FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

TRABAJO FIN DE GRADO

HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA EL

DESARROLLO DE TRATAMIENTOS BASADOS EN LA

TERAPIA GÉNICA

Autor: Shilpa Lekhraj Peswani Sajnani

Tutor: Prof. Dr. Óscar Escribano Illanes

Convocatoria: Junio 2017

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ÍNDICE

1.Resumen……………………………………………………….......3

2. Introducción y antecedentes……………………………………....3

2.1. Vectores virales……………………………………………….5

2.2. Vectores no virales……………………………………………8

2.3. Aplicaciones de la terapia génica…………………………….9

3. Objetivos……………………………………………………….....11

4. Metodología………………………………………………………11

5. Resultados y discusión……………………………………………11

5.1. Mecanismos de edición génica………………………………13

5.2. Herramientas de edición genómica………………………….14

5.3. Vectores para la introducción de herramientas moleculares para la edición

genómica…………………………………………………………………..18

5.4. Aplicaciones de la edición de genes………………………...19

6. Conclusiones………………………………………………………20

7. Bibliografía…………………………………………………….....20

8. Anexo I……………………………………………………………21

9. Anexo II…………………………………………………………..22

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1. RESUMEN

La terapia génica se ha definido históricamente como la adición de nuevos genes a las

células humanas. Sin embargo, el reciente avance en tecnologías de edición del genoma ha

permitido un nuevo paradigma en el que la secuencia del genoma humano puede manipularse

con precisión para lograr un efecto terapéutico. Esto incluye la corrección de mutaciones que

causan la enfermedad, la adición de genes terapéuticos a sitios específicos en el genoma y la

eliminación de genes deletéreos o secuencias del genoma. Este trabajo pretende revisar los

diferentes mecanismos y estrategias implicados en la edición del genoma, describir los

avances tecnológicos y las distintas aplicaciones diversas áreas de terapia génica y celular.

También se analizan los retos actuales y las perspectivas futuras de la edición del genoma

como tecnología transformadora para el tratamiento de diversas enfermedades.

2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

El concepto de terapia génica nació durante los años sesenta y setenta y hoy en día sigue

siendo un paradigma relativamente nuevo en la medicina con enorme potencial terapéutico.

Se define como una técnica mediante la cual se inserta un gen funcional en las células de un

paciente humano para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una nueva

función. (García Miniet, R.S. et al, 2008). Permite modular la expresión de proteínas

específicas para el tratamiento de enfermedades tanto monogénicas como alteraciones

genéticas adquiridas como cáncer y SIDA, y otras enfermedades multifactoriales como la

diabetes y enfermedad cardiovascular. (Austin-Ward et al, 1998).

En función de la célula diana, existen dos modalidades de terapia génica:

a) Terapia génica de células germinales: consiste en la introduccion de un gen funcional en

células responsables de la formación de óvulos y espermatozoides, generando cambios en la

dotación genética; se transmite a la descendencia. En principio, esta terapia sería la más

adecuada y eficaz para contrarrestar las enfermedades congénitas y trastornos hereditarios,

aunque en la actualidad, debido a que la legislación lo prohibe y a una variedad de

dificultades técnicas y razones éticas, es poco probable que la terapia de línea germinal sea

probada en seres humanos en un futuro próximo.

b) Terapia génica somática: introducción de un gen funcional en células no germinales

(células que no son ni espermatozoides ni óvulos). Cualquier modificación y efecto se limitará

al paciente individual y no será heredado por el descendiente de los pacientes ni por ninguna

generación posterior.

Debido al consenso general entre los investigadores y la legislación vigente, basada en

motivos éticos y de seguridad, solamente se llevan a cabo protocolos clínicos en este tipo de

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terapia génica (Ronchera-Oms et al). La terapia génica somática puede ser motivo de reservas

éticas cuando es utilizado con el fin de potenciar mediante la manipulación genética el

aspecto físico sin llegar a tratar una enfermedad.

Según el lugar donde se produce la manipulación genética, la terapia genética somática

se clasifica en:

a) Terapia in vivo: aborda un conjunto de técnicas que consisten en la introducción del gen

terapéutico directamente en las células del organismo a través de un vector. No se produce la

extracción de las células del paciente. La ventaja que presenta sobre las técnicas in vitro es su

grado de sencillez pero tiene el inconveniente de que el grado de eficiencia de la transferencia

es menor y además es problemático el conseguir la especificidad tisular.

b) Terapia ex vivo: método más común que abarca la totalidad de las técnicas o protocolos en

la que se produce la extraccion de las células del paciente que posteriormente son aisladas y

cultivadas en laboratorio para poder luego ser introducidas de nuevo en el paciente. Son

sometidas al proceso de transferencia in vitro.

Figura 1. Terapia ex vivo vs in vivo (Turitz Cox. D, 2015)

La ventaja principal que presenta esta terapia frente a la terapia in vivo es que permite

especificidad a la hora de elegir el tipo de célula diana que se quiere manipular y tratar.

Además, se puede realizar un control exhaustivo sobre el proceso y existe mayor eficacia en

la transducción genética. Sin embargo, presenta complicaciones por el coste y complejidad

del proceso como puede ser por la dificultad en la transducción de ciertos tejidos que no

crecen idóneamente en cultivo o riesgo de contaminación de células manipuladas.

Para poder llevar a cabo la transferencia del material genético y hacer llegar el gen

terapéutico a la célula diana es necesario basarse en lo que se denomina en inglés “gene

delivery”, proceso mediante el cual se introduce ADN foráneo en células huesped (Isamat,

M). Es necesario la presencia de una molécula portadora denominada vector que transfiera el

gen terapéutico a la célula huésped de forma segura y eficaz, tanto para el paciente como para

el medio ambiente. Además, es importante que tenga una mayor eficacia en la transferencia

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génica, mayor persistencia en la expresión del material transferido, así como una alta

especificidad al tipo celular que se desea transferir. Una de las características más

significativas es que debe ser inocuo, que no despierte en el paciente una respuesta inmune así

como una reacción alérgica.

Una vez llevado a cabo la transferencia génica, los genes insertados tienen la opción de

integrarse en los cromosomas de la célula diana, o bien quedar como elementos genéticos

extracromosómicos (episomas). En este caso, el gen introducido puede no pasar a la progenie

tras divisiones celulares por lo que será necesario tratamientos repetidos para conseguir el

efecto terapéutico. La ventaja que presenta la integración del gen el cromosoma es que

permanece por replicación tras la división celular en células madres obteniendo así una

expresión estable y contínua a largo plazo, generando la posibilidad de curar un trastorno

genético. Por otro lado, la integración presenta diversas complicaciones puesto que ocurre

mayoritariamente al azar (Ronchera-Oms, C.L. et al): puede que los genes no se expresen o

que inciten la muerte de la célula huésped, podrían modificar patrones normales de expresión

de genes que controlan la división o la proliferación celular, por ejemplo a través de la

activación de un oncogén o de la inactivación de un gen supresor de tumores o de un gen

implicado en la apoptosis, aumentando el riesgo de cáncer.

Los vectores utilizados como el método para la transferencia de genes se pueden dividir

en dos categorías, virales y no virales.

2.1.Vectores virales:

Los vectores virales son el medio más eficiente para transferir genes, permiten modificar

específicamente una célula o un tejido, para inducir la expresión de genes terapéuticos

(Legorreta-Herrera et al, 2012). Los virus son elementos genéticos con capacidad infectiva

que se pueden replicar independientemente de los cromosomas de la célula que infectan. Por

ello, tradicionalmente, se ha aprovechado el cromosoma de virus humanos con especificidad

natural para determinados tejidos, después de haber reemplazado algún segmento génico que

confiriera virulencia al virus, por el gen terapéutico. (Isamat, M.)

El inconveniente de la transfección es la pluricelularidad ya que la metodología difiere a

la ahora de modificar una parte del individuo o a la totalidad. Es importante saber si se

requiere que los fenotipos adquiridos se hereden y que no todas las células que contienen el

mismo genoma responden al mismo método de transfección (Legorreta-Herrera et al, 2012).

Algunos de los diferentes tipos de virus utilizados como vectores de terapia génica son:

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A.Retrovirus

Los retrovirus son los primeros virus que se utilizaron como vectores en experimentos de

terapia génica (Misra, S. 2013). Son virus con envuelta que presentan ARN como material

genético que se caracterizan por presentar la enzima transcriptasa inversa que, al infectar una

célula, es capaz de retrotranscribir material genético de ARN a ADN de doble hebra. Para que

este ADN posteriormente se integre como copia simple en el genoma de la célula huésped es

necesario que las células estén en división.

Una de las grandes ventajas del empleo de retrovirus es la estabilidad funcional y

estructural de las formas integradas del vector. Sin embrago, presenta problemas a la hora de

inserción ya que la enzima integrasa puede insertar material genético del virus en cualquier

posición en el genoma del huésped, lo que puede llevar a mutagénesis de inserción o a la

división celular no controlada que conduce al cáncer.

B.Adenovirus

Los adenovirus son viriones sin envuelta y con un genoma constituido por ADN de

doble cadena que se replica en el núcleo de células en división o en células quiescentes. Son

utilizados en terapia génica in vivo ya que pueden infectar de forma eficaz una variedad más

amplia de células que el retrovirus, incluyendo células que se dividen más lentamente, tales

como células pulmonares o células que no se encuentran en fase de división. Facilitan la

expresión de elevada cantidad de virus y son muy estables sin tener que integrarse en el

genoma del tejido diana. Su capacidad para replicarse in vivo depende del tipo de célula

diana. Un inconveniente es que algunas de las proteínas virales pueden ser tóxicas para la

célula (Legorreta-Herrera et al, 2012), pudiendo favorecer una respuesta inmune intensa

contra las células diana. Asimismo, los altos niveles de virus requeridos para el tratamiento, a

menudo provocan una respuesta inflamatoria indeseable.

Actualmente el primer producto de terapia génica con licencia para tratar cáncer de

cabeza y cuello es el producto adenovírico denominado Gendicina (Misra, S. 2013).

C. Virus asociados a los adenovirus (AAV)

Los AAV son virus pequeños de la familia Parvovirus con un genoma de ADN

monocatenario que precisan de la cooperación de otro virus para que se puedan replicar. Son

unos de los vectores más utilizados ya que estimulan una expresión eficaz del transgén por

tiempos prolongados en diferentes tejidos como son: el hígado, el músculo, la retina y el

sistema nervioso central (Legorreta-Herrera et al, 2012). El principal inconveniente de AAV

es que al ser tan pequeño, su carga útil resulta relativamente limitada cuando se realiza a gran

escala, dando como consecuencia una producción viral poco eficiente. En los humanos, existe

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la presencia de una inmunidad preexistente para estos vectores AAV, y en el caso de que se

produzca la integración, sería al azar dando lugar a alteraciones en la activación del gen

endógeno. Diferentes serotipos de AAV tienen distintos patrones de expresión debido a

diferencias en las células y en las actividades intracelulares (Legorreta-Herrera et al, 2012).

Otro hecho interesante de los AAV es que sensibilizan a las células para la actuación de los

fármacos terapéuticos.

Actualmente se están utilizando en estudios preliminares para el tratamiento de la

enfermedad hereditaria de la sangre hemofilia, enfermedad muscular y ocular. También se

han iniciado ensayos clínicos para utilizar vectores AAV para administrar genes al cerebro, ya

que el virus puede infectar células no divisorias como las neuronas en las que se expresa su

genoma durante mucho tiempo.

D. Lentivirus

Últimamente se han desarrollado los lentivirus que son vectores retrovirales, basados en

el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1). En contraste con los retrovirus

convencionales, los lentivirus tienen la capacidad de infectar de forma eficiente células que no

están en división debido a que presentan señales de localización nuclear que ayudan a facilitar

la entrada de los virus por poros nucleares. La aplicación principal está enfocada en la

transferencia de genes a neuronas in vivo y a progenitores hematopoyéticos ex vivo.

E. Herpes Simplex Virus (HSV)

Se trata de un virus neurotrópico humano, que se utiliza principalmente para la

transferencia de genes en el sistema nervioso al permanecer en forma de episoma. Tiene un

genoma enorme comparado con otros virus, que permite insertar más de un gen terapéutico en

un solo virus, allanando el camino para el tratamiento de trastornos causados por más de un

defecto genético. HSV hace un vector ideal, ya que puede infectar una amplia gama de tejidos

incluyendo el músculo, el hígado, el páncreas y las células nerviosas y pulmonares.

También existen una serie de vectores no derivados de virus implicados en gene delivery.

2.2.Vectores no virales

Los vectores no virales abarcan aquellas técnicas de transferencia donde el material

genético es introducido utilizando métodos químicos y/o físicos. Las principales ventajas son:

sencillez en la preparación, facilitando producción a gran escala; posibilidad de introducir

DNA de gran tamaño; escasa toxicidad e inmunogenicidad, haciendo posible administrarlo de

forma repetida; y especificidad tisular. En comparación con los vectores virales presentan una

baja eficacia global.

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A.ADN Desnudo

El método más simple de transfección no viral es la del ADN desnudo que supone la

inyección directa de plásmidos de ADN sin ningún revestimiento lipídico o proteico (Isamat,

M.) en el interior de la célula. Aunque presenta problemas de especificidad en la terapia in

vivo, ha sido exitoso en la inmunización frente a ciertos tipos de cáncer y otras enfermedades.

B.Liposomas

Los liposomas están constituidas por una bicapa lipídica concéntrica en cuyo interior

contiene el ADN plasmídico que incluye el gen terapéutico con las señales de secuencia para

su expresión en la célula diana. La transferencia a la célula se lleva a cabo mediante fusión

entre los fosfolípidos del liposoma y los de la membrana celular.

Se clasifican en dos tipos, por un lado están los liposomas catiónicos, que presentan

carga positiva y forman un complejo estable con el ADN, y por otro lado están los liposomas

cargados negativamente que forman una cápsula alrededor del ADN, sin llegar a formar un

complejo. Como ventaja principal, son capaces de llevar grandes fragmentos de ADN a

diferencia de los vectores virales, que están limitadas a llevar un ADN de longitud más

reducida. El principal inconveniente de esta estrategia es la falta de especificidad de las

células diana en terapias in vivo y la baja eficacia de la transferencia. (Ismat, M.)

C. Bombardeo de partículas

Consiste en una técnica física, altamente eficaz de transferencia de genes tanto in

vitro como in vivo. El plásmido o porción de ADN es recubierto en su superficie por gotas de

oro o tungsteno, de 1 a 3 micras de diámetro, que posteriormente son aceleradas por una

descarga eléctrica o por un pulso de gas y disparadas hacia el tejido diana. La capacidad de

penetración es limitada y se utilizan con frecuencia en cultivos de líneas celulares, epidermis,

músculo e hígado.

D. Otros

Los esfuerzos de investigación han dado lugar a otros métodos no virales de

transferencia génica, como la electroporación (creación de poros inducidos por el campo

eléctrico en la membrana plasmática), sonoporación (frecuencias ultrasónicas para interrumpir

la membrana celular) y magnetofección (uso de partículas magnéticas complejadas con

ADN). Cada método tiene sus propias ventajas y desventajas.

2.3. Aplicaciones de la terapia génica

La terapia génica ofrece una multitud de estrategias novedosas para el tratamiento de

numerosas enfermedades causadas por mutaciones genéticas y se distinguen según categorías:

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-Enfermedades monogénicas: originadas por mutaciones en un solo gen, que causan pérdida

de la función de la proteína que codifican y son de naturaleza recesiva. Estas mutaciones son

poco frecuentes en la población, sin embargo, son responsables de numerosas enfermedades

crónicas, por ejemplo, de las hemofilias, la anemia falciforme, las deficiencias inmunológicas,

la hipercolesterolemia familiar y la fibrosis quística (Yunta, E.R., 2003).

Con la introducción de una copia normal del gen mutado en los tejidos afectados se

sintetizaría la proteína correctamente funcional dentro de aquellas células afectadas,

corrigiendo así el error genético. La enfermedad puede llegar a ser curada o paliada

dependiendo del tiempo de expresión adecuada del gen.

-Enfermedades multifactoriales, en el que tanto los genes como el ambiente están

involucrados en la expresión de la enfermedad, siendo las enfermedades coronarias, la

hipertensión y la diabetes las más destacadas.

- Enfermedades adquiridas, como es el caso del cáncer. Se ha visto poca eficacia clínica en la

introducción de copias normales de genes mutados debido a varios factores como puede ser el

efecto dominante de ciertas mutaciones, dificultad de acceder a la masa tumoral y a las

metástasis, y elevado grado de inducción mutagénica. Actualmente se están realizando

numerosos ensayos clínicos para tratar diferentes tipos de cáncer, y algunas de las estrategias

utilizadas incluyen: introducción de citoquinas, TNF-alfa, interleucinas y otras células

inmunomoduladoras que aumentan la actividad antitumoral de células inmunes; introducción

de genes activadores de drogas en células tumorales o “terapia de genes suicidas”; bloqueo de

la expresión de oncogenes mediante terapia antisentido para normalizar el ciclo celular;

introducción de genes supresores de tumores (p53), que inhibe angiogénesis y el crecimiento

celular; manipulación de las células de la médula ósea al introducir genes resistentes a los

fármacos para disminuir la toxicidad de la quimioterapia; introducción de “vacunas

tumorales” para aumentar inmunogenicidad frente a los tumores; e introducción de

adenovirus oncolíticos para eliminar células tumorales (Ronchera-Oms et al).

- Enfermedades infecciosas: incluyen al herpes, la hepatitis y el SIDA.

La infección por VIH, causante del SIDA, se considera una enfermedad genética donde

el virus retrotranscribe su ARN e integra el ADN de doble cadena resultante en el cromosoma

de la célula huésped (Ronchera-Oms et al), haciendo que el SIDA sea un candidato ideal para

la terapia génica. Se están realizando ensayos clínicos, la mayoría de ellos ex vivo, en las que

se llevan a cabo las siguientes estrategias: estimulación del sistema inmune del paciente al

introducir un gen del virus VIH (vacunas anti VIH); introducción de interferón-a a nivel de

linfocitos T y monocitos para inhibir la replicación vírica; transferencia de genes de proteínas

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mutantes del VIH, competidoras con las proteínas nativas, imposibilitando el ensamblaje y/o

la replicación; bloqueo de la traducción mediante parejas de oligonucleótidos antisentido que

complementan las secuencias genéticas del VIH; introducción de genes productores de

ribozimas, que al unirse a secuencias complementarias del ARN diana, degradan el ARN

viral, sin dar lugar a una respuesta inmunológica; introducción en las células diana de genes

codificantes de anticuerpos de cadena única frente a proteínas del VIH, neutralizando así las

proteínas víricas dentro de las células infectadas, incluso antes de que se produzca el

ensamblaje del virus, tratándose pues de una verdadera “inmunización intracelular”(Rochera-

Oms et al).

3. OBJETIVOS

El objetivo de este trabajo es realizar una revisión bibliográfica sobre el avance en los

distintos mecanismos moleculares implicados en terapia génica y las posibles aplicaciones

para el tratamiento de enfermedades tanto monogénicas como poligénicas.

4. MATERIAL Y MÉTODOS

Para llevar a cabo este trabajo se ha realizado una revisión bibliográfica en el que se han

empleado diversos textos científicos referentes al tema de estudio, recogidos en la

bibliografía, los cuales se han obtenido de la base de datos de publicaciones científicas

MEDLINE (PubMed), Elsevier, Scholar Google, así como de otras web de interés científico

con el fin de contribuir a la consecución y desarrollo de los objetivos previamente marcados.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La terapia génica clásica ha logrado con éxito la introducción de genes exógenos en el

genoma, pero la imposibilidad de controlar el sitio de integración de los vectores virales ha

supuesto una importante limitación. Los recientes avances en el desarrollo de tecnologías de

edición de genomas basadas en nucleasas programables han mejorado significativamente la

capacidad de realizar cambios precisos en los genomas de células eucariotas. Una aplicación

particularmente atractiva de nucleasas programables, es la posibilidad de corregir

directamente las mutaciones genéticas en tejidos y células afectadas para el tratamiento de

enfermedades que son refractarias a terapias tradicionales.

El fundamento para el campo de la edición de genes fue el descubrimiento de que los

cortes de doble hebra en sitios específicos de ADN (DSBs) podrían ser usados para estimular

la maquinaria de reparación celular endógena. Los DSBs, además de aumentar la frecuencia

de recombinación homóloga, también podían estimular la generación de pequeñas inserciones

y deleciones en el sitio específico de corte. Estos dos hallazgos convirtieron a las DSBs en el

principio clave de la edición génica (Chamorro Poyo, C. 2016)

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El paso fundamental de la terapia génica por edición es la formación de DSBs

específicos en sitios precisos del genoma, y que posteriormente, los propios mecanismos de

reparación endógena de la célula repare la rotura. Estas roturas en el ADN se reparan

típicamente a través de una de las dos vías principales-recombinación homóloga (RH) o unión

de extremos no homólogos (NHEJ).

- RH: repara el DSB utilizando una secuencia de ADN molde exógena introducida en la

célula diana, realizando cambios precisos en la secuencia diana. (Maeder, M.L. et al,

2016). Estos cambios pueden implicar un nucleótido o un reducido número de

nucleótidos dando una corrección de mutación puntal, hasta la introducción de un

transgén terapéutico en un locus preciso del genoma (adición génica).

- NHEJ: mecanismo que consiste en reparar DSBs a través de la religación directa de los

extremos escindidos. (Cox, D. B. T et al, 2015). No necesita la presencia de una

secuencia exógena de ADN como molde. Esta vía de reparación es propensa a errores

y con frecuencia resulta en inserciones y/o deleciones (indels) en el sitio de la ruptura,

siendo más frecuente la eliminación de nucleótidos. En el caso de que se formen dos

DSBs simultáneamente en el mismo cromosoma, se formará una deleción entre los

dos puntos de corte.

Figura 2. DSBs inducidas por nucleasas programadas en sitios concretos del genoma que activan los mecanismos de reparación endógena.

(Maeder, M L, 2016)

La eficiencia del mecanismo de reparación por NHEJ y RH varía dependiendo del tipo

celular y del estado de ciclo celular. En general se considera que el mecanismo de NHEJ es

más activo que RH (Charmorro Poyo, C. 2016) ya que se ha visto que la vía NHEJ está activo

durante todo el ciclo celular mientras que RH actúa principalmente durante la fase S/G2 (Cox,

D. B. T et al, 2015).

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5.1.Mecanismos de la edición génica

1. Bloqueo de genes (gene knockout)

Esta forma más simple de edición de genes utiliza la naturaleza propensa a errores de

NHEJ para introducir pequeños indels en el sitio de destino. El NHEJ clásico religa

directamente los extremos sin procesar del ADN mientras que el NHEJ alternativo,

denominado MMEJ (microhomology-mediated end joining), requiere una resección final

seguida de la recombinación de regiones de microhomología cortas y singulares y una

posterior ligadura del extremo del ADN. Activa durante todas las etapas del ciclo celular,

ambas rutas de NHEJ reparan ADN con una alta frecuencia de mutagénesis que da lugar a la

formación de indels en el sitio de la ruptura. Cuando el sitio diana de nucleasa se coloca en la

región de codificación de un gen, los indels resultantes causarán a menudo cambios de marco

de lectura (frameshifts).

La aplicación más común de mutagénesis dirigida implica la inducción de mutaciones

frameshift con el fin de generar knockout genes. En comparación con la terapia génica clásica,

que se limita a la adición de secuencias exógenas al genoma, la capacidad de eliminar genes

endógenos abre una nueva vía de tratamiento terapéutico en el que la función del gen puede

ser permanentemente interrumpido. Una aplicación de este enfoque es el llegar a los genes

dominantes que dan mutaciones de “ganancia de función”, como los que se encuentran en la

enfermedad de Huntington. Esta enfermedad es causada por una repetición de la expansión de

un alelo del gen huntingtina (HTT), lo que conduce a la producción de una proteína tóxica y

mutante HTT. La eliminación de este alelo mutante por la edición de genes basada en NHEJ

podría proporcionar un beneficio clínico a los pacientes de Huntington (Maeder, M.L. et al,

2016). En otras enfermedades, a veces puede ser terapéutico eliminar la función normal de un

gen. El ejemplo más destacado de esto es el método de edición de genes actualmente en

ensayos clínicos para el tratamiento del VIH, en el cual el knockout de CCR5, el principal co-

receptor de VIH, prohíbe la infección viral de células T modificadas. Por último, en lugar de

dirigirse directamente al genoma humano, la eliminación de genes críticos en bacterias

invasoras o virus basados en ADN podría servir como tratamientos antimicrobianos eficaces.

2. Supresión de genes

Además de los indels relativamente menores resultantes de NHEJ, es posible eliminar

grandes segmentos de ADN flanqueando la secuencia con dos DSBs. De hecho, se ha

demostrado que la introducción simultánea de dos roturas dirigidas puede dar lugar a

deleciones genómicas de hasta varias megabases de tamaño. Este enfoque es útil para

estrategias terapéuticas que pueden requerir la eliminación de un elemento genómico

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completo, tal como una región potenciadora, como se ha propuesto para el tratamiento de

hemoglobinopatías por deleción de la región potenciadora específica del eritroide (BCL11A).

3. Corrección de genes

A diferencia de las mutaciones impredecibles resultantes de NHEJ, las DSBs dirigidas

pueden inducir la edición de genes precisos mediante la estimulación de HDR con una

plantilla (template) de donantes suministrados exógenamente. Activo principalmente durante

las fases S y G2 del ciclo celular, RH utiliza la cromátida hermana como plantilla para la

reparación del ADN. Sin embargo, también se puede usar una secuencia donante

proporcionada exógenamente como una plantilla de reparación. De este modo, la introducción

conjunta de nucleasas dirigidas junto con un vector que contiene ADN homólogo al sitio de

rotura permite la edición de genes de alta eficacia basada en HDR. Cualquier diferencia de

secuencia presente en la plantilla donante puede ser incorporada en el locus endógeno para

corregir mutaciones que causan la enfermedad. Aunque tradicionalmente los plásmidos han

sido la fuente más comúnmente utilizada de ADN donante, estudios recientes han demostrado

que los oligonucleótidos monocatenarios (ssODNs) pueden servir como plantillas donantes

eficaces para HDR. Para células que son difíciles de transfectarse, también pueden usar

vectores virales tales como el lentivirus o el virus adenoasociado a la integrasa (AAV) como

fuente de ADN donante.

5.2 Herramientas de edición genómica

Dado que la edición de genes inducida por DSB se basa en los mecanismos de

reparación endógena de la célula, es universalmente aplicable a cualquier tipo de célula u

organismo que emplea estos métodos para la reparación del ADN. El elemento crítico para la

implementación de cualquiera de estos genes de edición es la introducción precisa de un DSB

target. Existen actualmente cuatro endonucleasas para inducir estos DSB específicos de sitio

y se caracterizan por tener un dominio de reconocimiento de ADN y otro dominio con

capacidad de generar cortes en una secuencia definida del genoma.

- ZFNs: Las nucleasas de dedo de zinc (ZFNs) están constituidas por varios dominios de

dedos de zinc fusionados al dominio nucleasa de la enzima de restricción de tipo IIS, Fokl.

(Cai, M. et al, 2014). Estos dominios están compuestos por un conjunto de tres a seis dedos de

zinc que tienen como función la unión específica al ADN, mientras que el dominio

endonucleasa posee actividad enzimática y mediará la ruptura de la doble cadena de ADN.

Los dedos de zinc contienen un dominio de Cys2-His2 que es uno de los motivos de

unión a ADN más comunes codificados en el genoma humano. Consiste en una configuración

ββα compacta formando una estructura de dedo que se mantiene unida y estable debido a

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interacciones entre dos residuos de cisteína de las láminas β y dos residuos de histidina de la

α-hélice que están tetraédricamente coordinados por un átomo central de zinc. Debido a que la

nucleasa FokI funciona como un dímero, dos ZFNs que unen hebras opuestas de ADN son

requeridos para la inducción de un DSB. Los primeros experimentos mostraron que los DSB

inducidos por ZFN podrían usarse para modificar el genoma a través de NHEJ o HDR y esta

tecnología se ha utilizado posteriormente para modificar con éxito genes en células madre

somáticas y pluripotentes humanas (Maeder, M.L. et al, 2015).

Figura 3. Mecanismo de acción de los ZFNs. (Le Provost, Fabienne et al., 2009)

-TALENs: Son proteínas de unión al ADN específicas de sitio. Presentan un dominio de

reconocimiento de ADN fusionado por su extremo carboxiterminal al dominio con actividad

nucleasa Fokl. Estas nucleasas presentan un dominio denominado TALEs (Gaj,T et al, 2013),

compuesto por múltiples unidades repetidas de aminoácidos (llamadas repeticiones TALE)

dispuestas en tándem. Cada repetición reconoce un único par de bases del ADN. Estas

repeticiones de TALE son casi idénticas en secuencia excepto para dos aminoácidos

altamente variables situados en posición 12 y 13 que establecen la especificidad de

reconocimiento de base de cada unidad. (Maeder, M.L. et al, 2015). Una matriz de cuatro

unidades de repetición diferentes es suficiente para generar TALEs con nuevos sitios de

reconocimiento de ADN. Al fusionarse los TALEs con la nuclease Fok1, los TALEN se unen

y escinden el ADN en parejas.

A diferencia de un dedo de zinc de 30 aminoácidos que une tres bases de ADN, los

TALEN requieren 34 aminoácidos para especificar un solo par de bases y esta diferencia de

tamaño puede prohibir la liberación de ambos monómeros TALEN en un vector viral único

con capacidad de empaquetamiento limitada. Se ha demostrado que los TALEN

administrados por lentivirus son susceptibles a reordenamientos, aunque este fenómeno puede

ser mitigado por la diversificación de codones entre las repeticiones. Los sistemas

adenovirales también se han utilizado para administrar los TALENs con éxito.

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Figura 4. Mecanismo acción TALENs (http://www.nlbiochemex.com/resourse/fasttale-technology.html)

-Meganucleasas: Las meganucleasas son endonucleasas específicas de secuencia que

reconocen secuencias diana grandes. Las endonucleasas homing (HEs) son meganucleasas

naturales y debido a su alta especificidad, se han utilizado para la mutagénesis dirigida en una

variedad de organismos tales como bacterias, hongos, plantas, insectos y metazoarios.

La tecnología de la meganucleasa implica la reingeniería de la especificidad de unión al

ADN de las HEs de origen natural. (Maeder, M.L. et al, 2015). A través de una combinación

de diseño racional y selección, estas HE pueden ser re-dirigidas a nuevas secuencias de

destino. Aunque muchos estudios muestran promesa para el uso de meganucleasas en la

edición del genoma, los dominios de unión a ADN y división de las HE son difíciles de

separar, y la dificultad relativa de la ingeniería de proteínas con nuevas especificidades ha

limitado tradicionalmente el uso de esta plataforma. Para abordar esta limitación, las proteínas

quiméricas que comprenden fusiones de meganucleasas, ZF y TALE han sido diseñadas para

generar nuevas enzimas monoméricas que aprovechan la afinidad de unión y la especificidad

de escisión de meganucleasas (Gaj, T. et al, 2016). Una ventaja asociada con la tecnología de

meganucleasa es que la formación de DSB por estas enzimas da como resultado un saliente 3',

que puede ser más recombinógeno para RH que el saliente 5' generado por la escisión FokI.

Además, las meganucleasas son la clase más pequeña de nucleasas manipuladas, haciéndolas

potencialmente susceptibles a todos los métodos estándar de administración génica.

-Nucleasas CRISPR/Cas9: El sistema CRISPR son repeticiones palindrómicas cortas

agrupadas y regularmente espaciadas (del inglés clustered regularly interspaced short

palindromic repeats) y Cas es la proteína asociada a CRISPR (del inglés CRISPR associated

protein) (Chamorro Poyo, C., 2016), y juntos constituyen un componente esencial de los

sistemas inmunes adaptativos basados en ácidos nucleicos que son comunes en las bacterias y

Archaea. Se trata de un sistema inmune adaptativo microbiano que utiliza nucleasas guiadas

por ARN para escindir elementos genéticos extraños. El método CRISPR/Cas9 ha sido

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diseñado a través de ingeniería genética del sistema CRISPR procariótico de tipo II y utiliza

un gARN para dirigir la nucleasa Cas9 a una secuencia genómica específica (Maeder, M.L. et

al, 2015). Debido a su especificidad, simplicidad y versatilidad, el sistema CRISPR/Cas9 ha

surgido recientemente como una poderosa herramienta para la ingeniería del genoma en

varias especies.

Este sistema consta de dos elementos fundamentales: una endonucleasa no específica

(Cas 9) y una secuencia corta de gARN, este último constituido por un ARN CRISPR

(crRNA) que al emparejarse con el crRNA trans-activante (TracrRNA), forma una estructura

de dos ARN que dirige la endonucleasa Cas9 a las secuencias genómicas que son

complementarias a la secuencia de gARN (Pellagatti, A. et al, 2015). Se produce el

emparejamiento de bases de Cas9-gARN a una secuencia diana próximo al motivo adyacente

al protoespaciador (PAM), componente de orientación esencial para la unión específica del

Cas9 (Singh, V. et al 2017). En estos sitios, Cas9 corta ambas cadenas de ADN con dominios

enzimáticos separados, el dominio de nucleasa de HNH (corta la hebra de ADN en dirección

3’→5’) y el dominio de tipo RuvC (corta la hebra de ADN en dirección 5’→3’), para generar

una rotura de doble cadena.

A diferencia de los tres sistemas de nucleasas previamente definidos, las nucleasas

CRISPR/Cas no requieren la ingeniería de nuevas proteínas para cada sitio diana de ADN

(Gaj, T. et al, 2017) (Ver Anexo I). La relativa facilidad con que se pueden orientar los

nuevos sitios, simplemente alterando la región corta del gRNA que dicta especificidad, hace

de este sistema un método altamente atractivo para la introducción de DSB específicos de

sitio. Además, debido a que el Cas9 proteína no está directamente acoplado al gRNA, este

sistema es altamente susceptible de multiplexing a través del uso concurrente de múltiples

gRNA para inducir DSBs en varios loci.

Los estudios más recientes informan que el sistema CRISPR/Cas9 podría ser diseñado

para la modificación genética eficiente en organismos eucariotas tales como plantas, C.

elegans, Drosophila, pez cebra, ratones y ratas. (Cai, M. et al, 2014).

Figura 5. Edición del genoma dirigida a través del sistema CRISPR-Cas9. (Singh, V et al, 2016)

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5.3 Vectores para la introducción de herramientas moleculares para la edición genómica

El suministro eficiente y seguro a células y tejidos diana hasta ahora ha sido el desafío

más importante para las estrategias de terapia génica exitosas. La duración y la magnitud de la

expresión de la nucleasa es un parámetro crítico para el nivel de la actividad de la nucleasa

tanto en la diana como fuera de la diana. Maximizar la eficiencia de la entrega es

particularmente importante ya que la edición de genes es un evento inherentemente

estocástico que ocurre en sólo una fracción de las células en las que se expresa la nucleasa.

El método para introducir nucleasas en células en estudios de principio prueba (proof of

principle studies) es la transfección de ADN plasmídico que lleva nucleasas y cassettes de

expresión de gRNA (Feng, Z. et al, 2014). Aunque simple y directo, este método no es ideal

para la mayoría de las terapias genéticas y celulares debido a la baja eficiencia de transfección

de células primarias, la citotoxicidad relacionada con el ADN, la presencia de secuencias de

ADN bacterianas en las cadenas plasmídicas y la posibilidad de integración aleatoria de

fragmentos plasmídicos en el genoma. Por consiguiente, la electroporación del ARNm que

codifica las nucleasas y gRNAs generados a través de la transcripción in vitro se ha

convertido en un método preferido para la edición de genes ex vivo de células primarias

relevantes para terapia génica, tales como células T y células madre hematopoyéticas.

(Maeder, M.L., 2015).

Alternativamente, la introducción directa de proteínas nucleadas purificadas o

complejos de proteína Cas9-ARNg también ha tenido éxito, ya sea por electroporación o por

fusión a péptidos penetrantes de células, lo que evita la toxicidad mediada por

electroporación. (Wang, M. et al, 2017). La modificación química de los gRNAs puede

aumentar aún más la robustez de la edición de genes en células primarias aumentando la

estabilidad y/o disminuyendo las respuestas inmunes innatas. Es probable que los futuros

esfuerzos se aprovechen de las nuevas formulaciones de nanopartículas para un suministro

eficiente y no tóxico.

Para muchas aplicaciones, los vectores virales siguen siendo el vehículo óptimo para

maximizar la eficacia de la administración al mismo tiempo que se minimiza la toxicidad. En

particular, los vectores lentivirales han sido optimizados para la transducción altamente

eficiente de células T y células hematopoyéticas. Sin embargo estos vectores también se

integran en el genoma y expresan de forma estable su carga de transgén. Con el fin de

aprovechar la eficiencia de la transducción lentiviral mientras se limita la duración de la

expresión de nucleasa en las células diana, vectores lentivirales deficientes de integrasa se han

utilizado para entregar transitoriamente herramientas de edición del genoma a las células

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diana. De forma similar, los sistemas adenovirales también pueden alcanzar altos niveles de

transducción de una variedad de tipos de células en ex vivo. Ambos vectores lentivirales y

adenovirales también tienen la ventaja de capacidad de envasado suficiente para transportar

múltiples nucleasas o gRNA cassettes de expresión para la edición de varios loci. (Cai, M. et

al, 2014).

La edición de genes in vivo presenta retos adicionales de segmentación específica de

tejido, distribución del vector e inmunogenicidad y biocompatibilidad del portador. Sin

embargo, el suministro de genes in vivo con AAV al hígado, ojo, sistema nervioso y músculo

esquelético y cardíaco ha mostrado una eficacia impresionante tanto en los modelos

preclínicos como en los ensayos clínicos. Por consiguiente, el AAV es también un sistema

prometedor para la administración de nucleasas.

5.4 Aplicaciones de la edición de genes.

-Terapia antiviral: La aplicación más directa de la edición de genes es utilizar el mecanismo

relativamente eficiente de NHEJ para eliminar genes en una terapia ex vivo, donde las células

somáticas pueden ser aisladas, modificadas y transferidas de nuevo al paciente. Por otra parte,

una de las aplicaciones más atractivas es la prevención de la infección viral o la replicación.

La estrategia de edición de genes más avanzada hasta la fecha es la modificación ex vivo de

las células T para eliminar el co-receptor CCR5 (por ZFNs) utilizado para la infección

primaria por VIH.

Además de abordar la infección por el VIH, todas las plataformas de edición de genes

también se han aplicado a otros patógenos virales, incluyendo el virus de la hepatitis B, el

virus del herpes simple y el virus del papiloma humano. Estas estrategias implican la

eliminación de genomas virales por degradación tras escisión por la nucleasa y mediante la

edición de genes esenciales para la estabilidad del genoma, mantenimiento y replicación. Un

reto general de las terapias antivirales es la alta mutabilidad de las dianas virales.

-Inmunoterapia para el cáncer: Una estrategia prometedora para la inmunoterapia implica la

ingeniería de células T para expresar receptores sintéticos conocidos como receptores de

antígenos quiméricos, o CAR, que reconocen epítopos en las células cancerosas. Tales células

T CAR han tenido un éxito particular en el tratamiento del linfoma de células B.

Sin embargo, una limitación de este enfoque es que estas células T modificadas

expresan tanto el receptor endógeno de células T como el CAR modificado. Debido a que

estos receptores funcionan como dímeros, los receptores naturales y modificados pueden

dimerizar e interactuar, dando como resultado una especificidad de epítopo impredecible,

reduciendo la potencia terapéutica. Para abordar esta limitación, varios estudios se han

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centrado en eliminar los receptores endógenos de células T con nucleasas de ingeniería. Un

desafío importante para el desarrollo de inmunoterapias de células T ampliamente traducibles

es la necesidad de utilizar células autólogas para evitar el rechazo inmune, como es en el caso

de eliminar el antígeno de leucocitos humanos (HLA) por el cual el sistema inmunológico

discrimina a las células propias y extranjeras.

-Desórdenes hematológicos: posibilidad de tratar trastornos de coagulación tales como

hemofilia A y hemofilia B, así incluyendo enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher,

enfermedad de Pompe, enfermedad de von Gierke y Hurler y Síndrome de Hunter (Prakash,

V. 2016). Sin embargo, cada una de estas poblaciones de pacientes es relativamente pequeña

y los tipos de mutaciones de cada gen implicado en estas enfermedades son diversos. Por lo

tanto, el costo del desarrollo clínico y la aprobación reglamentaria para desarrollar

herramientas seguras y eficaces de edición de genes para cada una de estas enfermedades

puede ser excesivo. Un enfoque inteligente para abordar cada uno de estos retos es la

integración dirigida de genes terapéuticos al locus de la albúmina downsteam del promotor de

albúmina endógena.

6. Conclusión

La terapia génica debe considerar cada estrategia y adaptarla al tipo celular que debe ser

modificado. No existe una estrategia universal para todos los tipos celulares y todas las

condiciones. Es muy importante regular la actividad precisa del gen en el contexto tisular y

momento necesario. En el caso de producir moléculas nuevas desde un vector de expresión,

ya sean éstas las proteínas terapéuticas o cualquier otra fabricada a partir del mismo vector, es

importante evitar las defensas celulares de inactivacion de proteínas extrañas y finalmente,

cuando ya se entra en protocolos de terapia génica de condiciones que afectan a la especie

humana, mantener siempre y estrictamente el rigor y protocolo de los ensayos clínicos.

7. BIBLIOGRAFÍA

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ANEXO I. Comparación de las diferentes plataformas de nucleasas programables (Cox, D. B.

T et al, 2015).

ZFN TALEN CRISPR/Cas9 Meganuclease

Recognition site Typically 9 to 18bp

per ZFN monomer,

18 to 36 bp per

ZFN pair.

Typically 14 to

20bp per TALEN

monomer, 28 to

40bp per TALEN

pair.

22bp (20bp guide

sequence + 2bp

PAM sequence for

S. pyogenes Cas9);

up to 44 bp for

double nicking.

Between 14 and

40bp.

Specificity Small number of

positional

mismatches

tolerated.

Small number of

positional

mismatches

tolerated.

Positional and

multiple

consecutive

mismatches

tolerated.

Small number of

positional

mismatches

tolerated.

Targeting

constraints

Difficult to target

non-G-rich

sequences.

5’ targeted base

must be a T for

each TALEN

monomer.

Targeted sequence

must precede a

PAM.

Targeting novel

sequences often

results in low

efficiency.

Ease of engineering Difficult, may

require substantial

protein engineering.

Moderate, requires

complex molecular

cloning methods.

Easily re-targeted

using standard

cloning procedures

and oligo synthesis.

Difficult, may

require substantial

protein engineering.

Immunogenicity Likely low, as ZFs

are based on human

protein scaffold.

Fokl is derived

from bacteria and

may be

immunogenic.

Unknown, protein

derived from

Xanthamonas sp.

Unknown, protein

derived from

various bacterial

species.

Unknown,

meganucleases may

be derived from

many organisms

including

eukaryotes.

Ease of ex vivo

delivery

Relatively easy

through methods

such as

electroporation and

viral transduction.

Relatively easy

through methods

such as

electroporation and

viral transduction.

Relatively easy

through methods

such as

electroporation and

viral transduction.

Relatively easy

through methods

such as

electroporation and

viral transduction.

Ease of in vivo

delivery

Relatively easy due

to small size of

ZFN expression

cassettes, allows

use in a variety of

viral vectors.

Difficult due to the

large size of each

TALEN and

repetitive nature of

DNA encoding

TALENs, leanding

to unwanted

recombination

events when

packaged into

lentiviral vectors.

Moderate: The

commonly used

Cas9 from S.

pyogenes is large

and may impose

packaging problems

for viral vectors

such as AAV, but

smaller orthologs

exist.

Relatively easy due

to small size of

meganucleases,

allows use in a

variety of viral

vectors.

Ease of

multiplexing

Low. Low. High. Low.

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ANEXO II. Ejemplos de las aplicaciones de la edición genómica a modelos terapéuticos.

(Cox, D. B. T et al, 2015).

Disease Type Nuclease Platform Employed Therapeutic Strategy

Hemophilia B ZFN HDR-mediated insertion of

correct gene sequence

HIV ZFN and CRISPR NHEJ-mediated inactivation of

CCR5

DMD CRISPR and TALEN NHEJ-mediated removal of stop

codon, and HDR-mediated gene

correction

HBV TALEN and CRISPR NHEJ-mediated depletion of

viral DNA

SCID ZFN HDR-mediated insertion of

correct gene sequence

Cataract CRISPR HDR-mediated correction of

mutation in mouse zygote

Cystic fibrosis CRISPR HDR-mediated correction of

CFTR in intestinal stem cell

organoid

Hereditary tyrosinemia CRISPR HDR-mediated correction of

mutation in liver

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