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EXTRACTOSEXTRACTOSEXTRACTOS EXTRACTOS ALERGENICOSALERGENICOS

Dra Sheila CabrejosDra Sheila CabrejosServicio de AlergologíaServicio de Alergología

Dra CabrejosDra CabrejosNoviembre 2009Noviembre 2009

www.alergomurcia.comwww.alergomurcia.com

Servicio de AlergologíaServicio de AlergologíaH.U. Virgen de la ArrixacaH.U. Virgen de la Arrixaca

Murcia (España)Murcia (España)

EL PRINCIPIO ACTIVOEL PRINCIPIO ACTIVO

►► Son mezclas heterogéneas de compuestos biológicos (proteínas y Son mezclas heterogéneas de compuestos biológicos (proteínas y glicoproteínas, lípidos, ácidos nucleicos, etc.) obtenidos a partir de glicoproteínas, lípidos, ácidos nucleicos, etc.) obtenidos a partir de fuentes naturales de alergenos.fuentes naturales de alergenos.

►► Se consideran productos alergénicos todos los derivados de Se consideran productos alergénicos todos los derivados de extractos alergénicos nativos, alergoides, productos conjugados de extractos alergénicos nativos, alergoides, productos conjugados de alergenos con otras sustancias, o productos alergénicos fabricados alergenos con otras sustancias, o productos alergénicos fabricados mediante tecnología del ADN recombinante (clonación de alergenos mediante tecnología del ADN recombinante (clonación de alergenos y obtención de formas recombinantes). y obtención de formas recombinantes).

E l íd é tid i téti d l l t i dE l íd é tid i téti d l l t i d►► Excluídos: péptidos sintéticos de alergenos, las construcciones de Excluídos: péptidos sintéticos de alergenos, las construcciones de ADN, o los agentes alergénicos de bajo peso molecular.ADN, o los agentes alergénicos de bajo peso molecular.

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►► Se pueden dividir en dos categorías diferentes:Se pueden dividir en dos categorías diferentes:-- Producidos industrialmente para el diagnóstico o tratamiento de Producidos industrialmente para el diagnóstico o tratamiento de una población (contienen un único alergeno o una mezcla de éstos).una población (contienen un único alergeno o una mezcla de éstos).

-- Preparados para un solo individuo que llevan el nombre del Preparados para un solo individuo que llevan el nombre del paciente). paciente).

Estabilidad del Extracto Alergénico (EA)Estabilidad del Extracto Alergénico (EA)

►► Vida media variable dependiendo de la formulación, composición, Vida media variable dependiendo de la formulación, composición, dilución o condiciones de almacenamiento.dilución o condiciones de almacenamiento.

►► Las mezclas suelen presentar mayor degradación debido a las Las mezclas suelen presentar mayor degradación debido a las propiedades enzimáticas de muchos extractos (Mayor a mayor propiedades enzimáticas de muchos extractos (Mayor a mayor distancia en la escala taxonómica).distancia en la escala taxonómica).

►► Los productos en estado acuoso presentan una significativa Los productos en estado acuoso presentan una significativa reducción de la potencia después de varias semanas de reducción de la potencia después de varias semanas de almacenamiento entre 20º y 25ºC (Recomendable 5+/almacenamiento entre 20º y 25ºC (Recomendable 5+/--3ºC).3ºC).

►► El empleo de sustancias estabilizantes o protectoras mejora El empleo de sustancias estabilizantes o protectoras mejora p p jp p jconsiderablemente las condiciones de los extractos (albúmina considerablemente las condiciones de los extractos (albúmina humana o el Tween).humana o el Tween).

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EL ALERGENOEL ALERGENO►► Se definen como proteínas capaces de inducir una Se definen como proteínas capaces de inducir una

reacción alérgica mediada por IgE.reacción alérgica mediada por IgE.

►► Características:Características:-- No son sustancias intrínsecamente tóxicas y No son sustancias intrínsecamente tóxicas y generalmente inocuas en ausencia de una reacción generalmente inocuas en ausencia de una reacción alérgica.alérgica.-- La mayoría son proteínas o glicoproteínas La mayoría son proteínas o glicoproteínas extracelulares de tamaño variable por encima de los extracelulares de tamaño variable por encima de los 3kDa hasta los 80 o 90kDa, tamaño que deba permitirles 3kDa hasta los 80 o 90kDa, tamaño que deba permitirles atravesar la membrana de la mucosa.atravesar la membrana de la mucosa.

L í lt t l blL í lt t l bl-- La mayoría son altamente solubles en agua.La mayoría son altamente solubles en agua.-- En general poseen un punto isoeléctrico ácido.En general poseen un punto isoeléctrico ácido.-- Son capaces de producir una respuesta inmunológica Son capaces de producir una respuesta inmunológica mediada por IgE. mediada por IgE.

►► No todos los alergenos son reconocidos con la misma No todos los alergenos son reconocidos con la misma frecuencia ni con igual intensidad por los individuos frecuencia ni con igual intensidad por los individuos sensibilizados. Por eso se habla de “alergeno principal sensibilizados. Por eso se habla de “alergeno principal (entre 1 y 5)” y de “alergeno minoritario”. Clasificación (entre 1 y 5)” y de “alergeno minoritario”. Clasificación b d l i d I E l i i id d db d l i d I E l i i id d dbasada en la presencia de IgE o en la positividad de basada en la presencia de IgE o en la positividad de pruebas cutáneas en pacientes sensibilizados frente a un pruebas cutáneas en pacientes sensibilizados frente a un extracto.extracto.

►► Se desconoce la causa por la que determinadas Se desconoce la causa por la que determinadas moléculas o proteínas son capaces de unir IgE, aunque moléculas o proteínas son capaces de unir IgE, aunque existen algunas características comunes: resistencia a la existen algunas características comunes: resistencia a la

t óli i i d lú id id l t ít óli i i d lú id id l t íproteólisis, presencia de glúcidos unidos a la proteína, proteólisis, presencia de glúcidos unidos a la proteína, actividad enzimática proteolítica (ácaros y hongos).actividad enzimática proteolítica (ácaros y hongos).

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FUENTES DE ALERGENOS. LA MATERIA FUENTES DE ALERGENOS. LA MATERIA PRIMAPRIMA

►► El polen, los hongos, los ácaros o los epitelios no son alergenos El polen, los hongos, los ácaros o los epitelios no son alergenos propiamente dichos sino fuentes emisoras de éstos, son algunos de propiamente dichos sino fuentes emisoras de éstos, son algunos de sus componentes como proteínas y glicoproteínas los responsables sus componentes como proteínas y glicoproteínas los responsables p p y g p pp p y g p pde la respuesta alérgica.de la respuesta alérgica.

POLENESPOLENES►► Casi todos sus alergenos son proteínas o glicoproteínas solubles en Casi todos sus alergenos son proteínas o glicoproteínas solubles en

agua con un rango de peso molecular muy variable (3agua con un rango de peso molecular muy variable (3--5kDa hasta 5kDa hasta 70 u 80 kDa).70 u 80 kDa).

►► Los alergenos son liberados del grano de polen rápidamente al Los alergenos son liberados del grano de polen rápidamente al entrar en contacto con la mucosa. El tiempo climático y el viento entrar en contacto con la mucosa. El tiempo climático y el viento son determinantes en cuanto a niveles y dispersión de éstosson determinantes en cuanto a niveles y dispersión de éstosson determinantes en cuanto a niveles y dispersión de éstos son determinantes en cuanto a niveles y dispersión de éstos respectivamente.respectivamente.

►► Se debe considerar la importancia de cada especie según el área Se debe considerar la importancia de cada especie según el área geográfica en el que se desarrolle la clínica alérgica.geográfica en el que se desarrolle la clínica alérgica.

►► La familia de las gramíneas son la mayor fuente de polinosis, La familia de las gramíneas son la mayor fuente de polinosis, presentes en casi todo el mundo y fáciles de crecer. Máxima presentes en casi todo el mundo y fáciles de crecer. Máxima eclosión: mayo y junio y se prolongan hasta agosto.eclosión: mayo y junio y se prolongan hasta agosto.

►► Las malezas o hierbas engloban plantas muy heterogéneas, Las malezas o hierbas engloban plantas muy heterogéneas, ñ áñ ánumerosas familias y especies. En España las más prevalentes son numerosas familias y especies. En España las más prevalentes son

: parietaria, Salsola, Chenopodium, Artemisisa y Plantago. : parietaria, Salsola, Chenopodium, Artemisisa y Plantago. ►► El grupo de árboles engloba gran variedad de familias y géneros de El grupo de árboles engloba gran variedad de familias y géneros de

polinización estacional. ESPAÑA. Cupresáceas, oleáceas y polinización estacional. ESPAÑA. Cupresáceas, oleáceas y platanáceas.platanáceas.

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ÁCAROSÁCAROS

►► Los ácaros domésticos (D. Pteronyssinus y D. Farinae) constituyen Los ácaros domésticos (D. Pteronyssinus y D. Farinae) constituyen l f t i i l d l l d l Ll f t i i l d l l d l Lla fuente principal de alergenos en polvo de las casas. La la fuente principal de alergenos en polvo de las casas. La reactividad cruzada que existe entre las especies es reactividad cruzada que existe entre las especies es considerablemente elevada. considerablemente elevada.

►► La fuente alergénica es el propio cuerpo del ácaro y también las La fuente alergénica es el propio cuerpo del ácaro y también las partículas fecales.partículas fecales.

HONGOSHONGOS

►► Se conocen dos tipos de estructuras básicas: celular Se conocen dos tipos de estructuras básicas: celular (levaduras) e hifas.(levaduras) e hifas.(levaduras) e hifas. (levaduras) e hifas.

►► Son agentes sensibilizantes de excepción.Son agentes sensibilizantes de excepción.►► Se han descrito tres tipos diferentes de antígenos Se han descrito tres tipos diferentes de antígenos

responsables de sensibilización:responsables de sensibilización:-- Antígenos Somáticos: intracelulares y corresponden al contenido Antígenos Somáticos: intracelulares y corresponden al contenido citoplásmico del microorganismo que queda expuesto después de la citoplásmico del microorganismo que queda expuesto después de la rotura celular.rotura celular.-- Antígenos Metabólicos: proceden de productos extracelulares Antígenos Metabólicos: proceden de productos extracelulares obtenidos a partir del filtrado del cultivo en el que se ha obtenidos a partir del filtrado del cultivo en el que se ha desarrollado el hongo.desarrollado el hongo.-- Antígenos hidrosolubles: originados en la pared celular fúngica.Antígenos hidrosolubles: originados en la pared celular fúngica.

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EPITELIOS DE MAMÍFEROSEPITELIOS DE MAMÍFEROS

►► Todos los vertebrados pueden ser causantes de procesos de Todos los vertebrados pueden ser causantes de procesos de sensibilización al excretar proteínas o acumularlas en la superficiesensibilización al excretar proteínas o acumularlas en la superficiesensibilización al excretar proteínas o acumularlas en la superficie sensibilización al excretar proteínas o acumularlas en la superficie corporal.corporal.

►► Relacionados con procesos alérgicos tipo asma ocupacional en los Relacionados con procesos alérgicos tipo asma ocupacional en los trabajadores que están en contacto con animales, especialmente trabajadores que están en contacto con animales, especialmente roedores.roedores.

►► Las fuentes de alergenos se encuentran en la saliva, la piel, el pelo Las fuentes de alergenos se encuentran en la saliva, la piel, el pelo y, especialmente la orina.y, especialmente la orina.

►► La mayoría de alergenos de este grupo se encuadran dentro de lasLa mayoría de alergenos de este grupo se encuadran dentro de las►► La mayoría de alergenos de este grupo se encuadran dentro de las La mayoría de alergenos de este grupo se encuadran dentro de las lipocalcinas y las albúminas, si bien el Fel d 1 posee actividad lipocalcinas y las albúminas, si bien el Fel d 1 posee actividad uteroglobina.uteroglobina.

VENENOSVENENOS

►► La alergia al veneno de himenóptero supone un gran riesgo para el La alergia al veneno de himenóptero supone un gran riesgo para el i ti tpaciente.paciente.

►► La característica común que presentan estas sustancias es que la La característica común que presentan estas sustancias es que la mayoría se encuadran dentro de las familias de proteínas con mayoría se encuadran dentro de las familias de proteínas con actividad hialuronidasa y fosfolipasa, por eso existe entre ellos gran actividad hialuronidasa y fosfolipasa, por eso existe entre ellos gran reactividad cruzada.reactividad cruzada.

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FABRICACIÓN DE PRODUCTOS FABRICACIÓN DE PRODUCTOS ALERGÉNICOS.ALERGÉNICOS.

►► La naturaleza y las características de la materia prima deben La naturaleza y las características de la materia prima deben reflejarse de la forma más clara posible en los certificados de reflejarse de la forma más clara posible en los certificados de análisis de los productos.análisis de los productos.análisis de los productos.análisis de los productos.

►► El nombre científico de la materia prima (género y especie, cuando El nombre científico de la materia prima (género y especie, cuando se posible), el tipo de fuente de la que se obtiene (polen, ácaro, se posible), el tipo de fuente de la que se obtiene (polen, ácaro, epitelio..) y otros factores como la recolección (método de epitelio..) y otros factores como la recolección (método de recogida), el tratamiento (si ha sido previamente tratada, por recogida), el tratamiento (si ha sido previamente tratada, por ejemplo para su desengrasado) o el almacenamiento (humedad, ejemplo para su desengrasado) o el almacenamiento (humedad, temperatura), deben quedar documentados en cualquier materia temperatura), deben quedar documentados en cualquier materia prima que se recoja. Además, el nombre del proveedor, el origen, prima que se recoja. Además, el nombre del proveedor, el origen, la fecha de recolección, la uniformidad de ésta, la riqueza y el grado la fecha de recolección, la uniformidad de ésta, la riqueza y el grado de pureza son parámetros que son imprescindibles de conocer y de pureza son parámetros que son imprescindibles de conocer y debería salir detallados en las etiquetas.debería salir detallados en las etiquetas.

FABRICACIÓN DE LOS EXTRACTOSFABRICACIÓN DE LOS EXTRACTOS

►► Conlleva una serie de pasos que tienen por objeto la transformación Conlleva una serie de pasos que tienen por objeto la transformación final de la materia prima en un producto elaborado rico enfinal de la materia prima en un producto elaborado rico enfinal de la materia prima en un producto elaborado, rico en final de la materia prima en un producto elaborado, rico en alergenos y proteínas, y con un alto grado de purificación. alergenos y proteínas, y con un alto grado de purificación.

►► El producto final puede presentarse en forma de compuesto El producto final puede presentarse en forma de compuesto liofilizado, al que se le ha extraído su contenido en agua, o como liofilizado, al que se le ha extraído su contenido en agua, o como una suspensión acuosa enriquecida.una suspensión acuosa enriquecida.

►► El proceso de fabricación se describirá con detalle, quedarán El proceso de fabricación se describirá con detalle, quedarán registrados todos los pasos para garantizar la trazabilidad del registrados todos los pasos para garantizar la trazabilidad del producto Se deben registrar también los incidentesproducto Se deben registrar también los incidentesproducto. Se deben registrar también los incidentes.producto. Se deben registrar también los incidentes.

►► El trabajo ha de realizarse en condiciones higiénicas y con material El trabajo ha de realizarse en condiciones higiénicas y con material estéril. La concentración del producto (acuoso o liofilizado) debe estéril. La concentración del producto (acuoso o liofilizado) debe prepararse en condiciones estériles y en zonas destinadas para ello.prepararse en condiciones estériles y en zonas destinadas para ello.

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ESQUEMA DE FABRICACIÓN DE LOS ESQUEMA DE FABRICACIÓN DE LOS EXTRACTOSEXTRACTOS

MATERIA PRIMAMATERIA PRIMA

HOMOGENIZACIÓN Y EXTRACCIÓN EN SOLVENTES

CENTRIFUGACIÓN

RECOLECCIÓN DE LA FABRICACIÓN PROTEICA

PURIFICACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL EXTRACTO

LIOFILIZACIÓN FRACCIÓN ACUOSA ENRIQUECIDA

PURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOSPURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS

►► La eliminación de las diversas sustancias de origen biológico La eliminación de las diversas sustancias de origen biológico mediante procesos de diálisis, concentración y filtración hace que mediante procesos de diálisis, concentración y filtración hace que los extractos se enriquezcan en proteínas y alergenos, sin embargo, los extractos se enriquezcan en proteínas y alergenos, sin embargo, algunas sustancias permanecen adheridas tras los sistemasalgunas sustancias permanecen adheridas tras los sistemasalgunas sustancias permanecen adheridas tras los sistemas algunas sustancias permanecen adheridas tras los sistemas tradicionales de purificación.tradicionales de purificación.

►► Gracias a la “despigmentación” (LETI) que es un tratamiento ácido Gracias a la “despigmentación” (LETI) que es un tratamiento ácido suave, se logran separar electroforéticamente las sustancias suave, se logran separar electroforéticamente las sustancias “contaminantes” adheridas a los alergenos (lipídos, glúcidos y “contaminantes” adheridas a los alergenos (lipídos, glúcidos y pequeños nucleótidos) que suponen entre un 30 y 60% del peso pequeños nucleótidos) que suponen entre un 30 y 60% del peso total del extracto alergénico.total del extracto alergénico.

►► Con esto se asegura un compuesto purificado con las mismasCon esto se asegura un compuesto purificado con las mismas►► Con esto se asegura un compuesto purificado con las mismas Con esto se asegura un compuesto purificado con las mismas características y propiedades inmunoquímicas de los extractos características y propiedades inmunoquímicas de los extractos nativos de procedencia y un incremento proporcional del alergeno nativos de procedencia y un incremento proporcional del alergeno mayoritario y el contenido proteico total.mayoritario y el contenido proteico total.

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FABRICACIÓN DEL PRODCUTO FINALFABRICACIÓN DEL PRODCUTO FINAL

►► Es aquél que va a ser preparado a partir de otro producto Es aquél que va a ser preparado a partir de otro producto intermedio.intermedio.

►► Suele estar concentrado y presenta una elevada potencia biológica y Suele estar concentrado y presenta una elevada potencia biológica y concentración de alergeno.concentración de alergeno.gg

►► A partir de él, mediante estandarización, el producto final se diluirá A partir de él, mediante estandarización, el producto final se diluirá a fin de adecuarlo a la dosis humana de tratamiento.a fin de adecuarlo a la dosis humana de tratamiento.

►► Su fabricación debe llevarse a cabo según los estándares de Su fabricación debe llevarse a cabo según los estándares de fabricación de productos farmacéuticos y las normas de laboratorio.fabricación de productos farmacéuticos y las normas de laboratorio.

►► La adición al producto final de alguna sustancia conservante La adición al producto final de alguna sustancia conservante ayudará a prevenir la contaminación microbiana que pudiera ocurrir ayudará a prevenir la contaminación microbiana que pudiera ocurrir durante el almacenamiento de la solución concentrada o en la durante el almacenamiento de la solución concentrada o en la du a te e a ace a e to de a so uc ó co ce t ada o e adu a te e a ace a e to de a so uc ó co ce t ada o e afabricación de la vacuna ( multidosis).fabricación de la vacuna ( multidosis).

►► Métodos de control de los productos intermedios y finales:Métodos de control de los productos intermedios y finales:

Composición alergénica:Composición alergénica:►► Perfil Proteico (SDSPerfil Proteico (SDS--PAGE)PAGE)►► Isoelectroenfoque (IEF)Isoelectroenfoque (IEF)►► InmunoblotInmunoblot

Potencia alergénica.Potencia alergénica.Control Microbiológico. Esterilidad o recuento microbiano.Control Microbiológico. Esterilidad o recuento microbiano.Contenido en conservantes/adyuvantes.Contenido en conservantes/adyuvantes.Contenido de agua en liofilizados: <10%Contenido de agua en liofilizados: <10%Toxicidad anormal (hongos por vía inyectable).Toxicidad anormal (hongos por vía inyectable).En el caso de alergenos adsorbidos en gel de hidróxido o fosfato de En el caso de alergenos adsorbidos en gel de hidróxido o fosfato de aluminio, debe comprobarse que la cantidad de aluminio que contienen aluminio, debe comprobarse que la cantidad de aluminio que contienen es inferior al máximo permitido (1,25mg Al/dosis humana).es inferior al máximo permitido (1,25mg Al/dosis humana).Cuando se utiliza fosfato de calcio como adsorbente, el contenido de Cuando se utiliza fosfato de calcio como adsorbente, el contenido de calcio no debe ser inferior al 80% ni superior al 120% del valor calcio no debe ser inferior al 80% ni superior al 120% del valor declarado.declarado.

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ESTANDARIZACIÓN DE EXTRACTOS ESTANDARIZACIÓN DE EXTRACTOS ALERGÉNICOSALERGÉNICOS

►► Minimizar las variaciones cualitativas y cuantitativas en la Minimizar las variaciones cualitativas y cuantitativas en la composición de los extractos finales, con el fin de obtener altos composición de los extractos finales, con el fin de obtener altos niveles de seguridad y eficacia y lograr la consistencia de los lotes niveles de seguridad y eficacia y lograr la consistencia de los lotes d f b i iód f b i ióde nueva fabricación.de nueva fabricación.

►► Comprende dos fases críticas: la selección de un patrón de Comprende dos fases críticas: la selección de un patrón de referencia interno (PRI), o estándar de compañía y la selección de referencia interno (PRI), o estándar de compañía y la selección de los procesos de estandarización mediante los cuales se van a los procesos de estandarización mediante los cuales se van a comparar los lotes sucesivos con el PRI. comparar los lotes sucesivos con el PRI.

►► La obtención de extractos más o menos purificados va a dependerLa obtención de extractos más o menos purificados va a depender►► La obtención de extractos más o menos purificados va a depender La obtención de extractos más o menos purificados va a depender de los fabricantes, de los procesos de purificación a los que sometan de los fabricantes, de los procesos de purificación a los que sometan sus extractos, y de los parámetros de control de calidad para la sus extractos, y de los parámetros de control de calidad para la aceptación de éstos.aceptación de éstos.

►► Estándar de compañía (PRI)Estándar de compañía (PRI)

►► Debido a que los EA están constituídos por una mezcla heterogénea Debido a que los EA están constituídos por una mezcla heterogénea de componentes alergénicos y no alergénicos, es aceptado que no de componentes alergénicos y no alergénicos, es aceptado que no p g y g , p qp g y g , p qpueden ser tratados con los mismos procedimientos que otros pueden ser tratados con los mismos procedimientos que otros productos biológicos. productos biológicos.

►► Las diferencias en la homogeneidad de los extractos van a depender Las diferencias en la homogeneidad de los extractos van a depender de dos puntos principales:de dos puntos principales:-- El fabricante (procesos de fabricación, tiempo, solvente, pH del El fabricante (procesos de fabricación, tiempo, solvente, pH del extractante, Tº, etc.)extractante, Tº, etc.), , ), , )-- Naturaleza de la materia Prima (variación según condiciones Naturaleza de la materia Prima (variación según condiciones climáticas, subespecies, ciclo estral de los animales, etc).climáticas, subespecies, ciclo estral de los animales, etc).

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►► Por todas estas variables se estableció un sistema de Por todas estas variables se estableció un sistema de estandarización que adsorbiera todas las diferencias y garantizara estandarización que adsorbiera todas las diferencias y garantizara una homogeneicidad de los lotes obtenidos a partir de distintas una homogeneicidad de los lotes obtenidos a partir de distintas materias primas de la misma especie y en distintos años: PRI.materias primas de la misma especie y en distintos años: PRI.

►► El PRI siempre se fabrica siguiendo un protocolo preestablecido, el El PRI siempre se fabrica siguiendo un protocolo preestablecido, el resto de lotes deben seguir exactamente la misma metodología resto de lotes deben seguir exactamente la misma metodología empleada para el PRI, y los resultados se referenciarán en empleada para el PRI, y los resultados se referenciarán en comparación con él. comparación con él.

Caracterización biológica e inmunoquímica del PRICaracterización biológica e inmunoquímica del PRI►► Parámetros in vitro:Parámetros in vitro:

-- Determinación del perfil proteico/antigénico.Determinación del perfil proteico/antigénico.-- Perfil en función del tamaño molecular de las proteínas (SDSPerfil en función del tamaño molecular de las proteínas (SDS-- PAGE).PAGE).-- Perfil en función del punto isoeléctrico de las proteínas (IEF).Perfil en función del punto isoeléctrico de las proteínas (IEF).-- Perfil en función de ambos parámetros (estudios de 2Perfil en función de ambos parámetros (estudios de 2--D).D).Perfil en función de ambos parámetros (estudios de 2Perfil en función de ambos parámetros (estudios de 2 D).D).

-- Contenido proteico total del extracto (LowryContenido proteico total del extracto (Lowry--Biuret, bradford y unidades Biuret, bradford y unidades de nitrógeno proteico {PNU}).de nitrógeno proteico {PNU}).-- Caracterización mediante cromatografía.Caracterización mediante cromatografía.-- Perfil alergénico (inmunoblot con pool de sueros).Perfil alergénico (inmunoblot con pool de sueros).-- Capacidad de unión a IgE: ELISA inhibición (50% de inhibición).Capacidad de unión a IgE: ELISA inhibición (50% de inhibición).-- Capacidad de unión a IgG: ELISA inhibición (50% de inhibición).Capacidad de unión a IgG: ELISA inhibición (50% de inhibición).-- Cuantificación de alergenos mayoritarios y minoritarios.Cuantificación de alergenos mayoritarios y minoritarios.

►► Parámetros in vivo:Parámetros in vivo:►► Parámetros in vivo:Parámetros in vivo:-- Prueba cutánea: cuyo objetivo final es correlacionar la respuesta de un Prueba cutánea: cuyo objetivo final es correlacionar la respuesta de un grupo de pacientes sensibilizados al alergeno en estudio con el extracto que grupo de pacientes sensibilizados al alergeno en estudio con el extracto que se está empleando. se está empleando.

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►► Unidades de EstandarizaciónUnidades de Estandarización..►► La presentación de los extractos disponibles actualmente se llevan a La presentación de los extractos disponibles actualmente se llevan a

cabo basándose en diferentes unidades que no dan una idea de la cabo basándose en diferentes unidades que no dan una idea de la actividad real del extracto y no garantizan la seguridad del actividad real del extracto y no garantizan la seguridad del producto.producto.

►► Estas unidades se basan en una estandarización en unidades de Estas unidades se basan en una estandarización en unidades de masa:masa:

Unidades noon 81 Noon0 cantidad de alergeno extraído de 1mg de Unidades noon 81 Noon0 cantidad de alergeno extraído de 1mg de MP).MP).Unidades peso/volumen (1/100: 1g de MP/100 mL de dilución).Unidades peso/volumen (1/100: 1g de MP/100 mL de dilución).Unidades de Nitrógeno proteico (1mg de N contiene 100.000 PNU).Unidades de Nitrógeno proteico (1mg de N contiene 100.000 PNU).Cantidad de liofilizado/mL.Cantidad de liofilizado/mL.Unidades de alergeno/mg.Unidades de alergeno/mg.

►► La concentración de proteínas de cada extracto debe hacerse de La concentración de proteínas de cada extracto debe hacerse de forma obligatoria para conocer la composición aproximada.forma obligatoria para conocer la composición aproximada.

►► Las unidades biológicas más destacadas de productos Las unidades biológicas más destacadas de productos estandarizados biológicamente son: HEP, BU, AU, BAU, IRC, y UB.estandarizados biológicamente son: HEP, BU, AU, BAU, IRC, y UB.

►► Tipos de estandarizaciónTipos de estandarización

►► Estandarización en función de la actividad biológica.Estandarización en función de la actividad biológica.In Vivo: In Vivo: es la capacidad de un extracto de inducir una reacción es la capacidad de un extracto de inducir una reacción cutánea en una población de pacientes sensibilizados al extracto en cutánea en una población de pacientes sensibilizados al extracto en cuestión. Se hace una comparación entre el tamaño de la pápula de cuestión. Se hace una comparación entre el tamaño de la pápula de histamina y la concentración del extracto (concentraciones seriadas) enhistamina y la concentración del extracto (concentraciones seriadas) enhistamina y la concentración del extracto (concentraciones seriadas) en histamina y la concentración del extracto (concentraciones seriadas) en pacientes sensibilizados y luego se representa en una recta de pacientes sensibilizados y luego se representa en una recta de regresión.regresión.

In VitroIn Vitro : : se calcula el 50% de inhibición del producto empleando un se calcula el 50% de inhibición del producto empleando un pool de sueros de los pacientes en los que se ha llevado a cabo la pool de sueros de los pacientes en los que se ha llevado a cabo la valoración in vivo. Este valor corresponde a los miligramos de extracto valoración in vivo. Este valor corresponde a los miligramos de extracto que se necesitan para inhibir el 50% del extracto. Así se establece una que se necesitan para inhibir el 50% del extracto. Así se establece una correlación entre los miligramos necesarios in vivo e in vitro, y éstos correlación entre los miligramos necesarios in vivo e in vitro, y éstos

l l tili d t i l di ó til l tili d t i l di ó tison los valores que se utilizan para determinar el diagnóstico y son los valores que se utilizan para determinar el diagnóstico y tratamiento del extracto.tratamiento del extracto.

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►► Fabricación de Extractos estandarizados en potencia Fabricación de Extractos estandarizados en potencia biológica.biológica.

►► Una vez que la potencia biológica de un extracto liofilizado ha sido Una vez que la potencia biológica de un extracto liofilizado ha sido definida con respecto al PRI, el siguiente paso es diluir dicho definida con respecto al PRI, el siguiente paso es diluir dicho extracto hasta la concentración establecida para tratamiento oextracto hasta la concentración establecida para tratamiento oextracto hasta la concentración establecida para tratamiento o extracto hasta la concentración establecida para tratamiento o diagnóstico.diagnóstico.

►► Se establece la equivalencia entre el resultado in vivo y la capacidad Se establece la equivalencia entre el resultado in vivo y la capacidad de inhibición que posee el extracto in vitro y se define una de inhibición que posee el extracto in vitro y se define una correlación entre ambos parámetros. Un vial para diagnóstico, correlación entre ambos parámetros. Un vial para diagnóstico, llevará la concentración de miligramos equivalente a la obtenida en llevará la concentración de miligramos equivalente a la obtenida en el ensayo in vivo, mientras que para el tratamiento se ajustará conel ensayo in vivo, mientras que para el tratamiento se ajustará conel ensayo in vivo, mientras que para el tratamiento se ajustará con el ensayo in vivo, mientras que para el tratamiento se ajustará con la obtenida en el ensayo in vitro.la obtenida en el ensayo in vitro.

►► Estandarización en unidades masa de alergenoEstandarización en unidades masa de alergeno

►► Se basan en la cuantificación de ciertos alergenos Se basan en la cuantificación de ciertos alergenos presentes en los extractos alergénicos para asegurar una presentes en los extractos alergénicos para asegurar una concentración adecuada en todos los lotes.concentración adecuada en todos los lotes.S f l l lS f l l l►► Se cuantifican por: anticuerpos policlonales, anticuerpos Se cuantifican por: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y densitometría de escáner.monoclonales y densitometría de escáner.

►► El más usado es el de anticuerpos monoclonales, el El más usado es el de anticuerpos monoclonales, el problema es su baja especificidad (puede haber problema es su baja especificidad (puede haber reconocimiento cruzado o infravaloración del contenido reconocimiento cruzado o infravaloración del contenido por reconocimiento de una única isoforma proteica).por reconocimiento de una única isoforma proteica).

►► Actualmente la estandarización exclusivamente enActualmente la estandarización exclusivamente en►► Actualmente la estandarización exclusivamente en Actualmente la estandarización exclusivamente en unidades de masa de alergeno mayor no es posible y unidades de masa de alergeno mayor no es posible y debe combinarse con una estandarización de potencia debe combinarse con una estandarización de potencia biológica.biológica.

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Galénica de las vacunas alergénicas. Tipos de Galénica de las vacunas alergénicas. Tipos de Vacunas.Vacunas.

►► Según el Real Decreto 1345/2007, los productos alergénicos Según el Real Decreto 1345/2007, los productos alergénicos comprenden cualquier medicamento destinado a detectar o comprenden cualquier medicamento destinado a detectar o provocar una alteración adquirida y específica en la respuesta provocar una alteración adquirida y específica en la respuesta p q y p pp q y p pinmunológica a un agente alergenizante.inmunológica a un agente alergenizante.

►► La presentación de los medicamentos alergénicos variará según el La presentación de los medicamentos alergénicos variará según el tipo de inmunoterapia que vaya a emplearse y también en función tipo de inmunoterapia que vaya a emplearse y también en función de la vía de administración.de la vía de administración.

►► Son los siguientes:Son los siguientes:Soluciones inyectablesSoluciones inyectablesSuspensiones inyectables.Suspensiones inyectables.p yp ySoluciones sublinguales o nasales.Soluciones sublinguales o nasales.Comprimidos o cápsulas.Comprimidos o cápsulas.Polvos o liofilizados.Polvos o liofilizados.Parches.Parches.

►► Una de las peculiaridades es que están preparadas con agentes Una de las peculiaridades es que están preparadas con agentes inmunizantes a concentración y dilución específicas, según la inmunizantes a concentración y dilución específicas, según la correspondiente prescripción facultativa para un paciente correspondiente prescripción facultativa para un paciente determinado.determinado.

►► Extractos Alergénicos no modificadosExtractos Alergénicos no modificadosgg►► Vacunas Acuosas:Vacunas Acuosas: Puede hacerse de dos formas: la primera Puede hacerse de dos formas: la primera

consiste en diluir en una solución adecuada (agua o algún tampón consiste en diluir en una solución adecuada (agua o algún tampón fosfato o una solución salina), el producto resultante de la fosfato o una solución salina), el producto resultante de la extracción de la fuente alergénica (poco usados en España). No extracción de la fuente alergénica (poco usados en España). No suelen tratarse de vacunas estandarizadas, son vacunas muy poco suelen tratarse de vacunas estandarizadas, son vacunas muy poco estables y de corta vida media y el riesgo de reacciones adversas es estables y de corta vida media y el riesgo de reacciones adversas es considerable y frecuente.considerable y frecuente.

►► Vacunas Sublinguales: Vacunas Sublinguales: administración de elevadas dosis de administración de elevadas dosis de alergeno mediante dispensación de gotas debajo de la lengua, nació alergeno mediante dispensación de gotas debajo de la lengua, nació con el objetivo de reducir al mínimo los efectos adversos de la con el objetivo de reducir al mínimo los efectos adversos de la forma subcutánea. El proceso de presentación antigénica es más forma subcutánea. El proceso de presentación antigénica es más lento por lo que el tiempo de contacto del extracto con la mucosa lento por lo que el tiempo de contacto del extracto con la mucosa es crucial.es crucial.

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►► Con el fin de hacerlas más estables se emplea el glicerol en su Con el fin de hacerlas más estables se emplea el glicerol en su composición.composición.

►► La concentración del alergeno puede ser entre 10 y 50 veces más la La concentración del alergeno puede ser entre 10 y 50 veces más la concentración del EA.concentración del EA.

►► La composición del EA es la misma que en las subcutáneas. La La composición del EA es la misma que en las subcutáneas. La presentación habitual se hace en función de la potencia biológicapresentación habitual se hace en función de la potencia biológicapresentación habitual se hace en función de la potencia biológica presentación habitual se hace en función de la potencia biológica y/o concentración de alergeno o alergenos mayoritarios, sólo se y/o concentración de alergeno o alergenos mayoritarios, sólo se modifica el excipiente que contienen.modifica el excipiente que contienen.

►► La mayoría de alergenos vienen disueltos en soluciones acuosas La mayoría de alergenos vienen disueltos en soluciones acuosas fosfatadas para mantener el equilibrio de las proteínas , con fosfatadas para mantener el equilibrio de las proteínas , con glicerina para estabilizar los alergenos, y con fenol al 0,5% para glicerina para estabilizar los alergenos, y con fenol al 0,5% para evitar la proliferación de bacterias (multidosis). evitar la proliferación de bacterias (multidosis).

►► Se incluyen aromatizantes y saborizantes para enmascarar suSe incluyen aromatizantes y saborizantes para enmascarar su►► Se incluyen aromatizantes y saborizantes para enmascarar su Se incluyen aromatizantes y saborizantes para enmascarar su desagradable sabor. desagradable sabor.

►► Vacunas Tópiconasales: Vacunas Tópiconasales: poseen efectos terapéuticos eficaces en poseen efectos terapéuticos eficaces en la rinitis perenne y estacional. Poseen características similares a las la rinitis perenne y estacional. Poseen características similares a las de las vacunas empleadas en terapia sublingual. Se preparan con de las vacunas empleadas en terapia sublingual. Se preparan con excipientes adecuados para la mucosa nasal, con un pH entre 6 y excipientes adecuados para la mucosa nasal, con un pH entre 6 y 6.5 y pueden contener una gran cantidad de extracto alergénico. 6.5 y pueden contener una gran cantidad de extracto alergénico. Gran cantidad de efectos secundarios.Gran cantidad de efectos secundarios.

►► Productos Orales Liofilizados: Productos Orales Liofilizados: recientes.recientes. Dirigida a pacientes con Dirigida a pacientes con rinitis, contiene como excipientes hidróxido sódico, manitol y rinitis, contiene como excipientes hidróxido sódico, manitol y gelatina. Actualmente disponible sólo pata Phleum Pratense.gelatina. Actualmente disponible sólo pata Phleum Pratense.

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►► Extractos Alergénicos ModificadosExtractos Alergénicos ModificadosSon EA que han sido sometidos a algún tipo de tratamiento con el Son EA que han sido sometidos a algún tipo de tratamiento con el fin de aumentar su eficacia y/o seguridad.fin de aumentar su eficacia y/o seguridad.

►► Modificaciones Físicas:Modificaciones Físicas: se combinan con sustancias como el se combinan con sustancias como el hidróxido de aluminio el fosfato cálcico la tirosina o los liposomashidróxido de aluminio el fosfato cálcico la tirosina o los liposomashidróxido de aluminio, el fosfato cálcico, la tirosina o los liposomas hidróxido de aluminio, el fosfato cálcico, la tirosina o los liposomas con los objetivos de aumentar eficacia y reducir los efectos con los objetivos de aumentar eficacia y reducir los efectos adversos. Las sustancias con las que se asocia el alergeno actúan adversos. Las sustancias con las que se asocia el alergeno actúan favoreciendo la presentación de los antígenos al sistema inmune favoreciendo la presentación de los antígenos al sistema inmune mediante el secuestro de antígenos vacunales y su posterior mediante el secuestro de antígenos vacunales y su posterior liberación de manera lenta y prolongada, así evitan su desaparición liberación de manera lenta y prolongada, así evitan su desaparición en la circulación sanguínea y produce una ligera inflamación o en la circulación sanguínea y produce una ligera inflamación o granuloma que activa la atracción de células presentadoras de granuloma que activa la atracción de células presentadoras de

í óf fí óf fantígeno y macrófagos, favoreciendo la quimiotaxis. Tienen alta antígeno y macrófagos, favoreciendo la quimiotaxis. Tienen alta eficacia y poca frecuencia de reacciones adversas.eficacia y poca frecuencia de reacciones adversas.

►► Modificaciones Químicas:Modificaciones Químicas: Se introduce un proceso que afecta la Se introduce un proceso que afecta la estructura química del alergeno, busca aumentar la seguridad de la estructura química del alergeno, busca aumentar la seguridad de la vacuna.vacuna.

Polimerización del alergeno: se utiliza sobretodo el glutaraldehído ya Polimerización del alergeno: se utiliza sobretodo el glutaraldehído ya que da lugar a moléculas de gran peso molecular con mucha menos que da lugar a moléculas de gran peso molecular con mucha menos alergenicidad (95% menos), preservando la capacidad inmunogénica. alergenicidad (95% menos), preservando la capacidad inmunogénica. También se usa formaldehído alginatos moléculas de IgG etc AlTambién se usa formaldehído alginatos moléculas de IgG etc AlTambién se usa formaldehído, alginatos, moléculas de IgG, etc. Al También se usa formaldehído, alginatos, moléculas de IgG, etc. Al aumentar la seguridad permite utilizar mayores concentraciones de aumentar la seguridad permite utilizar mayores concentraciones de alergeno y por lo tanto mayor eficacia. Después de la polimerización los alergeno y por lo tanto mayor eficacia. Después de la polimerización los productos son purificados por ultrafiltración y diálisis y diluídos en productos son purificados por ultrafiltración y diálisis y diluídos en soluciones salinas fisiológicas fenoladas para preparar los tratamientos. soluciones salinas fisiológicas fenoladas para preparar los tratamientos. Se pueden combinar más de un proceso químico.Se pueden combinar más de un proceso químico.

►► Modificaciones Fisicoquímicas:Modificaciones Fisicoquímicas: Se someten a dos tipos de Se someten a dos tipos de difi i l á ú l bi ió d lé ldifi i l á ú l bi ió d lé lmodificaciones; el caso más común es la combinación de moléculas modificaciones; el caso más común es la combinación de moléculas

polimerizadas con hidróxido de aluminio o algún otro adyuvante, polimerizadas con hidróxido de aluminio o algún otro adyuvante, potenciando la respuesta inmunológica.potenciando la respuesta inmunológica.

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Los excipientes. Variables Terapéuticas.Los excipientes. Variables Terapéuticas.►► Se definen como sustancias constituyentes de los productos Se definen como sustancias constituyentes de los productos

farmacéuticos elaborados, que se administran al paciente junto con farmacéuticos elaborados, que se administran al paciente junto con el extracto activo. Su elección dependerá de acuerdo con las el extracto activo. Su elección dependerá de acuerdo con las funciones que presentan considerando vía de administración, así funciones que presentan considerando vía de administración, así q p ,q p ,como la dosis para mejorar la aceptabilidad del paciente e como la dosis para mejorar la aceptabilidad del paciente e incrementar la duración de la fase de acción del producto.incrementar la duración de la fase de acción del producto.

►► El agua. El agua. Es el solvente más utilizado. Va a ser inyectada debe Es el solvente más utilizado. Va a ser inyectada debe demostrarse que está libre de organismos microbiológicos y demostrarse que está libre de organismos microbiológicos y endotoxinas bacterianas (no pueden ser superiores a 0,25 UI/mL), endotoxinas bacterianas (no pueden ser superiores a 0,25 UI/mL), ensayos de conductividad y valoración de la concentración total de ensayos de conductividad y valoración de la concentración total de y yy ycarbono orgánico. Para administración oral o nasal ésta se prepara carbono orgánico. Para administración oral o nasal ésta se prepara por destilación y debe satisfacer los límites de endotoxinas y por destilación y debe satisfacer los límites de endotoxinas y microorganismos.microorganismos.

►► Conservantes Antimicrobianos y estabilizantes. Conservantes Antimicrobianos y estabilizantes. Aumentan la Aumentan la vida media del producto y retardan y/o reducen el crecimiento vida media del producto y retardan y/o reducen el crecimiento microbiano. El comúnmente usado es el Fenol al 0,5%, sobretodo microbiano. El comúnmente usado es el Fenol al 0,5%, sobretodo en vacunas multidosis también se usa el glicerol Si la solución vaen vacunas multidosis también se usa el glicerol Si la solución vaen vacunas multidosis, también se usa el glicerol. Si la solución va en vacunas multidosis, también se usa el glicerol. Si la solución va a ser inyectable, el conservante debe ser preferiblemente isotónico a ser inyectable, el conservante debe ser preferiblemente isotónico y que reduzca el dolor durante la inyección (agua con cloruro y que reduzca el dolor durante la inyección (agua con cloruro sódico).sódico).

►► Adyuvantes. Adyuvantes. Se agregan para aumentar su eficacia y mejorar la Se agregan para aumentar su eficacia y mejorar la producción de anticuerpos en el sistema inmunológico ( a veces producción de anticuerpos en el sistema inmunológico ( a veces pueden amplificar la respuesta inflamatoria). Los más usados sonpueden amplificar la respuesta inflamatoria). Los más usados sonpueden amplificar la respuesta inflamatoria). Los más usados son pueden amplificar la respuesta inflamatoria). Los más usados son las sales minerales (hidróxido de aluminio y el fosfato cálcico), las las sales minerales (hidróxido de aluminio y el fosfato cálcico), las emulsiones grasas (LPS o monofosforil lípido A), los derivados emulsiones grasas (LPS o monofosforil lípido A), los derivados microbianos y los inmunomoduladores humanos (citocinas).microbianos y los inmunomoduladores humanos (citocinas).