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EVALUACIÓN DE PELÍCULAS DE QUITOSANO SUPLEMENTADAS CON
ACEITES ESENCIALES DE ORÉGANO (Origanum vulgare L.) Y ROMERO
(Rosmarinus officinalis) COMO POSIBLES AGENTES ANTIMICROBIANOS Y
ANTIOXIDANTES
Trabajo de grado presentado para optar por el título de Ingeniero de Materiales
Leidy Vanessa Monsalve Moreno
Directores
Mayra Eliana Valencia Zapata
Master en Ingeniería de Materiales
Carlos David Grande Tovar
Doctor en Ciencias Químicas
Universidad de San Buenaventura
Facultad de Ingeniería
Ingeniería de Materiales
Santiago de Cali – Valle del Cauca
2014
TABLA DE CONTENIDO
Introducción ............................................................................................................................ 1
Justificación ............................................................................................................................ 2
Objetivos ................................................................................................................................. 3
Objetivo general .......................................................................................................................... 3
Objetivos específicos................................................................................................................... 3
Estado del arte ......................................................................................................................... 4
La quitina 4
El quitosano 4
Aplicaciones de la quitina y el quitosano .................................................................................... 7
Aceites esenciales ........................................................................................................................ 8
Orégano ................................................................................................................................... 9
Romero .................................................................................................................................... 9
Proceso de hidrodestilación ....................................................................................................... 10
Películas biodegradables ........................................................................................................... 11
7Patógenos 12
Bacteria Escherichia coli (E. coli) ......................................................................................... 12
Bacteria Bacillus subtilis (B. subtilis).................................................................................... 13
Fabricación de películas de quitosano para recubrimiento de alimentos a partir de quitosano 13
Películas de quitosano con sorbato de potasio....................................................................... 13
Películas de quitosano con aceites esenciales de comino y clavo ......................................... 14
Películas de quitosano con aceite esencial de canela ............................................................ 14
Películas de quitosano con aceite esencial de romero ........................................................... 14
Películas de quitosano con aceite esencial de limón ............................................................. 15
Películas de quitosano con aceite esencial de tomillo ........................................................... 15
Películas de quitosano con aceite esencial Boiss y extracto de semilla de uva ..................... 15
Películas de quitosano contra diferentes bacterias ................................................................ 16
Metodología experimental .................................................................................................... 17
Materiales 17
Diseño experimental .................................................................................................................. 17
Descripción de la unidad experimental ................................................................................. 17
Factores, niveles y tratamientos............................................................................................. 19
Extracción y obtención de quitosano ........................................................................................ 20
Limpieza ................................................................................................................................ 20
Secado .................................................................................................................................... 21
Trituración ............................................................................................................................. 21
Despigmentación ................................................................................................................... 21
Desmineralización ................................................................................................................. 22
Desproteinización .................................................................................................................. 22
Desacetilación ........................................................................................................................ 23
Caracterización del quitosano ................................................................................................... 23
Titulación potenciométrica .................................................................................................... 23
Determinación del peso molecular ........................................................................................ 24
Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) ........................................... 25
Caracterización de las plantas ................................................................................................... 25
Clasificación taxonómica ...................................................................................................... 25
Determinación del Contenido de humedad ........................................................................... 26
Extracción del aceite esencial ................................................................................................ 26
Análisis por cromatografía de gases ...................................................................................... 27
Preparación de las películas de quitosano ................................................................................. 28
Caracterización películas de quitosano ..................................................................................... 28
Propiedades físicas de las películas ....................................................................................... 28
Microscopia electrónica de barrido (SEM) ........................................................................... 31
Microscopia de fuerza atómica (AFM) ................................................................................. 31
Contenido total de fenoles (TPC) .......................................................................................... 32
Actividad antioxidante ........................................................................................................... 33
Propiedades mecánicas .......................................................................................................... 33
Actividad antimicrobiana ...................................................................................................... 34
Discusión y análisis de resultados......................................................................................... 36
Extracción y obtención de quitosano ........................................................................................ 36
Caracterización del quitosano ................................................................................................... 37
Titulación potenciométrica .................................................................................................... 37
Determinación del peso molecular ........................................................................................ 39
Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) ........................................... 41
Caracterización de las plantas ................................................................................................... 44
Clasificación taxonómica ...................................................................................................... 44
Contenido de humedad de las plantas.................................................................................... 45
Extracción del aceite esencial ................................................................................................ 46
Análisis por cromatografía de gases ...................................................................................... 49
Preparación de la película de quitosano .................................................................................... 52
Caracterización películas de quitosano ..................................................................................... 53
Propiedades físicas de las películas ....................................................................................... 53
Microscopia electrónica de barrido ....................................................................................... 59
Microscopia de fuerza atómica .............................................................................................. 61
Contenido total de fenoles ..................................................................................................... 64
Actividad antioxidante (DPPH) ............................................................................................. 65
Propiedades mecánicas .......................................................................................................... 66
Actividad antimicrobiana ...................................................................................................... 67
Conclusiones ......................................................................................................................... 71
Bibliografía ........................................................................................................................... 72
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Capacidad antioxidante y contenido total de fenoles del orégano y el romero. 9
Tabla 2. Factores, niveles y tratamientos del primer experimento. 20
Tabla 3. Factores, niveles y tratamientos del segundo experimento. 20
Tabla 4. Parámetros viscosimétricos. 24
Tabla 5. Estandarización de color según la diferencia total de color (ΔE) 31
Tabla 6. Parámetros para la extracción de quitosano a partir de exoesqueleto de camarón. 36
Tabla 7. Datos de la titulación potenciométrica del quitosano experimental y el quitosano
comercial. 38
Tabla 8. Medidas viscosimétricas de quitosano comercial al 1% v/v de ácido acético a 25°C. 39
Tabla 9. Medidas viscosimétricas de quitosano experimental al 1% v/v de ácido acético a 25°C.
39
Tabla 10. Clasificación taxonómica planta 1 (Origanum vulgare L. L.) 44
Tabla 11. Clasificación por parámetros físicos planta 1 (Origanum vulgare L. L.) 44
Tabla 12. Clasificación taxonómica planta 2 (Rosmarinus officinalis.) 45
Tabla 13. Clasificación por parámetros físicos planta 2 (Rosmarinus officinalis.) 45
Tabla 14. ANOVA de dos factores: rendimiento (ml/g) vs. Tipo de planta*tiempo de secado. 47
Tabla 15. Método de Tukey con una confianza de 95,00%. 48
Tabla 16. Composición química de AEO (Origanum vulgare L.). 50
Tabla 17. Composición química de AER (Rosmarinus officinalis). 51
Tabla 18. Datos del análisis termo gravimétrico de las películas de quitosano comercial
suplementadas con aceites esenciales. 57
Tabla 19. Ángulos de contacto de las películas de quitosano. 58
Tabla 20. Colorimetría y opacidad de las películas de quitosano. 59
Tabla 21 Rugosidad de las películas de quitosano comercial suplementadas con aceites
esenciales 62
Tabla 22. Propiedades mecánicas de las películas de quitosano 66
Tabla 23. Porcentaje de inhibición de películas de quitosano suplementadas con aceites
esenciales. 68
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura de la quitina. 4
Figura 2. Estructura química de la quitina y el quitosano. 5
Figura 3. Estructura y carácter catiónico del quitosano en disolución ácida. 6
Figura 4. Esquema secuencial de la actividad antimicrobiana del quitosano. 7
Figura 5. Esquema del proceso de hidrodestilación. 11
Figura 6. Unidad experimental. 18
Figura 7. Diagrama de bloques que describe el diseño experimental del primer experimento. 18
Figura 8. Diagrama de bloques que describe el diseño experimental del segundo experimento. 19
Figura 9. Montaje del proceso de hidrodestilación (A), hidrodestilación de orégano (B),
hidrodestilación de romero (C) y obtención de aceite esencial (D). 27
Figura 10. Titulación potenciométrica del quitosano experimental y el quitosano comercial. 38
Figura 11. Curva de viscosidad reducida vs concentración de quitosano comercial en soluciones
al 1% de ácido acético. 40
Figura 12. Curva de viscosidad reducida vs concentración de quitosano experimental en
soluciones al 1% de ácido acético. 40
Figura 13. FTIR de quitina experimental. 42
Figura 14. FTIR de quitosano experimental. 43
Figura 15. FTIR de quitosano comercial. 43
Figura 16. Extracción de aceite esencial de romero y orégano a diferentes tiempos de secado (5,
10 y 15 horas). 46
Figura 17. Interacción del tipo de planta según el rendimiento (ml/g). 49
Figura 18. Película de quitosano experimental PQE (A), película de quitosano comercial PQC
(B), PQC con 0,4% orégano (C), PQC con 1,5% orégano (D), PQC con 0,4% romero (E) y PQC
con 1,5% romero (F). 52
Figura 19. Espesor de las películas. 53
Figura 20. Porcentaje de humedad de las películas. 54
Figura 21. Análisis termogravimétrico de las películas de quitosano comercial suplementadas
con aceites esenciales. 56
Figura 22. DTGA de las películas de quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales.
56
Figura 23. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la película (A) control de
quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de orégano y (C) con 1,5% de aceite esencial de
orégano. 60
Figura 24. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la sección transversal de la
película (A) control de quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de orégano y (C) con 1,5% de
aceite esencial de orégano. 60
Figura 25. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la superficie de las películas (A)
con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial de romero. 61
Figura 26. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la sección transversal de las
películas (A) con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial de
romero. 61
Figura 27. AFM película de quitosano con aceite esencial de orégano al 0,4% (a) y AFM película
de quitosano con aceite esencial de orégano al 1,5% (b). 63
Figura 28. AFM película de quitosano con aceite esencial de romero al 0,4% (a) y AFM película
de quitosano con aceite esencial de romero al 1,5% (b) 63
Figura 29. Curva de calibración del ácido gálico equivalente. 64
Figura 30. Contenido total de fenoles para las películas de quitosano suplementadas con aceites
esenciales de orégano y romero. 64
Figura 31. Captación de radical libre de las películas. 66
Figura 32. Porcentaje de inhibición de las películas de quitosano frente a E. coli y B. Subtillis. 68
Figura 33. Porcentaje Inactivación de E. coli de las películas de quitosano suplementadas con
aceites esenciales. 69
Figura 34. Porcentaje Inactivación de B. subtilis de las películas de quitosano suplementadas con
aceites esenciales. 69
RESUMEN
En este trabajo se presentan los resultados obtenidos implementando películas de
quitosano suplementadas con aceites esenciales de orégano y romero, a concentraciones del 0,4%
y 1,5% (v/v), en donde se evaluó su comportamiento como agentes antioxidantes y
antimicrobianos frente a las bacterias patógenas E. coli y B. subtilis. La incorporación de aceites
esenciales permitió mejorar las propiedades físicas, antioxidantes y antimicrobianas de las
películas, siendo la película con aceite de romero en una concentración del 1,5 % (v/v), el
resultado más promisorio de la investigación. La película con aceite de romero al 1,5% obtuvo
los siguientes resultados: en la colorimetría se obtuvo una diferencia total de color de de 11,83 ±
1,56, acorde con la norma ISO 12647-2 un contenido total de fenoles del 0,0523 mg de ácido
gálico equivalente (AGE)/g de película, captación de radical libre del 16,47% y porcentaje de
inhibición del 11,96% y 36,29% frente a E. coli y B. subtilis, respectivamente.
Palabras claves: Películas de quitosano, aceites esenciales, capacidad antioxidante,
actividad antimicrobiana, propiedades mecánicas.
ABSTRACT
The results obtained by implementing chitosan films supplemented with essential oils of
rosemary and oregano, at concentrations of 0.4% and 1.5% (v / v), where their performance was
evaluated as antioxidants and antimicrobials are presented in this work against pathogenic E. coli
and B. subtilis. Incorporating essential oils allowed improve physical, antioxidants and
antimicrobial properties of the films, the film being rosemary oil at a concentration of 1.5% (v /
v), the most promising research result. The film with rosemary oil 1.5% obtained the following
results: a total difference colorimetry color quality is obtained according to the ISO 12647-2
standard with a value of 11.83 ± 1.56, total content 0.0523 mg gallic acid equivalent (GAE) / g
of film, free radical capture 16.47% and percent inhibition of 11.96% and 36.29% against E. coli
and B. subtilis, respectively.
Keywords: Chitosan films, Essential oils, Antioxidant capacity, Antimicrobial activity,
Mechanical properties.
1
INTRODUCCIÓN
El sector alimentario está en constante riesgo de contaminación, debido a todos los
agentes externos a los cuales los alimentos están expuestos, por lo tanto actualmente se estudian
diferentes métodos de conservación de alimentos, libres de preservativos químicos; resaltando la
utilización del quitosano, un biopolímero derivado de los residuos del sector marítimo,
específicamente, de los camarones.
Colombia es uno de los treinta principales países en la actividad de captura de camarón y
langostino, con más de 7.246 toneladas al año (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
Observatorio Agrocadenas Colombia, 2005), lo cual lo convierte en una excelente fuente de
quitosano, permitiendo no solo el desarrollo investigativo, sino también el buen manejo y
aprovechamiento de los residuos generados en la industria marítima, como lo es el caparazón de
los camarones. Estos caparazones se componen principalmente de un polisacárido conocido
como quitina, de la cual se extrae el biopolímero quitosano. El quitosano es un excelente
aspirante para recubrimientos protectores de alimentos, no solo por sus características no tóxicas
y no alergénicas, sino también porque proviene de una fuente renovable, es biodegradable y
posee buenas propiedades antimicrobianas (Mármol, y otros, 2011).
La presente investigación pretende evaluar las propiedades antioxidantes y
antimicrobianas de las películas de quitosano frente a algunos agentes externos que deterioran
los alimentos, por medio de la incorporación de aceites esenciales de orégano y romero, para
mejorar la vida útil de los alimentos.
2
JUSTIFICACIÓN
En los últimos años se ha reportado un incremento en las intoxicaciones alimentarias,
provocadas principalmente por alimentos de origen animal, a causa del aumento del comercio
internacional, los cambios en la producción y en el consumo de alimentos, y la aparición de
nuevos patógenos. Lo anterior propicia la investigación y desarrollo de nuevos de materiales que
promuevan la conservación de los alimentos, como lo es el quitosano.
Actualmente, se ha trabajado con películas de quitosano como preservantes en la
industria de alimentos de origen animal, debido al incremento de la contaminación por
microorganismos patógenos los cuales provocan enormes pérdidas en la industria alimentaria y
la economía (FAO/WHO (Food and Agriculture Organization World Health Organization),
2003). Adicionalmente, las películas de quitosano con aceites esenciales son biocompatibles,
biodegradables y seguras para el consumo humano, además se ha investigado su aplicación en la
conservación de alimentos.
El presente trabajo busca evaluar las propiedades de las películas de quitosano frente a la
inhibición de agentes externos que deterioren los alimentos, adicionalmente se pretende
incorporar aceites esenciales en las películas para mejorar sus propiedades antioxidantes y
antimicrobianas, debido a que estos aceites se componen de compuestos fenólicos que facilitan la
preservación de los alimentos frente a la oxidación lipídica.
3
OBJETIVOS
1. Objetivo general
Evaluar las propiedades antimicrobianas y antioxidantes de películas de quitosano
suplementadas con aceites esenciales.
2. Objetivos específicos
• Extraer quitosano a partir de las conchas de camarón.
• Caracterizar fisicoquímicamente el quitosano obtenido.
• Preparar películas de quitosano y suplementarlas con aceites esenciales de
orégano y romero obtenidos por hidrodestilación.
• Evaluar las propiedades físicas (espesor, aspecto, absorción) y mecánicas
(tensión) de las películas.
• Evaluar la capacidad de inhibición de las películas de quitosano
suplementadas con aceites esenciales hacia las bacterias patógenas E. coli y B.
subtilis.
4
ESTADO DEL ARTE
1. La quitina
La quitina es el principal componente de la estructura del exoesqueleto de los animales
invertebrados: crustáceos, insectos y arácnidos; encontrándose presente en algas y en la mayoría
de hongos. (Fornaguera & Gómez, 2004). La quitina es un polisacárido natural de alto peso
molecular, formado por unidades repetidas de n-acetil-d-glucosamina; cabe destacar que es el
polisacárido más abundante en la naturaleza después de la celulosa, y su principal derivado es el
quitosano, el cual es quitina desacetilada.
Adicionalmente la quitina es un biopolímero altamente insoluble en agua, lo cual limita
sus aplicaciones (Investigación y Desarrollo, 2000). Sin embargo, posee una estructura porosa la
cual favorece a una elevada absorción de agua (Ramírez, Rodríguez, Alfonso, & Peniche, 2010).
Figura 1. Estructura de la quitina.
Fuente: (Mármol, y otros, 2011)
2. El quitosano
Es un polisacárido de alto peso molecular, obtenido por desacetilación parcial de la
quitina en donde tiene lugar la sustitución de los grupos acetamido de la misma, por grupos
amino, al tratar la quitina con álcalis fuertes (Mármol, y otros, 2011).
5
El quitosano posee propiedades particulares muy importantes por ser el único poli
electrólito catiónico disponible en la naturaleza. Con respecto a su solubilidad, es soluble en
ácidos orgánicos diluidos, gelificando y coagulando en medio débilmente acido o neutro.
Adicionalmente tiene la capacidad de formar filmes semipermeables al O2 y CO2 y tiene
propiedades anti fúngicas, posibilitando su aplicación en la preservación de alimentos
(Valderrama, 2000).
Figura 2. Estructura química de la quitina y el quitosano.
Fuente: (Flores Vasquez, Ly, Tapia Huanambal, & Maldonado Garcia, 2001)
La composición química de las cadenas de quitosano depende de la fuente y el método de
obtención del mismo (Rhazi, Desbrieres, Tolaimate, Alagui, & Vottero, 2000). Con respecto a la
fuente se pueden distinguir dos tipos de quitosano (Q): el primero α-Q presenta cadenas anti
paralelas y se encuentra presente en la cutícula de crustáceos como cangrejos, camarones,
langostinos, etc. y en menor proporción en la cutícula de hongos, levaduras e insectos; y el
segundo β-Q presenta cadenas paralelas y se obtiene desde la pluma cartilaginosa interna del
endoesqueleto de calamares. En relación al método de obtención del quitosano, se ha reportado
que el más utilizado es la metodología de evaporación del solvente y moldeado (Tolaimate, y
otros, 2000).
6
Cabe señalar que la variabilidad de la actividad antimicrobiana del quitosano y su
capacidad inhibitoria es influenciada por el tipo de quitosano (α –β-quitosano), el grado de
desacetilación, el peso molecular, el organismo blanco y las condiciones del medio en que se
deposita (pH).
Adicionalmente, los mecanismos de acción antimicrobiana del quitosano están vinculados
a su estructura química y difieren del microorganismo (Hernandez-Lauzardo, y otros, 2008), a
continuación se nombran los tipos de mecanismos que se presentan:
Carácter catiónico: Se basa en las cargas positivas que posee el quitosano (NH3+), las
cuales juegan un papel importante en la actividad antibacteriana de las membranas
celulares de los microorganismos (Rabea, Badawy, Stevens, Smagghe, & Steurbaut,
2003), debido a que el quitosano forma canales de transporte de moléculas mediante
bicapas lipídicas artificiales, lo cual presume que el quitosano puede desorganizar la
membrana celular (Zakrzewska, y otros, 2007).
Figura 3. Estructura y carácter catiónico del quitosano en disolución ácida.
Fuente: (Valenzuela V. & Arias, 2012)
7
Agente quelante: El quitosano tiene la capacidad de actuar como agente quelante, por
medio de la formación de complejos con metales trazas (como Ni2+, Cu2+ y otros) y en
condiciones acidas, permitiendo la inhibición del desarrollo microbiano de los
microorganismos (Rabea, Badawy, Stevens, Smagghe, & Steurbaut, 2003).
Penetración al interior de la célula: En este caso son los oligómeros de quitosano de bajo
peso molecular los que penetran en las células de los microrganismos, impidiendo el
crecimiento de estas (Tharanathan & Kittur, 2003).
Figura 4. Esquema secuencial de la actividad antimicrobiana del quitosano.
Fuente: (Ikeda, Tazuk, & Suzuki, 1984)
3. Aplicaciones de la quitina y el quitosano
Las aplicaciones de la quitina y sus derivados son extensas, su utilización se encuentra en
la industria de alimentos y bebidas, y en la agricultura. En el primer caso se emplean películas de
quitosano como recubrimientos comestibles, las cuales son resistentes, duraderas y flexibles, con
propiedades mecánicas similares a algunos polímeros comerciales de fuerzas medias. Se ha
Adsorción del quitosano y/o oligómeros de
quitosano sobre la célula bacteriana
Difusión a través de la pared celular e interrupción de
su función
Interrupción de la membrana
citoplasmática
Generación de fugas de los
constituyentes citoplásmaticos
Muerte de la célula
8
comprobado que concentraciones mayores al 0,02% de quitosano, protegen los alimentos frente
al patógeno Escherichia coli (Peral & Gartzia, 2001).
En relación con la agricultura, la adición de quitina y sus derivados al suelo, beneficia al
crecimiento y a la actividad de muchos organismos qutinolíticos, debido a un efecto sinérgico.
La quitina y sus derivados son potenciales sustitutos de los actuales plaguicidas químicos y/o
reguladores del crecimiento de las plantas (Ramírez, Rodríguez, Alfonso, & Peniche, 2010).
Cabe destacar que las propiedades del quitosano son verdaderamente útiles en la
agricultura, debido a su actividad bactericida, actividad fungicida, actividad antiviral,
estimulación del crecimiento e inducción de resistencia; las cuales permiten la preservación de
alimentos y promueven el desarrollo de la agricultura (Lárez Velásquez, 2008).
4. Aceites esenciales
Los aceites esenciales son mezclas de varias sustancias químicas biosintetizadas por las
plantas, que dan el aroma característico a algunas flores, arboles, frutas, hierbas, especias,
semillas y a ciertos extractos de origen animal. Estos presentan propiedades antimicrobianas, las
cuales inhiben el crecimiento de patógenos en los alimentos (Burt, 2004).
En el caso de Colombia, algunas plantas ampliamente reconocidas son: el romero y el
orégano (Secretaria de Agricultura y Pesca), las cuales evidencian propiedades antimicrobianas
como se puede constatar en la Tabla 1.
9
Tabla 1. Capacidad antioxidante y contenido total de fenoles del orégano y el
romero.
Planta Nombre en latín Familia DPPH (mg AAE/g) Fenoles (mg GAE/G)
Orégano Origanum vulgare L. Lamiaceae 209,1 91,4
Romero Rosmarinus officinalis L. Lamiaceae 44,7 -
Orégano
El aceite de orégano es el primer antiséptico natural y posee propiedades de agente
antimicrobiano. Es un agente anti fúngico herbal, no toxico, antibacterial y antioxidante. Con
respecto a la extracción del aceite de orégano, se hace a partir de las hojas principalmente, y se
ha reportado que tanto las hojas como los extractos obtenidos de estas, han inhibido la oxidación
lipídica en sistemas alimentarios, debido a la presencia de varios componentes fenólicos
(Yanishlieva, Marinova, & Pokorny, 2006).
Romero
El aceite de romero posee propiedades antioxidantes, que obedecen al efecto conjugado
del eucaliptol, el pineno y el ácido rosmarínico; en donde los dos primeros pertenecen a
compuestos monoterpenoides que se caracterizan por su interacción con radicales libres, lo que
impide que las reacciones en cadena se lleven a cabo, mientras el ácido rosmarínico es un
compuesto fenólico con cuatro grupos hidroxilo en su estructura, los cuales benefician la
reacción entre el antioxidante y el radical libre para impedir la propagación de más radicales.
(Wang, y otros, 2011)
10
En segundo lugar, el problema de mayor relevancia en el área de alimentos es la
oxidación lipídica, la cual ocasiona efectos adversos en la calidad de los productos y en la salud
humana. Ahora bien una de las formas de contrarrestar este efecto es la adición de antioxidantes
sintéticos, sin embargo actualmente se ha relacionado su ingesta con el desarrollo de
enfermedades cancerígenas lo cual promueve la investigación de fuentes naturales con capacidad
antioxidante, como lo son los aceites esenciales de origen vegetal (Yanishlieva, Marinova, &
Pokorny, 2006).
La capacidad antioxidante está directamente relacionada con la propiedad de inhibición,
la cual es análoga a los compuestos fenólicos que componen las plantas. Estos compuestos son
metabolitos secundarios que se localizan en todas las partes de las plantas y participan en
numerosas funciones, tales como: la asimilación de nutrientes, la fotosíntesis y más importante
aún las propiedades antioxidantes de los alimentos de origen vegetal. Cabe resaltar que la
característica antioxidante de los fenoles se debe a la reactividad del grupo fenol (Robbins, 2003)
(Kähkönen, Marja, Anu, & Heinonen, 2001).
5. Proceso de hidrodestilación
Para la obtención de aceites esenciales se emplea el método de hidrodestilación, el cual
consiste en la destilación de las flores u otras partes de la planta empleando vapor de agua. El
proceso consiste en que el vapor de agua transporta el aceite esencial que contienen las flores,
teniendo en cuenta que el punto de ebullición de la mezcla de aceite esencial más agua es menor
al punto de ebullición del agua, lo cual permite que sea destilada (Sánchez, 2006).
11
Figura 5. Esquema del proceso de hidrodestilación.
Fuente: (Cerpa Chávez, 2007)
6. Películas biodegradables
Las películas comestibles o plásticos biodegradables son aquellos materiales que cuando
son expuestos a condiciones determinadas de humedad, flora microbiana y oxigeno durante un
periodo de varios meses, se transforman en sustancias sencillas (como el agua y dióxido de
carbono (CO2)) y en biomasa mediante la acción enzimática de los microorganismos (bacterias,
hongos et al.) presentes en el medio ambiente. Las películas comestibles se emplean en
diferentes áreas (medicina, agricultura, alimentación, envases y embalaje, entre otros) teniendo
en cuenta las características funcionales que debe presentar el material según la aplicación
específica a la que se destine (Parzanese, 2003).
Las películas de quitosano son empleadas como recubrimiento de alimentos gracias a
que son bioadherentes, altamente biocompatibles, transparentes e incoloras. Una de las
características más representativas para considerarlas películas comestibles es que presentan baja
12
toxicidad, con un DL50 = 16 ml/kg, valor similar al del azúcar y es menos toxico que la sal
(Romanazzi, Nigro, Ippolito, Diverene, & Salerno, 2002).
Adicionalmente la quitina y el quitosano se biodegradan in vivo, haciendo posible que sus
productos de degradación (oligosacáridos o monosacáridos) sean absorbidos o excretados
(Dinesh & Alok, 2000). Lo anterior se fundamenta en que, tanto la quitina como el quitosano son
susceptibles a la hidrólisis enzimática de los enlaces ß (14) mediana por la enzima lisozima, la
cual se encuentra presente en el organismo humano (Castañeda Ramírez, M. de la Fuente
Salcido, Pacheco Cano, Ortiz-Rodríguez, & Barboza Corona, 2011).
7. Patógenos
Las propiedades antimicrobianas de soluciones y películas de quitosano frente a
patógenos como Bacillus subtilis y Escherichia coli, han sido reportadas por diversos autores.
Por ejemplo, se han reportado estudios de las películas de quitosano con capacidad de inhibir B.
subtilis y E. coli presentes en la carne de vacuno (Darmadji & Izumimoto, 1994), la carne de
cerdo (Park, Youn, Kim, & Ahm, 1999) y la salchicha (Rao, Chander, & Sharma, 2005);
adicionalmente E. coli se presenta en el tocino (Lee, Park, & Ahn, 2003), y el filete de bacalao
(Rao, Chander, & Sharma, 2005).
Bacteria Escherichia coli (E. coli)
Es una bacteria anaerobia facultativa con un tipo de metabolismo que es a la vez
fermentativo y respiratorio. Es o no móvil mediante flagelos peritricos. Las cepas de E. coli son
un importante habitante facultativo del intestino grueso, ampliamente distribuido en el intestino
de los seres humanos y animales de sangre caliente y es el anaerobio facultativo predominante en
el intestino y parte de la microbiota esencial que mantiene la fisiología del huésped sano. Por
13
otra parte E. coli es usada como indicador en la contaminación del agua y las heces; sin embargo
es considerada un riesgo de contaminación no solo en el agua, sino también en productos
alimenticios debido al incremento en su contaminación (Torres, 2010).
Bacteria Bacillus subtilis (B. subtilis)
Es una bacteria Gram positiva, catalasa-positiva, aerobio comúnmente encontrada en el
suelo. Miembro del Género Bacillus, B. subtilis tiene la habilidad para formar una resistente
endospora protectora, permitiendo al organismo tolerar condiciones ambientalmente extremas. B.
subtilis no es considerado patógeno humano; sin embargo puede contaminar los alimentos, pero
raramente causa intoxicación alimenticia. Sus esporas pueden sobrevivir la calefacción extrema
que a menudo es usada para cocinar el alimento, y es responsable de causar la fibrosidad en el
pan estropeado (Madigan & Martinko, 2005).
8. Fabricación de películas de quitosano para recubrimiento de alimentos a
partir de quitosano
Se han estudiado diversos tipos de películas de quitosano, como lo son:
Películas de quitosano con sorbato de potasio
La matriz de quitosano fue unida física y covalentemente con sorbato de potasio, el cual
es un efectivo antifúngico de uso alimentario; para recubrimiento de langostino y frutillas,
generando buenos resultados de inhibición microbiológica en las muestras unidas
covalentemente. La unión covalente del sorbato de potasio al quitosano se realizó mediante a
formación de una unión amida con el grupo amino del quitosano y el carboxilato el sorbato de
potasio. El mejor comportamiento fue obtenido por los quitosano de peso molecular medio.
(Avila, y otros, 2010).
14
Películas de quitosano con aceites esenciales de comino y clavo
Se evaluó el efecto de quitosano a diferentes pesos moleculares, para la elaboración de
películas antimicrobianas, adicionando aceites esenciales y extractos funcionales de comido
(Cuminum cymminum L.) y clavo (Eugenia caryophyllata), como agentes antimicrobianos. La
mayor actividad antimicrobiana fue la de las películas de quitosano de bajo peso molecular con
una concentración de aceite esencial de clavo del 2% y el extracto de clavo E7 (Hernández-
Ochoa, Gonzales-Gonzales, Gutiérrez-Mendez, Muñoz-Castellanos, & Quintero-Ramos, 2011).
Películas de quitosano con aceite esencial de canela
Se elaboraron películas de quitosano, con adición de aceite esencial de canela a una
concentración de 0,4 %, 0,8 %, 1,5% y 2 % (v/v), a las cuales se evaluaron sus propiedades
antimicrobianas, físicas y mecánicas. El resultado de la investigación fue que la incorporación de
aceite de canela aumentó la actividad antimicrobiana de las películas. Las películas que
contienen aceite de canela son útiles para el recubrimiento de alimentos altamente perecederos
como el pescado y aves de corral (Ojagh S. , Rezaei, Razavi, & Hosseini, 2010).
Películas de quitosano con aceite esencial de romero
Se adicionaron nano partículas de arcilla montmorillonita y aceite esencial de romero
para mejorar las propiedades físicas y mecánicas de las películas de quitosano, y a su vez
mejorar su comportamiento antioxidante y antimicrobiano. Las partículas fueron adicionadas de
1 a 5% en peso, y el aceite esencial en concentraciones de 0,5 %, 1 % y 1,5 % v/v. La
compatibilidad del aceite esencial de romero con el nanocomposite de quitosano con arcilla fue
comprobada en orden para producir una actividad bionanocompuesta para empaques de
alimentos (Abdollahi, Rezaei, & Farzi, 2012).
15
Películas de quitosano con aceite esencial de limón
Se evaluó el efecto de la adición de aceite esencial de limón a concentraciones de 0,5%,
1% y 2% v/v y de diferentes surfactantes (Tween 80 y Span 80) a una concentración de 0,1%
v/v, sobre las propiedades físicas, ópticas y estructurales de las películas de quitosano. La
incorporación del aceite esencial de limón disminuyo el contenido de humedad, la permeabilidad
a vapor de agua y las propiedades mecánicas. Con respecto a los tipos de surfactante, Tween 80
mejoro la estabilidad del aceite en la película, mientras que Span 80 provoco burbujas de aceite
en la superficie de la película (Peng, Yin, & Li, 2013).
Películas de quitosano con aceite esencial de tomillo
Se evaluó el efecto de la adición de aceites esenciales de tomillo: Thymus moroderi (TM)
y Thymus piperella (TP), de las películas de quitosano sobre la actividad antibacteriana,
contenido total de fenoles y actividad antioxidante. En relación a la actividad antibacteriana las
películas con aceite TP fueron más efectivas contra Serratia marcenscens y Listeria innocua en
comparación con las que contenían aceite TM. Y con respecto a la actividad antioxidante, esta
fue mayor en las películas con aceite TM (Ruiz Navajas, Viuda Martos, Sendra, Perez Alvarez,
& Fernandez Lopez, 2013).
Películas de quitosano con aceite esencial Boiss y extracto de semilla de uva
Se elaboraron películas de quitosano suplementadas con aceite esencial Boiss Zataria
multiflora (BZM) en concentraciones de 5 y 10 g/L y extracto de semilla de uva (ESU) a una
concentración de 10 g/L; a las cuales se evaluaron sus propiedades físicas, mecánicas y
antioxidantes. La adición de BZM y ESU incremento la mojabilidad de la superficie, el
contenido total de fenoles y la actividad antioxidante (Moradi, y otros, 2012).
16
Películas de quitosano contra diferentes bacterias
Se evaluó la incorporación de ácido gálico a diferentes concentraciones en las películas
de quitosano, sobre las propiedades antimicrobianas, físicas, mecánicas y estructurales. Las
películas de quitosano a una concentración de 1,5g/100 g de ácido gálico, presentaron la mayor
la actividad antimicrobiana frente a las bacterias Escherichia coli, Salmonella typhimurium,
Listeria innocua y Bacillus subtilis. El esfuerzo a la tensión se benefició con la concentración de
0, 5g/100 g de ácido gálico; sin embargo la permeabilidad a vapor de agua y permeabilidad al
oxigeno disminuyó a esta concentración (Sun, Wang, Kadouh, & Zhou, 2014).
17
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
1. Materiales
Para la realización de la metodología experimental se utilizaron dos tipos de quitosano:
Quitosano extraído: el cual se obtuvo de los caparazones de camarón titi
de la especie Xiphopenaeus riveti, del Puerto de Buenaventura, Valle del Cauca.
Quitosano comercial: de mediano peso molecular y grado de
desacetilación de 64,17% (Sigma-Aldrich).
Los aceites esenciales de orégano y de romero fueron obtenidos por medio del proceso de
hidrodestilación. Adicionalmente, se empleó el reactivo ácido acético marca Sigma Aldrich,
ácido ascórbico marca Honeywell; y los reactivos de ácido gálico, metanol, acetona, glicerina y
Folin Cicaltou, todos de marca Merck.
2. Diseño experimental
La metodología experimental utilizada para el desarrollo de este proyecto se presenta en
las Figura 7 y 8. Como primer experimento se determinó el efecto que ejerce el tiempo de secado
sobre el rendimiento de las plantas de orégano y romero; seguido se planteó un segundo
experimento con el fin de determinar el efecto que ejerce la adición de aceite esencial de orégano
y romero, a diferentes concentraciones, sobre las propiedades: físicas, mecánicas, antioxidantes
y antimicrobianas de las películas de quitosano comercial.
Descripción de la unidad experimental
Película de quitosano de mediano peso molecular y un grado de desacetilación de
64,17%, la adición de los aceites esenciales se realizó paralelamente a la preparación de la
18
película por medio de una solución acuosa (1 % v/v) de ácido acético glacial para una
concentración de 2 % (p/v), con adición del aceite esencial en concentraciones del 0, 0,4 y 1,5 %
(v/v). Todas las películas provienen del mismo lote de quitosano con el fin de garantizar que su
composición química es homogénea. En la Figura 6 se puede observar la unidad experimental.
Figura 6. Unidad experimental.
Figura 7. Diagrama de bloques que describe el diseño experimental del primer
experimento.
19
Figura 8. Diagrama de bloques que describe el diseño experimental del segundo
experimento.
Factores, niveles y tratamientos
En la Tabla 2 se muestran los factores, niveles y tratamientos utilizados en el diseño
experimental del primer experimento. Variables como temperatura, peso de las plantas y tiempo
de hidrodestilación permanecieron constantes.
20
Tabla 2. Factores, niveles y tratamientos del primer experimento.
Factores Niveles Tratamientos
Tipo de planta 1. Orégano
2. Romero
1 - 1
1 - 2
1 - 3
2 - 1
2 - 2
2 - 3
Tiempo de secado (horas) 1. T1: 5 horas
2. T2: 10 horas
3. T3: 15 horas
En la Tabla 3 se muestran los factores, niveles y tratamientos utilizados en el diseño
experimental del segundo experimento. Variables como temperatura, adición de plastificante,
adición de surfactante, velocidad de agitación y tiempo de secado permanecieron constantes.
Tabla 3. Factores, niveles y tratamientos del segundo experimento.
Factores Niveles Tratamientos
Tipo de aceite 1. Orégano
2. Romero
1 - 1
1 - 2
1 - 3
2 - 1
2 - 2
2 - 3
Concentración de aceite (%) 1. C1: 0,0
2. C2: 0,4
3. C3: 1,5
3. Extracción y obtención de quitosano
La extracción obtención de quitosano a partir de caparazones de camarón se basó en la
metodología reportada por Mármol et al. (2004) y Teli & Sheikh (2012), la cual se describe a
continuación:
Limpieza
Se tomaron 500 gramos de caparazón de camarón y pasaron por un proceso de lavado con
agua destilada, adicionalmente se agregó en una solución no jabonosa con base en O2 y sin cloro
21
(Vanish®); previamente se extrajeron manualmente las extremidades del caparazón del camarón
tales como son las patas, antenas, cola y demás residuos de carne existentes.
Secado
Se realizó un proceso de secado a la muestra de 400 gramos de caparazón de camarón, a
una temperatura de ±110°C durante 4 horas aproximadamente o hasta obtener un peso constante
de la muestra; para extraer el exceso de agua y facilitar el proceso de trituración.
Trituración
Para el proceso de trituración de caparazón de camarón se empleó un molino IKA M20;
el proceso consistió en ciclos de 10 segundos de triturado y 5 segundos entre ciclos. La cantidad
de muestra por ciclo fue de 50 gramos, realizando 8 ciclos en total. Posteriormente la muestra
triturada se pasó por un tamiz N°60 (250 micras de abertura), para garantizar un tamaño de grano
fino.
Despigmentación
Consistió en retirar los pigmentos o la coloración rosada característica del caparazón
(exoesqueleto) de camarón titi. Para el proceso se empleó acetona, y una relación de 1:6
peso/volumen (p/v), es decir, por cada gramo de materia prima se agregaron 6ml de solución; se
trabajó a temperatura ambiente durante 2 horas, y seguidamente se filtró el material más la
solución con agua caliente por medio de un equipo de filtración basado en una bomba de vacío.
Finalmente, se secó el material filtrado a una temperatura de ±110°C durante 4 horas
aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del polvo.
22
Desmineralización
A continuación se realiza el proceso de desmineralización, el cual consiste en retirar los
carbonatos de calcio presentes en la muestra a partir de una solución de HCl 2N. Los parámetros
del proceso fueron: una relación de 1:5 p/v, es decir, por cada gramo de materia prima se
agregaron 5ml de solución; se trabajó a temperatura ambiente durante 2 horas, y seguidamente,
se filtró el material más la solución con agua caliente por medio de un equipo de filtración
basado en una bomba de vacío. Finalmente, se secó el material filtrado a una temperatura de
±110°C durante 4 horas aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del polvo.
Para la ejecución de este proceso se debe tener en cuenta la determinación de cenizas de
la muestra sin desmineralizar (a) y desmineralizada (b), el ensayo de determinación de cenizas se
realizó por medio de un secado de las muestras a y b a una temperatura de ±800°C durante 6
horas; el ensayo de determinación de cenizas tiene como propósito verificación del proceso de
desmineralización.
Desproteinización
Después se realizó el proceso de desproteinización, el cual tiene como objetivo eliminar
las proteínas presentes en la muestra a partir de una solución alcalina de NaOH 2N. Los
parámetros del proceso fueron: una relación de 1:10 p/v, es decir, por cada gramo de materia
prima se agregaron 10ml de solución, se trabajó a una temperatura de ±90°C durante 2 horas, y
seguidamente se filtró el material más la solución con agua caliente por medio de un equipo de
filtración basado en una bomba de vacío. Finalmente, se secó el material filtrado a una
temperatura de ±110°C durante 4 horas aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del
23
polvo. Cabe resaltar que después del proceso de desproteinización se ha obtenido el polisacárido
denominado quitina.
Desacetilación
En último lugar para la eliminación de unidades de acetilo presentes en la quitina, se
realizó un proceso de desacetilación a partir de una solución de NaOH 50% por medio de un
sistema de reflujo para la disminución de generación de gases de reacción. Los parámetros del
proceso fueron: una relación de 1:15 p/v, es decir, por cada gramo de materia prima se agregaron
15ml de solución, se trabajó a una temperatura de ±90°C durante 3 horas, y seguidamente se
filtró el material más la solución con agua caliente por medio de un equipo de filtración basado
en una bomba de vacío. Posteriormente se secó el material filtrado a una temperatura de ±110°C
durante 4 horas aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del polvo que correspondía
al quitosano.
4. Caracterización del quitosano
Titulación potenciométrica
Se realizó una titulación potenciométrica con el quitosano para determinar su grado de
desacetilación por medio de un pH-metro Thomson PHS-3BW. El procedimiento consistió en
disolver 0,25 gramos de quitosano en 30 ml de HCl 0,3M durante 2 horas, y posteriormente
adicionar NaOH hasta obtener un pH constante. El grado de desacetilación fue calculado
mediante la Ecuación 1.
NH2= 16,1 (V2-V1)
Wf (1)
24
En donde:
• NH2 = % grupo amino (grado de desacetilación).
• V2= primer punto de inflexión de la curva (volumen).
• 𝑉1= segundo punto de inflexión de la curva (volumen).
• W= peso del quitosano.
• f= normalidad de NaOH
Determinación del peso molecular
El peso molecular promedio fue determinado por viscosimetría capilar utilizando un
viscosímetro tipo Ubbelohde tamaño 300, a 25 °C. Las disoluciones utilizadas fueron preparadas
con el quitosano comercial al 1% v/v de ácido acético considerando una concentración inicial de
quitosano de 1.0x10-2g/mL a partir de la cual se prepararon disoluciones de 2.0x10-3, 4.0x10-3,
6.0x10-3, y 8.0x10-3g/mL (Cardona & Padilla, 2012). Después de establecer las condiciones de
trabajo, se procedió a medir el tiempo de caída de cada una de las disoluciones poliméricas, con
tres réplicas, para determinar los parámetros viscosimétricos, los cuales fueron calculados
mediante las ecuaciones expresadas en la Tabla 4.
Tabla 4. Parámetros viscosimétricos.
Nombre común Símbolo y ecuación que lo define
Viscosidad relativa ƞr = ƞ/ η0 = t / t0
Viscosidad específica ƞsp = ƞr – 1 = (ƞ- η0)/ η
0 ≈ (t - t0)/ t0
Viscosidad reducida ƞred = ƞsp / C
Viscosidad inherente ƞinh = (ln ƞr) / C
Viscosidad intrínseca [ƞ] = (ƞsp / C)C=0
= [(ln ƞred) /C]C=0
25
Basados en la viscosidad intrínseca, se procede a calcular el peso molecular promedio
viscosimétrico, por medio de la Ecuación 2.
[η]=KMva (2)
En donde:
• [η] = viscosidad intrínseca
• K y a = parámetros de MHS
• M = peso molecular
Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR)
Se realizó un ensayo de FTIR para caracterizar el quitosano experimental y el quitosano
comercial, por medio de un espectrofotómetro Nicolet® 6700, utilizando pastillas de KBr-
quitosano en el intervalo de números de onda entre 400 y 4000 cm-1. Los datos fueron tratados
mediante el software Omnic®.
5. Caracterización de las plantas
Clasificación taxonómica
La clasificación vegetal se realizó en el laboratorio de biología de la Universidad de San
Buenaventura, con acompañamiento y asesoría del herbario de la Universidad del Valle.
Para poder realizar la clasificación vegetal se tuvieron en cuenta los siguientes
parámetros:
• Tipo, forma y tamaño de la hoja. Característica de la nervadura.
• Tipo y forma del fruto.
26
• Forma de inflorescencia. Características.
• Presencia o ausencia de peciolo.
• Tipo y forma de la flor.
• Raíz característica.
Una vez identificadas las características anteriores se buscaron en un libro de claves
taxonómicas las características de las plantas, logrando identificar que correspondían a
Origanum vulgare L. y Rosmarinus officinalis. Para mayor seguridad especímenes de ambas
plantas se llevaron al herbario de la Universidad del Valle para la confirmación de los datos.
Determinación del Contenido de humedad
Se determinó el porcentaje de humedad para la planta de orégano y romero mediante una
balanza de humedad marca House. Los condiciones del ensayo fueron una temperatura de
100°C, una muestra de mínimo 500 gramos y se realizaron tres replicas por planta.
Extracción del aceite esencial
Se realizó mediante un secado a 45°C durante 5, 10 y 15 horas, hasta un porcentaje de
humedad del 5%, para la planta de orégano y romero, respectivamente; posteriormente se efectúo
un proceso de hidrodestilación a las hojas de la planta a 100°C durante 1 hora y media. El
rendimiento de la planta se determinó por medio de la Ecuación 3.
Rendimiento=Volumen aceite (ml)
Peso hojas secas (gr)*100 (3)
27
Figura 9. Montaje del proceso de hidrodestilación (A), hidrodestilación de orégano
(B), hidrodestilación de romero (C) y obtención de aceite esencial (D).
Análisis por cromatografía de gases
Los aceites esenciales de Origanum vulgare L. L.y Rosmarinus officinalis fueron
obtenidos por el método de la destilación con vapor. El análisis por GC / MS se llevó a cabo en
un espectrómetro de cromatografía de gases AT 6890 Serie A plus (Agilent Technologies, Palo
Alto, California, EE.UU.), con un detector selectivo de masas (Agilent Technologies, MSD 5975
inerte XL) (Análisis completo) utilizando impacto electrónico (EI, 70 eV). El análisis se llevó a
cabo utilizando una columna de sílice fundida capilar DB- 5MS (60 m, 0,25 mm; 0.25 µm, J &
W Scientific Inc., Folsom, CA, EE.UU.). El programa de temperatura fue de 10 min a 60 ° C,
luego a 250 ° C a 5 ° C / min, se mantuvo durante 10 min. Otras condiciones de funcionamiento
fueron las siguientes: gas portador, helio (99,999 %), con una velocidad de flujo de 1,1 ml / min;
volumen de inyección de 2 l y relación de división, 01:30. La identificación de los principales
componentes del aceite esencial se llevó a cabo utilizando impacto la base de datos de Adams
(Wiley, 138 y NIST05).
D C B A
28
6. Preparación de las películas de quitosano
La preparación de películas de quitosano se basó en la metodología planteada por Ojagh
et al. (2010), en la cual inicialmente se disolvió el quitosano (60 – 90 % desacetilizado) en una
solución acuosa (1 % v/v) de ácido acético glacial para una concentración de 2 % (p/v) agitando
constantemente a 40°C durante 6 horas. Seguido a esto se adiciono glicerol como plastificante en
una relación de 0,75 mL/g por gramo de quitosano, durante 30 minutos; después se adiciono el
surfactante en una concentración del 0,2 % (p/v) respecto al aceite esencial, en concentraciones
del 0, 0,4 y 1,5 % (v/v). A continuación, la solución se centrifugo a una velocidad de 9000 rpm
durante 10 minutos. En seguida se prepararon las películas en cajas de Petri y se dejaron secando
a temperatura ambiente durante 30 horas. Para finalizar se realizó un segundo secado a 40°C
durante 24 horas y las películas se almacenaron en un desecador a 25°C, con una humedad
relativa de 51%.
7. Caracterización películas de quitosano
Propiedades físicas de las películas
Espesor
El espesor de las películas se determinó usando un medidor de espesor de recubrimiento
digital (ELCOMETER A300 FNP 23, ELCOMETER INSTRUMENT LTD., Manchester,
Inglaterra) con una precisión de 0,001 mm. Los valores reportados son un promedio de al menos
cinco lugares al azar de las películas de quitosano. Se calcularon y usaron las medias en la
determinación de las propiedades físicas.
29
Contenido de humedad
Se determinó el contenido de humedad para cada película de quitosano mediante una
balanza de humedad marca House. Los condiciones del ensayo fueron una temperatura de
100°C, una muestra de mínimo 500 gramos y se realizaron tres replicas por espécimen.
Análisis térmico
Las propiedades térmicas de las películas de quitosano suplementadas con aceites
esenciales se midieron por medio de un análisis termogravimétrico (TGA) utilizando un aparato
de 2920 de TA INSTRUMENTS TGA. Las muestras se calentaron hasta 600 °C a una velocidad
de calentamiento de 10 ºC/min, bajo una atmósfera de nitrógeno seco (tasa de flujo de 80 ml /
min) en un analizador termogravimétrico de TA INSTRUMENTS 2950. Los resultados de TGA
se analizaron utilizando el software de análisis universal TA INSTRUMENTS.
Propiedades de superficie
El ángulo de contacto estático de goniometría con agua se llevó a cabo utilizando un
instrumento 200 KSV CAM (KSV LTD.) Utilizando el método de la gota de burbujas con agua.
El ángulo de contacto se define como el ángulo entre la superficie de la película y la línea
tangente en el punto de contacto de la gota de agua con la superficie (SEDICI Repositorio
Institucional de la UNLP, 2014). Para cada tipo de película, se realizaron al menos cinco
mediciones y el promedio fue tomado.
Colorimetría y opacidad
Se realizaron pruebas de colorimetría y opacidad a las películas de quitosano con 0%,
0,4% y 1,5% de aceite de romero y orégano por medio de un espectrofotómetro KONICA
30
MINOLTA CM 600 d. Las mediciones fueron realizadas depositando las películas sobre el
estándar y efectuando 4 repeticiones. Se usó la escala de Laboratorio CIE, donde L* fue 0 para
negro y 100 para blanco, los valores de a* indicaron rojo (+) a verde (-), y valores de b*
indicaron amarillo (+) a azul (-). La diferencia total de color (∆𝑬) y blancura (𝑾𝑰) fueron
calculadas mediante la Ecuación 4 y la Ecuación 5, respectivamente.
∆E=[(∆L*)]2+ (∆a*)
2+(∆b
*)2]0.5
(4)
WI=100-[(100-L*)2+a*2+b
*2]
0.5
(5)
La opacidad de la película fue calculada midiendo la absorbancia a 600nm con un
espectrofotómetro por medio de la Ecuación 6 (Park & Zhao, Incorporation of a high
concentration of mineral or vitamin chitosan films, 2004):
O= Abs600
L⁄ (6)
En donde:
• O = opacidad de la película
• Abs600 = absorbancia a 600nm
• L = espesor de la película
Adicionalmente se utilizó la norma ISO 12647-2 de estandarización del color para el
análisis de resultados con respecto a la diferencia total de color (∆E) la cual se aprecia en la
Tabla 5.
31
Tabla 5. Estandarización de color según la diferencia total de color (ΔE)
Valores de ΔE Calidad
0 y 1 Excelente
1 y 2 Buena
2 y 3 Normal
3 y 4 Suficiente
Superiores a 5 Mala
Microscopia electrónica de barrido (SEM)
El análisis SEM de las películas de quitosano se realizó con la ayuda de la microscopía
electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) usando un instrumento JEOL JSM 6330f
operando a 5 y 3 kV. Las muestras fueron fotografiadas en ángulos de inclinación de 60-90 ° con
respecto al haz de electrones para las vistas en la sección transversal.
Microscopia de fuerza atómica (AFM)
El ensayo de AFM se llevó a cabo en condiciones ambientales por medio de un
PICOSPM II (PICOPLUS, MOLECULAR IMAGING - AGILENT TECHNOLOGIES) con una
velocidad de barrido de 1,0 a 1,5 líneas / s. Los tipos de modo de punteo disponibles en el
mercado (TAP300, SILICON AFM SONDAS, TED PELLA, INC.) fueron utilizados en los
voladizos con una frecuencia de resonancia en el rango de 290 a 410 kHz. Todas las imágenes
topográficas de AFM (tipo de punteo AAC) fueron procesadas utilizando el software
GWYDDION 2.19.
32
Contenido total de fenoles (TPC)
Se determinó el contenido total de fenoles usando el reactivo Folin-Ciocalteu (Singleton
& Rossi, 1965). El procedimiento consistió en la disolución de 100 mg de cada película en 3ml
de metanol durante 5 minutos, seguido a esto se tomó 0,3 ml de la disolución y se introdujo en
tubos de ensayo. Luego se adicionaron 2,5 ml del reactivo Folin-Ciocalteu (disuelto 10 veces en
agua) y 2 ml de carbonato de sodio (7,5% p/v). Los tubos fueron mezclados por medio de vórtex
e incubados a 50 °C por 5 minutos en una incubadora HERATHERM Incubator. Por último se
midió la absorbancia a 760 nm por medio de un espectrofotómetro (se realizaron tres replicas) y
se comparó con una curva de calibración de ácido gálico, de un rango de 1ppm a 5ppm.
El contenido fenólico total se calculó como equivalente de ácido gálico (GAE) por medio
de la Ecuación 7.
T=C*V
M (7)
En donde:
• T = contenido fenólico total en mg/g de las películas como GAE.
• C = concentración de ácido gálico establecida a partir de la curva de
calibración en mg/ml.
• V = volumen de la solución de película en ml.
• M = peso de la película en g.
33
Actividad antioxidante
La actividad antioxidante se evaluó mediante el método de ensayo de DPPH. La eficacia
de las películas para secuestrar los radicales 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) se determinó
utilizando el método de espectrofotometría con base en el blanqueo del color rojo azulado o
púrpura de la solución de DPPH como reactivo (Siripatrawan & Harte, 2010). El procedimiento
consistió en disolver 100 mg de cada película en 3 ml de metanol durante 5 minutos,
posteriormente 1,0 ml de esta solución se agregó en tubos de ensayo. Luego se añadió 1,0 ml del
reactivo de DPPH (disuelto en 20 ml de metanol, al cual se midió la absorbancia a 517 nm y se
ajustó a 1 absorbancia). Los tubos se mezclaron mediante vórtex durante 1 minuto y se
almacenaron en un lugar oscuro durante 2 horas. Finalmente se midió la absorbancia a 517 nm
utilizando un espectrofotómetro (se hicieron tres repeticiones) y se comparó con una curva de
calibración de ácido ascórbico, de un rango de 20 µl a 100 µl.
El porcentaje de DPPH actividad secuestrante de radicales libres se calculó por medio de
la Ecuación 8.
Captación de radical libre (%)= Absblanco-Absmuestra
Absblanco*100 (8)
En donde:
• Absblanco = absorbancia del blanco.
• Absmuestra = absorbancia de la muestra.
Propiedades mecánicas
Se realizaron ensayos a tensión a las películas de quitosano experimental, comercial y
suplementadas con aceites esenciales, según la norma ASTM D882 – 12 “Standard Test Method
34
for Tensile Properties of Thin Plastic Sheeting”. Para la determinación de la resistencia a la
tensión se empleó una máquina INSTRON 3366 y una celda con capacidad máxima 10 kN. Las
dimensiones de las muestras fueron: 10mm de longitud y 2,5mm de ancho, según condiciones
establecidas en la norma referenciada anteriormente.
Actividad antimicrobiana
Cultivos bacterianos
Colonias aisladas individuales de E. coli K-12 MG 1655 y B. subtilis 102 se cultivaron en
15 ml de caldo de soya tríptica (TSB) (Oxoid, Inglaterra) durante la noche a 35 ° C, 80 rpm. El
cultivo bacteriano se centrifugó a 4000 rpm durante 10 min. Las células se lavaron y se re
suspendieron en solución de tampón de fosfato (PBS, 0,01 M, pH D 07:04) (Fisher Scientific,
EE.UU.) y la suspensión bacteriana se ajustó para dar una densidad óptica (DO) de 0,5 a 600 nm,
que corresponde a una concentración celular de 107 unidades formadoras de colonias UFC / ml-
1.
Ensayo de viabilidad bacteriana
Se tomaron imágenes de fluorescencia para determinar el número de células totales y
muertos expuestos a CS y CS - IR. Para este experimento, cubreobjetos circulares de diámetro 12
mm se limpiaron con etanol al 70 %. Los cubreobjetos limpios se recubrieron con CS y CS -GO
película fina por cintas de doble cara. Cada cubreobjetos recubierto se depositó en una placa de
micro titulación de fondo plano de 12 pocillos (Falon). Las alícuotas de 2 ml de cultivo
bacteriano en 0,5 DO600nm en PBS fueron añadidas en cada pocillo y después se incubaron
durante 1 h (sin agitación) a temperatura ambiente. Después del período de incubación, una
alícuota de la solución de 10 ml se colocó en un portaobjetos de vidrio, se tiñó y fotografío con
35
un microscopio de fluorescencia. Para cada pocillo, se hicieron tres repeticiones y seis imágenes
fueron tomadas por cada réplica para dar un total de 18 imágenes por solución. Para determinar
la cantidad total de células vivas y muertas en la suspensión de bacterias de la muestra, la
solución se tiñó con un kit Baclight bacteriana viabilidad en vivo / muerto (Invitrogen), tal como
se describe por el fabricante en su boletín técnico. El kit utiliza dos colorantes ácidos nucleicos:
SYTO 9 (verde) y yoduro de propidio (rojo). El kit tiñó todas las celdas en verde (SYTO9) y las
células muertas con las membranas dañadas en rojo (yoduro de propidio). Después de la tinción,
la superficie se colocó en un portaobjetos de microscopio de forma cóncava con un cubreobjetos
(25mm × 25mm) y se fotografiaron utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX 51
(Leeds Instrument Inc.) equipado con una cámara digital DP72 bajo un objetivo de 40x y un
isotiocianato de fluoresceína (FITC) de filtro. Todas las imágenes fueron obtenidas y analizadas
usando un software de imágenes digitales de dimensión de Celdas Sens (Olympus). El mismo
software se utilizó para contar las células para cada una de las 18 imágenes durante cada ensayo.
El porcentaje de células inactivas se expresó como la relación de porcentaje del número total de
células inactivas (rojo) con el número total de bacterias (verde) adjunto. Los porcentajes de los
valores medios y desviación estándar se calcularon según el recuento de células.
36
DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
1. Extracción y obtención de quitosano
Para el proceso de extracción y obtención de quitosano se prosiguió la metodología
experimental reportada por Mármol et al. (2004) y Teli & Sheikh (2012), la cual consistió
primeramente en una limpieza del caparazón de los camarones por medio de agua destilada,
seguido por un secado del exoesqueleto a una temperatura de ±110°C durante 4 horas, para
después realizar un proceso de trituración el cual buscaba disminuir el tamaño de grano a 250
micras, a continuación se realizaron los procesos químicos de despigmentación,
desmineralización, desproteinización y desacetilación, que permiten la eliminación de
pigmentos, minerales, proteínas y sustitución de grupos acetamido por grupos amino,
respectivamente, en el exoesqueleto de camarón para la obtención de quitosano.
Los resultados obtenidos en el proceso de extracción y obtención de quitosano,
permitieron establecer los parámetros reportados en la tabla 6.
Tabla 6. Parámetros para la extracción de quitosano a partir de exoesqueleto de
camarón.
Proceso Solución Relación p/v Temperatura (°C) Tiempo (h) Rendimiento (%)
Despigmentación Acetona 1/6 25 2 93,51
Desmineralización HCl 2N 1/5 25 2 40,71
Desproteinización NaOH 2N 1/10 90 2 43,35
Desacetilación NaOH
50%
1/15 90 3 30,16
37
De acuerdo al rendimiento del proceso de extracción y obtención de quitosano, se obtuvo
un resultado del 30,16%, lo cual es menor a lo reportado por Hernández Cocoletzi et al. (2009)
con un rendimiento del 51,94%, y mayor a lo reportado por Mohammed et al. (2013) con un
rendimiento del 25%; debido a la variabilidad en las condiciones de cada proceso y a la especie
de camarón trabajada.
Adicionalmente, se realizaron pruebas de determinación de cenizas para las muestras
despigmentada y desmineralizada, con un resultado del 44,802 % (±0,21%) y 0,25 % (±0,01%)
de cenizas, respectivamente. El porcentaje de cenizas se redujo en un 99,44% con respecto al
material despigmentado, lo cual comprueba que la remoción de los carbonatos de calcio de los
caparazones fue efectiva.
2. Caracterización del quitosano
Titulación potenciométrica
Para la determinación del grado de desacetilación del quitosano extraído (experimental) y
el quitosano comercial se realizó una titulación potenciométrica, en la cual se evaluó el
porcentaje de grupos amino que había en cada quitosano. Los resultados se pueden apreciar en la
figura 10.
38
Figura 10. Titulación potenciométrica del quitosano experimental y el quitosano
comercial.
Tabla 7. Datos de la titulación potenciométrica del quitosano experimental y el
quitosano comercial.
Quitosano
Experimental 69,34 85,00 96,00 0,25542 0,1
Comercial 64,17 84,00 94,00 0,25088 0,1
El grado de desacetilación del quitosano experimental es mayor en comparación al del
quitosano comercial, lo cual se puede apreciar en la tabla 7. Ambos resultados cumplen con el
rango establecido para que el material se considere quitosano, el cual está entre el 60% y el 90%
(Ramirez, Plascencia, Huerta, Vásquez, & Shirai, 2002). Los resultados obtenidos son similares a
los reportados por Hernández Cocoletzi et al. (2009), Barra et al. (2012) y Beltrán Patiño (2010),
con un 64%, 65% y 65,2% de grado de desacetilación, respectivamente.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 20 40 60 80 100 120
ΔpH
/ΔV
Volumen (ml)
EXPERIMENTAL COMERCIAL
39
Determinación del peso molecular
La determinación del peso molecular del quitosano por medio de la viscosimetría capilar,
se basó en la medición de la viscosidad de las soluciones de quitosano en relación con el tiempo
de caída de un volumen específico a través de un tubo capilar, contra el tiempo del solvente
utilizado. Las medidas viscosimétricas obtenidas para el quitosano comercial y el quitosano
experimental se aprecian en las tablas 8 y 9, respectivamente.
Tabla 8. Medidas viscosimétricas de quitosano comercial al 1% v/v de ácido acético
a 25°C.
Concentración (g/mL) Tiempo (s) ƞr ƞsp ƞred (mL/g) ƞinh (mL/g)
0,002 37,32 9,19 8,19 4095,65 1109,13
0,004 92,34 22,74 21,74 5435,76 781,06
0,006 163,96 40,38 39,38 6563,90 616,40
0,008 350,94 86,44 85,44 10679,91 557,43
0,01 603,82 148,72 147,72 14772,29 500,21
Tabla 9. Medidas viscosimétricas de quitosano experimental al 1% v/v de ácido
acético a 25°C.
Concentración (g/mL) Tiempo (s) ƞr ƞsp ƞred (mL/g) ƞinh (mL/g)
0,002 39,23 9,66 8,66 4331,28 1134,13
0,004 95,76 23,59 22,59 5646,55 790,17
0,006 168,43 41,49 40,49 6747,54 620,89
0,008 358,34 88,26 87,26 10907,64 560,04
0,01 612,56 150,88 149,88 14987,68 501,65
Adicionalmente la viscosidad intrínseca se obtiene extrapolando la viscosidad reducida a
una concentración de cero. De esta manera se construye la curva de viscosidad reducida vs
40
concentración de quitosano en soluciones al 1% v/v de ácido acético, donde el intercepto con el
eje Y es la viscosidad intrínseca, como se puede observar en las Figuras 11 y 12, para el
quitosano comercial y el quitosano experimental, respectivamente.
Figura 11. Curva de viscosidad reducida vs concentración de quitosano comercial en
soluciones al 1% de ácido acético.
Figura 12. Curva de viscosidad reducida vs concentración de quitosano
experimental en soluciones al 1% de ácido acético.
y = 1E+06x + 33.02
R² = 0.9254
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012
ƞre
d (
mL
/g)
Concentración (g/mL)
y = 1E+06x + 55.19
R² = 0.9234
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012
ƞre
d (
mL
/g)
Concentración (g/mL)
41
Las regresiones lineales obtenidas se observan en la Ecuación 9 y 10.
y = 1E+06x + 33,02 (9)
y = 1E+06x + 55,19 (10)
Reemplazando en la Ecuación 9 y en la Ecuación 10 el valor de la viscosidad intrínseca y
tomando los valores de 0,00474 mL/g y 0,72 reportados por Kasaai (2007) para las constantes K
y α en la Ecuación 2 de Mark-Houwink-Sakurada, los valores encontrados para el peso
molecular promedio viscosimétrico fueron de 217519,52 g/mol y 443952,17 g/mol, para el
quitosano comercial y el quitosano experimental, respectivamente. Los resultados obtenidos son
similares a los obtenidos por Parada et al. (2004), Cardona & Padilla (2012) y Paz et al. (2013),
con 6,22x105 g/mol para quitosano extraído a partir de exoesqueletos de camarón, 2,08x105
g/mol para quitosano comercial y 3,1x105 g/mol para quitosano derivado de la quitina de
langosta, respectivamente.
Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR)
La caracterización por medio de espectroscopia infrarroja de la quitina experimental
realizada preparando pastillas de este material con KBr, mostro el espectro que se aprecia en la
Figura 13; en donde se observan definidos los picos de absorción correspondientes a la quitina: a
1661,75cm-1 se atribuyen a vibraciones de estiramiento del grupo C=O (carbonilo) asociados a
grupos amida y estiramientos de las amidas II a 1555,66cm-1, que son grupos importantes en la
composición de la quitina, tambien se observan vibraciones de los grupos –C-H en los
1425,46cm-1, que es muy probable que esten asociados en la estructura de la quitina con grupos
OH que vibran a 1378,2cm-1 o con el grupo acetilo de la misma. Se aprecian tambien tensiones
antisimetricas del enlace C-O-C a 1158,3cm-1 y vibraciones de tension de enlaces C-N de aminas
42
primarias a 1260,54cm-1 y 1026,17cm-1. El anterior resultado concuerda con lo reportado por
Benavente et al. (2011) y Escobar Sierra et al. (2013).
Figura 13. FTIR de quitina experimental.
Adicionalmente en la Figura 14 se puede apreciar el espectro del quitosano experimental,
en donde se observan las bandas de los grupos funcionales característicos de la molécula de
quitosano, se hace evidente la aparición de la banda del grupo amino a 1660 cm-1 debido a la
vibración de estiramiento del C=O, típico de amidas. Luego se observa una banda ancha y fuerte
a 3434cm-1 a causa del estiramiento del –OH típico de alcoholes que solapa el estiramiento N-H,
típico de amidas. También se aprecian las bandas del estiramiento debido a la vibración de
tensión -C-H alifáticos entre 2926cm-1 y 2883cm-1, bandas del grupo Piranósico a 1098 cm-1, y
bandas del grupo C-O-C a 1039cm-1. Cabe destacar que las señales correspondientes al C-O-C,
anillo piranósico, C-H y O-H, se mantuvieron presentes en el espectro de la quitina y del
quitosano, mientras que las bandas correspondientes al grupo NH de la amina se definieron
mejor después del proceso de desacetilación (Nalwa, 1997). Los resultados del espectro del
43
quitosano experimental concuerdan con lo reportado por Hernández Cocoletzi et al. (2009) y
Escobar Sierra et al. (2013).
Figura 14. FTIR de quitosano experimental.
Finalmente en la Figura 15 se observa el espectro del quitosano comercial; en donde se
aprecian las bandas debidas a los grupos funcionales o subestructuras –NH2, –OH, – CH2OH, –O
— (Silverstein, Bassler, & Morrill, 1981) característicos de este material.
Figura 15. FTIR de quitosano comercial.
44
3. Caracterización de las plantas
Clasificación taxonómica
Se realizó una clasificación taxonómica y por parámetros físicos de las plantas de
orégano y romero, en el laboratorio de Biología de la Universidad de San Buenaventura, con
acompañamiento y asesoría del herbario de la Universidad del Valle. Los resultados se aprecian
en las Tablas 10, 11, 12 y 13. (Botanical-online, 2014)
Tabla 10. Clasificación taxonómica planta 1 (Origanum vulgare L. L.)
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Plantas con flores
Clase Magnoliopsida
Dicotiledóneas
Orden Lamiales
Familia Labiadas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Genero Origanum
Especie Origanum vulgare L.
Tabla 11. Clasificación por parámetros físicos planta 1 (Origanum vulgare L. L.)
Parámetros Descripción
Tipo de hoja Opuestas, pecioladas, ovales o enteras; verde claro
Tipo de raíz Fibrosa
Tipo de fruto Tetraquenio liso
Tipo de tallo Erectos, pilosos y aromáticos; tonalidad rojiza
Tipo de flor Agrupadas en corimbos terminales densos; rosadas, vioáceas o blancas
45
Tabla 12. Clasificación taxonómica planta 2 (Rosmarinus officinalis.)
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Lamiales
Familia Lamiaceae
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Genero Rosmarinus
Especie Rosmarinus officinalis
Tabla 13. Clasificación por parámetros físicos planta 2 (Rosmarinus officinalis.)
Parámetros Descripción
Tipo de hoja Forma linear, firmes, verde oscuras por el haz y blanquecinas por el envés
Tipo de raíz Fibrosa
Tipo de fruto Seco con semillas menudas
Tipo de tallo Tallos jóvenes borrosos y tallos añosos de color rojizo y con la corteza
resquebrajada
Tipo de flor Axilares, color azul o violáceo pálidos con los estambres más largos que los
pétalos y el labio superior de la corola curvado
Según la clasificación taxonómica realizada, se logró identificar y clasificar las plantas
seleccionadas para realizar el proyecto así:
- Orégano: Origanum vulgare L. l.
- Romero: Rosmarinus officinalis.
Contenido de humedad de las plantas
De acuerdo con la medición del porcentaje de humedad de las plantas de órgano y romero
se obtuvo un 9,810 % (±0,16%) y 9,990 % (±0,43%), respectivamente. Según los resultados
obtenidos la planta de romero posee un mayor porcentaje de humedad en comparación con la
46
planta de orégano. Belén-Camacho et al. (2011) encontraron un contenido de humedad para el
organo del 8,45% (±0,16%) y para el romero se reporta un contenido de humedad del 9%
(Herbotecnia, 2014), los cuales son muy similares a los valores determinados en esta
investigación.
Extracción del aceite esencial
Para la extracción de aceite esencial se realizó un diseño factorial 2x3, en el cual las
variables fueron: tipo de planta (romero y orégano) y el tiempo de secado (5, 10 y 15 horas).
Figura 16. Extracción de aceite esencial de romero y orégano a diferentes tiempos de
secado (5, 10 y 15 horas).
Según la Figura 16 se puede observar que con respecto a la planta de romero, al
incrementar el tiempo de secado incrementa el rendimiento; sin embargo teniendo en cuenta que
la cantidad media de aceite esencial que se encuentra en la mayoría de las plantas aromáticas es
5 10 15
Oregano 1,10 0,83 0,68
Romero 1,25 2,49 2,91
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
Ren
dim
iento
(m
l/g)
Tiempo de Secado (h)
47
alrededor de 1 a 2% (Servicio Nacional de Aprendizaje SENA , 2012); el tiempo de secado de 5
horas con 1,25 ml/g es adecuado para el experimento.
En caso contrario para la planta de orégano, en donde el incremento del tiempo de secado
disminuye el rendimiento; permitiendo obtener un mejor resultado al emplear menor tiempo de
secado, como se aprecia al utilizar un tiempo de 5 horas de secado con un resultado de 1,10 ml/g.
Análisis estadístico
Adicionalmente se realizó un análisis estadístico de los resultados por medio de un
análisis de varianza (ANOVA), un pos-ANOVA utilizando el método Tukey y un gráfico de
interacción. El análisis estadístico se realizó mediante el software de MiniTab 16.
Tabla 14. ANOVA de dos factores: rendimiento (ml/g) vs. Tipo de planta*tiempo de
secado.
Fuente GL SC CM F P
Tipo de planta 1 7,1288 7,12884 196,77 0
Tiempo de secado 2 0,7597 0,37985 10,48 0,002
Interacción 2 4,4787 2,23934 61,81 0
Error 12 0,4347 0,03623
Total 17 12,802
S = 0,1903
R-cuadrado = 96,60%
R-cuadrado (ajustado) = 95,19%
48
Se ejerció un buen control de los niveles de los factores debido a que las sumas de
cuadrados de tipo de planta, tiempo de secado e interacción son mayores que el error.
Con respecto a la prueba de hipótesis de interacción o dependencia entre los dos factores
la cual se aprecia en la Tabla 14, se hayo que a un nivel de significancia de 0,000 hay
dependencia entre el tipo de planta y el tiempo de secado por lo tanto para realizar las
comparaciones se fijó el tipo de planta y se compararon los tiempos de secado,
Se plantea la prueba post ANOVA asumiendo igualdad de medias vs diferencia entre las
medias, la cual se puede apreciar en la Tabla 15.
Tabla 15. Método de Tukey con una confianza de 95,00%.
Tipo de planta Tiempo de secado (horas) N Media Agrupación
2 15 3 2,9 A
2 10 3 2,5 A
1 5 3 1,4 B
2 5 3 1,3 B C
1 10 3 0,8 C D
1 15 3 0,7 D
Se debe tener en cuenta que:
• Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.
• El tipo de planta numero 1 representa a la planta de orégano.
• El tipo de planta numero 2 representa a la planta de romero.
Se observa que la planta 2 a 15 horas presenta el mejor rendimiento, y que la misma
planta a 10 horas es estadísticamente igual que a 15 horas, a un nivel de significancia del 5%.
49
Se observa que la planta 2 a 5 horas es estadísticamente igual a la planta 1 a 5 y 10 horas,
a un nivel de significancia del 5%.
Se observa que la planta 1 a 10 horas es estadísticamente igual que a 15 horas, a un nivel
de significancia del 5%.
Figura 17. Interacción del tipo de planta según el rendimiento (ml/g).
Según la Figura 17 se puede observar que el comportamiento de la planta 1 en
comparación con la planta 2, con respecto al rendimiento (ml/g) es inversamente proporcional; es
decir que para la planta 1 el incremento del tiempo de secado disminuye su rendimiento, y en
contraste para la planta 2 el incremento del tiempo de secado aumenta su rendimiento.
Análisis por cromatografía de gases
Los datos analíticos de GM (MS) de los compuestos principales del aceite esencial de
orégano (AEO) se muestran en la Tabla 16. El compuesto de Alcanfor fue un compuesto
50
predominante y represento el 23,9% del área total del pico. Los otros componentes fueron 1,8-
cineol (22,7%), α-Pineno (20,5%) y Canfeno (10,4%). Olmedo et al. (2013) encontro resultados
diferentes en donde los componentes mayoritarios del oregano fueron β-terpineol (55.5 g/100 g),
terpinen-4-ol (15.9 g/100 g) y el timol (12.9 g/100 g), debido a que se observan dos quimiotipos
diferentes.
Tabla 16. Composición química de AEO (Origanum vulgare L.).
Nº Compuesto RI % del área total del pico
1 Alcanfor 27.07 23.9
2 1,8-cineol 22,18 22.7
3 α-Pineno 17.76 20.5
4 Canfeno 18.52 10.4
5 β-pineno 19.74 4.6
6 Limoneno 22.00 3.9
7 Borneol 27.92 2.5
8 p-Cimeno 21.75 2.1
9 Acetato de bornilo 31.95 1.8
10 Isoborneol 27.59 1.6
11 α-Terpineol 28.69 1.1
12 Trans-β-cariofileno 37.32 1.0
13 α-Fencheno 18.40 0.8
14 β-Mirceno 20.05 0.6
15 Linalool 24.77 0.6
De la misma forma los datos analíticos de GM (MS) de los compuestos principales del
aceite esencial de romero (AER) se muestran en la Tabla 17. El compuesto de β-Mirceno fue un
compuesto predominante y represento el 27,8% del área total del pico. Los otros componentes
fueron Alcanfor (23,9%), 1,8-cineol (16,2%) y Canfeno (5,5%). Los resultados obtenidos
51
coinciden con los resultados reportados por Tafurt et al. (2005) en donde los compuestos
mayoritarios fueron: alcanfor (28,7%), eucaliptol (15,9%), α-pineno (10,4%), canfeno (7,6%) y
β-pineno (5,1%).
Tabla 17. Composición química de AER (Rosmarinus officinalis).
Nº Compuesto RI % del área total del pico
1 β-Mirceno 20,04 27.8
2 Alcanfor 26,92 23.9
3 1,8-cineol 22,02 16.2
4 Canfeno 18,40 5.5
5 β-Pineno 17,61 4.6
6 α-Pineno 19,64 4.5
7 Acetato de bornilo 31,87 3.4
8 trans-β-cariofileno 37,27 2.2
9 Limoneno 21,84 2.1
10 p-Cimeno 21,62 1.5
11 α-Terpineol 28,59 1.1
12 α-Tujeno 17,23 1.0
13 Óxido de cariofileno 42,46 0.9
14 Borneol 27,79 0.8
15 Terpinen-4-ol 28,06 0.7
16 α-Humuleno 38,49 0.7
17 Linalool 24,65 0.6
18 γ-Terpineno 23,02 0.3
19 cis-Hidrato de sabineno 24,86 0.2
20 Terpinoleno 24,18 0.2
52
4. Preparación de la película de quitosano
Se prepararon películas de quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales de
orégano y romero al 0,4 y 1,5%, y películas de quitosano experimental sin aceite; de acuerdo a la
metodología planteada por Ojagh et al. (2010). Las películas obtenidas se pueden apreciar en la
Figura 18, en donde se observa que aquellas que contienen aceites poseen una tonalidad amarilla,
en comparación a las películas sin aceite. Hernández-Ochoa et al. (2011) tuvieron resultados
similares al adicionar aceites esenciales a peliculas de quitosano de mediano peso molecular, con
una coloración amarrillo/ámbar y Peng et al. (2013) obtuvieron películas de quitosano con un
aspecto ligeramente amarillo.
Figura 18. Película de quitosano experimental PQE (A), película de quitosano
comercial PQC (B), PQC con 0,4% orégano (C), PQC con 1,5% orégano (D), PQC con
0,4% romero (E) y PQC con 1,5% romero (F).
53
5. Caracterización películas de quitosano
Propiedades físicas de las películas
Espesor
Los resultados de las mediciones del espesor de las películas se pueden apreciar en la
Figura 19.
Figura 19. Espesor de las películas.
En cuanto al espesor de las películas, el quitosano experimental (extraído) presenta
valores menores en comparación con la película de quitosano comercial en un 28,36%. Por lo
que se refiere a las películas de quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales de
orégano y romero se observó que en ambos casos el espesor aumenta a medida que incrementa la
concentración de los aceites; este comportamiento se observó en las investigaciones de Ojagh et
Experimental Comercial 0,4 Oregano 1,5 Oregano 0,4 Romero 1,5 Romero
Espesor 0,067 0,086 0,105 0,121 0,105 0,133
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
Esp
eso
r (m
m)
Pelicula
54
al. (2010) y Alfonso Arce (2011) al adicionar aceite esencial de canela y romero,
respectivamente.
Cabe destacar que las películas con 0,4% de aceite esencial presentaron el mismo espesor
de 0,105mm; sin embargo a una concentración de 1,5% la película con aceite esencial de romero
presenta un mayor espesor en comparación con la película con aceite esencial de orégano; la
primera con un porcentaje de incremento del 15,24% y la segunda con 26,67%. Así pues el
aceite esencial de orégano al 1,5% ofrece el menor espesor a esta concentración.
Contenido de humedad
De acuerdo con la medición del porcentaje de humedad de las películas de quitosano
suplementadas con aceites esenciales se obtuvieron los resultados reportados en la Figura 20.
Figura 20. Porcentaje de humedad de las películas.
Con respecto a las películas suplementadas con aceite esencial de romero el incremento
de la concentración de aceite aumenta el porcentaje de humedad de la película, debido a que la
Patron
experimental
Patron
comercialPQC-0,4R PQC-1,5R PQC-0,4O PQC-1,5O
% HUMEDAD 27,94 21,4 17,7 20,43 22,09 21,31
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30
% H
um
edad
Pelicula
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planta de romero tenía mayor contenido de humedad en comparación a la planta de orégano,
como se reportó anteriormente. En contraste en las películas suplementadas con aceite esencial
de orégano el incremento de la concentración de aceite disminuye el porcentaje de humedad de
la película. Cabe destacar que la incorporación de aceites esenciales a las películas de quitosano
disminuyó su contenido de humedad, lo cual concuerda con lo reportado por Ojagh et al. (2010),
Peng et al. (2013) y Alfonso Arce (2011) al adiconar aceite esencial de canela, de limon y de
romero, respectivamente.
Análisis térmico
Se realizó un análisis termogravimétrico (TGA) de la pérdida de peso de las películas de
quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales de orégano y romero, el cual se puede
observar en las Figuras 21 y 22. De acuerdo a la temperatura se pueden identificar diferentes
transiciones en el termograma, estando cada uno de ellos asociado a diferentes pérdidas de masa
y humedad; los datos de estas transiciones para todas las películas de quitosano se pueden
observar en la Tabla 18. El primer evento térmico ocurre entre los 48,6°C y 54,09°C el cual se
atribuye a la perdida de humedad y de los componentes más volátiles de los aceites esenciales. El
segundo evento ocurre entre los 152,48°C y los 165,79°C en donde el quitosano empieza a
descomponerse a través de sus enlaces termolábiles C-O.
El último evento ocurre entre los 248,39°C y los 255,94°C el cual se atribuye a la
formación de carbón de quitosano o a reacciones de despolimerización de las cadenas de
quitosano. A partir de este rango de temperatura las películas comienzan a degradarse, debido a
que alcanzan su temperatura de degradación térmica (Don, King, Chiu, & Peng, 2005). Los
resultados obtenidos son similares a los reportados por Lin & Pascall (2014).
56
Figura 21. Análisis termogravimétrico de las películas de quitosano comercial
suplementadas con aceites esenciales.
Figura 22. DTGA de las películas de quitosano comercial suplementadas con aceites
esenciales.
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Pes
o (
%)
Temperatura (°C)
Control
Oregano 0,4
Oregano 1,5
Romero 0,4
Romero 1,5
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Tabla 18. Datos del análisis termo gravimétrico de las películas de quitosano
comercial suplementadas con aceites esenciales.
Película Temperatura (°C) Peso (%)
Control 54,09 7,79
164,18 47,27
251,68 72,32
Orégano 0,4 50,53 8,58
152,48 41,08
251,42 68,69
Orégano 1,5 50,95 7,92
157,27 42,28
248,39 67,29
Romero 0,4 50,88 9,78
165,79 53,97
252,02 78,04
Romero 1,5 48,60 7,57
153,78 40,21
255,94 67,85
349,44 78,14
Propiedades de superficie
Se midió el ángulo de contacto de las películas de quitosano suplementadas con aceites
esenciales. Como se puede observar en la Tabla 19, el ángulo de contacto incrementó al
incorporar los aceites esenciales a las películas de quitosano. Ojagh et al. (2010) reportaron
resultados similares al adicionar aceite de canela.
58
Tabla 19. Ángulos de contacto de las películas de quitosano.
Película de quitosano Angulo de contacto con el agua
Control 43.03 ± 1,70
Orégano 0,4% 72.53 ± 1,23
Orégano 1,5% 77,37 ± 2,00
Romero 0,4% 68,37 ± 1,12
Romero 1,5% 82,46 ± 1,73
Colorimetría y opacidad
Las características de las películas con respecto al color y opacidad se muestran en la
Tabla 20. El parámetro b*, ∆𝐸 y opacidad de la película de control fueron 14.67, 11.95 y 4.75,
respectivamente. La adición de aceite esencial de romero y de orégano incrementó los
parámetros de b*, ΔE y opacidad de las películas de quitosano, mientras que los parámetros de
L* y WI disminuyeron. Resultados similares fueron reportados por Peng et al. (2013) y Ojagh et
al. (2010).
Con respecto a la norma ISO 12647-2, se obtuvo una diferencia total de color de calidad
buena y calidad suficiente, para las películas de romero y orégano, respectivamente. Lo anterior
supone que las películas son aptas en apariencia según los estándares de la norma.
59
Tabla 20. Colorimetría y opacidad de las películas de quitosano.
Película L a b Delta E WI O
Blanco 89,15±0,06 -0,10±0,01 3,24±0,02 x x x
Experimental 88,12±0,02 -0,53±0,01 6,78±0,09 11,98±0,02 86,27±0,04 4,86±0,06
Patrón 85,92±0,85 -1,13±0,29 14,67±2,67 11,95±2,77 79,54±2,50 4,72±0,04
0,4R 86,67±0,28 -1,23±0,02 13,37±0,31 10,00±0,38 81,81±0,42 8,76±0,8
1,5R 86,28±0,57 -1,09±0,00 14,25±1,47 11,83±1,56 80,85±1,41 11,90±1,02
0,4O 84,50±0,29 -1,16±0,22 17,75±0,04 14,86±0,03 76,40±0,15 13,23±0,43
1,5O 80,38±5,08 0,46±2,36 18,90±0,76 17,86±1,76 72,56±3,15 16,54±0,23
Microscopia electrónica de barrido
Se realizó un análisis morfológico a las películas de quitosano suplementadas con aceites
esenciales de orégano y romero el cual se puede apreciar en la Figura 23 y Figura 25; y las
secciones transversales de las películas se aprecian en la Figura 24 y Figura 26.
Con respecto a la película de control y con aceite de orégano se observó un aspecto liso y
aparentemente uniforme, exceptuando unas pequeñas partículas que se evidencian en la Figura
23, estas partículas se atribuyen al surfactante por falta de homogeneidad de la mezcla.
60
Figura 23. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la película (A)
control de quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de orégano y (C) con 1,5% de aceite
esencial de orégano.
Figura 24. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la sección transversal
de la película (A) control de quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de orégano y (C)
con 1,5% de aceite esencial de orégano.
Por lo que se refiere a la morfología de las películas de quitosano comercial
suplementadas con aceite esencial de romero, se observó que no hubo una buena dispersión del
aceite en la película, lo cual se evidencia en la Figura 25 en donde se distinguen dos fases.
61
Figura 25. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la superficie de las
películas (A) con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial de
romero.
Figura 26. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la sección transversal
de las películas (A) con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial
de romero.
Microscopia de fuerza atómica
La morfología superficial de las películas de quitosano comercial suplementadas con
aceites esenciales, se estudió por medio de la microscopía de fuerza atómica, AFM, en el modo
“tapping” de imagen. Como se puede observar la Figura 26 en las películas con aceite esencial
de orégano la rugosidad disminuyo conforme se aumentó la concentración de aceite. En el caso
62
contrario para las películas con aceite esencial de romero las cuales se pueden apreciar en la
Figura 27, en donde la rugosidad aumento conforme se incrementó la concentración de aceite.
Cabe destacar que las películas suplementadas con aceite de romero presentan menor rugosidad
en comparación con las películas suplementadas con aceite de orégano, debido posiblemente a la
composición química de cada aceite esencial. Los resultados obtenidos de la rugosidad de las
películas se aprecian en la Tabla 21. Nosal et al. (2005) reportaron una rugosidad menor de
0.33nm para las peliculas de quitosano y de 0.9nm para las peliculas modificadas;
adicionalmente en otra investigación realizada por Nosal et al. (2005) se reporto una menor
rugosidad de 0.33nm para las peliculas de quitosano y 3.1nm para las peliculas modificadas con
1,2 Epoxy-3-phenoxy-propane.
Tabla 21 Rugosidad de las películas de quitosano comercial suplementadas con
aceites esenciales
Película de quitosano comercial Rugosidad (nm)
Aceite esencial de orégano 0,4% 15,097
Aceite esencial de orégano 1,5% 6,470
Aceite esencial de romero 0,4% 1,250
Aceite esencial de romero 1,5% 8,885
63
Figura 27. AFM película de quitosano con aceite esencial de orégano al 0,4% (a) y
AFM película de quitosano con aceite esencial de orégano al 1,5% (b).
Figura 28. AFM película de quitosano con aceite esencial de romero al 0,4% (a) y
AFM película de quitosano con aceite esencial de romero al 1,5% (b)
64
Contenido total de fenoles
Se determinó el contenido total de fenoles de las películas de quitosano, y los resultados
se compararon una curva de calibración de ácido gálico, la cual se observa en la Figura 29.
.
Figura 29. Curva de calibración del ácido gálico equivalente.
Figura 30. Contenido total de fenoles para las películas de quitosano suplementadas
con aceites esenciales de orégano y romero.
y = 0,0069x - 0,0012
R² = 0,9845
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0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
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Abso
rban
cia
(nm
)
Concentración (mg/mL)
PQ PQ-0,4R PQ-1,5R PQ-0,4O PQ-1,5O
TPC 0,0066 0,0162 0,0523 0,0421 0,1098
0,00
0,03
0,06
0,09
0,12
mg A
GE
/g p
elic
ula
Pelicula
65
Como se puede apreciar en la Figura 30, las películas de quitosano incorporadas con
aceites esenciales tuvieron mayor contenido de fenoles en comparación con la película control.
Resultados similares fueron obtenidos por Moradi et al. (2012) y Ruiz Navajas et al. (2013) al
incorporar aceites esenciales de Zatari multiflora y Thymus moroderi, respectivamente. Este
resultado puede ser atribuido a la formación de cromógenos, debido a la reacción del reactivo
Folin y Ciocalteu con la reducción de sustancias no fenólicas las cuales pueden ser detectadas
espectrofotometricamente.
Actividad antioxidante (DPPH)
Se determinó la actividad antioxidante por medio del reactivo DPPH, midiendo el
porcentaje de inhibición. Los resultados obtenidos se observan en la Figura 31, como se aprecia
el porcentaje de inhibición aumenta con la incorporación de los aceites esenciales, sin embargo
al aumentar la concentración de los aceites esenciales disminuye el porcentaje de inhibición,
siendo el resultado de la concentración al 0,4% mayor que el de 1,5%, pero con ambos películas
se obtiene un porcentaje de inhibición mayor al de la película control. Ruiz Navajas et al. (2013)
y Moradi et al. (2012) reportaron resultados similares al incorporar aceites esenciales de Thymus
moroderi y Zatari multiflora, respectivamente. El anterior comportamiento se atribuye a que los
aceites esenciales presentan gran cantidad de fenoles, los cuales benefician a la captación de
radicales libres. Con respecto al desempeño de los aceites esenciales, el aceite de romero tuvo
mayor porcentaje de inhibición en comparación con el aceite de orégano.
66
Figura 31. Captación de radical libre de las películas.
Propiedades mecánicas
Se realizaron ensayos a tracción para las películas de quitosano experimental, quitosano
comercial y suplementadas con aceite de orégano y romero. Los resultados de las propiedades
mecánicas se observan en la Tabla 22.
Tabla 22. Propiedades mecánicas de las películas de quitosano
Películas Esfuerzo de
tracción
(MPa)*
Porcentaje de
Deformación
a la ruptura*
Experimental 29,00 ± 1,43a 10,15 ± 0,41c
Comercial 23,28 ± 1,84b 9,16 ± 0,52d
0.4 Orégano 8,53 ± 3,70c 8,30 ± 0,48e
1.5 Orégano 0,79 ± 0,29d 7,96 ± 0,06f
0.4 Romero 0,78 ± 1,02e 10,83 ± 0,28a
1.5 Romero 0,61 ± 0,05f 10,74 ± 0,32b
*Los resultados en cada columna con diferente letras de superíndice son significativamente diferentes (p < 0,005).
Con respecto a la película de quitosano experimental se observó que se necesitó un mayor
esfuerzo para romper y deformar la película, con 29,00 ± 1,43 MPa y 10,15 ± 0,41 %,
PQP 0,4O 1,5O 0,4R 1,5R
% INHIBICION 7,18 10,08 9,27 16,47 12,79
0
4
8
12
16
20
Cap
taci
ón d
e ra
dic
al l
ibre
(%
)
Pelicula
67
respectivamente, en comparación a la película de quitosano comercial. Cabe destacar que los
resultados son similares, lo cual supone que una futura implementación de los aceites esenciales
en las películas de quitosano experimental tendría un comportamiento similar a las películas de
quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales.
En relación al comportamiento de las películas suplementadas con aceites esenciales, se observa
que al adicionar aceite esencial de orégano el esfuerzo a tracción y la deformación a la ruptura
disminuyeron. Peng et al. (2013) encontraron comportamientos similares al analizar las
propiedades mecanicas de peliculas de quitosano suplementadas con aceite esencial de limon.
En contraste al comportamiento de las películas con aceite esencial de romero, en las
cuales el esfuerzo a tracción disminuyó y la deformación a la ruptura aumentó. Abdollahi et al.
(2012) tambien trabajaron con aceite esencial de romero, y tuvieron comportamientos similares
al adicionar este tipo de aceite en peliculas de quitosano.
Actividad antimicrobiana
Se determinó el porcentaje de inhibición de las películas de quitosano suplementadas con
aceites esenciales de romero y orégano, frente a los patógenos de E. coli y B. subtilis, los
resultados obtenidos se observan en la Tabla 23 y en la Figura 32. Adicionalmente en la Figura
33 y 34 se evidencian las imágenes de fluorescencia, en donde se observan las celdas en verde
(SYTO9) y las células muertas con las membranas dañadas en rojo (yoduro de propidio).
68
Tabla 23. Porcentaje de inhibición de películas de quitosano suplementadas con
aceites esenciales.
Película de quitosano Porcentaje de inhibición
de E. coli
Porcentaje de inhibición
de B. subtilis
Control 3,77 ± 2,01 12,46 ± 4,75
Orégano 0,4% 4,70 ± 1,06 15,93 ± 6,25
Orégano 1,5% 6,94 ± 2,18 23,75 ± 5,22
Romero 0,4% 6,32 ± 1,04 35,69 ± 7,55
Romero 1,5% 11,96 ± 4,17 36,29 ± 9,8
Figura 32. Porcentaje de inhibición de las películas de quitosano frente a E. coli y B.
Subtillis.
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Control Orégano 0,4% Orégano 1,5% Romero 0,4% Romero 1,5%
Po
rcen
taje
de
inhib
ició
n (
%)
Título del eje
E. Coli B. Subtilis
69
Figura 33. Porcentaje Inactivación de E. coli de las películas de quitosano
suplementadas con aceites esenciales.
Figura 34. Porcentaje Inactivación de B. subtilis de las películas de quitosano
suplementadas con aceites esenciales.
70
Como se observa en la Tabla 23 y en la Figura 32, 33 y 34, las películas con aceites
esenciales de orégano y romero superaron el porcentaje de inhibición de la película control frente
a E. coli y B. subtilis. Para el caso de E. coli el porcentaje de inhibición de la película control fue
de 3.77%, y las películas con aceite esencial de orégano al 1.5% y romero al 1.5% tuvieron un
6.94% y 11.96% de inhibición, respectivamente. Así mismo, en el caso de B. subtilis el
porcentaje de inhibición de la película control fue de 12,46%, y las películas con aceite esencial
de orégano al 1.5% y romero al 1.5% tuvieron un 23,75% y 36,29% de inhibición,
respectivamente.
Con respecto al comportamiento de ambos aceites esenciales en la inhibición de E. coli y
B. subtilis, el aceite esencial de romero presento mejor inhibición en comparación al aceite
esencial de orégano para ambas bacterias. Se observó que la relación entre la concentración de
los aceites esenciales y el porcentaje de inhibición es directamente proporcional, es decir, que el
incremento de la concentración en ambos aceites esenciales beneficia a la inhibición del
crecimiento de la bacteria. En general la respuesta de todas las películas hacia la inhibición de las
bacterias fue mayor frente a la bacteria B. subtilis, en comparación con la bacteria E. coli.
Adicionalmente, se ha reportado actividad antimicrobiana en películas de quitosano por
Youn et al. (2000) frente a B. subtilis en el alimento de salchica y Rao et al. (2005) frente a E.
coli y B. subtilis en alimentos de filete de bacalao y salchicha.
71
CONCLUSIONES
Se logró extraer quitosano a partir del camarón titi de la especie Xiphopenaeus riveti,
como se pudo evidenciar en las pruebas de caracterización del mismo, en donde se obtuvo un
grado de desacetilación del 69,34% y un peso molecular del 443952,17 g/mol, adicionalmente la
espectroscopia IR permitió identificar los grupos correspondientes al quitosano.
Con respecto a las películas de quitosano, las propiedades físicas tales como apariencia y
rugosidad se vieron beneficiadas con la adición de aceites esenciales. Cabe destacar que estas
propiedades influyen en la calidad superficial del recubrimiento, siendo los resultados obtenidos
favorables para la aplicación.
Las propiedades antioxidantes y antimicrobianas incrementaron con la adición de aceites
esenciales; la capacidad antioxidante el aceite esencial de orégano presentó la mayor capacidad
antioxidante en comparación al aceite de romero. En relación con la actividad antimicrobiana se
observó mayor porcentaje de inhibición de las películas contra el patógeno B. subtilis, en donde
el romero brindó la mayor inhibición. Se evidenció que los aceites esenciales cumplieron su
papel de agentes antioxidantes y antimicrobianos, lo cual supone un beneficio en la preservación
de alimentos.
Sin embargo, las propiedades mecánicas de las películas se vieron afectadas
negativamente con la incorporación de los aceites esenciales, siendo el aceite de orégano el que
presentó mayor resistencia a la tensión en comparación con el aceite de romero. Así pues las
propiedades mecánicas de las películas suplementadas con aceites esenciales no contribuyen a la
aplicación como recubrimiento.
72
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