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Clave: FER36PAT20111215

EVALUACION Y CINETICA DE CRECIMIENTO DE

LACTOBACILLI UTILIZANDO FRUCTANOS DE AGAVE

Anel Karina Bernal Martínez, Patricia Araceli Santiago García,

Mercedes Guadalupe López Pérez

DIRECCIÓN DE LOS AUTORES

Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional

CIIDIR-IPN Oaxaca, Oax., 68030 y Depto. de Biotecnología y Bioquímica, Centro de

Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Campus Guanajuato, Irapuato Gto.,

36500 México.

CORREO ELECTRÓNICO

[email protected]







2288 aall 3300 ddee MMaarrzzoo ddeell 22001122 -- IIxxttaappaa--ZZiihhuuaattaanneejjoo GGuueerrrreerroo,, MMééxxiiccoo.. ee--mmaaiill:: ccoolleeggiiooiibbqq@@hhoottmmaaiill..ccoomm wwwwww..ccmmiibbqq..oorrgg..mmxx

INTRODUCCIÓN

Los prebióticos son ingredientes

alimentarios no digeribles con efectos

benéficos por su capacidad de estimular el

crecimiento o la actividad de bacterias

probióticas en el colon, y de este modo

mejorar la salud del anfitrión. Estos a su

vez son fermentados por probióticos que

son microorganismos vivos con efectos

beneficos para el anfitrión y para la

mejora del equilibrio de la flora intestinal

(Astiasarán y col. 2003). Dentro de los

probióticos más populares se encuentran

los del género: Lactobacillus,

Streptococcus y Bifidobacterium (Chow,

2002). Los fructanos de agave son

carbohidratos no digeribles y

fermentables que por su estructura

(Mancilla-Margalli y López 2006) son

considerados como prebióticos. La

extracción de los fructanos, es una

alternativa para los productores de agave

en Oaxaca, la producción es de 130,240

toneladas, del cual solo se cosecha el

27%, de modo que se cuenta con la

disponibilidad de la materia prima para su

obtención, además de su importancia

como prebiótico.

OBJETIVO

Evaluar la cinética y el crecimiento de

cuatro cepas de Lactobacilli

(Lactobacillus acidophilus, L. casei, L.

paracasei y L. rhamnosus), utilizando

como fuente de carbono fructanos de

Agave angustifolia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los fructanos utilizados se obtuvieron de

Agave angustifolia Haw., de 8 años de

edad, provenientes de Totolapan,

Tlacolula Oaxaca.

Bacterias

Cuatro cepas de Lactobacillus a) L.

acidophilus LA-2 25302; b) L. casei

LCC-1 53103; c) L. paracasei LPC-1 393

y d) L. rhamnosus LR 4356 fueron

probadas como probióticas siguiendo el

método reportado por Gibson y Wang

(1994).

Diseño experimental

El experimento se estableció con un

arreglo factorial 4x5x2. Los factores de

estudio fueron: 1) Cuatro cepas de

Lactobacillus; 2) cinco diferentes fuente

de carbono: fructanos de A. angustifolia

cadena larga (A), cadena corta (B) y

totales (C) y dos tipos de inulina de

achicoria Raftiline (RN) y Raftilose (RS)

3) la obtención de los fructanos de agave,

fueron extraídos por dos métodos:

convencionalmente (C): utilizando

solución etanol-agua y secados por

aspersión (100-80°C) y extraídos solo con

agua (H) clarificado con carbón activado

y secados por convección a 50°C.

Identificación de fructooligosacáridos

(FOS) y contenido de carbohidratos

Se utilizaron placas de gel sílice para

cromatografía en capa fina, para

visualizar la separación de compuestos se

utilizó un revelador específico para

azúcares. En la placa de gel de sílice se

aplicaron 10 µL de cada muestra








utilizando los estándares de glucosa,

fructosa, sacarosa, 1-kestosa, 1,1-

kestotetraose, 1,1,1-kestopentaose. La

determinación de azúcares directos,

totales y fructosa fueron realizados por

métodos colorimétricos.

Cinética de crecimiento

Se utilizó el 1% de cada fuente de

carbono y se disolvieron con caldo MRS

(Man-Rogosa-Sharpe), el medio de

cultivo y la fuente de carbono se

esterilizaron en un autoclave marca

Market Forge-Sterilmatic, posteriormente

se inoculó el 1% de bacterias y se

incubaron a 37 ºC en condiciones

anaeróbicas, midiendo su crecimiento

por densidad óptica a 600 nm, a

diferentes tiempos; t=0, 2, 4, 6, 9,12, 15,

18, 24 y 30 horas.

Crecimiento bacteriano

El crecimiento bacteriano de

Lactobacillus acidophilus, L. casei, L.

paracasei y L. rhamnosus, fueron

evaluadas como cepas probióticas,

siguiendo la metodología de Gibson y

Wang (1994) con una concentración de

10 g/L de fructanos, Raftiline y Raftilose

como única fuente de carbono.

El crecimiento bacteriano fue medido por

densidad óptica a 600 nm en un

espectrofotómetro UV-Visible 1601

marca SHIMADZU y la ingesta de los

fructanos por las bacterias fue evaluada

midiendo los cambios de pH con un

potenciómetro. Los resultados se reportan

como el promedio de tres

determinaciones independientes para cada

caso.

Análisis estadístico

El análisis estadístico fue realizado

usando SAS para Windows versión 8. El

procedimiento GLM y la prueba de

Tukey fueron usados para determinar las

diferencias significativas entre las

poblaciones bacterianas usando los

diferentes fructanos. Diferencias fueron

consideradas significativas cuando P <

0.05.

DESARROLLO

Fructanos

Bifidobacterias y lactobacilli

Fermentación

Acetato, propionato

H2, H2S, CO2 y

CH4

Lactato y succinato

Biomasa

Figura 1. Fermentación de fructanos

RESULTADOS Y DISCUSION

Identificación de fructooligosacáridos.

La figura 2 muestra el perfil de una TLC

de los fructanos de A. angustifolia

utilizados. En ella se observa que en (AC)

hubo mayor intensidad de la mancha en la

base del cromatógrafo similares al

estándar de inulina con un DP

aproximado de 20 que en la muestra

(AH), en el cual se observa también la

presencia de fructanos de cadena corta o

de menor grado de polimerización (DP) y

con mayor intensidad fructosa y glucosa;

este hecho se puede asociar a que hubo

una hidrólisis mayor en (AH), debido al

método de extracción utilizado y al ser








secado por convección, comparado con

(AC).

Figura 2. TLC de Fructano de cadena larga

convencional (AC) y en agua (AH); fructano de cadena

corta convencional (BC) y en agua (BH); fructanos

totales convencional (TC) y en agua (TH). Estándares:

F=fructosa; G=glucosa; S=sacarosa; 1-kestosa (DP3);

1,1 kestotetraose (DP4) y 1,1,1 kestopentaose (DP5) e

inulina de achicoria.

Tabla 1. Contenido de azúcares en los fructanos de A.

angustifolia secos

Fructano

Carbohidratos

totales

mg/g

Reductores

directos

mg/g

Fructosa

mg/g

AC 878.16 79.72 385

AH 726.21 135.25 280

BC 579.86 124.75 275

BH 511.01 90.79 410

TC 892.52 82.67 585

Se observa que la producción de

azúcares libres se debió a la hidrolisis de

los fructanos de cadena corta durante la

extracción. Además de que la velocidad

de formación de fructosa durante la

hidrólisis depende de la longitud de la

cadena para transformarse en fructosa.

Cinética de crecimiento

La figura 3 muestra las cinéticas de

crecimiento de las cuatro cepas de

Lactobacillus en fructanos de cadena

larga de A. angustifolia extraídos de

forma convencional y secados por

aspersión a una temperatura de 100-80 ºC

(AC). En ella observamos que cada cepa

de Lactobacillus tuvo un comportamiento

diferente con este susbtrato. L.

rhamnosus, tuvo una fase lag más corta,

teniendo una tasa de crecimiento

específico ( =0.3256 h-1

) mayor que los

otros Lactobacillus, y un tiempo de

duplicación menor (2.1288 h).

Figura 3. Cinética de crecimiento de L. acidophilus

(L.a); L. casei (L.c); L. paracasei (L.pc) y L. rhamnosus

(L.r), utilizando como fuente de carbono (AC).

Utilizando los fructanos de alto DP

extraídos en agua (AH), se observa que

la cinética de crecimiento de las cuatro

cepas de Lactobacillus, en donde L.

acidophilus tuvo una fase exponencial

con un coeficiente de determinación de

r2=0.9752, lo que indica que el 97.52% de

la variación en el crecimiento del

lactobacilli se debió a la relación lineal

que existe entre el tiempo de incubación y

la fuente de carbono, la cual cómo








podemos ver fue más eficiente para L.

acidophilus. Con respecto a L. casei se

encontró un r2= 0.9520 ligeramente

menor que para L. acidophilus pero muy

similar a la de L. paracasei y L.

rhamnosus los cuales tuvieron un

coeficiente de determinación similar. El

comportamiento de los lactobacilos

usando como substrato (BH), fue similar

para L. acidophilus y L. casei en la fase

lag a diferencia del L. rhamnosus que

resultó más corta que en las anteriores,

en el caso de L. paracasei se encontró que

la fase lag fue más larga que para L.

rhamnosus (Fig.4). De la comparación de

los substratos (BC) y (BH) el mejor

crecimiento de estas bacterias fue con

(BC), ya que el crecimiento de los

lactobacilos en (BH) no tuvieron el mejor

rendimiento como substrato

probablemente por la deficiencia del

método de secado y tal vez a una

caramelización de los azúcares los cuales

ya no puedieron ser utilizados

0

0.5

1

1.5

2

0 10 20 30 40

D.O

a 6

00 n

m

Tiempo, hr

L.a L.c

L.pc L.r

Figura 4. Cinética de crecimiento de L. acidophilus

(L.a); L. casei (L.c); L. paracasei (L.pc) y L. rhamnosus

(L.r), utilizando como fuente de carbono (BH).

Efecto de los fructanos de agave sobre

el crecimiento de Lactobacilli

El crecimiento del L. acidopilus se

muestra en la figura 5, en ella se observa

que no hubo diferencia significativa en

los fructanos (BH y TH) además del

estándar (RN). Raftilose (RS) resultó el

mejor substrato, seguido de fructanos de

agave de alto DP extraído en agua (AH)

este probablemente porque fue

hidrolizado más durante su extracción y

secado, y por lo tanto incrementó la

presencia de fructanos de DP corto, así

como azúcares libres, que seguramente

fueron consumidos primero por los

lactobacilos antes de comenzar a degradar

las cadenas ramificadas de los fructanos

de agave.

Figura 5. Crecimiento de L. acidophilus. Valores con

letras diferentes fueron significativamente diferentes

(P 0.05).

L. acidophilus con el susbstrato (BC) tuvo

un buen crecimiento (DO=1.3532) y con

(BH) un crecimiento de OD=1.2667.

Esto concuerda con estudios realizados

por (Biedrzycka y Bielecka, 2004;

Roberfroid y col. 1998) en que los

fructanos de cadena corta son mejor

utilizados como fuente de carbono para

las bifidobacterias y lactobacilos.

Santiago y López (2009) reportaron

mayor crecimiento de L. acidophilus en

fructanos de A. angustifolia de cadena

corta resultando el mejor tratamiento que








los estándares (Raftiline y Raftilose

Synergy 1), sin embargo en los fructanos

de cadena larga el crecimiento de esta

bacteria resultó por debajo de los

fructanos de cadena corta y de los de tipo

comercial. El resultado obtenido del

crecimiento del L. acidophilus, se puede

comparar con las cinéticas anteriores para

esta misma bacteria, el cual coincide en

que fue el lactobacilo que mayor

crecimiento tuvo en cada substrato

utilizado con respecto a las otras cepas.

Los fructanos de agave evaluados fueron

degradados por el L. acidophilus,

seguramente por enzimas β-fructosidasa,

el cual se ha encontrado en el genoma de

algunas cepas de Lactobacillus (Makras y

col. 2005). Para el caso del crecimiento

de L. casei (Fig. 6) utilizando los

fructanos de A. angustifolia fue en

general menor que el presentado por L.

acidophilus, L. paracasei y L. rhamnosus.

Figura. 6. Crecimiento de L. casei

Para el crecimiento del L. paracasei, el

mejor substrato considerado por el efecto

que tuvo en el crecimiento de esta

bacteria es el AH, (DO=1.0395), otro

substrato en el que hubo también mayor

crecimiento fué el de cadena corta BC,

(DO=0.9247), estos fructanos resultaron

mejor fuente de carbono que los

estándares Raftiline y Raftilose.

En cuanto a los fructanos BH y TH no

hubo diferencia significativa, lo mismo

con los fructanos AC y Raftiline.

CONCLUSIONES

El método de extracción y secado tuvo un

efecto significativo en el contenido de

fructanos de cadena corta. De la cinética

de crecimiento observamos que

dependiendo de la capacidad de cada

lactobacilli se lleva a cabo su duplicación.

A mayor contenido de fructanos de

cadena corta se incrementa el crecimiento

de las cepas de lactobacilli.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Mancilla-Margalli NA, López MG. 2006.

Journal of Agricultural and Food

Chemistry 54, 7832-7839

Gibson GR, Wang X. 1994. Food

Microbiology 11, 491-498

Biedrzycka E, Bielecka M. 2004. Trends

in Food Science and Technology 15: 170-

175

Makras L, Van Acker G, De Vuyst L.

2005. Applied and Environmental

Microbiology. Vol. 71, 11: 6531-6537.

Santiago GP, López MG. 2009. Dynamic

Biochemistry, Process Biotechnology and

Molecular Biology 3.

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