los años 1940’s LaMer y sus colegas
18
incursionaron en la investigación para tratar de establecer la teoría que explica la preparación
de soluciones coloidales monodispersas. En su trabajo publicado en 1950, se propuso el
concepto de “nucleación espontánea” [13]. En este proceso, se generan núcleos que
posteriormente comienzan a crecer sin nucleación adicional. Debido a que todas las partículas
forman núcleos simultáneamente, sus historiales de crecimiento son similares, permitiendo así
un control sobre la distribución de tamaño de partículas en la solución. Por otro lado, si los
núcleos siguieran formándose a destiempo, resultarían crecimientos desiguales.
En el diagrama de la Fig. 1. se visualiza la barrera energética que existe para inducir el
cambio espontáneo del sistema de una fase homogénea a una heterogénea. La concentración
del monómero, la subunidad mínima del cristal, aumenta constantemente con el tiempo hasta
que el grado de supersaturación es suficientemente alto como para que la barrera energética
sea superada dando lugar a la formación y acumulación de núcleos estables. Dado que es un
sistema cerrado donde no están siendo suministrados más precursores de monómeros y que
éstos están siendo consumidos para la nucleación y crecimiento, la concentración del
monómero disminuye hasta que la velocidad neta de nucleación es cero. Una vez alcanzado
este nivel, la nucleación se detiene y el sistema entra en una etapa de crecimiento mientras que
la solución siga permaneciendo sobresaturada [14].
Fig. 1 Diagrama de LaMer: Grado de saturación en relación al tiempo.
El mecanismo de síntesis se puede dividir en tres fases definidas: nucleación, evolución del
núcleo a semillas y crecimiento de las semillas en cristales; al momento que las reacciones
químicas resultan ser bastante sencillas [15]. Implicando así que la nucleación (incorporación
del material soluto a la red cristalina por integración superficial) y la difusión (de los
19
monómeros y núcleos o material soluto de la solución bulk supersaturada) son los elementos
clave en la formación de las partículas [10].
a. Precursores
Los precursores utilizados en este trabajo son las sales de nitrato de Plata (AgNO3) y bromuro
de sodio (NaBr). A continuación, en la siguiente Tabla 1. se presentan algunos trabajos de
relevancia publicados en relación a la síntesis de nanomateriales de AgBr a partir de distintos
precursores, agentes estabilizantes, agentes reductores y cuya actividad es útil para diferentes
finalidades.
El agente reductor suave empleado para la síntesis en este trabajo es el ácido ascórbico o
simplemente ascorbato (el anión del ácido ascórbico), su química redox es bien conocida en la
nutrición humana y otras especies por sus propiedades antioxidantes, asimismo en la síntesis
de nanomateriales avanzados [16]. El motivo de emplear este reductor está asociado con la
necesidad de obtener nanopartículas de AgBr con baja citotoxicidad.
20
Tabla 1. Resumen de trabajos relacionados a nanomateriales de AgBr, con distintas variables y efectos evaluados.
Nanomaterial Metodología Precursor Agente Reductor Agente Estabilizante
Variables Actividad Referencia
AgBr NPs Reducción química en microemulsión
AgNO3 Contraión de bromuro de dioctildimetilamonio en sistema de
Tiofenol Concentración de surfactante y cosurfactante, Cantidad AgNO3, Proporción molar agua:surfactante
_ Juan Vera et al., 2004 [17]
AgBr NPs Reducción química en microemulsión
AgBr en bulk Contraión de CTAB Tiofenol Agitación, temperatura, Concentraciones de CTAB y n-butanol y Proporción agua:surfactante
_ Juan Vera et al., 2005 [18]
AgBr NPs Reducción química en microemulsión
AgNO3 Contraión de CTAB en sistema de n-butanol, isooctano y agua
Tiofenol Concentración de surfactante y cosurfactante, Moles de AgNO3, Proporción molar agua:surfactante
_ Juan Vera et al., 2007 [19]
AgBr NPs Reducción química en microemulsión
Complejo CTASB
Contraión de CTAB CTAB Concentración de CTAB y Proporción molar CTAB:AgNO3
_ Xian-Hao Liu et al., 2007 [20]
Composito AgBr NP/polímero
Precipitación en sitio
Para-toluensulfonato de Plata (AgPTS)
Aniones Br- del polímero
Poli(4-vinilpiridina)-co-poli(bromuro
% de alquilación del polímero y Proporción iones de
Antibacterial contra B. cereus y S. aureus (Gram
Varun Sambhy et al., 2006 [21]
21
de 4- vinil-N-hexilpiridina), NPVP
Plata:iones bromuro del polímero
positivas) y E.coli y P. aeruginosa (Gram negativas)
AgBr NPs Reducción química AgNO3 Ión bromuro de CTAB CTAB Concentración de CTAB y Lavado de NPs con agua y cloroformo
_ Moumita Chakraborty et al., 2012 [22]
Composito AgBr NPs/PVP
Sol-gel y electrospinning
AgNO3 HBr PVP Cantidades AgNO3
_ Jie Ba et al., 2012 [23]
AgBr NPs Single jet AgNO3 KBr PVP Peso molecular de PVP, Proporción PVP:precursor y tiempo de adición de PVP
_ Marijana Jukić et al., 2012 [24]
AgBr nanocubos y Ag@AgBr NPs
Reducción química AgNO3 y NaBr NaBH4 para las Ag@AgBr NPs
PVP Obscuridad e irradiación de luz visible
Antibacterial contra E. coli
Zhouzhou Liu et al., 2015 [8]
AgBr y Ag NPs Reducción química AgNO3 KBr y NaBH4,
respectivamente
PEG, PVP, PVA y HEC
Polímeros Antimicrobiana contra 5 bacterias Gram +, 4 bacterias Gram – y 4 hongos
Petr Suchomel et al., 2015 [25]
AgBr-AgBr/CTAB nanomaterial
Deposición en fase líquida
Reactivo de Tollen y AgNO3
NH4OH CTAB Precursores: Reactivo de Tollen y AgNO3
Adsorción de colorantes orgánicos
Liang Tang et al., 2016 [26]
AgBr nanorods decorados con AgBr NPs
Reducción química AgNO3 NaBH4 CTAB Orden de adición de reactivos
_ Micheal Jose et al., 2016 [27]
22
b. Agentes estabilizantes
Los agentes estabilizantes actúan por medio de varios mecanismos, ya sea proveyendo
estabilidad electrostática (positiva y negativa), estérica, por fuerzas de hidratación, estabilidad
por reducción o por fuerzas van der Waals [28]. La elección del agente estabilizante utilizado
durante la síntesis de las nanopartículas es crucial, ya que puede influir en varias de sus
características como el tamaño, morfología, y demás propiedades que afectan la interacción
con su medio circundante [29]. En este trabajo, se realizó el estudio del efecto que manifiestan
tres de los tipos de estabilidades conferidas a las nanopartículas durante la síntesis. Los
agentes estabilizantes que en este trabajo se utilizaron fueron Polivinilpirrolidona (PVP),
Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB) y Dodecilsulfato de Sodio (SDS) y se estudió el
efecto que tuvieron sobre la morfología de las nanopartículas, su actividad antimicrobiana y
citotoxicidad que se evaluó sobre fibroblastos gingivales (un tipo de células dentales). En la
Fig. 2 se esquematiza la estabilidad que manifiesta cada uno de ellos. En los siguientes
incisos, se profundiza en algunas propiedades de cada uno de ellos.
Fig. 2 Tipo de estabilidad de los agentes estabilizantes: a) PVP, estérica; b) CTAB, electroestática positiva; c)
SDS, electrostática negativa.
i. PVP
El PVP es comúnmente utilizado como agente estabilizante y en algunas ocasiones como
agente direccionador en el crecimiento de nanoestructuras metálicas [9].
El PVP es un polímero voluminoso, no tóxico y no iónico con grupos funcionales: C=O, C–N
y CH2. La molécula contiene un grupo altamente hidrofílico (la parte pirrolidona) y uno
considerablemente hidrofóbico (el grupo alquilo) como se muestra en la Fig.3. Como
resultado de su grupo altamente polar y el grupo no polar, el PVP es fácilmente soluble en
agua y otros líquidos no acuosos. El PVP es buen agente estabilizador que previene la
agregación de las nanopartículas gracias a las fuerzas repulsivas que surgen de sus cadenas de
b) a) c)
23
carbono hidrofóbicas que se extienden hacia los solventes dándole un efecto de repulsión
estérica Fig.2 inciso a) [30].
Fig. 3 Molécula de PVP, polímero no iónico.
ii. CTAB
Una sustancia anfifílica exhibe doble afinidad, que desde el punto de vista fisicoquímico
puede verse como una dualidad polar/no polar. Una molécula anfifílica típicamente consiste de
dos partes: un grupo polar con grupos funcionales que contiene átomos como N, O, P o S y un
grupo esencialmente no polar que por lo general es una cadena de hidrocarburos del tipo
alquilo o alquilbenceno conteniendo en algunas ocasiones átomos de halógenos u átomos de
oxígeno no ionizados [31].
El CTAB es un surfactante catiónico que se disocian en el agua en un catión anfifílico y un
anión del tipo halógeno, Br-, su estructura molecular se esquematiza en la Fig. 4.
Fig. 4 Molécula de CTAB, surfactante catiónico.
Ha sido establecido que CTAB es el surfactante catiónico más común como agente
estabilizante/direccionador, responsable del crecimiento anisotrópico de algunos
nanomateriales en solución acuosa [16], ofreciendo estabilidad electroestática positiva, como
también se puede observar en la Fig. 2 inciso b).
24
iii. SDS
Por otro lado, el SDS es un surfactante aniónico que se disocia en un anión anfifílico y un
catión, siendo en este caso del grupo amonio, NH4+ como se puede ver en la Fig.5 [16],
confiriendo estabilidad electrostática negativa controlando así el crecimiento de las
nanopartículas durante su síntesis, como se puede observar en la Fig.2 inciso c).
Fig. 5 Molécula de SDS, surfactante aniónico.
3. Técnicas de caracterización
Como se mencionó anteriormente, las propiedades de superficie, fisicoquímicas, electrónicas,
mecánicas, magnéticas, termodinámicas, micro y biológicas de los nanomateriales son reflejo
de las características intrínsecas de composición química, física y eléctrica, por ejemplo,
cristalinidad (planos cristalográficos, etc.), tamaño, morfología, composición, características
eléctricas, conductividad eléctrica, térmica, etc. De aquí la importancia de caracterizar
cabalmente los materiales sintetizados para lograr dilucidar más claramente las relaciones
entre sus características y sus propiedades facilitando su diseño y método de síntesis. A
continuación, se describen brevemente las técnicas de caracterización utilizadas en este trabajo
para conocer las nanopartículas de AgBr sintetizadas.
a. Difracción de Rayos-X
La difracción de rayos-X (XRD, por sus siglas en inglés) es una técnica no destructiva
utilizada para analizar las características cristalinas de los materiales tales como cristales,
metales, cerámicas, minerales, nanomateriales y otros, para identificar su estructura.
Las características cristalinas de los nanomateriales como el sistema cristalino, los parámetros
de la red cristalina, fase cristalina, tamaño y distribución de cristal, planos cristalinos
preferenciales, disponibilidad de sitios activos, entre otras, y su combinación específica son
propios de cada material, y pueden conferir propiedades muy específicas o aumentadas
(catalíticas, electrónicas, fotónicas, de imagenología, biológicas y demás).
25
El principio de esta técnica se basa en la observación de la intensidad dispersada de un haz de
rayos-X que inciden sobre una muestra, en función del ángulo de incidencia y de dispersión,
polarización y longitud de onda o energía.
Las intensidades del haz de rayos-X difractado son detectadas, procesadas y contadas para
obtener el espectro de difracción. El difractograma provee dos tipos de información única para
cada material cristalino: las posiciones de los picos (correspondiente a la distancia interplanar
de acuerdo a la ley de Bragg) y la intensidad relativa de los picos. El grosor de los picos se
relaciona al tamaño de los cristales submicrométricos a través de la ecuación de Scherrer. Las
reflexiones también se pueden comparar con las fichas cristalográficas de los parámetros de
materiales conocidos [65–68].
b. Microscopía de Transmisión Electrónica
La Microscopía de Transmisión Electrónica (TEM, por las siglas derivadas de Transmission
Electron Microscopy en inglés) es otra técnica que se utiliza para la caracterización de
materiales, que posee un alcance desde atómico, pasando por nanométrico (1~100 nm), hasta
micrométrico y más. Los microscopios de transmisión de electrones utilizan un haz de
electrones para la penetración y observación de muestras delgadas, a diferencia de los
microscopios ópticos que utilizan luz visible, cuya resolución está limitada por su longitud de
onda. La resolución de un TEM se puede aproximar con la ecuación dada por ~1.22 λ/β
(donde λ es la longitud de onda de la radiación y β el semiángulo de colección del lente de
magnificación). La utilización de electrones permite el análisis de su difracción para dilucidar
las características cristalográficas de los nanomateriales, cuya modificación puede resultar en
cambios fenomenológicos de éstos y por ende afectar su actividad y aplicación real.
Asimismo, TEM es utilizado para visualizar la forma, tamaño, estructura y dispersión de los
nanomateriales [9] [32], pero a diferencia de XRD, con resolución a nivel atómico [33].
Lograr una caracterización tan detallada de los nanomateriales, no solo nos permite conocer
sus propiedades morfológicas, sino también nos guía para perfeccionar las técnicas de síntesis.
26
c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo
En Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo (FE-SEM, derivado de sus
siglas en inglés) el haz de electrones de barrido es más angosto con baja y alta energía de
electrón, por lo que provee una mejor resolución espacial mientras que minimiza el daño a las
muestras (en comparación con SEM). Su lente provee información topográfica con 250–
1,000,000 magnificaciones. FE-SEM se emplea en la caracterización física de las
nanopartículas para determinar dispersión y agregación, morfología, tamaño y distribución de
tamaño de partícula [34].
Además, el cañón de electrones de emisión de campo es la fuente de partícula más brillante en
toda el área de la física, por lo que la microdifracción de electrones produce la señal más
intensa a partir del volumen más pequeño de materia en todas las ciencias [33].
d. Espectroscopía de Dispersión de Energía
En Microscopía de Barrido de Electrones (SEM) se hace uso de un haz enfocado de electrones
de alta energía para generar distintas señales en la superficie de las muestras sólidas como las
nanopartículas. Los electrones incidentes también expulsan electrones fuera de la muestra,
resultando en la formación de “huecos” cargados positivamente en las bandas ocupadas. Estos
“huecos” atraen electrones desde niveles más elevados. Este movimiento de electrones hacia
los “huecos” resulta en la emisión de rayos-X. La energía de estos rayos-X es característica y
única para los átomos, en este caso, constituyentes de las nanopartículas. La Espectroscopía de
Dispersión de Energía de rayos-X (EDS o EDX) detecta los rayos-X emitidos desde la muestra
para realizar una caracterización de su composición elemental [34].
e. Análisis Termogravimétrico - Calorimetría Diferencial de Barrido
El Análisis Termogravimétrico es una técnica que mide los cambios de masa (de pérdida o
ganancia) de una muestra sometida a un proceso programado de inducción de temperatura en
ascenso con una velocidad de calor (heat rate) de, por lo general, 1-20 °C/min dentro de un
rango de temperatura también establecido. Este análisis se puede correr bajo una atmósfera
gaseosa controlada, ya sea de gas inerte como nitrógeno, argón o helio o de gas reactivo
(oxígeno, hidrógeno, bióxido de carbono, entre otros) o aire. Las pérdidas de masa se pueden
27
deber a la degradación y/o descomposición, vaporización de líquidos adsorbidos, sublimación,
reducción de óxidos metálicos en metales o la desorción de gases. Las ganancias de masa se
pueden adjudicar a la adsorción de gases o a reacciones de los sólidos con los gases como el
oxígeno, cloro o monóxido de carbono, incluida la combustión [35].
Los termogramas obtenidos son característicos de compuestos específicos dadas las reacciones
fisicoquímicas únicas que ocurren para ellos a lo largo de ciertos rangos de temperatura
específicos, siempre y cuando se tenga una idea de la composición aproximada de la muestra
(cuando este análisis no está acoplado a ninguna otra técnica de caracterización).
En Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC, de Differential Scanning Calorimetry), el calor
liberado de un proceso químico, ya sea de una reacción química o alguna alteración
conformacional, es registrado a partir de la muestra y del control colocados en cámaras
separadas. A partir de aquí se determina el calor de reacción o ΔrH [34]. Siendo esto válido
para equipos con configuración de doble cámara u horno. Sin embargo, existen equipos con
una sola cámara que operan bajo el diseño de Boersma, donde las diferencias de temperatura
se miden directamente de la muestra y no de la compensación de calor que el equipo realiza en
la doble cámara para igualar la temperatura con la referencia.
Por convención, de acuerdo a la técnica del instrumento en uso, se ha establecido que en los
DSC derivados de equipos con doble cámara (heat flow), los picos endotérmicos (para los
fenómenos que requieren energía) apuntan hacia arriba porque el equipo necesita suplir
energía para mantener el equilibrio de temperatura entre las dos cámaras; y en los DSC de una
sola cámara (heat flux), estos mismos fenómenos provocan que la muestra absorba calor o se
enfríe en relación al horno, entonces los picos apuntan hacia abajo. E igual para los picos
exotérmicos cuando se libera energía [36].
f. Potencial Zeta
Las partículas (sólidos con tamaño de 1 nm-1000 nm) en solución coloidal (heterogénea de
dos fases inmiscibles), coloides, tienen una carga eléctrica negativa o positiva que producen
fuerzas de repulsión electrostática con otros coloides vecinos y con los iones de la solución
(medio de dispersión). Dada la alta proporción área superficial:volumen característica de las
nanopartículas dispersas, el área interfacial total resulta muy grande, y en consecuencia, la
28
interacción entre las dos fases es muy importante porque esto afecta las propiedades físicas del
coloide, las reacciones químicas del sistema y su estabilidad [37]. De aquí se deriva la
necesidad de conocer en relación a la solución el potencial eléctrico que se produce entre el
coloide y su atmósfera cargada contrariamente. El Potencial Zeta (ζ) indica cambios en el
potencial de la superficie y en las fuerzas de repulsión entre los coloides donde se unen la capa
Stern (capa adyacente al coloide) y la capa difusa (capa de contra iones aún repelidos por la
capa Stern) [38].
g. Espectroscopía de Absorbancia de Luz UV-Vis
Los electrones exhiben una frecuencia de vibración natural de acuerdo a su energía de orbital.
Cuando los electrones se encuentran con una frecuencia de onda de luz igual a la suya,
absorben energía y adquieren un movimiento vibratorio. Los electrones en movimiento
interactúan con sus electrones vecinos y convierten la vibración en calor de energía. De aquí
que la espectroscopia de absorción se refiere a la medición de la absorción de luz en función
de la longitud de onda de luz UV-Vis [34].
Sin embargo, para los nanomateriales es necesario tomar ciertas consideraciones, ya que como
es sabido, su proporción área superficial/átomos disponibles:volumen es mayor a su
contraparte en bulk, por lo que la absorbancia es variable dependiendo del tamaño, morfología,
agregación, etc. de partícula u otras características como las que manifiestan algunos
nanomateriales metálicos con plasmón superficial.
29
SECCIÓN 3. Microbiología y biología celular
Las propiedades de las nanopartículas de AgBr probadas en este trabajo se encuentran en las
áreas de microbiología y biología celular, se realizó la observación del efecto en su actividad
antimicrobiana y citotóxica, respectivamente, en relación al agente estabilizante empleado
durante su síntesis.
La superficie celular micro y macro-biológica cumple dos funciones esenciales: mantener la
integridad de la célula y ser el punto primordial de contacto con el entorno. Es el punto de
contacto entre huésped-hospedero (patógeno o no), con los anticuerpos, con los antibióticos,
con las superficies de su ambiente circundante, etc. [39] y en nuestro caso, también es el
principal punto de contacto con las nanopartículas. Derivándose de aquí la importancia de
comprender las estructuras celulares.
1. Microbiología
Tal como es importante conocer las características de las nanopartículas para entender sus
propiedades, también lo es el conocer la estructura celular de los microorganismos sobre los
que se probaron las propiedades de las AgBr NPs para así comprender su interacción, causas y
efectos.
A continuación, se presenta una breve reseña sobre la biología de estos microorganismos.
a. Bacterias Gram positivas y Gram negativas
Todas las células están formadas por cuatro tipos de componentes químicos o
macromoléculas: proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y polisacáridos. La naturaleza química y
la disposición de las macromoléculas de una célula de un organismo es lo que las diferencia de
una célula de otro organismo. A grandes rasgos, la diferencia entre una bacteria Gram positiva
y una Gram negativa es su pared celular; en el primer caso, ésta está constituida por una
membrana citoplasmática (bicapa lipídica) y una capa relativamente gruesa de peptidoglicano,
en el segundo caso, la pared celular está conformada por una membrana citoplasmática, una
capa relativamente delgada de peptidoglicano ubicada en el periplasma y una membrana
externa de lipopolisacáridos y proteínas, como se observa en la Fig. 6.
30
Fig. 6 Diferencias estructurales en la pared celular de bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La distinción entre las bacterias Gram positivas y las Gram negativas se deriva de una técnica
de tinción realizada en laboratorio que consta del seguimiento una metodología de coloración
y decoloración con colorantes orgánicos que presentan afinidad por determinados
componentes celulares, algunos están cargados positivamente y se combinan fuertemente con
los constituyentes celulares cargados negativamente como los polisacáridos ácidos. Estos
colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Después de
terminada la tinción diferencial, las bacterias Gram positivas aparecen de color morado
mientras que las negativas presentan color rojo debido a que el alcohol utilizado en un paso de
la técnica es capaz de decolorar las células Gram negativas, pero no las positivas [40].
En este trabajo se eligió una bacteria representativa de cada tipo, Escherichia coli como
bacteria Gram negativa y Staphylococcus aureus como bacteria Gram positiva, ambas
patógenas en condiciones propicias para su proliferación.
b. Levaduras
Además de las bacterias, también se trabajó con Candida albicans, una levadura. Las
levaduras son hongos unicelulares mucho más grandes que las bacterias [40]. La composición
química de la pared celular fúngica, al igual que la pared celular bacteriana que también son de
superficie aniónica está conformada de polisacáridos. Las paredes están compuestas
mayormente por manoproteínas y glucano, como se muestra en la Fig.7. La quitina es un
carbohidrato polímero que también se encuentra en menor proporción, pero contribuye a la
insolubilidad de las fibras. En la superficie externa de la pared se encuentran las
manoproteínas que están altamente glicosiladas con O y N [41].
31
Fig. 7 Esquema de la pared celular de una levadura.
c. Mecanismo de acción antimicrobiana
De acuerdo a la literatura, las AgBr NPs liberan iones de Ag+ que interactúan con las células
induciendo perturbaciones en su función biológica y daño celular [8].
Existen varias propuestas para esclarecer el mecanismo acción que los nanomateriales de Plata
dirigen para ejercer su actividad antimicrobiana, entre todas ellas y a grandes rasgos, se
sugiere que los iones de Plata interaccionan con las proteínas de la membrana, afectan su
permeabilidad, bloquean la cadena respiratoria y transferencia de electrones y, cuando los
cationes logran penetrar dentro de las células, éstos tienen afinidad por el ADN, proteínas
intracelulares, producen ROS e incitan apoptosis (muerte celular programada) [42] [34] [43]
[44] [45].
d. Técnicas para la evaluación de actividad antimicrobiana
Siendo la nanociencia relativamente joven, sobre todo la aplicación biológica de los
nanomateriales, las técnicas para la evaluación de su actividad antimicrobiana aún no han sido
estandarizadas en su totalidad; sin embargo, el instituto internacional Clinical and Laboratory
Standards Institute y al European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases
(ESCMID) han estandarizado la metodología para determinar in vitro la susceptibilidad de
microorganismos a antibióticos convencionales y para confirmar el desarrollo de resistencia a
ellos, estos mismos protocolos son los más comúnmente utilizados para la determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Bactericida (CMB), mismos que también son
aplicados en nanomateriales. La magnitud de ellas determina la dosis requerida para el efecto
32
inhibitorio/biocida de las AgBr NPs, en los siguientes incisos se presentan sus definiciones
[46] [47].
i. Concentración Mínima Inhibitoria
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) es una herramienta de investigación para
determinar la susceptibilidad in-vitro de los microorganismos ante los agentes antimicrobianos
nuevos; y, por definición, se describe como la concentración más baja a la cual se inhibe el
crecimiento microbiano visible (en relación a turbiedad) después de un ciclo de incubación
[46] [47] [48].
ii. Concentración Mínima Biocida
La Concentración Mínima Biocida (CMB) es la concentración mínima que, no solamente
inhibe el crecimiento microbiano, sino que provoca la muerte del 99.9% de la población
microbiana inicial. Se determina a partir de una adaptación de la metodología para determinar
la CMI; en este caso, después de seguir dicho protocolo, se recultivan las muestras en un
medio libre de agente antimicrobiano, se vuelve a incubar durante otro ciclo y se debe cumplir
que no haya crecimiento microbiano en lo absoluto medido en presencia o ausencia [48] [49].
iii. Observación microscópica
La obtención de imágenes micrográficas claras es difícil por el gran contenido de agua de las
células. Al tratar de deshidratar las muestras para que sea posible su observación por FE-SEM,
las fuerzas de tensión superficial causan daño estructural a las células, por lo que es importante
tomar esto en cuenta para lograr una preparación adecuada. Existen varios métodos de
preparación y los más comunes son secado al aire, secado al punto crítico y por liofilización.
En este trabajo, se implementó la técnica de secado al aire utilizando cultivos frescos en fase
de crecimiento, evitando las fases de muerte y muestras sobre cultivadas.
La técnica de secado al aire se basa en el uso de Hexametildisilazane (HMDS), un compuesto
orgánico altamente volátil, seguido de deshidrataciones con etanol mediante concentraciones
aumentadas gradualmente para remover el agua de las células hasta que ésta sea reemplazada
33
totalmente por el alcohol. Previo al uso de HMDS, se realiza una fijación primaria de las
muestras con Glutaraldehído. El Glutaraldehído posee grupos aldehído los cuales se
entrecruzan molecularmente, ayudando a la preservación estructural de las muestras para ser
observadas por microscopía [50] [51] [52].
En las micrografías tomadas de las muestras se puede observar el daño ocasionado a la
integridad de las células y la liberación de polisacáridos u otros componentes intracelulares, o
en caso contrario, se observa la conservación estructural sin rotura alguna.
2. Biología celular
Tal como resulta importante conocer la estructura celular de los microorganismos, también lo
es la estructura de las células animales utilizadas para probar la toxicidad de las nanopartículas
de AgBr en este trabajo.
a. Fibroblastos gingivales
Una de las aplicaciones propuestas para las nanopartículas de AgBr es en medicina oral como
agente antimicrobiano para microorganismos causantes de infecciones, sin embargo, la co-
exposición a células y tejidos adyacentes debe tenerse en cuenta y estudiarse su efecto en ellos.
Los fibroblastos gingivales son células mesenquimales (células estromales o madre con
funciones específicas con la habilidad de auto-regeneración) de tejidos periodontales. Son
responsables de gran parte de la síntesis de la matriz extracelular en tejidos conectivos y
desempeñan un papel importante en la cura de heridas. Los fibroblastos son de las células
mamíferas de mayor acceso y uno de los tipos más fáciles de cultivar. Los fibroblastos
dentales son los principales constituyentes del tejido gingival y son importantes para su
mantenimiento [53] [54].
b. Citotoxicidad
La citotoxicidad (capacidad de resultar tóxico para las células) de los reactivos químicos y
partículas depende de sus propiedades fisicoquímicas y de sus interacciones con los sistemas
biológicos; sin embargo, reiterando que la actividad de los nanomateriales no es como la de
34
sus contrapartes másicas, no se puede comparar entre ellos. De hecho, existen resultados
contradictorios donde algunos nanomateriales son altamente tóxicos, otros poco tóxicos, otros
inertes y otros que incluso manifiestan hormesis (fenómeno biológico donde a bajas dosis un
agente puede resultar benéfico cuando de lo contrario, a altas dosis se puede considerar tóxico
o letal). Además, tampoco existen índices comunes para medir toxicidad provocada por
nanomateriales. Por esta razón, la toxicidad de cada nanomaterial debe ser probado en las
células que serán expuestas a las dosis concordantes con las concentraciones mínimas
inhibitorias de los microorganismos causantes de infecciones sobre esas mismas células.
Debido a la infinidad de nanopartículas, sus mecanismos de citotoxicidad pueden igualmente
ser muy variables, pero dependiendo de su modo de exposición, se pueden englobar en
toxicidad localizada o sistémica posiblemente debido al estrés oxidativo que induce
inflamación, una respuesta inmunológica, fibrogénesis y remodelación de tejido, coagulación
sanguínea, daño vascular, neurotoxicidad y genotixicidad.
En el caso de las nanopartículas de AgBr sintetizadas en este trabajo, únicamente se estudió su
citotoxicidad bajo el enfoque de viabilidad en relación al agente estabilizante empleado para
su síntesis.
c. Ensayo del MTT
Para lograr evaluar la citotoxicidad de cualquier agente (antibiótico, químico, nanomaterial,
etc.) sobre líneas celulares, se recurre al Ensayo del MTT que es una técnica utilizada para
medir la viabilidad y proliferación celular. Esta técnica se basa en la reducción enzimática del
colorante salino Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) a través de
una enzima deshidrogenasa que genera equivalentes reductores como el NADH y NADPH. El
MTT inicial tiene una coloración amarilla que después de ser reducido a formazán se torna
púrpura que puede ser medido por espectrofotometría.
Por otro lado, cuando las células han sufrido daño, apoptosis, necrosis u algún fenómeno que
impida su proliferación normal, no se conservan las células sanas o vivas para llevar a cabo la
reducción del MTT. La relación número de células:señal producida (absorbancia) es lineal, por
lo que resulta en una cuantificación acertada sobre la viabilidad celular y por ende, la
citotoxicidad del material evaluado [55] [56].
35
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA
36
37
Metodología general
La metodología general de este proyecto se esquematiza en la Fig. 8 En primera instancia, se
realizaron las síntesis de las nanopartículas de AgBr considerando al agente estabilizante como
el único factor variable. Posteriormente, se llevó a cabo su caracterización mediante XRD,
TEM, FE-SEM, EDS, TGA-DSC, Potencial ζ y UV-Vis. Una vez preparados los materiales, se
procedió a evaluar su actividad antimicrobiana sobre Escherichia coli (Gram negativa),
Staphylococcus aureus (Gram positiva) y Candida albicans (levadura) mediante la
determinación de su CMI, así como a través de la observación visual del daño celular
manifestado mediante micrografías FE-SEM; simultáneamente se realizó la evaluación de
citotoxicidad sobre fibroblastos gingivales.
Fig. 8 Metodología del proyecto.
Síntesis de Nanopartículas
Caracterización
Evaluación Actividad
Antimicrobiana
Observación Microfotográfica
Evaluación Citotoxicidad
38
1. Síntesis de las nanopartículas de AgBr
La síntesis de las nanopartículas de AgBr se llevó a cabo en las instalaciones del Centro de
Investigación y Desarrollo Tecnológico (CIDETEQ), subsede Tijuana. En este trabajo se
siguió un método de reducción química en fase acuosa basado en una adaptación de la
metodología de síntesis de nanopartículas cúbicas de Pd [57]. La metodología modificada se
basa en la reducción de la sal metálica AgNO3 y NaBr mediante ácido ascórbico en fase
acuosa a temperatura fija de 80 °C mantenida a reflujo constante y agitación durante 4 h
seguida de un periodo de maduración durante la noche sin calor aplicado; la nucleación y
agregación y crecimiento de las nanopartículas se controló por los agentes estabilizantes PVP,
CTAB y SDS. El efecto de estos agentes estabilizantes como variables sobre la morfología,
actividad antimicrobiana y citotoxicidad sobre fibroblastos fue el objetivo de investigación de
este trabajo. En el diagrama que se muestra en la Fig. 9, se indican los reactivos empleados en
el proceso de síntesis de las nanopartículas de AgBr.
La estructura química y demás información relativa a los agentes estabilizantes se presentó
anteriormente en la Sección II.
Fig. 9 Reactivos empleados en la síntesis de las AgBr NPs
Precursores:
AgNO3
NaBr
Medio:
Agua
Agente reductor suave:
Ácido ascórbico
Agentes
estabilizantes:
PVP
CTAB
SDS
39
REACTIVOS
• Nitrato de Plata (AgNO3), JT Baker, pureza al 99%,
• Bromuro de sodio (NaBr), JT Baker, pureza al 99.5%,
• Ácido ascórbico, Faga Lab, pureza al 99%,
• Dodecil sulfato de sodio (SDS), ACTOS, pureza al 85%,
• Polivinilpirrolidona (PVP), Sigma Aldrich 40,000 PM y
• Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB), FLUKA, pureza al 96%.
Todos los reactivos se utilizaron como se recibieron sin purificación adicional. El nitrato de
Plata se mantuvo protegido de la luz en un frasco ámbar cubierto por aluminio debido a su
fotosensibilidad. Se utilizó agua desionizada obtenida por un sistema Milli-Q (Millipore
Corporation®) para todas las reacciones de síntesis y lavados subsecuentes. Para este último
propósito también se utilizó alcohol isopropílico y etanol puro. Los agentes estabilizantes se
manejaron con cuidado resguardándolos de la humedad lo más posible dada su propiedad
higroscópica.
No se prepararon soluciones stock, todos los reactivos se prepararon al momento y utilizados
en una sola corrida. La metodología de síntesis se describe en los siguientes pasos:
• Paso 1. Se pesan 0.1000 g (sin exceder ± 0.0004 g) del agente estabilizante y se disuelven
en 5 mL de agua desionizada; y 0.0230 g (sin exceder ± 0.0004 g) de ácido ascórbico en 3
mL de agua; se someten a baño ultrasónico para su efectiva solubilización y,
posteriormente se mezclan entre sí e incorporan al sistema de síntesis que se visualiza en la
Fig. 10 donde se muestra un esquema. Para su calentamiento a 80 °C con agitación
magnética constante.
Fig. 10 Esquema del sistema de síntesis.
40
• Paso 2. Durante el tiempo necesario para que la solución del paso anterior alcance la
temperatura adecuada y estable, se pesan 0.2500 g NaBr (sin exceder ± 0.0004 g) y se
disuelven en 2 mL de agua desionizada; al igual que 0.0500 g de AgNO3 (sin exceder ±
0.0004 g) en 1 mL y se solubilizan en baño ultrasónico.
• Paso 3. Una vez alcanzados los 80 °C de la solución del Paso 1, se mezclan las dos
soluciones del Paso 2 e instantáneamente se adicionan al sistema de síntesis del Paso 1.
para su incorporación a la solución bajo calentamiento.
• Paso 4. La reacción es mantenida durante 4 horas, vigilando que la temperatura no fluctúe
y que la agitación no sea interrumpida. Una vez cumplido el tiempo establecido, se
eliminan la inducción de calor y agitación y se permite un periodo de reposo durante la
noche. Las muestras de síntesis (SDS, PVP y CTAB, respectivamente) obtuvieron las
coloraciones que se muestran en la Fig. 11; sin embargo, ésta no hace justicia a las
coloraciones observadas en vivo, siendo las observadas en la realidad de izquierda a
derecha: gris claro lechosa, morado lavanda lechosa y amarillo pardo lechosa.
Fig. 11 Coloraciones de las soluciones de síntesis con PVP, CTAB y SDS.
• Paso 5. Al día siguiente, se retira la solución del sistema y se realizan los lavados de las
nanopartículas. Se someten a un proceso de centrifugación a 4,000 rpm durante 20 minutos
y se descarta el sobrenadante. Se repite esta operación por lo menos 6 veces con agua y
alcohol isopropílico (también con etanol para la síntesis con CTAB ya que a simple vista
resulta mucho más turbio que con los demás agentes estabilizantes) re-dispersando las
muestras en baño ultrasónico entre un lavado y otro.
• Paso 6. Se secan las muestras en horno de convección a la misma temperatura de síntesis,
80 °C, hasta obtener polvos secos. Posteriormente, se pulverizan en mortero de ágata para
posterior caracterización.
41
2. Caracterización de las nanopartículas de AgBr
La caracterización mediante XRD, TEM, FE-SEM, TGA-DSC y UV-Vis de los
nanomateriales sintetizados se realizó en las instalaciones del Centro de Investigación de
Materiales Avanzados (CIMAV), sede Chihuahua, mientras que el EDS y Potencial ζ se
determinaron en el Centro de Investigación y Desarrollo Tecnológico en Electroquímica
(CIDETEQ), subsede Tijuana, Fig 12.
Fig. 12 Instalaciones de CIMAV y CIDETEQ-Tijuana.
a. Difracción de Rayos-X
La fase cristalina de las nanopartículas se determinó mediante la interpretación de los
espectros de Difracción de Rayos-X, los cuales se obtuvieron a través del equipo Bruker, D8
Advance mostrado en la Fig. 13. Las muestras en polvo sin previa preparación se colocaron
directamente sobre su portamuestras. El difractómetro se operó con radiación de Cu-Kα1 (λ =
1.541874 Å) de 2θ = 20.000° a 99.950° a intervalos de 0.050°, a 40 kV y 200 mA.
Fig. 13 Equipo de XRD, Bruker, D8 Advance
42
b. Microscopía de Transmisión Electrónica
Las muestras de nanopartículas se dispersaron en alcohol isopropílico; una gota se colocó en
rejillas convencionales de cobre recubiertas de carbón y se dejaron secar bajo el calor de un
foco incandescente. Las micrografías se tomaron mediante el microscopio electrónico de
transmisión TEM, HITACHI, HT7700 (Fig. 14) para observar las morfologías y medir los
tamaños de partícula.
Fig. 14 Equipo TEM, HITACHI, HT7700.
c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo
Para observar la morfología de las nanopartículas de AgBr sintetizadas con los tres distintos
agentes estabilizantes, CTAB, SDS y PVP, se utilizaron las mismas muestras que se
prepararon sobre rejillas para la caracterización mediante TEM. Las muestras se observaron
por microscopía electrónica de barrido de emisión de campo, FE-SEM con un equipo JEOL
JSM-7401F operado a 5Kv, Fig. 15.
Fig. 15 FE-SEM, JEOL JSM-7401F
43
d. Espectrometría de Dispersión de Energía
Para realizar el análisis de la composición elemental de las nanopartículas, se recurrió a la
espectrometría de dispersión de energía (EDS, por sus siglas en inglés). Las muestras se
analizaron en polvo directamente sin previa preparación en un equipo SEM, ZEISS EVO-
MA15, Fig.16.
Fig. 16 SEM, ZEISS EVO-MA15
e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido
El Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido se realizó con un equipo
TA Instruments, SDT˗Q600 (Fig. 17) que se corrió dentro de un intervalo de temperatura de
200 a 1400 °C a una tasa de calentamiento de 10 °C/min con flujo de aire de 100 cc/min. Las
muestras no se sometieron a una preparación previa, los polvos se analizaron como tal.
Fig. 17 Equipo de TGA˗DSC, TA Instruments, SDT˗Q600
44
f. Potencial Zeta
El potencial Zeta de cada material, AgBr NPs (CTAB, SDS y PVP), se midió a las mismas
concentraciones que se probaron para determinar la concentración mínima inhibitoria, cuya
preparación se indica más detalladamente en el apartado correspondiente 3: Actividad
antimicrobiana que se presenta más adelante en este capítulo de metodología. Se utilizó un
equipo Horiba Scientific, SZ˗100, Fig. 18. para medir potencial Zeta.
Fig. 18 Equipo para medir Potencial Zeta, Horiba Scientific, SZ˗100
g. Espectrometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis
Se dispersaron 3 mg/mL de cada muestra de nanopartículas de AgBr sintetizadas con los
agentes estabilizantes variables (CTAB, SDS y PVP) empleando baño ultrasónico durante 3 h
para obtener los espectros de absorbancia a través de un espectrofotómetro Thermo Scientific,
Varioskan Lux (Fig. 19) corrido dentro de un rango de longitud de onda de 200 a 700 nm.
Fig. 19 Espectrofotómetro Thermo Scientific, Varioskan Lux
45
3. Actividad antimicrobiana
Posterior a la caracterización fisicoquímica de las nanopartículas de AgBr sintetizadas con
agente estabilizante variable, se procedió a evaluar sus propiedades micro y biológicas.
REACTIVOS
• Soya Tripticaseína, caldo, BD BBL, lote 0238269
• Soya Tripticaseína, agar, MCD LAB, lote 717215C004
• Papa Dextrosa, caldo, HIMEDIA, lote 0000242827
• Papa Dextrosa, agar, MCD LAB, lote 704215D001
• Glutaraldehído 25% peso en H2O, SIGMA-ALDRICH
• Hexametildisilazane, HMDS ((CH3)3SiNHSi(CH3)3), SIGMA-ALDRICH, pureza ≥ 99%
a. Determinación de la CMI
La concentración mínima inhibitoria (CMI) es una herramienta de investigación para
determinar la susceptibilidad in-vitro de los microorganismos ante los agentes antimicrobianos
nuevos; y, por definición, se describe como la concentración más baja a la cual se inhibe el
crecimiento microbiano visible después de un ciclo de incubación. Esta metodología consiste
en preparar tubos seriados, con medio de cultivo inoculado con una suspensión estandarizada
del microorganismo bajo prueba, a los que se les añaden concentraciones descendentes de la
dispersión de las NPs y se incuban durante la noche a 35 ± 2 °C [12]. Para tal propósito, se
siguió la metodología estándar de macrodilución en caldo de cultivo publicada por la
organización internacional Clinical and Laboratory Standards Institute y el estándar ISO
20776-1:2006. Los pasos que se siguieron son los que se presentan a continuación:
46
• Paso 1. Preparación de dispersiones stock del agente antimicrobiano
El rango de dispersión que se preparó fue de 500 – 3.9 μg/mL para evaluar el rango final de
250 – 2 μg/mL de AgBr NPs. Se pesaron 1000 μg (sin exceder ± 100 μg) de nanopartículas de
AgBr y se dispersaron en 1 mL de solución salina al 9% estéril (Baxter, grado uso médico); a
partir de esta dispersión se realizaron 8 diluciones seriadas o geométricas, traspasando 0.5 mL
al siguiente tubo que ya contenía 0.5 mL de solución salina pura y así sucesivamente para
obtener las concentraciones finales de: 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.8 y 3.9 μg/mL, como
se ejemplifica en la Fig. 20.
Fig. 20 Metodología de diluciones seriadas.
• Paso 2. Preparación del inóculo
Se utilizaron los microorganismos Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus
ATCC 25923 y Candida albicans aislada de paciente con estomatitis subplaca previamente
diagnosticada clínicamente para probar la actividad antimicrobiana de las AgNPs. Donde el
acrónimo ATCC representa la American Type Culture Collection, la colección americana de
cultivos tipo. Las bacterias se crecieron en medio de cultivo Soya Tripticaseína caldo;
mientras que, la levadura en Papa Dextrosa caldo, durante un ciclo de 16 h a 35 ± 2 °C para
posteriormente realizar el ajuste de concentración de inóculo con caldo estéril. Las
concentraciones de los inóculos se obtuvieron en relación a la Densidad Óptica (D.O.) medida
por espectrofotometría a una longitud de onda de λ = 600 nm para las bacterias y λ = 520 nm
para la levadura, haciendo uso de un equipo Spectronic Instruments, SPECTRONIC 20D+.
Las concentraciones iniciales de los inóculos se muestran en la Tabla 2. en relación a cada
material de AgBr NPs sintetizado con agente estabilizante CTAB, SDS o PVP,
respectivamente, y a cada microorganismo probado.
47
Tabla 2. Concentraciones microbianas de los inóculos.
Microorganismo
Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans
Agente
Estabilizante
Conc.
[UFC/mL]
D.O.
[ua]
Conc.
[UFC/mL]
D.O.
[ua]
Conc.
[UFC/mL]
D.O.
[ua]
CTAB 1.4 × 106 0.129 9.4 × 106 0.046 7.2 × 105 0.207
SDS 1.7 × 109 0.051 2.7 × 107 0.046 1.7 × 106 0.045
PVP 1.7 × 107 0.050 1.3 × 107 0.046 2.1 × 106 0.051
UFC = Unidades formadoras de colonias
ua= unidades arbitrarias.
• Paso 3. Inoculación e incubación
Dentro de los próximos 15 minutos después de ajustar la concentración del inóculo en el Paso
2., se procedió a mezclar 1 mL de éste con 1 mL de cada una de las 8 diluciones seriadas del
Paso 1., como se muestra en la Fig. 21, llegando así a un rango final de concentración de
suspensión de AgBr NPs de 250 – 2 μg/mL y una dilución 1:2 de la concentración del inóculo
final. Para el control de calidad negativo, se sustituyó el mililitro de suspensión de
nanopartículas por 1 mL de caldo de cultivo estéril (la concentración del inóculo resultó en
una dilución de 1:2 también); mientras que, para el control de calidad positivo, se utilizaron
solamente 2 mL de caldo cultivo estéril sin exposición a nanopartículas ni a microorganismos.
Las muestras se incubaron durante 24 h a 35 ± 2 °C. Todas las pruebas se realizaron por
triplicado.
Fig. 21 Inoculación de las dispersiones de los agentes antimicrobianos.
48
b. Determinación de la CMB
Continuando con la metodología para la determinación de la CMI, se prosigue
ininterrumpidamente al proceso para la determinación de la CMB. Una vez finalizado el
período de incubación del Paso 3., se siembra de nuevo cada muestra en medio de cultivo agar
estéril de Soya Tripticaseína o Papa Dextrosa libre de agente antimicrobiano, según sea el
caso, en cajas Petri, como se muestra en la Fig. 22, y se incuba nuevamente para determinar la
concentración donde no hay crecimiento microbiano; incluidos los controles correspondientes.
Fig. 22 Resiembra en medio de cultivo libre de agente antimicrobiano.
c. Observación microfotográfica
Para observar las muestras bajo el microscopio FE-SEM, las muestras se fijaron a través de la
siguiente metodología:
• Paso 1. Se siguió la metodología para la determinación de la CMI delineada anteriormente,
pero con tres excepciones. 1) Dado que ya se conocen las CMIs, no se trabajó con las 8
diluciones seriadas, sino con la concentración anterior a la CMI determinada, esto con la
finalidad de permitir la suficiente colonización (crecimiento) de los microorganismos hasta el
grado de ser posible observarlos, pero que al mismo tiempo presenten cierto grado de daño
ocasionado por las AgBr NPs. 2) Otra excepción fue el volumen de trabajo, escalándose éste
hasta los 50 mL para lograr tener un pellet suficientemente grande. 3) La última excepción fue
el tiempo de incubación, siendo éste solamente durante la noche y no de 24 h.
• Paso 2. Posteriormente, se centrifugaron las muestras a 7,000 rpm durante 10 min, se
descartó el sobrenadante y el pellet formado se re-suspendió con 100 μL de glutaraldehído al
5% preparado con solución amortiguadora de fosfato 0.025 M, pH = 7.2. Después de un
periodo de contacto de 30 min, se centrifugó nuevamente y se descartó el sobrenadante.
49
• Paso 3. A continuación, se realizaron dos lavados re-suspendiendo el pellet con la solución
amortiguadora de fosfato, permaneciendo en contacto durante 10 min a baño de hielo en cada
ocasión, se centrifugó y descartó el sobrenadante nuevamente.
• Paso 4. En seguida, se realizó la deshidratación de las muestras realizando lavados con
alcohol etílico a concentraciones ascendentes de 10, 30, 50, 70, 80, 90 y 95% hasta llegar al
grado absoluto, permaneciendo en contacto con cada concentración durante 10 min a baño de
hielo, después se centrifugó y descartó el sobrenadante. Los lavados con 95% y alcohol
absoluto se realizaron por duplicado.
• Paso 5. Subsecuentemente, las muestras deshidratadas se pusieron en contacto con
proporciones ascendentes de HMDS (1:1, 1:2 y 1:3) diluido con alcohol etílico hasta llegar al
HMDS concentrado; con las centrifugaciones y descartado de los sobrenadantes
correspondientes. Al llegar al HMDS concentrado, el tiempo de contacto aumenta a un
mínimo de 30 min y no se centrifuga. A todo momento, se trabajó bajo campana de extracción
dada la alta toxicidad del HMDS.
• Paso 6. En este punto las muestras están listas para montarse directamente sobre
portamuestras de FE-SEM previa y adecuadamente lavados con alcohol y acetona. Se colocó
una gota de cada muestra con el cuidado de no exponerlas demasiado al aire para evitar su
rehidratación, se permitió el secado natural y se resguardaron en un desecador hasta ser
observadas por microscopía.
4. Evaluación de la citotoxicidad
Paralelo a las pruebas de actividad antimicrobiana, se realizó la evaluación de la citotoxicidad
de las AgBr NPs sobre fibroblastos gingivales siguiendo los siguientes pasos:
• Paso 1. Se procedió a sembrar 10,000 células por mL de fibroblastos en el interior de una
caja de 96 pozos estéril para cultivo celular y se dejaron incubar por 24 h a 37 ˚C bajo
condiciones atmosféricas de 95% de humedad y 5% de CO2.
• Paso 2. A continuación, se retiró todo el medio de cultivo y se colocó medio nuevo, y en
los tres primeros pozos se colocó un volumen inicial de NPs y se diluyó para dar una
concentración final de 1,000 µg/mL (en el interior de los pozos) con medio de cultivo
Dubelco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), enriquecido con un 10% v/v de suero
bovino fetal y 1% v/v de una mezcla de antibiótico/antimicótico. Esta mezcla a
continuación se diluyó de forma seriada hasta llegar a una concentración de 2 µg/mL y se
50
dejaron incubar por 24 h. Como control, se utilizó únicamente el medio de cultivo
enriquecido sin NPs.
• Paso 3. Al término de la incubación, se retiró el medio de cultivo, se lavó dos veces con
solución amortiguadora de fosfatos pH = 7.2 y se procedió a realizar el procedimiento
espectrofotométrico de MTT.
51
CAPÍTULO III. RESULTADOS
52
53
1. Caracterización de las nanopartículas de AgBr
Después de realizada la síntesis de las nanopartículas de AgBr, se prosiguió a llevar a cabo su
caracterización bajo el enfoque y consideración del cambio de agente estabilizante (CTAB,
SDS y PVP) como variable del diseño experimental.
a. Difracción de Rayos˗X
Se identificó la composición, cristalinidad y tamaños cristalinos de las AgBr NPs, los picos 2θ
= 30.961°, 44.347°, 55.044°, 64.478°, 71.092°, 73.263° y 81.615° de los difractogramas
obtenidos y mostrados en la Fig. 23 se indexaron a los planos cristalinos: (200), (220), (222),
(400), (331), (420) y (422), respectivamente; resultando en buena congruencia con la carta
cristalográfica JCPDS No. 79-0149 del AgBr.
Fig. 23 Difractogramas de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, SDS y CTAB.
54
Además, los patrones de difracción revelaron la misma geometría cristalina cúbica centrada en
las caras (fcc, por sus siglas en inglés) para las nanopartículas sintetizadas con los tres agentes
estabilizantes.
Los índices de Miller (hkl) correspondientes a los planos cristalográficos obtenidos se
dedujeron a partir de la relación con la Ley de Bragg mediante las siguientes ecuaciones:
𝑑ℎ𝑘𝑙 =𝑎
√ℎ2 + 𝑘2 + 𝑙2
donde d es la longitud del espacio interplanar [nm], la celda unitaria es 𝑎 = 2𝑟√2 = 5.775 Å
(en este caso), 𝑟 el radio atómico (que se puede encontrar también en la carta cristalográfica) y
𝐿𝑒𝑦 𝑑𝑒 𝐵𝑟𝑎𝑔𝑔: 𝜆 = 2𝑑 𝑠𝑒𝑛𝜃,
donde λ es la longitud de onda de la radiación de Cu-Kα1 equivalente a 1.541874 Å y θ es el
promedio de los ángulos difractados correspondientes a la faceta seleccionada para el análisis.
Los tamaños de cristal promedio se obtuvieron mediante la Ecuación Debye-Scherrer
resultando en 9.24, 47.21, and 10.0 nm para las nanopartículas de AgBr utilizando CTAB,
SDS y PVP, respectivamente.
𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐷𝑒𝑏𝑦𝑒 − 𝑆𝑐ℎ𝑒𝑟𝑟𝑒𝑟: 𝐷 = 𝐾𝜆
𝛽𝑐𝑜𝑠𝜃 ,
donde 𝐾 es el factor de proporcionalidad o Constante de Scherrer equivalente a 0.94 y 𝛽 es la
Anchura a Media Altura o FWHM por sus siglas en inglés (Full Width at Half Maximum)
calculadas a partir de los picos de los espectros de difracción.
b. Microscopía de Transmisión Electrónica
Para definir los tamaños de las nanopartículas, se midieron por lo menos 50 partículas cuyas
morfologías es tipo semiesféricas, y se obtuvieron tamaños promedio de 12.5, 49.4 y 10.9 nm,
en relación a los agentes estabilizantes PVP, CTAB y SDS, respectivamente. Las micrografías
se muestran en las Figs. 24–26 con sus respectivos recuadros (insets) donde se muestran los
histogramas de distribución de tamaño de partícula.
55
Fig. 24 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB.
56
Fig. 25 Micrografía TEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS.
57
Fig. 26 TEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP.
58
c. Microscopía de Barrido de Electrones de Emisión de Campo
La morfología de los clústeres de las AgBr NPs sintetizadas con los tres distintos agentes
estabilizantes se observan en las micrografías obtenidas a través de FESEM, Fig. 27–29. Se
puede observar que el nanomaterial obtenido con PVP resultó de menor tamaño en
comparación con el uso de los otros dos agentes estabilizantes, lo cual puede atribuirse a la
permanencia de este estabilizante, aún después de su purificación. Además, se observa que,
debido a la ausencia de algún material soporte, dichas nanopartículas se aglomeraron en
escalas micrométricas. Sin embargo, a partir de las imágenes TEM, se demuestra que, estas
mantienen su tamaño nanométrico.
Fig. 27 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con CTAB.
59
Fig. 28 Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con SDS.
Fig. 29. Micrografía FE-SEM de AgBr NPs sintetizadas con PVP.
60
d. Espectrometría de Dispersión de Energía
El análisis elemental se estudió mediante los Espectros de Dispersión de Energía que se
tomaron con un Microscopio Electrónico de Barrido ZEISS, EVO MA15. Para confirmar la
presencia y cuantificación de Plata y bromo, para tal efecto, se analizaron 5 zonas de cada
muestra y los resultados se muestran a continuación en las Fig. 30–32.
Fig. 30 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con CTAB, en el inserto se indican las zonas
analizadas.
Fig. 31 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con SDS, en el inserto se indican las zonas analizadas.
61
Fig. 32 Espectro EDS elemental de AgBr NPs sintetizadas con PVP, en el inserto se indican las zonas
analizadas.
Tabla 3. Composición atómica de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP como agentes estabilizantes.
Composición Atómica
[at.%]
Elemento AgBr, CTAB AgBr, SDS AgBr, PVP
Plata 24.89 40.98 40.91
Oxígeno 45.57 18.67 19.17
Bromo 29.54 40.36 39.92
De la Tabla 3 se determina que, la composición atómica entre Ag y Br en las nanopartículas
sintetizadas empleando SDS y PVP es similar, indicando la formación y existencia de
nanopartículas AgBr en una relación atómica 1:1. En el caso del CTAB, la composición
atómica de Br es superior a la de la Ag (4%), este fenómeno puede atribuirse a la presencia
CTAB como impureza en el polvo de nanopartículas de AgBr.
62
e. Análisis Termogravimétrico ˗ Calorimetría Diferencial de Barrido
Las AgBr NPs sintetizadas con PVP y SDS no mostraron pérdidas de peso significativas
debidas a evaporación de agua o pérdida de compuestos volátiles a <200 °C, mostrando una
mínima disminución porcentual de 0.72% y 0.23%, respectivamente alrededor de ~300-350
°C, comprobando de esta manera una alta pureza de nanopartículas de AgBr, sin residuos
debidos al uso de dichos agentes estabilizantes (Fig. 33–35). Se ha reportado que el PVP puro
se descompone alrededor de 400 °C en aire, pero cuando se encuentra unido a nanopartículas
de Plata las temperaturas de descomposición varían entre 200 y 400 °C [30] y el SDS puro a
~180 °C [58].
Las AgBr NPs sintetizadas con CTAB mostraron una pérdida de peso de 8.948% a ~240–285
°C (Fig. 35) que puede ser atribuida a la descomposición térmica del surfactante que ocurre a
~276–310°C [22] [26] [59]. Por lo tanto, a través de EDX y TGA se comprueba la existencia
de CTAB en el polvo de AgBr, correspondiente a un 9% del total de masa del material.
Además, las tres curvas de TGA mostraron una pérdida de peso pronunciada alrededor de 820
°C debida a la descomposición o a una transición vítrea de acuerdo al DSC de las AgBr NPs.
Fig. 33 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con PVP.
63
Fig. 34 Termograma de AgBr NPs sintetizadas con SDS.
Fig. 35 Termograma de AgBr NPs syntetizadas con CTAB.
64
f. Potencial Zeta
El Potencial Zeta se evaluó con ayuda del equipo Horiba Scientific, SZ-100. Los promedios de
los Potenciales ζ de las NPs estabilizadas con PVP, CTAB y SDS se establecieron como -
28.74, 27.46 y -19.18 mV, respectivamente. La Fig. 36 ilustra el Potencial ζ en relación a la
concentración de los nanomateriales. Las concentraciones que se utilizaron en los ensayos
fueron las mismas que se emplearon para la determinación de la actividad antimicrobiana que
se describe en su debida sección; las concentraciones fueron 1000, 500, 250, 125, 62, 32, 16, 8
y 4 μg de nanopartículas/mL de agua desionizada. En general, las nanopartículas de AgBr
sintetizadas empleando CTAB muestran un potencial zeta positivo en prácticamente todo el
rango de concentraciones. Mientras que, las nanopartículas de AgBr sintetizadas utilizando
SDS y PVP muestran mayoritariamente un potencial zeta negativo. Estas cargas superficiales
son importantes debido a la interacción de la nanopartícula con el microorganismo. Se ha
reportado que, la interacción entre potenciales zeta de la nanopartícula y del microorganismo
altera la estructura de la membrana y como resultado su permeabilidad y desempeño global y
viabilidad [60].
Fig. 36 Potencial ζ de las AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y SDS.
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
1000 500 250 125 64 32 16 8 4Po
ten
cial
ζ[m
V]
Concentration [μg/mL]
AgBr, PVP AgBr, CTAB AgBr, SDS
65
La interacción inicial entre los microorganismos y los agentes antimicrobianos es
electrostática, y de ser catiónica, resulta en una interacción fuerte con las membranas celulares
cargadas negativamente [61]. Es así como se deduce que la densidad de carga positiva es un
parámetro clave para definir la eficacia de un agente antimicrobiano [62]. Por lo que, la
cantidad reducida de peptidoglicano cargado negativamente hace que las bacterias Gram
negativas sean menos propensas ante ciertos agentes antimicrobianos cargados positivamente
[63]. En literatura, se han reportado los potencial zeta promedio para E. coli y S. aureus sin
ningún tratamiento, siendo estos de -44.2 y -35.6 mV, respectivamente [60].
g. Espectrofotometría de Absorbancia de Luz UV˗Vis
Las absorbancias de luz UV˗Vis por las muestras de AgBr nanopartículas se obtuvieron
mediante el espectrofotómetro Thermo Scientific, Varioskan Lux.
Las dispersiones acuosas de las nanopartículas mostraron diferentes coloraciones como se
mencionó en la sección 6.1 Síntesis y se observó en la Foto. 2. y como se muestra nuevamente
en el recuadro dentro de la gráfica de la Fig. 37. de izquierda a derecha las soluciones
representan muestras de los nanomateriales estabilizados durante su síntesis con PVP, CTAB y
SDS; sus espectros se muestran en la Figura. Esto se relaciona con la banda plasmón de la
Plata. Los picos a 295, 250 y 245 nm se encuentran en conformidad con la absorbancia de
AgBr NPs reportada en la literatura encontrándose en el rango entre 250 and 320 nm [22] [18].
Fig. 37 Espectros de absorbancia de luz UV˗Vis de AgBr NPs sintetizadas con PVP, CTAB y SDS.
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
234 284 334 384 434 484 534 584 634 684 734
Ab
sorb
anci
a [a
.u.]
Longitud de onda [nm]
AgBr-PVP AgBr-CTAB AgBr-SDS
66
2. Actividad antimicrobiana
Posterior a la caracterización de las AgBr NPs, se procedió a realizar la evaluación de la
actividad antimicrobiana y la toxicidad como efectos del cambio en la variable (agente
estabilizante) en el diseño experimental.
Las pruebas microbiológicas, a excepción de las micrografías FE-SEM, se realizaron en la
Universidad Autónoma de Baja California (UABC), Campus Mexicali (Fig. 38.). Los modelos
celulares con los que se trabajaron fueron: fibroblastos gingivales, Escherichia coli ATCC
25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Candida albicans, aislada de un paciente
diagnosticado con estomatitis protésica (para la determinación de las CMI) y ATCC 10231
(para las micrografías).
Fig. 38 Instalaciones UABC, Facultad de Odontología..
a. Determinación de la CMI
Las concentraciones iniciales de los inóculos microbianos fueron las que se indican en la
siguiente Tabla 4. para los tres microorganismos probados bajo el efecto de las nanopartículas
de AgBr sintetizadas con los tres distintos agentes estabilizantes, CTAB, SDS y PVP.
Tabla 4. Concentraciones microbianas de los inóculos.
Microorganismo
Escherichia coli Staphylococcus aureus Candida albicans
Agente
Estabilizante
Conc.
[UFC/mL]
D.O.
[ua]
Conc.
[UFC/mL]
D.O.
[ua]
Conc.
[UFC/mL]
D.O.
[ua]
CTAB 1.4 × 106 0.129 9.4 × 106 0.046 7.2 × 105 0.207
SDS 1.7 × 109 0.051 2.7 × 107 0.046 1.7 × 106 0.045
PVP 1.7 × 107 0.050 1.3 × 107 0.046 2.1 × 106 0.051
UFC = Unidades formadoras de colonias
ua= unidades arbitrarias.
67
Posterior a un ciclo de incubación, y de acuerdo a la definición de CMI, la cual dice que ésta
se determina en el punto donde hay una disminución visual evidente en la turbiedad de las
muestras, los resultados se muestran en la Tabla 5:
Tabla 5. Concentraciones Mínimas Inhibitorias de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP evaluadas
contra E. coli, S. aureus y C. albicans.
CMI Agente Estabilizante
Microorganismo CTAB SDS PVP
E. coli (Gram -) 62 μg/mL – 62 μg/mL
S. aureus (Gram +) 4 μg/mL – –
C. albicans (Levadura) 4 μg/mL – –
– No hubo disminución visual evidente de turbiedad.
Para corroborar los resultados de disminución visual de crecimiento microbiano, también se
midieron las concentraciones reales, aunque no siempre coincidieron; los resultados se
muestran en las siguientes gráficas Fig. 39–41 donde las concentraciones de las AgBr NPs se
muestran en el eje de la abscisa y el log10 de las UFC/mL en el eje de la ordenada.
Fig. 39 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans después de un ciclo
de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB
a) b) c)
68
Fig. 40 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans después de un ciclo
de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con SDS
Fig. 41 Gráficas de la concentración microbiana de a) E. coli, b) S. aureus y c) C. albicans después de un ciclo
de incubación en presencia de las AgBr NPs sintetizadas con PVP.
Los resultados obtenidos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA y Tukey de
comparaciones múltiples con un nivel de significancia de a = 0.05.
a) b) c)
a) b) c)
69
b. Determinación de la Concentración Mínima Biocida
De acuerdo a la definición de Concentración Mínima Biocida, se establece que ésta se
determina cuando después de cumplido el proceso para la evaluación de la CMI, se resiembra
la muestra en medio libre del agente antimicrobiano y se mide presencia / ausencia (o
disminución del 99.9%) de crecimiento microbiano. Los resultados que se obtuvieron son los
siguientes, Tabla 6.:
Tabla 6. Concentraciones Mínimas Biocidas de las AgBr NPs sintetizadas con CTAB, SDS y PVP evaluadas
contra E. coli, S. aureus y C. albicans.
CMB Agente Estabilizante
Microorganismo CTAB SDS PVP
E. coli (Gram -) 125 μg/mL – 62 μg/mL
S. aureus (Gram +) 4 μg/mL – –
C. albicans (Levadura) 31 μg/mL – –
– No hubo disminución visual evidente de crecimiento microbiano.
En las siguientes fotografías se muestra la evidencia visual de las CMB, Fig. 42.
Fig. 42 Crecimiento microbiano después de un ciclo de incubación en medio de cultivo libre de AgBr NPs.
Controles Negativos
AgBr NPs
(CTAB)
AgBr NPs
(SDS)
AgBr NPs
(PVP)
Controles Positivos
E. coli
C. albicans
S. aureus
70
c. Observación microfotográfica
Se tomaron micrografías a través de FE-SEM para visualizar el efecto que las nanopartículas
de AgBr sintetizadas con CTAB, SDS y PVP como agentes estabilizantes causaron sobre la
integridad estructural de los microorganismos bajo estudio, E. coli, S. aureus y C. albicans,
asimismo, se logra apreciar la presencia de los nanomateriales en algunas muestras y la
preservación morfológica de los tres microorganismos sin exposición a las NPs (los controles).
Los resultados se muestran en las siguientes imágenes micrográficas Fig. 43–45:
Como se mencionó en la sección de Metodología para la Observación Visual del efecto de las
AgBr NPs sobre los microorganismos, se trabajó con concentraciones inferiores a las CMI
determinadas y con tiempos de incubación más cortos. Esto con la finalidad de obtener un
crecimiento suficiente para la obtención de muestra necesaria para su manejo y preparación.
Es decir, se trabajó con concentraciones distintas a las que provocan la inhibición de
crecimiento microbiano o a las biocidas, por lo que esta prueba no se realizó con el propósito
de cuantificar la viabilidad o muerte celular.
Reiterando, esta prueba se realizó únicamente con fines de observación cualitativa, no
cuantitativa debido a que las CMI no resultaron con comportamiento lineal extrapolable, ni las
condiciones fueron exactamente las mismas Sin embargo, a pesar de estos cambios en las
metodologías, se logra apreciar la diferencia del efecto sobre la estructura celular que
manifiesta la utilización de los diferentes agentes estabilizantes durante la síntesis de las
nanopartículas de AgBr .
• Efecto sobre E. coli:
En la Figura 43 Se visualiza una mayor deformación estructural en las células de E. coli
(mayor rugosidad) ocasionada por las AgBr NPs sintetizadas con CTAB a diferencia de SDS y
PVP. Y, por otro lado, se observa una conservación estructural mayor cuando las células se
expusieron a las NPs sintetizadas con PVP, lo cual no es totalmente congruente con las CMI
reales (no las utilizadas en esta prueba), lo cual se puede asociar a limitada zona de análisis.
71
Fig. 43 Micrografías FE-SEM de E. coli a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs sintetizadas con b)
CTAB, c) PVP y d) SDS.
• Efecto sobre S. aureus:
En las micrografías de la Figura 44 de Staphylococcus aureus expuestas a las AgBr NPs
sintetizadas con CTAB, se observa contenido intracelular derramado (indicado con un
recuadro rojo); y en los incisos b) y c) se observan huecos en algunas células. Nuevamente, la
utilización de CTAB resulta en mayor efecto sobre las bacterias en comparación con SDS y
PVP.
a) b)
c) d)
72
Fig. 44 Micrografías FE-SEM de S. aureus a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs sintetizadas con
b) CTAB, c) PVP y d) SDS.
• Efecto sobre C. albicans:
Las levaduras sometidas a contacto con las nanopartículas de AgBr sintetizadas con los tres
agentes estabilizantes, CTAB, SDS y PVP, presentaron formación de huecos (flechas rojas) y
rugosidad (flechas verdes) en las células como se muestra en las micrografías de la Figura 45;
sin embargo, en este caso, no se logra hacer una comparación de magnitud contundente del
efecto entre un agente estabilizante y otro.
a) b)
c) d) c)
73
Fig. 45 Micrografías FE-SEM de C. albivcans a) sin exposición a NPs y en presencia de AgBr NPs sintetizadas
con b) CTAB, c) PVP y d) SDS.
a) b)
c) d)
74
3. Evaluación de la citotoxicidad
Las pruebas de citotoxicidad a través del ensayo del MTT corrido en líneas celulares de
fibroblastos gingivales se realizaron en colaboración con la UABC y los resultados obtenidos
son los siguientes, Fig. 46–48:
Fig. 46 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con CTAB contra viabilidad celular.
Fig. 47 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con SDS contra viabilidad celular.
Fig. 48 Gráfica de concentraciones ascendentes de AgBr NPs sintetizadas con PVP contra viabilidad celular.
75
CAPÍTULO IV. CONCLUSIONES
76
SECCIÓN I. Sobre el efecto del agente estabilizante en la síntesis de las AgBr NPs
Con el uso de distintos agentes estabilizantes (CTAB, SDS y PVP) durante la síntesis de
nanopartículas de AgBr es posible sintetizar nanopartículas de AgBr de composición química,
cristalinidad, pureza y estabilidad térmica similares (EDS, UV-Vis, XRD, TGA-DSC), pero
con tamaño cristalino y de partícula distintos, así como el potencial ζ resulta con carga positiva
para las AgBr NPs sintetizadas con PVP y CTAB en oposición a la negativa resultante
empleando SDS.
SECCIÓN II. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su actividad
antimicrobiana
El uso de agentes estabilizantes variables (CTAB, SDS y PVP) empleados durante la síntesis
de nanopartículas de AgBr juega un papel importante en el efecto que se manifiesta a través de
su actividad antimicrobiana, resultando el empleo de CTAB más efectivo y de amplio espectro
contra bacterias Gram positivas, Gram negativas y levaduras.
SECCIÓN III. Sobre el efecto del agente estabilizante de las AgBr NPs en su
citotoxicidad
Es posible que las nanopartículas de AgBr sintetizadas con distintos agentes estabilizantes
presenten baja citotoxicidad sobre líneas celulares mamíferas (fibroblastos dentales) a las
concentraciones necesarias para que éstas manifiesten actividad antimicrobiana significativa.
77
CAPÍTULO V. APÉNDICE
78
Difracción de Rayos-X, Fundamentos
Los materiales cristalinos se caracterizan por componerse de la repetición de un patrón de
átomos ordenados. La celda unitaria se describe como el patrón repetitivo básico que define al
cristal [64] y puede clasificarse en uno de los 7 sistemas cristalinos con 14 tipos de redes de
Bravais (la clasificación puede profundizarse aún más en torno a 8 tipos de elementos de
simetría). Los vectores (o longitudes) de la celda y sus ángulos interaxiales se definen como
los parámetros de la red cristalina. En la Fig. 49., que se presenta a continuación, se puede
observar una celda unitaria esquematizada y en la Tabla 7. se presenta la clasificación de los
sistemas cristalinos. Los átomos de los cristales se encuentran alineados formando planos
cristalográficos, que se indican con los índices de Miller (h k l) y se definen como los
recíprocos de los interceptos fraccionales que los planos hacen con los ejes cristalográficos
[65].
Fig. 49 Esquema de una celda unitaria.
Tabla 7. Sistemas cristalinos y redes de Bravais.
Sistema Longitudes axiales y ángulos Redes de Bravais Símbolo de red
Cúbico Tres ejes iguales con ángulos rectos
a = b = c, α = β = ᵞ = 90°
Simple Centrado en el cuerpo Centrado en las caras
P I F
Tetragonal Dos ejes con ángulos rectos, dos iguales
a = b ≠ c, α = β = ᵞ = 90°
Simple Centrado en el cuerpo
P I
Ortorrómbico Tres ejes desiguales con ángulos rectos
a ≠ b ≠ c, α = β = ᵞ = 90°
Simple Centrado en el cuerpo
Centrado en la base Centrado en las caras
P I C F
Trigonal Tres ejes iguales, con misma inclinación
a = b = c, α = β = ᵞ ≠ 90°
Simple R
Hexagonal Dos ejes iguales coplanares a 120° con ángulos rectos
a = b ≠ c, α = β = 90°, ᵞ= 120°
Simple P
Monoclínico Tres ejes desiguales, un par sin ángulos rectos
a ≠ b ≠ c, α ≠ ᵞ = 90° ≠ β
Simple Centrado en la base
P C
Triclínico Tres ejes desiguales, desigualmente inclinados y ninguno con ángulos rectos
a ≠ b ≠ c, α ≠ β ≠ ᵞ ≠ 90°
Simple P
79
Las características cristalinas de los nanomateriales como el sistema cristalino, los parámetros
de la red cristalina, fase cristalina, tamaño y distribución de cristal, planos cristalinos
preferenciales, disponibilidad de sitios activos, entre otras, y su combinación específica son
propios de cada material, y pueden conferir propiedades muy específicas o aumentadas
(catalíticas, electrónicas, fotónicas, de imagenología, biológicas y demás). Como es el ejemplo
referente a catálisis, donde las nanopartículas de platino con superficies delimitadas por la
familia de planos {100} catalizan reacciones de hidrógeno, mientras que la reactividad del
monóxido de carbono es aumentada por la familia de planos {210} de nanopartículas tipo
buckyball [66] y el caso en que la actividad fotocatalítica de las nanopartículas de TiO2 es más
dependiente de la disponibilidad de los sitios activos que del área superficial total y su
actividad generativa de ROS (del inglés reactive oxygen species) es igualmente más
dependiente de la disponibilidad de sitios defectuosos superficiales (o planos cristalinos
discontinuos) y de su sistema cristalino, anatasa o rutilio [67].
La difracción de rayos-X (XRD, por sus siglas en inglés) es una técnica no destructiva
utilizada para analizar las características cristalinas de los materiales tales como cristales,
metales, cerámicas, minerales, nanomateriales y otros, para identificar su estructura (si el
espacio interplanar, d, es función de la química del material) y para caracterizar mezclas
heterogéneas de sólidos mediante la cuantificación relativa de sus componentes.
El principio de esta técnica se basa en la observación de la intensidad dispersada de un haz de
rayos-X que inciden sobre una muestra, en función del ángulo de incidencia y de dispersión,
polarización y longitud de onda o energía.
Los rayos-X son generados por un tubo de rayo catódico al calentar un filamento para producir
electrones; posteriormente son filtrados para obtener un haz monocromático que es colimado
para concentrar y dirigir el haz hacia la muestra. Las intensidades del haz de rayos-X
difractado son detectadas, procesadas y contadas para obtener el espectro de difracción. El
difractograma provee dos tipos de información única para cada material cristalino: las
posiciones de los picos (correspondiente a la distancia interplanar de acuerdo a la ley de
Bragg) y la intensidad relativa de los picos. El grosor de los picos se relaciona al tamaño de los
cristales submicrométricos a través de la ecuación de Scherrer. Las reflexiones también se
pueden comparar con las fichas cristalográficas de los parámetros de materiales conocidos.
80
Los rayos-X se clasifican como ondas electromagnéticas, como las ondas de radio, luz visible,
rayos gamma y demás, excepto que su longitud de onda y energía varía de entre 100 eV y
10MeV. En su consideración como onda, presentan longitudes de onda de 10 a 10-3 nm; y de
acuerdo a la teoría cuántica, en su consideración como partícula, se le llama fotón o cuanto de
luz con todas sus características esenciales de energía, momentum y otras [65]. Los rayos-X
utilizados para analizar cristales tiene λ de 1–2 Å, como por ejemplo, cobre Kα = 1.5428 Å
[68].
“El haz de rayos-X es una onda electromagnética caracterizada por un campo eléctrico que
está vibrando a una frecuencia constante, perpendicular a la dirección de movimiento. Esta
variación del campo eléctrico da a los electrones (partículas cargadas) un cambio sinusoidal
con el tiempo a la misma frecuencia. Como resultado de la aceleración y desaceleración
periódica del electrón, se genera una nueva onda electromagnética como los rayos-X. En este
sentido, los rayos-X son dispersados por los electrones. Este fenómeno es llamado dispersión
Thomson. Por otro lado, el fenómeno físico llamado “difracción como función de la posición
atómica” también se encuentra cuando un haz de rayos-X encuentra un cristal cuyo orden
atómico muestra periodicidad de largo rango. La intensidad de los rayos-X difractados
depende no solo del arreglo atómico sino también de la especie atómica. Cuando se considera
la difracción de los rayos-X de un cristal, se necesita información acerca de los “factores de
dispersión atómica”, los cuales proveen una medida de la habilidad de dispersión de los rayos-
X por átomo. Debido a que el núcleo de un átomo es relativamente pesado en comparación
con un fotón de rayos-X, no dispersa rayos-X. La habilidad de dispersión de un átomo
depende solamente de los electrones, su número y distribución [65].”
El fenómeno de dispersión de rayos-X por cristales es atribuido a ciertas relaciones de fases
entre dos o más ondas, tales como las diferencias de fase producidas por las diferencias en la
longitud de trayectoria de las ondas y un cambio en la amplitud relacionado a la diferencia de
fase. Dos ondas se encuentran totalmente en fase si la diferencia entre las longitudes de
trayectoria es cero o un múltiplo entero de la longitud de onda. El propósito principal de la
difracción de rayos-X por cristales es conocer la condición particular en la cual los rayos-X
dispersados de los átomos y los rayos-X de incidencia están en fase completamente y se
refuerzan mutuamente para producir un haz de difracción detectable [65]. Explicado de otra
81
forma, se basa en la interferencia constructiva (misma fase) de rayos-X monocromáticos (una
sola longitud de onda) y la muestra cristalina.
Si los rayos-X con longitud de onda (λ) inciden un cristal donde los átomos se encuentran
arreglados periódicamente con un espacio interplanar (d´), la difracción del haz con suficiente
intensidad es detectado solamente cuando se cumple la Ley de Bragg
𝑛𝜆 = 2𝑑´𝑠𝑖𝑛𝜃
donde n es llamada el orden de reflexión y es equivalente al número de longitudes de onda en
la diferencia de trayectoria entre rayos-X difractados de planos adyacentes y donde θ es el
ángulo del haz de rayos-X de incidencia; 2θ es el ángulo entre el haz de rayos-X difractado y
el haz transmitido, llamado el ángulo de difracción. La ecuación puede ser reescrita como
𝜆 = 2𝑑 𝑠𝑖𝑛𝜃
donde d = d’/n. [65]
Los índices de Miller que se mencionaron al principio de esta sección se deducen a partir de la
relación entre la ecuación de distancia interplanar correspondiente a cada uno de los sistemas
cristalinos y la ley de Bragg, y se consideran tres mínimos números enteros (h k l) que
satisfagan dicha relación y la igualdad con la distancia interplanar, d. En la Tabla 8. se
presentan las ecuaciones para calcular la distancia interplanar de acuerdo a cada sistema
cristalino.
82
Tabla 8. Ecuaciones de distancia interplanar para siete sistemas cristalinos.
Sistema Ecuación
Cúbico 1
𝑑2=
ℎ2 + 𝑘2 + 𝑙2
𝑎2
Tetragonal 1
𝑑2=
ℎ2 + 𝑘2
𝑎2+
𝑙2
𝑐2
Hexagonal 1
𝑑2=
4
3(
ℎ2 + ℎ𝑘 + 𝑘2
𝑎2) +
𝑙2
𝑐2
Trigonal 1
𝑑2=
(ℎ2 + 𝑘2 + 𝑙2) sin2 𝛼 + 2(ℎ𝑘 + 𝑘𝑙 + ℎ𝑙)(cos2 𝛼 − cos 𝛼)
𝑎2(1 − 3 cos2 𝛼 + 2 cos3 𝛼)
Ortorrómbico 1
𝑑2=
ℎ2
𝑎2+
𝑘2
𝑏2+
𝑙2
𝑐2
Monoclínico 1
𝑑2=
1
sin2 𝛽(
ℎ2
𝑎2+
𝑘2 sin2 𝛽
𝑏2+
𝑙2
𝑐2−
2ℎ𝑙 cos 𝛽
𝑎𝑐)
Triclínico 1
𝑑2=
1
𝑉2(𝑆11ℎ2 + 𝑆22𝑘2 + 𝑆23𝑙2+2𝑆12ℎ𝑘+2𝑆23𝑘𝑙+2𝑆13ℎ𝑙)
En el sistema triclínico, V es el volumen de la celda unitaria y los coeficientes se dan a continuación:
𝑺𝟏𝟏 = 𝒃𝟐𝒄𝟐 𝐬𝐢𝐧𝟐 𝜶, 𝑆12 = 𝑎𝑏𝑐2(cos 𝛼 cos 𝛽 − cos 𝛾),
𝑺𝟐𝟐 = 𝒂𝟐𝒄𝟐 𝐬𝐢𝐧𝟐 𝜷, 𝑆23 = 𝑎2𝑏𝑐(cos 𝛽 cos 𝛾 − cos 𝛼),
𝑺𝟑𝟑 = 𝒂𝟐𝒃𝟐 𝐬𝐢𝐧𝟐 𝜸, 𝑆13 = 𝑎𝑏2𝑐(cos 𝛾 cos 𝛼 − cos 𝛽).
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CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA
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