FACULTAD DE MEDICINA HIPOPÓLITO UNANUE LABORATORIO - BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

INFORME N°10

EXTRACCIÓN DE ADN Y ELECTROFORESIS

IMPORTANCIA

En nuestra carrera, que definitivamente es científica, es necesario entender y comprender a fondo, que la importancia de la genética ha ido creciendo poco a poco, ya que la famosa molécula denominada en siglas ADN, es importante puesto que es nuestra esencia orgánica, ya que se encuentra nuestra información genética, nosotros como futuros médicos, más adelante trataremos las enfermedades ya no con la clásica visión científica, sino con otra perspectiva desde el punto de vista genético, ya que está muy estrechamente relacionada con las patologías, por tal motivo, es de importancia entender y realizar desde ahora procedimientos como extracción de ADN desde muestras sencillas como el hígado de pollo o fresas.

OBJETIVOS

Adiestrar al alumno en las técnicas que permitan la extracción y visualización del ADN a partir de un tejido animal, comprobando su estructura fibrilar y gran longitud.

RESULTADOS

1) Extracción de ácidos nucleicos

En esta experiencia, para la extracción de ADN, primero teníamos que romper las células por procedimientos mecánicos. Nuestra muestra fue fresa, la llevamos a un mortero y con el pistilo empezamos a triturar la muestra. Echamos 5ml de SDS (dodecil sulfato de sodio), que actuará como un detergente iónico dispersando los componentes para facilitar la ruptura de las membranas, a su vez separa a las proteínas asociadas a la cromatina desnaturalizándolas.

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La solución que obtendremos la llevaremos a un tubo de ensayo por un sistema de filtrado, y le echamos NaCl para romper la carioteca y se libere la cromatina. Le echamos 1 ml de EDTA y lo vaciamos a un vaso precipitado donde lo mantendremos a calor por 15 minutos.

Lentamente por las paredes le agregaremos etanol, que estuvo previamente en el refrigerador. Luego veremos como el ADN va a precipitar y con una bagueta, girando suavemente, enrollaremos el ADN.

2) Electroforesis de ADN

El profesor a cargo del curso realizó esta experiencia, primero disolvió la agarosa al 0,1%, calentándola hasta su disolución, luego se añadió a una cámara electroforética por 30 minutos hasta que se transforme en gel, luego mezclamos las muestras con buffer de carga; luego de haber realizado esto, colocamos las muestras en los pocillos de la cámara electroforética formados por la peineta, esta

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parte de la práctica lo hicimos nosotros mismos, con supervisión del profesor a cargo. Posteriormente cubrimos la cámara y lo corremos a 100V por 30 minutos. Una vez realizado esto lo retiramos y procedemos a colocarlo en bromuro de etidio por 15 minutos aproximadamente (cabe recordar que el bromuro es una sustancia muy toxica, debemos realizarlo con sumo cuidado), luego lo enjuagamos, para finalmente colocarlo en el transiluminador para su observación.

DISCUSIÓN

En la extracción del ADN se realizaron los pasos correctamente, pero la visualización del ADN fue un poco complicada debido a que teníamos que agregarle más etanol. Mientras se le agregaba más del alcohol, el ADN precipitaba más.

En la práctica de electroforesis de ADN, no se llegó a visualizar muy bien el cromosoma debido a que falto dejarlo reposar por más tiempo.

CONCLUSIÓN

Hay que seguir los pasos correctamente y respetar el tiempo de reposo en cada práctica, para poder tener resultados precisos y visibles.

El ADN genómico de las plantas es más difícil de extraer a causa de la pared celular de la planta, que se elimina por homogeneización o mediante la adición de celulasa para degradar la celulosa que forma la pared celular.

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CUESTIONARIO

1) ¿Cuál es la relación entre la concentración de agarosa y la migración de las moléculas?

La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar las moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kDa.

Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse. Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración.

Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a través de los geles según la concentración de agarosa. En función de la concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 %.

2) ¿En qué ocasiones se recomienda usar geles de poliacrilamida?

Por sus beneficios y Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolución y gran versatilidad. Además, poseen una serie de ventajas tales como: ser químicamente inertes, estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica y fáciles de generar mediante la polimerización de acrilamida. En la mayoría de los casos, el gel se dispone entre dos receptáculos independientes y separados que contienen tampón de electroforesis y los electrodos positivo y negativo, de forma que la conexión eléctrica entre ambos receptáculos sólo es posible a través del gel. Una vez que la electroforesis ha tenido lugar, el gel de poliacrilamida se puede teñir, documentar o incluso se puede purificar la molécula de interés cortando literalmente el fragmento del gel.

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3) Si la siguiente es una corrida electroforética de una secuenciación por el método de Sanger, determine la secuencia nucleotídica original.

Secuencia de 5” a 3”:

GTCAGAGAAAGGGTCGGTTCTATAGGCAGTGGTCCGAT

Secuencia de 3” a 5”:

CAGTCTCTTTCCCAGCCAAGATATCCGTCACCAGGCTA

BIBLIOGRAFÍA

Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim

http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n#extraccionadn_medicina_la_concentraci.C3.B3n

http://www.elergonomista.com/biologia/genetica57.html

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