extracción en fase sólida de drogas de abuso; …€¦ · c18 o fenilos, para la retención ......

JOSE JUAREZ

JUNIO 2014

COLOMBIA

Agilent Confidential

1

Extracción en Fase Sólida de

Drogas de Abuso;

CERTIFY, CERTIFY II

Información General


2

Drogas de Abuso Metabolitos

Consumo

Analisis de drogas de abuso


3

Eliminar intereferencias

Concentración de analitos.

La transformacion de la muestra

Preparacion de la muestra


4


5

Paso Opcion

1 Recoleccion de la muestra

2 Almacenamiento de la muestra

3 Transporte de la muestra

4 Procesamiento pre-eliminar de la muestra

5 Pesado o la dilucion de la muestra

6 Metodos de procesamiento de la muestra

7 Filtracion o eliminar las particulas

8 Metodo de extraccion de la muestra o muestra

liquidas

9 Derivatizacion


6

Tiempo invertido para el

analisis Cromatografico

Fuentes de error generados durante

el analisis cromatografico


7

HOJA DE TRABAJO PARA LA PREPARACION DE LA MUESTRA

Preguntas para la preparacion de la muestra

Ejemplo /consideracion

Comentarios

Cual es la tecnica analitica para medicion de la

muestra?

LC-UV, LC/MS, GC/MS, etc

Muestra debe de ser compatible con la

tecnica analitica

Cual es el tiempo optimo de analisis? 1min, 10 min, 5 horas

El tiempo de prep de muestra puede exceder

el tiempo de analisis

Cual es el nivel requerido para LOD/LOQ? 100% o menos de 100%

100% del recobro es ideal, pero el numero de

pasos involucrados se tiene la oportunidad de

la perdida de la muestra

Como se va a cuantificar? STD Interno, STD externo

Cual es la matrix de la muestra? Organico, biologico, inorganico,

solido, semi-solido, gel, etc

Elegir una tecnica de preparacion de

muestras que pueda remover selectivamente

los analitos de interes de la matriz.

Cuanto sabemos de la concentracion de la muestra

en la matrix

Acuosa vs Aceite, alto contenido

de sale, volatil, la matriz es

ionizable

Lo primero que hacemos en un proceso de

extraccion de la muestra es pensar en las

propiedades la matrix y el analito


8

Cual es el volumen de la muestra Microlitros vs Litros,

miligramos vs kilogramo, etc

Material de lab necesario

Cuales son los gps funcionales de la matrix,

interferencia y analitos de interes Solubilidad, polaridad, pka,

etc

Que mas sabemos del analito mismo coeficiente de particion,

estructura, etc.

Que pasos de pre-tratamiento son requeridos? Evaporacion del solvente,

purga y trampa, etc.

Depende de los LOD y LOQ

Que solvente debe estar mi analito para un

analisis optimo?

Evita los solventes que

puedan causar interfencia de

UV, supresion ionica,

compatibilidad o no volatiles

Elegir solventes para los pasos finales de

la preparacion de la muestra, siempre se

puede concentrar o redisolver.

Que recursos estan disponibles para el

desarrollo de metodo y el analisis por rutina?

Una carga de muestras

grande requiere a veces

automatizacion; si tienes el

numero de herramientas

disponibles

La preparacion de la muestra requiere

mas personal y a menudo una labor mas

intensa en la medicion analitica


9

Tipos de muestra

Orgánica

Inorgánica

Sólidos

Semi-solidos

Líquidos

Gases


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Metodos de Pre-tratamiento

Gaseosas

Solidas

Liquidas

Suspensiones-Liquidas


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Metodos de Pre-tratamiento para muestras gaseosas

Muestreo por encapsulado

Muestreo por fase solida

Trampa Liquida

Muestreo por Head Space

Purga y Trampa

Desorción térmica

Extraccion térmica directa

Pirolisis

Extraccion en fase solida


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Metodos de Pre-tratamiento para muestras sólidas

Extraccion Solido-Liquido

Extraccion Soxhlet

Homogenización

Sonicación

Disolución

Extraccion por fluido presurizado

Soxhlet Automatizado

Extraccion por fluido supercrítico

Extraccion asistida por microondas


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Metodos de Pre-tratamiento para muestras liquidas y

suspensiones

Extraccion en fase solida (SPE)

Extraccion Liquido-Liquido

Dilución

Evaporación

Destilación

Microdialisis

Liofilización

Filtración

Centrifugación

Sedimentación SPME


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Metodos para la preparacion de muestras liquidas y suspensiones

Metodo de Preparacion

de Muestra Principio de la tecnica Comentarios

Extraccion en Fase Solida Similar al HPLC, la muestra es aplicada y un liquido es

pasado a través de la columna, la fase solida empacada

es selectiva para remover el analito ó la interferencia, el

analito puede ser eluido con un fuerte solvente; en algunos

casos las interferencias son retenidas y los analitos pasan

a través de la fase solida.

Hay una amplia variedad de

fases disponibles para remover

analitos inorgánicos, orgánicos;

existen fases especialmente para

drogas de abuso, carbohidratos,

catecolaminas, iones metálicos y

otras clases de compuestos.

Extraccion Liquido-Liquido La muestra es separada en dos fases inmiscibles las cuales

son elegidas por diferencias en la solubilidad, los analitos

libres de interferencias son recobrados en una de las dos

fases.

Tener precaución de la formación

de emulsiones- se pueden

romper con la adición de calor,

sales, los valores de Ko puede

optimizar el uso de los solventes

o aditivos (tales como buffers

para ajustar el pH.

Dilucion La muestra es diluida con solvente el cual es compatible con

la fase móvil del HPLC o la fase estacionaria de GC;

evitamos la sobrecarga de la columna, disminuimos la fuerza

del solvente o la señal de salida para estar dentro del rango

lineal del detector.

Para evitar el ensanchamiento o

la distorsión del pico, el solvente

del disolvente debe ser miscible

con la fase móvil del HPLC

(preferente menor), este es un

metodo típico para formulaciones

farmacéuticas.


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Evaporacion Liquido es removido gentilmente y a P atm con un flujo de

aire o un gas inerte; el vacío es muy útil para líquidos

volátiles.

No evapore rápidamente, un

burbujeo fuerte puede perder la

muestra; vigile la muestra para evitar

la perdida, no sobrecaliente a

sequedad, lo mejor es secar con N2;

rotavapor o sistemas de evaporación

automáticos

Microdialisis Una pared Semi-permeable es colocada entre dos fases

liquidas y los analitos se transfieren de un liquido a otro,

basados en la diferencia de concentración.

Técnicas de enriquecimiento

tales como SPE se necesitan

concentrar dializados,

Microdialisis se usa para el

trabajo de químicos

extracelulares en plantas vivas o

tejidos animales.

Liofilización Una muestra acuosa es congelada y el agua es removida por

sublimación bajo vacío

Es bueno paara compuestos

organicos no volatiles con un

gran volumen que puede ser

usado, para retirar analitos

volatiles y analitos termolabiles.


16




Filtración El liquido es pasado a través de un filtro en forma de

membrana o cartucho de SPE para remover partículas

suspendidas

Altamente recomendable para

prevenir problemas de sobre

presurización y conservar la vida de

la columna.

Centrifugación La muestra es colocada en una centrifuga cerrada y una

fuerza giratoria separa las fases; el liquido sobrenadante se

puede retirar o decantar.

Centrifugación se usa para retirar

partículas como una alternativa a

la filtración..

Sedimentación Permitimos que la muestra se asiente cuando no hay

movimiento ; tiene una velocidad de sedimentación.

Es un proceso extremadamente

lento; los recobros son manuales

para diferente tamaños de

partículas. .


17

Extraccion típica Liquido-Liquido

Compuestos no polares disueltos en

el agua, al realizar la extraccion

Liquido-Liquido; agua (polar) y

solvente orgánico (no polar) los

compuestos polares viajaran al

solvente no polar y así se realiza la

LLE


18


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Formación de Emulsiones

La formación de emulsiones son un problema que puede ocurrir en ciertas muestras

(e.g. matrices grasosas) bajo ciertas condiciones de solventes, si las emulsiones no se

rompen entre la fase acuosa y la fase orgánica, el recobro del analito se puede ver

afectado, las emulsiones se pueden romper por

Adición de sales al medio acuoso

Calentando o enfriando el reservorio de extraccion

Filtración a través una membrana de lana

Filtración a través de un filtro de papel

Colocando una pequeña cantidad de otro solvente orgánico

Centrifugación.


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Usos de la Extraccion en Fase Solida (SPE)

Remover las intereferencias

Concentración o enriquecimiento del analito

Desalinización

Derivatizacion in situ

Transporte y almacenamiento de muestras.


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Remover las intereferencias

Las interferencias de las matrices no deseadas en las muestras pueden

traslaparse con las señal de los analitos; ácidos grasos, proteínas, lípidos, color,

etc. Estos compuestos pueden ser removidos con RP-SPE

Ref. 5991-3326 EN_SPHB Pag 103

1.- 5990-7686EN Determination of 24 PAHs in Drinking Water

Proteínas y Péptidos

Sales

Lípidos y otras especies hidrofóbicos

Pigmentos

Componentes Celulares


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Enriquecimiento y Concentración del analito

Concentración de las trazas del compuesto.

Volumen de muestra grande

Sature la fase estacionaria (sobrecarga)

Elución con solvente.

1.- 5990-7686EN Determination of 24 PAHs in Drinking Water


23


Desalinización

Para muestras orgánicas como proteínas


Derivatizacion in situ.

Un reactivo de derivatizacion se absorbe sobre el cartucho de SPE y la muestra

Que contiene el analito de interés es pasado a través del cartucho de extracción

y dependiendo de la cinética, el analito es derivatizado y después concentrado.

3. Hudson, W.C.; Massi, J. M. Protein Desalting and Concentration for MS Analysis Using Agilent Bond

Elut OMIX C4 Pipette Tips,Agilent Technologies Application Note #5990-8885EN, 2011.

4. Banos, C.-E.; Silva, M. Talanta 2009, 77 (5), 1597-1602.

Almacenamiento y transportacion

Antes de realizar la extraccion de la muestra con solvente, se puede transportar y

o almacenar


24

Presentaciones y Formatos para SPE

Cartucho

Disco

Puntas para pipetas

Platos de formatos de 96 pocillos

Micro-extraccion en fase solida.



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Presentaciones y Formatos para SPE

Cartucho

Disco

Puntas para pipetas

Platos de formatos de 96 pocillos

Micro-extraccion en fase solida.



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Aparatos para Extraccion en Fase Sólida (SPE)



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Aparatos para Extraccion en Fase Sólida (SPE)



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Pasos para la Extraccion en Fase Solida (SPE)

1.- ACONDICIONAMIENTO Condition

2.- CARGA DE LA MUESTRA Loading

3.- LAVADO DEL MATERIAL Wash

4.- ELUCION DEL MATERIAL Extration

C L W E


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www.agilent.com/chem/spevideo

http://www.agilent.com/chem/spevideo


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1.- Acondicionamiento

Se hace pasan solventes como metanol (MeOH)

o Acetonitrilo (ACN) el objetivo es remover cualquier

impureza que pudo ser colectada ya sea por la exposición

o fabricación.

La solvatación (hidratación “agua o buffers”) para los empaques

de fase reversa en los empaques de C8,

C18 o fenilos, para la retención de analitos hidrofóbicos

El dejarlos secar puede disminuir de forma drástica la retención.

2.- Carga de la muestra

La muestra es disuelta en un solvente débil a menudo agua o

buffer con un 10% de Solvente organico. La muestra se puede

aplicar manualmente , con una pipeta.

El tamaño de la muestra de los cartucho deben de sobrecargar

la capacidad del cartucho.

La solución se debe pasar por el cartucho sin permitir se seque.



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3.- Lavado

Por lavado con un solvente de fuerza intermedia no usar grandes

cantidades de volumen para lavar o un solvente fuerte

Para evitar la perdida del analito.

Para el caso de RP-SPE se puede usar buffers o agua,

o un pequeño volumen de solvente organico se puede adicionar

para lavar.

Nota: para muestras muy limpias como agua para tomar,

el lavado del cartucho se omite.


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Fases y la química de los cartuchos

Silica

Inorganicos

Polimericas

La silica de los cartuchos de SPE es diferente calidad que la usada

para las columnas de HPLC, donde hay interacciones mínimas con los

grupos silanol. La razon de la diferencia de la calidad es que en SPE no

es necesario cuidad la línea base.


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Clases de fases de SPE


No polares (Fase Reversa)

Interacciones hidrofóbicas/no polares/interacciones Van der Waals

Fases polares (fase normal)

Interacciones polares (dipolo-dipolo y puentes de hidrogeno)

Intercambio iónico

Interacciones electrostáticas (cargas opuestas)

Modo Mixto

Interacciones electrostáticas e hidrofóbicas

Covalente


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Desarrollo de metodo SPE


Seleccionar el SPE

Acondicionar SPE

Seleccionar el solvente optimo

Seleccionar y optimizar el lavado

Evaluar la pureza, recobro y reproducibilidad

Quimica del Analito


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Adsorbente de modo mixto especial

Amplia gama de aplicaciones para extracción acuosa

Bimodal, no polar e Intercambio catiónico fuerte

Bond Elut Certify


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Matrices típicas

Orina, plasma, saliva, sangre, fluidos biológicos

Mecanismo de extracción primario

No polar e intercambio catiónico fuerte


38

Bond Elut Certify

Adsorbente mixto : C8 no polar e intercambiador catiónico

fuerte.

Se usa para fármacos básicos (catiónicos).

Compendio completo de aplicaciones para fármacos.

Consideraciones

iniciales Son sencillas y faciles de poner en practica

MeOH para abrir la parte hidrófoba (no polar) y se activa la

parte polar

Buffer lo cual elimina el exceso de metanol y permite un

ambiente similar entre la fase y la matriz. Asegurando una

máxima interacción en el sistema


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Consideraciones

iniciales Buffer ajusta el pH (extraccion de analitos)

Mayor Interaccion

pH


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Drogas Básicas

Anfetaminas, Fenilciclinas, Proxifenos, Mepiridina, LSD,

codeína, Oxicodona, Opiaciaceaos.

Diferente farmacología

Tienen grupos funcionales; NR3, NR2H pH NR3+, NR2H+ C18 Retención

Lavar interferencias polares Agua

Lavar interferencias no polares Acido

Extraccion Elución de drogas básicas Solvente Orgánico

No agua

Minimiza el contacto

MeOH /NH4OH

EtOAC

CH2Cl2/IPA


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Drogas Acidas o Neutras

C18

Barbituricos, Feniltoínas, Metaqualona, THC

Diferente farmacología

No tienen grupos funcionales; NR3, NR2H Retención

Lavar interferencias polares

Cationica Acido

Extraccion Elución de drogas básicas Solvente Orgánico

interferencias no polares se cargan

interferencias no polares se quedan en el cartucho


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Cuales son los números

de parte para ordenar

1210-2051

1211-3050


43

Bond Elut Certify

Mas de 25 años en el mercado forense.

Pueden considerarse otras matrices como cabellos, tejidos.

Mas de 30 procedimientos de aplicación con los siguientes

cartuchos: 1210-2051

http://www.crawfordscientific.com/downloads/Application-

Notes/Certify_Methods_Manual.pdf

http://www.crawfordscientific.com/downloads/Application-Notes/Certify_Methods_Manual.pdf





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