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EVALUACION DE 42 EXTRACTOS VEGETALES PARA EL CONTRO L DE LA BROCA DEL CAFÉ ( Hypothenemus hampei, FERRARI)

ANGELICA MARIA BUSTAMANTE PELAEZ

UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PERERIA FACULTAD DE TECNOLOGIA

ESCUELA DE TECNOLOGIA QUIMICA

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PEREIRA JULIO 2007

EVALUACION DE 42 EXTRACTOS VEGETALES PARA EL CONTRO L DE LA BROCA DEL CAFÉ ( Hypothenemus hampei, FERRARI)

TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al titulo de Tecnóloga Química

Presentado por ANGELICA MARIA BUSTAMANTE PELAEZ

Director JAIME NIÑO OSORIO

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UNIVERSIDAD TECNOLOGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGIA

ESCUELA DE TECNOLOGIA QUIMICA PEREIRA

JULIO 2007

1. INTRODUCCION

El cultivo del cafeto (Coffea arabica) constituye uno de los principales rubros generadores de divisas en América Latina y particularmente en Colombia; sin embargo, diversos factores bióticos y abióticos, influyen en la producción de este cultivo. Entre los factores bióticos los insectos participan como agentes responsables de los daños presentados en las plantaciones de café (Rosales et al., 1998). Se estima que la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari), provoca daños del orden de 500 millones de dólares en todo el mundo (Neves et al., 2005), siendo el insecto plaga de mayor importancia en las plantaciones de café. En muchas regiones cafeteras del mundo, afectadas por la broca del café, utilizan ampliamente los insecticidas como la principal medida de control (Decazy, 1978). En Colombia el uso indiscriminado de insecticidas ha causado serios problemas a la salud de los habitantes y trabajadores de las zonas cafeteras, contaminación de las fuentes de agua, mortalidad de la fauna y residualidad en el producto final, esto último puede conllevar a problemas de mercadeo del café en el ámbito internacional (Bustillo et al., 1998). El manejo integrado de la broca del café es de importancia fundamental debido a que la carencia de control puede causar reducción significativa en la producción de los cafetales; en este sentido, la aplicación de un programa de manejo integrado de plagas (MIP) que utilice al máximo los conocimientos integradores del agroecosistema, desempeña un papel fundamental para el control de sus poblaciones. El MIP es una filosofía de control que trata de preservar e incrementar los factores de mortalidad natural, implementando diferentes métodos de control, tomando en consideración aspectos ecológicos, económicos y sociales, con la finalidad de maximizar los rendimientos y minimizar su interferencia con el ecosistema (Rosales et al., 1998). Como forma de controlar la broca del café se utilizan técnicas biológicas en reemplazo de los insecticidas sintéticos, puesto que estos son costosos y altamente tóxicos al aplicarlos para controlar la plaga.

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Por lo anterior, con este trabajo se busca encontrar extractos vegetales con actividad insecticida contra la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari), que puedan integrarse a un programa MIP en los cafetales de la región colombiana, a partir de 21 especies de plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa.

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2. MARCO TEORICO

2.1. DESCRIPCIÓN ZONA DE ESTUDIO

Reserva Natural Bremen-La Popa Esta Reserva se encuentra ubicada en la zona limítrofe de los municipios de Finlandia y Circasia (Quindío), vía que de Armenia conduce a Pereira y es el remanente natural de bosque de mayor área en este departamento. Figura 1. Zona de Reserva Natural Bremen-La Popa La reserva forestal de Bremen-La Popa fue establecida a principios de la década de los 70 para la protección de cuencas hidrográficas del departamento del Quindío. Hoy en día, tiene 336 ha de bosque nativo y 411 ha de plantaciones maderables de árboles exóticos (figura 1). Actualmente estas plantaciones están siendo aprovechadas y dejadas en regeneración natural; por consiguiente en el futuro esta Reserva tendrá una extensión de 747 ha de bosque natural.

Figura 2. Ubicación geográfica zona de estudio Bremen-La Popa

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2.2. DESCRIPCION DE LA BROCA DEL CAFÉ, Hypothenemus hampei Ferrari (Coleóptera: Curculionidae: Scolytidae) Clasificación taxonómica: Reino: animalia Clase: insecta Orden: coleoptera Familia: scolytidae Genero: Hypothenemus Especie: Hypothenemus hampei Nombre común: broca del café (Farrell et al., 2001) El adulto de la broca es un pequeño escarabajo de coloración café oscuro brillante, casi negro, los elitros presentan estrías longitudinales paralelas, cubiertos de pelos cortos que crecen hacia atrás. En los machos, las alas son soldadas (rudimentarias) impidiéndoles volar. Caso contrario ocurre en las hembras. La cabeza es globular, con antenas capitadas de cinco segmentos como puede observarse en la figura 3. La hembra mide aproximadamente de 1,65 a 2,0 mm de largo, el macho mide 1,18 mm de largo. En el grano de café afectado, la relación entre el número de machos y hembras es de 1:10 (Rosales et al., 1998).

Figura 3. (A) Hembra de broca del café. (B) Macho de broca del café (Bustillo et al., 1998). Las hembras, al iniciar el periodo de oviposición, colocan en promedio dos huevos diarios y posteriormente, después de 10 a 20 días del inicio de la

A

B

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oviposición ponen un huevo por día durante 10 a 12 días y finalmente, un huevo cada dos días. Su ciclo biológico varia de 27 a 30 días (huevo: 6-10 días; larva: 14 días y pupa: 7 días) y se pueden presentar hasta siete generaciones de broca por año.

La longevidad promedio del adulto es de 156 días y cada hembra pone de 31 a 119 huevos. Entre cosechas, la hembra permanece en los frutos que caen al suelo debajo de la sombra del cafetal, manteniéndose allí hasta la próxima fructificación. Este lapso se denomina periodo de transito. Los daños se inician en los frutos entre los 120 a 150 días después de la floración, cuando ataca con preferencia frutos de consistencia sólida de aproximadamente un 20% de su peso seco. Este periodo es muy importante, ya que en el deben iniciarse las actividades de muestreos de frutos. Si los frutos se encuentran muy tiernos o acuosos no son preferidos por la broca. Diversos factores favorecen la infestación del insecto. Dentro de ellos los componentes del clima, las lluvias tienen un efecto directo cuando son de poca intensidad, ya que favorecen la reproducción abundante del insecto y su exceso tiene un efecto indirecto al retrasar la cosecha normal (Souza y Reis, 1993). También, la temperatura y la humedad relativa afectan directamente la duración del ciclo de vida; las altas temperaturas lo disminuyen y la elevada humedad facilita su sobrevivencia entre cosechas. De manera similar, al realizar la cosecha de forma incorrecta, o donde exista exceso de sombra y/o plantaciones densas se favorece la reproducción, dispersión e infestación de esta plaga (Matiello, 1991; Rena et al., 1994; Souza et al., 1993).

Larva

Prepupa

Figura 4. Ciclo de vida de la broca del café Hypothenemus

hampei (Bustillo et al., 1998).

Huevo

Pupa

Adulto

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Por otra parte, la tasa de reproducción del insecto varia de acuerdo con la altitud; a medida que esta aumenta se afecta negativamente su ciclo biológico y se reproduce lentamente (Souza et al., 1993). La broca inicia su ataque cuando las hembras fecundadas abandonan el interior del fruto, tratando de encontrar otro para su reproducción. Para ello, buscan las condiciones ideales para penetrarlo, generalmente la realizan por la corona. Después de la penetración, la hembra abre una galería y llega hasta el interior del grano, donde fabrica una pequeña cámara para depositar los huevos (Federación Nacional de Cafeteros de Colombia, 1989; Oliveira, 1982). 2.3. Estrategias para el control de la Broca del ca fé Para la broca del café, el control se debe iniciar cuando en el muestreo se obtiene 5% o más de frutos dañados y de 10% o más de frutos infestados para los muestreos convencionales o secuenciales, respectivamente (Crocomo, 1990; Gravena, 1992). 2.3.1. Alternativas de manejo De manera general, la aplicación de un programa de manejo integrado de plagas, utilizando el control cultural, biológico y químico tiene las siguientes estrategias: 1. Reducción de las poblaciones de la plaga y de la infestación inicial 2. Preservación e incremento de los enemigos naturales 3. Preservación e incremento de la diversidad del agroecosistema 4. Monitoreo de las plagas y de sus enemigos naturales 2.3.2. Control cultural Al analizar el daño que la broca le hace al café, su biología y comportamiento de ataque es fácil deducir que el control cultural del insecto está sustentado en las prácticas encaminadas a minimizar la disponibilidad de alimento y refugio de la plaga (Bustillo et al., 1998). Recomendaciones del manejo del cultivo para minimizar los daños causados por la broca del fruto del café.

• La cosecha debe realizarse muy bien, iniciándola, por los lotes de mayor infestación.

• Recolección de los frutos caídos al suelo y de los que permanecen en la planta después de la cosecha (re-re).

• Descomponer la pulpa del fruto antes de usarla como abono. • Eliminación de los cafetales abandonados. • Regulación del sombrío y control de las malezas. • Fertilización adecuada y oportuna.

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En Colombia las practicas de cosechas oportunas y recolección de todos los frutos maduros, redujeron los niveles de infestación de un 70% a menos del 6% durante la cosecha (Saldarriaga, 1994). 2.3.3. Control biológico Para el control biológico de la broca del fruto del café, en 1929 fue introducida de Uganda (África) a Sao Paulo (Brasil) la avispa Prorops nasuta Waterson, de la familia Bethylidae. Existen otros enemigos naturales que pueden ser utilizados (tabla 1). Parasitoide: Un parasitoide es un insecto que depreda o parasita a un insecto de otra especie inyectando sus huevos dentro del cuerpo de su huésped para que al eclosionar, sus larvas se alimenten de él, tal como es el caso de Prorops nasuta, Cephalonomia stephanoderis y Phymastichus caffea Entomopatógeno: Organismo causante de enfermedades en los insectos, normalmente son bacterias, virus, hongos o protozoos. Por ejemplo Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae y Paecilomyces spp. Aplicaciones localizadas de hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, en localidades que presentan tiempo nublado y alta humedad relativa favorecen su eficiencia de control, así como también la liberación de los parasitoides Cephalonomia stephanoderis y Heterospilus coffeicola. La liberación de los enemigos naturales de los insectos-plagas, contribuyen a incrementar el impacto del control biológico en un programa de manejo integrado. Tabla 1. Enemigos naturales de la broca del café (Rosales et al., 1998) 2.3.4. Control químico El control químico de la broca del café debe realizarse cuando las hembras adultas están volando en la búsqueda de nuevos granos de café ó cuando están iniciando la perforación, pretendiendo evitar daños en los granos de café

Enemigo Natural Hábito Nombre común Nombre científico

Avispa de Uganda

Prorops nasuta Parasitoide

Avispa de Costa de Marfil

Cephalonomia stephanoderis

Parasitoide

Avispa de Togo Phymastichus caffea

Parasitoide

Hongos

Beauveria bassiana Entomopatógeno Metarrhizium anisopliae

Entomopatógeno

Paecilomyces spp Entomopatógeno

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sanos (Bustillo et al., 1998); adicionalmente se deben tomar en consideración los índices porcentuales del muestreo o nivel de acción para las plagas (Gravena, 1992). Los insecticidas clorpirifos (O,O-dietil O-3,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato) y endosulfan (6,9-metano-2,4,3-benzodioxatiepin) son los más usados para el control de la broca. El endosulfan causa una alta mortalidad, pero se han encontrado en Nueva Caledonia linajes de broca resistentes (Brun et al., 1989). Son comunes los casos de envenenamiento, por lo que se recurre a insecticidas más inocuos tales como fenitrothion, fenothion y pirimifos de metilo (Bustillo et al., 1998). No obstante, en general cualquier insecticida es peligroso para la salud del ser humano y contamina el ambiente. 2.4. DESCRIPCION DE LAS FAMILIAS SELECCIONADAS EN EL ESTUDIO Plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiácea y Solanaceae, han sido muy utilizadas en la medicina natural, aunque algunos de sus componentes se usan como antibacterianos o antimicrobianos, antimaláricos o como sedantes (Mahabir, 1995); en este grupo de familias se encuentran algunas especies cuyos extractos se han empleado como insecticidas (Tabla 2), generando la posibilidad de investigar los extractos vegetales de las familias en estudio, de las cuales a continuación, se presenta una descripción general. 2.4.1. Familia Asteraceae Pueden ser hierbas, bejucos, arbustos o árboles, que presentan hojas alternas, verticiladas u opuestas, simples o compuestas; sin estípulas. Inflorescencia de una a numerosas cabezuelas o capítulos con una a numerosas flores sésiles sobre un receptáculo común; cabezuelas heterógamas radiadas o disciformes, u homógamas discoides o liguladas, basalmente rodeadas por un involucro de brácteas (filarias) libres o connatas, en una o varias series; receptáculo convexo, cóncavo, plano o cónico; paleas rodeando las flores o reducidas a cortas escamas o ausentes, un ejemplo de esta familia puede observarse en la figura 5. Figura 5. Tilesia baccata (Asteraceae).

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En esta familia se encuentran flores perfectas, femeninas, masculinas o estériles; corola gamosépala, regular, tubular, bilabiada, ligulada o filiforme, 2–5 dentada; 4–5 estambres, filamentos usualmente libres, anteras formando un tubo alrededor del estilo, ápice con apéndice, base truncada o con apéndices de varios tipos; ovario ínfero, unilocular, con un óvulo, estilo con 2 ramas, pubescente, glabro o glandular, con las porciones estigmáticas hacia adentro. Frutos con un aquenio coronado por el vilano o papo que es el cáliz modificado a manera de cerdas, escamas, pelos, aristas o setas (Aristeguieta, 1964). 2.4.1.1. Actividad biológica: Algunos extractos de plantas de la familia Asteraceae, como Achyrocline satureioides presentan actividad antmicrobiana; Ageratum conyzoides y Ambrosia cumanensis entre otras, presentaron actividad antimicrobiana contra Staphylococus aureus (Mahabir, 1995). 2.4.2. Familia Euphorbiaceae La familia Euphorbiaceae consta de unos 300 géneros y 7500 especies de distribución cosmopolita, mejor desarrollada en las regiones tropicales y subtropicales (Macbride, 1951). Se encuentran en esta familia hierbas, bejucos, árboles o arbustos, generalmente con látex lechoso o coloreado; plantas monoicas o dioicas. Hojas alternas, simples; estípulas generalmente presentes. Inflorescencia cimosa, racimosa, espigada como se observa en la figura 6. Posee flores unisexuales, perianto inconspicuo, estambres 5 a numerosos, filamentos libres o unidos, anteras con dehiscencia longitudinal; ovario súpero, 3-locular y 3-carpelar (raramente 2), estilos libres o unidos; óvulos 1–2 por lóculo en placentas axilares. Fruto capsular, tricoco con dehiscencia elástica y separándose de la columela central, o algunas veces una drupa; 1–2 semillas. Figura 6. Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae).

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2.4.2.1. Actividad biológica: El extracto etanólico de Acalypha alopecuroidea presentaron actividad antibacteriana; los extractos etanólicos de Acalypha guatemalensis mostraron actividad antimicrobiana contra cepas de Salmonella typhi (60%), Staphilococcus aureus (50%) y Pseudomona aureginosa (15%); además, los extractos acuosos y etanólicos de Jatropha gossypiifolia fueron activos como molluscicida frente a Bulinus globulus (Mahabir, 1995). Varias especies de Phyllantus, presentaron efectos antivirales contra la hepatitis B (Venkateswaran et al., 1987; Thyagarajan et al., 1988; Shead et al., 1992). 2.4.3. Familia Rubiaceae Esta família está constituída por árboles o arbustos, hierbas o trepadoras. Poseen hojas opuestas, simples; estípulas generalmente interpeciolares, persistentes o caducas. Flores perfectas o unisexuales; cáliz con el tubo unido al ovario formando un hipanto, limbo con 4–5 dientes o lóbulos o espatulado; corola gamopétala, actinomorfa, infundibuliforme, campanulada o rotada, lóbulos usualmente 4–6, imbricados, valvados o abiertos; estambres en igual número y alternos con los lóbulos de la corola, insertos en el tubo de la corola, anteras dehiscentes por hendiduras longitudinales; ovario ínfero, usualmente 2-locular, coronado por un disco carnoso, numerosos óvulos en cada lóculo. El fruto puede ser una baya o una cápsula (Andersson, 1992) un ejemplo de esta familia se observa en la figura 7. Figura 7. Guettarda crispiflora (Rubiaceae). La familia Rubiaceae es una de las más grandes que poseen plantas con flores, consta de unos 600 géneros y de unas 10.000 especies. Su distribución es cosmopolita pero está mejor representada en las zonas tropicales (Andersson, 1992). 2.4.3.1. Actividad biológica: En algunas especies de esta familia se han reportado saponinas esteroidales (Sparg et al., 2004); así como la presencia del alcaloide camptotecina aislado de Ophiorrhiza mungos, O. pumila, O. filistipula (Wink, 2003). Es importante destacar que este alcaloide es la materia prima para hemisíntesis de una serie

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de derivados con propiedades anticancerígenas. La corteza del árbol Ladambergia macrocarpa, se utiliza contra las fiebres palúdicas y estados febriles en general (García, 1992). 2.4.4. Familia Solanaceae En esta familia se pueden encontrar hierbas, arbustos o árboles, con pelos estrellados y algunas veces con espinas; biosintetizan alcaloides. Poseen hojas alternas, simples (raramente compuestas) enteras o hendidas; sin estípulas, como puede observarse en la figura 8. Poseen flores perfectas pequeñas a muy grandes; cáliz gamosépalo; corola simpétala, rotada a tubular, lóbulos convolutos, imbricados o valvados; estambres adheridos a la base del tubo de la corola, en igual número y alternos a los lóbulos o reducidos a 4, anteras con dehiscencia longitudinal o por poros; ovario súpero, bicarpelar, generalmente bilocular, numerosos óvulos en placentas axilares elaboradas. La familia Solanaceae consta de 83 géneros y unas 2800 especies de distribución cosmopolita, pero está mejor desarrollada en América del Sur. De importancia económica son la papa (Solanum tuberosum L.), el tomate (Lycopersicon esculentum Miller), el ají (Capsicum frutenses), el tabaco (Nicotiana tabacum), el lulo (Solanum quitoense), entre otros (Hunziker, 1979). Figura 8. Solanum acerifolium (Solanaceae). 2.4.4.1. Actividad biológica: Plantas de esta familia tienen usos medicinales debido a los alcaloides que biosintetizan, tales como hiosciamina, atropina y escopolamina, entre otros, los cuales actúan como anticolinérgicos, antirreumáticos y estimulantes del sistema nervioso central (SNC); así mismo, son usados por causar efectos relajantes y somnolencia. También se han reportado metabolitos secundarios como saponinas, esteroles, taninos, carbohidratos, flavonoides, ácidos grasos y vitamina D (Córdoba, 2002; Mora y Orozco, 2002). Solanum torvum Swartz contiene en sus frutos isoflavonoides como el torvanol A y el glicósido esteroidal torvosido H que le confiere una actividad fuerte contra el virus herpes simplex tipo I (Arthan et al., 2002).

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La especie Acnistus arborescens posee fuerte actividad citotóxica debido a sus lactonas esteroidales (Minguzzi et al., 2002). Las especies Solanum lycioides L. y Cestrum parifolium Willd. ex Roem et Schult. También son conocidas por tener metabolitos con capacidad citotóxica y son usadas popularmente en el tratamiento de enfermedades de la piel, úlceras y fiebre (Moreno-Murillo et al., 2001). 2.4.5. Familia Apocynaceae

Esta familia botánica se encuentra distribuida en todas las zonas tropicales y subtropicales del planeta contando con 15.000 especies divididas en 180 géneros. Presentan diferentes estructuras pudiendo ser leñosas, arbóreas y bejucos; prefieren los climas templados a secos y en algunos casos su crecimiento se circunscribe a suelos arcillosos (Schmidt, 2006) en la figura 9 se observa una planta característica de esta familia. Figura 9. Ervatamia divaricata (Apocynaceae) 2.4.5.1. Actividad biológica: La especie Acokanthera schimperi se utiliza en el tratamiento de varias enfermedades de la piel de origen viral; además, de ella se han identificado compuestos como la ouabaina, amirina, uvaol y derivados del ácido ursólico que inhibe infecciones causadas por rinovirus (Gebre-Mariam et al., 2006). Así mismo Acokantera schimperi ha demostrado actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus y Pseudomona aeruginosa, lo cual hace que sus extractos puedan utilizarse contra enfermedades causadas por estos microorganismos (Tadeg et al., 2005). En esta familia también se encuentran los alcaloides vinblastina y vincristina, aislados de Cantharanthus roseus, los cuales poseen marcada acción para el tratamiento del cáncer, por lo que son utilizados clínicamente contra la leucemia, el cáncer de seno, entre otros (Pung, 2000).

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2.4.6. Familia Asclepiadaceae La familia Asclepiadaceae constituye un gran grupo que comprende unas 1700 especies. Se trata de plantas herbáceas, lianas y árboles ocasionalmente, caracterizadas por tener hojas opuestas, simples y sin estípulas. Algunas veces presenta hábitos xerofíticos, con tallos suculentos y sin hojas, en relación con la adaptación al ambiente árido. Las flores son hermafroditas y actinomorfas, pentámeras, dispuestas en inflorescencias cimosas (figura 10). El cáliz está formado por 5 sépalos más o menos libres, y la corola por 5 pétalos escasamente concrescentes, normalmente con una corona de derivación corolina o de origen estaminal. El androceo está constituido por 5 estambres, generalmente soldados procurando una protección al gineceo, es decir, formando un ginostegio. El gineceo está compuesto por 2 carpelos formando un ovario súpero o, en alguna ocasión, semiínfero; los estilos están fusionados pero presentan 5 estigmas diferenciados con masas polínicas que se enganchan en los insectos polinizadores y aseguran la fecundación cruzada. Figura 10. Asclepias curassavica (Asclepiadaceae) 2.4.6.1. Actividad biológica: Asclepias linaria posee actividad insecticida contra el gorgojo del maíz Sitophilus zeamais y S. orizae (Hernandez, 1994). En el género Asclepias se encontró ácido cinnámico que actúa como fungicida, pesticida y herbicida, además polifenoles que poseen efectos antibacterianos (Mahabir, 1995). 2.5. Teorías de defensa de las plantas Los mecanismos de resistencia, son aquellas características de la planta que hacen que el insecto atacante le cause menos daños. La resistencia, es una herramienta importante con la cual cuenta el hombre para encontrar novedosos compuestos bioactivos que ayuden a reducir el daño que éstos puedan causar sobre los cultivos (Álvarez et al., 2001).

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Dos de los principales mecanismos de resistencia a insectos son la ecológica y la genética. Dentro de esta última se destacan las plantas que poseen factores de no preferencia, las que tienen tolerancia al daño y aquellas que provocan antibiosis. La antibiosis implica un efecto fisiológico adverso al desarrollo de un insecto de tipo transitorio o permanente, este efecto puede ser provocado por la presencia de sustancias como metabolitos tóxicos (glucósidos, quinonas), plantas que presentan un desbalance de nutrientes para el organismo plaga y la presencia de enzimas inhibidoras de la digestión. Estas sustancias pueden provocar la muerte de insectos pequeños, disminución de la tasa de crecimiento, fallas en la metamorfosis, alteración de la diapausa, reducción de la fertilidad, entre otros (Aragón, 2003).

La resistencia a plagas es una tecnología que puede brindar control a gran diversidad de insectos que suelen afectar a los cultivos pero su utilización debe ser efectuada dentro de un programa de control integrado, lo que permite fomentar el control biológico y reducir el uso de insecticidas. Entre las ventajas de las plantas resistentes se destacan su especificidad, persistencia, compatibilidad con otras tácticas de manejo integrado y el medio ambiente (Aragón, 2003).

Las plantas contienen gran riqueza de agentes químicos, algunos de los cuales pueden ser tóxicos e incluso pueden hacer que una plaga se desarrolle más lentamente. Hay docenas de productos naturales de plantas que tienen algún efecto antibiótico en los insectos, incluyendo los pesticidas botánicos como la rotenona y el piretro. La resistencia a insectos permite a una planta evitar, tolerar o recuperarse de los daños provocados por las poblaciones de insectos u otros organismos dañinos. Esta característica puede provenir de aspectos morfológicos y/o bioquímicos que afectan el comportamiento y metabolismo de las plagas.

Algunos de los compuestos, como el ácido jasmónico, pueden ser producidos por las plantas al primer ataque de un insecto o patógeno. Sin embargo, sus niveles son a veces muy bajos para proporcionar la protección adecuada. Igualmente, las plantas poseen estructuras como vellos o espinas que pueden impedir que insectos o agentes extraños la ataquen y de esta forma también se presenta un efecto de antibiosis (Caldwell et al., 2004). 2.6. Insecticidas naturales a partir de extractos v egetales A partir de la necesidad por encontrar nuevas alternativas naturales para el control de insectos plagas y en lo posible reemplazar los pesticidas sintéticos aparecen los insecticidas botánicos ofreciendo seguridad para el medio ambiente y una eficiente opción agronómica. Muchas plantas son capaces de sintetizar metabolitos secundarios que poseen propiedades biológicas importantes contra insectos plagas (Céspedes et al., 2001), estos deben tener principios activos potentes, con alta estabilidad química y óptima producción.

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En hortalizas como, la papa, el tomate y la berenjena pertenecientes a la familia Solanaceae, se producen alcaloides como chaconina, solanina y tomatina, que poseen un efecto insecticida amplio, aunque algunas especies de insectos han aprendido a tolerar estas toxinas (Menjivar, 2001). El uso de insecticidas naturales reduce el riesgo de la resistencia en los insectos, tiene menos consecuencias letales para los enemigos naturales, reduce la aparición de plagas secundarias, es menos nocivo para el hombre, y no ocasiona daños al medio ambiente (Stoll, 1989). Los compuestos son tan variados como las plantas de las cuales han sido aislados y el rango de su efecto protector va desde repelencia, disuasión de la alimentación y oviposición hasta toxicidad aguda e interferencia con el crecimiento y el desarrollo. Algunos extractos de diferentes familias de plantas que han presentado actividad para el control de insectos se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Ejemplos de extractos de plantas que presentan actividad insecticida.

FAMILIA ESPECIE COMENTARIO

Alliaceae

Allium sativum

El extracto de ajo ha sido utilizado como insecticida, repelente, fungicida, bactericida y nematicida (Silva et al., 2002).

Apocynaceae Ervatamia divaricata

Actividad insecticida contra T. confusum (17%) y C. formicarius (Mitchell et al., 2006).

Asclepiadaceae Asclepias curassavica

Actividad insecticida contra B. microplus (Mitchell et al., 2006).

Asteraceae

Asteraceae

Ambrosia cumanensis

En extractos de la planta se han encontrado propiedades insecticidas (Mahabir, 1995).

Franseria artemisioides

La coronofilina extraída de esta planta, posee actividad insecticida contra ciertos dípteros (Mahabir, 1995).

Agerantum conyzoides

El extracto acuoso de la planta entera ha demostrado actividad insecticida contra Tribolium castaneum y Musca domestica (Mahabir, 1995).

Compositae

Chrysantemum cinaerifolium

Las piretrinas son ésteres con propiedades insecticidas atacan tanto el sistema nervioso central como el periférico, lo que hace que el insecto apenas entre en contacto con la superficie tratada deje de alimentarse y caiga (Silva et al., 2002).

Euphorbiaceae

Croton linearis Actividad insecticida contra T. confusum (37%) y Cylas formicus (Mitchell et al., 2006).

Croton cajucara De esta planta se aisló un diterpeno (cis-dehidro-crotonin) que presenta propiedades insecticidas (Bittner et al., 2001).

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Moraceae Artocarpus altilis Park

Actividad insecticida contra C. formicarius e Hypothenemus hampei (Mitchell et al., 2006)

Myrtaceae Eucalyptus globulus

Las hojas de esta especie poseen actividad insecticida (parásitos) (García B, 1992).

Papaveraceae Boconia frutescens

Las semillas poseen un aceite empleado contra la sarna y los piojos (García B, 1992).

Papilionaceae

Gliricidian sepison El mata-ratón (nombre común) es utilizado como insecticida (García B, 1992).

Indigofera lespedezioides

El polvo de las semillas y raíces se empleam como insecticida (García B, 1992).

Tephrosia toxicaria

Las hojas de esta especie maceradas en agua fría poseen actividad insecticida (García B, 1992).

Abrus precatorius La parte aérea de esta planta posee actividad insecticida (García B, 1992).

Poligonaceae Polygonum segetum

Insecticida y emplean las hojas trituradas contra la sarna y pulgas de perros (García B, 1992).

Rubiaceae

Coffea liberica Actividad insecticida contra T. confusum (13%) (Mitchell et al., 2006)

Borreria laevis Actividad insecticida contra T. confusum (13%) (Mitchell et al., 2006).

Sapindaceae Blighia sapida Presenta actividad insecticida contra C. formicarius (100%) e Hypothenemus hampei (2.3%) (Mitchell et al., 2006)

Solanaceae

Nicotiana tabacum

La nicotina es básicamente un insecticida de contacto no persistente. La actividad insecticida de la nicotina provoca contracciones espasmódicas, convulsiones y la muerte del insecto (Silva et a, 2002).

Solanaceae

Capsicum frutenses

El extracto de ají es usado como repelente de contacto para insectos adultos, ovicida y disuasor de alimentación (Silva et al., 2002).

Theaceae Mammea americana

Las semillas (molidas) haciendo una emulsión con agua presentan actividad insecticida (García B, 1992).

Cuatro extractos (tabla 2) han sido usados como repelentes contra la broca del café, estos son: ají (Capsicum frutenses, Solanaceae), tabaco (Nicotiana tabacum, Solanaceae), ajo (Allium sativum, Alliaceae) y el extracto del árbol de Neem (Azadirachta indica, Meliaceae). Los extractos de las plantas Artocarpus altilis Park (Moraceae) y Blighia sapida (Sapindaceae) han sido evaluados como insecticidas contra la broca del café.

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3. JUSTIFICACION

Con este proyecto se trata de realizar el tamizado de los extractos vegetales de las plantas recolectadas en la reserva natural Bremen-La Popa, para determinar cuales impiden que la broca perfore y penetre el grano de café y así no puedan llegar a reproducirse dentro del grano, donde causa el verdadero daño cuando sus larvas se alimentan de la almendra. En nuestro país, la broca del café fue registrada por primera vez en 1988 afectando cafetales del sur del país. Se ha estimado que Colombia tiene aproximadamente 870.000 hectáreas cultivadas en café y actualmente la broca se encuentra distribuida en el 82% del área cafetera, 715.073 ha (Herrón, 1998). La inversión para el manejo de broca es de aproximadamente $96.385 pesos por ha/año (Duque, 1994), los costos se sitúan en un rango que va del 4,8%, hasta un 11,7% del costo total de producción (Marquez, 1998) Respecto a los insecticidas, un alto porcentaje de agricultores utilizan esta herramienta (95,8%), el producto más utilizado es el Thiodan (endosulfan) y el 34% de los agricultores aplican insecticidas cuatro o más veces por año. Estas condiciones muestran un uso intensivo de estos agentes, a pesar de que solo el 2,8% lo hace de acuerdo a los lineamientos del Manejo Integrado de Broca (MIB) (Duque et al., 1996). Se descubrió que la broca ha desarrollado gran resistencia al Endosulfan y otros insecticidas sintéticos (Brun et al., 1989); además, estos productos causan un impacto adverso en los ecosistemas. Teniendo en cuenta las hectáreas de cultivo de café afectadas por la broca y el costo de control por ha/año, en Colombia se invierten aproximadamente 6800 millones de pesos en un solo año para el control de la plaga. Por lo anterior, es de gran importancia evaluar y encontrar métodos que contribuyan a la disminución de las poblaciones de broca del café, que sean menos contaminantes para el medio ambiente y menos tóxico para la población humana. Se pretende con este trabajo contribuir al descubrimiento de la actividad insecticida de las plantas de nuestra región y adicionalmente valorar la flora regional.

20

4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Identificar especies de la Reserva Natural Bremen-La Popa con actividad insecticida contra Hypothenemus hampei (Ferrari). 4.2. Objetivos específicos

• Obtener extractos de diclorometano y metanol de 21 plantas

recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa. • Caracterizar fitoquímicamente los extractos de diclorometano y metanol.

• Evaluar el efecto insecticida de los 42 extractos vegetales contra

Hypothenemus hampei (Ferrari) utilizando granos de café pergamino húmedo.

21

5. SECCION EXPERIMENTAL

5.1. Materiales 5.1.1. Reactivos La extracción de los materiales vegetales se realizó con n-hexano (C6H14), metanol (MeOH) y diclorometano (CH2Cl2) grado comercial. En la preparación de la dieta artificial se utilizó agar bacteriológico Nº1 (Oxoid, Inglaterra), Derosal (Bayer Cropscience, Colombia), benzoato de Sodio (comercial), nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate Sigma, USA), levadura torula (MP Biomedicals, Inc., Francia), formaldehído 37% (Fisher Scientific, USA), ácido ascórbico (Carlo Erba), sacarosa (Sigma, USA), caseína hidrolizada (Oxoid, Inglaterra), etanol absoluto (Carlo Erba), sales de wesson (Sigma-Aldrich, USA) y colesterol (Sigma, USA). Para realizar la marcha fitoquímica se utilizaron cromatofolios de silica gel 60 F254 soportados sobre una placa de aluminio de 20 x 20 cm (Merck, Alemania). Los solventes utilizados en la preparación de las soluciones patrón de los extractos a 40000 mg/L fueron etanol (EtOH) y butanol (BuOH) ambos Merck, (Alemania) grado analítico. 5.1.2. Controles Como control positivo se utilizó el plaguicida Endosulfan, el cual ha sido el más utilizado para el control de la broca del café, así mismo se usó como control negativo EtOH al 1 % para extractos metanólicos y la mezcla BuOH-EtOH (3:1) para los extractos de diclorometano. 5.1.3. Material de vidrio Para esterilizar el agar y el café pergamino molido se utilizaron erlenmeyers de diferente volumen Schott Duran (Mainz, Alemania). Para la medición de volúmenes entre 100 y 1000 µL se usaron micropipetas Eppendorf serie 2100 de volumen variable y para los volúmenes entre 10 y 100 µL la pipeta Brand (Mainz, Alemania) serie 01T08000. Las cajas Petri que se emplearon para servir la dieta artificial Cenibroca D-200 fueron Pyrex 100 X 30 mm. Para realizar los ensayos por antibiosis se emplearon tubos eppendorf de 2 mL (tyco/Healthcare Kendall, USA)

5.1.4. Equipos Para pesar los reactivos a utilizar en este bioensayo se utilizó la balanza analítica Mettler Toledo AB 204 (Suiza), y para la preparación de los extractos vegetales se empleó un vortex IKA MS1 (Wilmington, EEUU). Soluciones de agar, el café pergamino molido y demás material aseptico fueron esterilizados

22

en autoclaves All American (NY, USA) y para asegurar un ambiente estéril, los ensayos se realizaron en la cabina de flujo laminar Purificación y análisis de fluidos C4 FLC 120 (Colombia) y para succionar las brocas del café se utilizó una bomba de vacío Vacuubrand ME 2C (Alemania). 5.1.5. Material vegetal El material vegetal fue recolectado en la Reserva Natural Bremen La Popa por el Grupo de Biotecnología Productos–Naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira UTP bajo la asesoría del taxónomo del Herbario de la Universidad de Antioquia, Francisco Javier Roldán (HUA, Medellín, Colombia) durante el periodo de 22-24 de agosto del 2005, tiempo en el cual se recolectaron 21 especies de plantas pertenecientes a las familias botánicas Apocynaceae, Asclepiedaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiácea y Solanaceae. 5.1.5. Material biológico Para la infestación de la dieta artificial se hizo una compra de 40000 hembras adultas de broca (Hypothenemus hampei, FERRARI) en el laboratorio BIOCAFE (Chinchiná, Colombia) 5.2. Métodos 5.2.1. Proceso de extracción Con el fin de obtener los extractos crudos que se usaron en el bioensayo, el material vegetal se sometió a extracción con tres diferentes solventes, como se resume en la figura 11.

Moler

Eliminar Marco

Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco MeOH)

Guardar los extractos a –10°C

Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco CH2Cl2)

Filtrar

Rotaevaporar hasta sequedad (Extracto seco n-hexano)

(Extraer con Metanol) x 3

(Extraer con Diclorometano) x 3

Secar el material vegetal a 50 ºC por 48 horas

Marco

Marco

(Someter a extracción 300 g del material vegetal seco y molido con n-hexano) x 3

Figura 11. Proceso de extracción del material vegetal y obtención de los extractos

23

5.2.2. Proceso de desinfección del café pergamino En la realización del bioensayo, se utilizaron granos de café pergamino húmedo desinfectado como se describe en la figura 12.

5.2.3. Proceso de desinfección de la broca del café Para la realización del bioensayo usando granos de café pergamino húmedo se realizó la desinfección de la broca con un solo producto (figura 13), el cual contribuyó a reducir la contaminación experimento. Figura 13. Proceso de desinfección de la broca del café para usar en ensayos de antibiosis con granos de café pergamino. Para el caso de la dieta artificial, la desinfección con cloruro de benzalconio al 10% no fue suficiente y se observó rápidamente contaminación en las cajas Petri; motivo por el cual, se encontró una manera adicional de desinfectar la broca del café y eliminar posibles hongos en la superficie de su cuerpo, obteniendo buenos resultados para el control de la contaminación en la dieta Cenibroca D-200 (figura 14).

Figura 1 2. Proceso de desinfección para los granos de café pergamino.

Secar las brocas en corriente de aire por 2 minutos o hasta cuando se muevan

(Depositar las brocas en los eppendorf con el grano de café pergamino) X 90

Asperjar las brocas con solución de cloruro de benzalconio al 10% (Sanivec) en la cabina de flujo laminar

Preparar una solución de Derosal (antifúngico) al 3% y sumergir los granos de café seleccionados por 24 horas

Seleccionar los granos de café que se encuentren enteros y sin perforaciones de broca

Sacar los granos de café de la solución, ponerlos en una malla y dejar secar completamente

24

Figura 14. Proceso de desinfección para la broca del café usada en la dieta artificial Cenibroca D-200 (Carrión et al., 2004) 5.2.4. Dieta artificial para la cría de broca del c afé in vitro Para tener disponibilidad de broca del café en el laboratorio, se requiere una dieta adecuada para su cría, de esta forma se eligió la dieta artificial Cenibroca D-200 que es una pasta dura maleable apta para el desarrollo y crecimiento de la misma (Portilla, 1999). La composición de la dieta se resume en la tabla 3. Tabla 3. Composición de la dieta artificial Cenibroca D-200 para la cría de broca del café.

Ingrediente Cantidad para 800 mL Agua 800 mL Agar 22.4 g

Café molido 106.6 g Sacarosa 14.9 g Caseína 21.4 g

Levadura torula 21.4 g Benzoato de sodio 0.85 g

Derosal 2.4 mL Nipagin 1.06 g

Colesterol 0.64 g Acido ascórbico 1.3 g

Sales de Wesson 2.14 g Etanol 10.6 mL

Formaldehído 37% 2.3 mL

Depositar las brocas en cajas de petri con la dieta artificial Cenibroca D-200 previamente preparada

Asperjar las brocas con solución de EtOH al 96% por 1 minuto

Asperjarlas con una solución de hipoclorito de sodio al 3% por 3 minutos

Asperjarlas con EtOH al 70% por 30 segundos

(Enjuagar las brocas con agua destilada estéril) X 3

Secar las brocas en corriente de aire por 2 minutos o hasta cuando se muevan

E N

C O N D I C I O N E S

A S É P T I C A S

25

La dieta artificial se realizó con el fin de mantener la cría de broca que luego servirá para realizar los bioensayos con los extractos vegetales obtenidos a partir de las plantas recolectadas, en el anexo 1 puede observarse el proceso de preparación de la dieta. 5.2.5. Evaluación de los extractos vegetales El bioensayo contra la broca del café (figura 15) se realizó por duplicado con el fin de tener confiabilidad en los resultados.

Figura 15. Proceso para evaluar los extractos vegetales contra Hypothenemus hampei en café pergamino 5.2.6. Marcha fitoquímica aplicada a los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol Con el fin de detectar los núcleos fitoquímicos presentes en los diferentes extractos crudos evaluados, se realizó una marcha fitoquímica por cromatografía de capa delgada (CCD) para cada extracto vegetal, siguiendo la metodología descrita por Stahl (1969). Se utilizaron reveladores y patrones específicos para cada tipo de núcleo fitoquímico con el fin de comparar los resultados de los extractos con los patrones (tabla 4).

Poner los granos en solución de los extracto a 1000 mg/L por 24 horas.

Poner un grano de café con una broca adulta recién emergida desinfectada en un eppendorf.

Sacar los granos de café del tratamiento con el extracto y secarlos por 24 horas.

Tomar 90 granos de café pergamino previamente desinfectados.

Cada 4 días por 40 días, se abren dos granos de café y se hace una revisión de los estados biológicos.

Control positivo Endosulfan 1 mg/L

26

Tabla 4. Patrones y reveladores utilizados en CCD para la detección de los núcleos fitoquímicos en estudio.

Núcleo fitoquímico Patrón Revelador Alcaloides Papaverina Dragendorff Terpenos

Taxol y lanosterol

Anisaldehído/ CH3COOH-H2SO4

Triterpenos Esteroles

Flavonoides Kaempferol AlCl3 al 2% en EtOH absoluto Taninos Acido gálico y ácido

tánico FeCl3 al 5% en solución salina

saturada Fenoles Saponinas esteroidales y

triterpénicas Digitonina H2SO4 10% en EtOH absoluto

Sesquiterpenlactonas

Digitoxina Acido 3,5-dinitrobenzóico MeOH-KOH

27

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Recolección de plantas y obtención de extracto s En la figura 16 se pueden observar los puntos de muestreo y en la tabla 5 se muestra la lista de plantas y la cantidad de cada extracto obtenido (n-hexano, diclorometano y metanol).

Figura 16. Mapa de la Reserva Natural Bremen-La Popa y sitios de muestreo.

Tabla 5. Plantas recolectadas y peso de cada extracto obtenido del material vegetal recolectado en la Reserva Natural Bremen-La Popa (ventana 1: cuenca río La Vieja).

Familia Nombre Científico

Voucher FJR

Nº UTP

Peso Extracto (g) n-Hexano CH2Cl2 MeOH

Apocynaceae Cynanchum sp

3964 123 16,282 6,362 32,286

Asclepiedaceae Oxypetalum cordifolium

3981 139 10,064 12,797 16,331

Asteraceae

Pentacalia urbanii

3963 122 7,326 4,276 9,282

Mikania banisteriae

3965 124 7,091 7,107 9,282

28

Asteraceae

Clibadium pentaneuron

3966 125 2,984 4,972 8,270

Critoniella acuminata

3968 127 6,463 5,757 22,907

Baccharis sp 3972 131 7,097 7,587 10,901 Tilesia baccata

3974 133 3,510 7,600 10,328

Mikania lloensis

3977 136 2,720 5,973 14,375

Lepidaploa lehmannii

3976 135 1,337 1,058 12,617

Euphorbiaceae

Acalypha diversifolia

3967 126 4,279 5,469 22,178

Alchornea calophylla

3969 128 6,188 3,756 24,975

Hyeronima sp

3971 130 7,947 4,912 40,649

Alchornea grandis

3982 140 2,227 3,159 14,058

Rubiaceae

Guettarda crispiflora

3973 132 0,900 4,823 25,891

Faramea sp 3979 138 3,408 4,818 9,601 Solanaceae

Solanum acerifolium

3961 120 11,804 9,720 11,695

Solanum trachycyphum

3962 121 12,987 6,359 36,344

Sin Identificar

3970 129 4,909 3,626 13,043

Solanum lepidotum

3975 134 1,410 5,180 19,210

Cestrum sp 3978 137 8,117 5,657 7,389 6.2. Caracterización fitoquímica En la tabla 6 se muestran los resultados de la caracterización fitoquímica; con el signo (+) se confirma la presencia del núcleo fitoquímico en estudio y con el signo (–) la ausencia de esta en los extractos evaluados. De acuerdo a la marcha fitoquímica, las especies evaluadas de las familias Asteraceae y Euphorbiaceae, presentaron abundancia de esteroles, triterpenos, saponinas, fenoles, flavonoides y taninos. Estos hallazgos concuerdan con la literatura en la cual se reportan flavonoides, diterpenos y lactonas sesquiterpénicas para la familia Asteraceae y diterpenos, flavonoides y esteroles en la familia Euphorbiaceae (Bruneton, 2001).

29

Los metabolitos secundarios encontrados en las plantas evaluadas de la familia Rubiaceae fueron esteroles, triterpenos, fenoles, flavonoides y taninos en baja proporción. El reporte bibliográfico indica la presencia de alcaloides indólicos, diterpenos, antraquinonas y cumarinas (Bruneton, 2001). Los núcleos fitoquímicos encontrados en los extractos de las plantas pertenecientes a estas familias, son los posibles responsables de la actividad contra la broca del café.

30

Tabla 6. Marcha fitoquímica de los 63 extractos de las plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa

Familia Nombre Científico

Extracto Metabolitos Secundarios

Alcaloides Esteroles y Triterpenos

Saponinas Fenoles Flavonoides Taninos

Apocynaceae Cynanchum sp

Hexano -1 + - - - - Diclorometano - - - - - - Metanol - - - - + -

Asclepiedaceae Oxypetalum cordifolium

Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - - Metanol + + + - + -

Asteraceae

Pentacalia urbanii

Hexano - - - - - - Diclorometano + + - + + + Metanol - + + + + +

Mikania banisteriae

Hexano - - - - - - Diclorometano - + - - - - Metanol - + + + + +

Clibadium pentaneuron

Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - - Metanol - + - - - -


Hexano - + - - - - Diclorometano - + - + - + Metanol + - + - - -

Baccharis sp Hexano - + - - - - Diclorometano - + - - - - Metanol - - - + - +

Tilesia baccata

Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - + - Metanol - + + - - -

Mikania lloensis

Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - - Metanol - - + - - -

31

Continuación tabla 6 Euphorbiaceae

Acalypha diversifolia

Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + + Metanol - - - + - +


Hexano - - - + - + Diclorometano - - + + + + Metanol - + + + + +

Hyeronima sp Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + + Metanol - + + + + +

Alchornea grandis

Hexano - - + - - - Diclorometano - - + - + - Metanol - + + + - +

Rubiaceae

Guettarda crispiflora

Hexano - - - - - - Diclorometano - + - - - - Metanol - - - - - -

Faramea sp Hexano - + - - - - Diclorometano - - - - + - Metanol - - - + - +

Solanaceae

Solanum acerifolium

Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + + Metanol + + + - - -

Solanum trachycyphum

Hexano - - - - - - Diclorometano + + - - + - Metanol + + + - - -

Sin Identificar

Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - + - Metanol + + - - - -

Solanum lepidotum

Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - - Metanol + - - - - -

Cestrum sp Hexano - + - - - - Diclorometano - + - - + - Metanol + - - - - -

1 (+) = Presente (-) = Ausente

32

6.3. Actividad contra la broca del café de extracto s de diclorometano y metanol El porcentaje de humedad de los granos de café al inicio de los ensayos fue superior al 40%, sin embargo a los 32 días después del inicio del experimento para los extractos metanólicos, la humedad fue menor al 20%, por lo cual se descartaron estos últimos datos. En las figuras 17 y 18 se presenta el avance del experimento en el tiempo, para los extractos metanólicos y de diclorometano respectivamente, en la figura 17 el extracto metanólico de Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) fue el que mas se acercó a la acción insecticida del control negativo (endosulfan 1 mg/L) presentando la mayor cantidad de brocas adultas muertas, seguido de los extractos metanólicos de las plantas Lepidaploa lehmannii (Asteraceae) y Alchornea grandis (Euphorbiaceae), entre tanto, en un extracto de diclorometano (figura 18) el total de individuos varía, ya que a medida que avanzaba el experimento, las brocas desarrollaban su ciclo biológico, por lo cual los extractos de diclorometano no presentaron ningún efecto tóxico sobre la broca del café que pudiera causar su muerte.

Figura 17. Brocas muertas hasta el día 28 en extractos MeOH

33

Figura 18. Brocas muertas hasta el día 28 en extractos de diclorometano. En la búsqueda de agentes insecticidas de origen vegetal para el control de la broca del café a través de este bioensayo in vitro, se encontró que solo los extractos metanólicos presentaron un posible efecto sobre el insecto; en la figura 19 también se presentan los extractos metanólicos con posible actividad insecticida, ya que se alejaron del control negativo y presentaron tendencia hacia el control positivo (línea base), ya que se presentaron pocos individuos en el tiempo. En este gráfico también se puede observar el efecto que el extracto metanólico de la planta Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) (voucher 3969) presentó sobre el total de individuos.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

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34

Figura 19. Extractos MeOH con posible actividad contra la broca Con base en los gráficos realizados se encontró que 7 extractos metanólicos presentaron actividad contra la broca del café (Hypothenemus hampei, Ferrari), este valor representa un 33.3% de las plantas usadas para el bioensayo, las familias Euphorbiaceae y Asteraceae ambas contribuyeron con 14.3%, mientras que la familia Rubiaceae contribuyó con un 4.7%. En la tabla 7 se pueden observar las plantas cuyos extractos metanólicos presentaron posible actividad contra la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari), pertenecientes a las familias botánicas Asteraceae, Euphorbiaceae y Rubiaceae. Tabla 7. Plantas cuyos extractos presentaron actividad insecticida contra la broca del café.

Familia Nombre científico

Voucher FJR

ASTERACEAE


3968

Lepidaploa lehmannii 3976

Tilesia baccata 3974

EUPHORBIACEAE

Alchornea calophylla 3969

Acalypha diversifolia 3967

Alchornea grandis 3982

RUBIACEAE Faramea sp 3979

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0 4 8 12 16 20 24 28 32

DDM

Indi

vidu

os

Mikania banisteriae



Tilesia baccata

Lepidaploa lehmannii

Faramea sp

Alchornea grandis

Negativo

35

En la familia Euphorbiaceae, se ha reportado actividad de los aceites esenciales de plantas del genero Croton como Croton zehntneri, Croton argyrophylloides, Croton nepetaefolius y Croton sonderianus contra larvas del mosquito emisor del dengue (Aedes aegypti, Diptera: Culicidae) (Lima et al., 2006); en esta familia también se presentan diterpenos que poseen propiedades insecticidas, por ejemplo, de Croton cajucara se aisló cis-dehidro-crotonina y de Croton linearis se aisló otro diterpeno tóxico para los insectos (Bittner et al., 2001). En la figura 20 se puede observar el efecto del extracto metanólico activo Alchornea calophylla (Voucher 3969), que causó la muerte de la broca del café, contrastado con el extracto inactivo de diclorometano (figura 21) de Mikania lloensis (Voucher 3977) el cual permitió que la broca perforara y penetrara el grano de café para reproducirse en su interior y de esta forma cumplir con su ciclo biológico en los 40 días del ensayo.

Figura 20. Acción sobre la broca del café de un extracto metanólico activo (muerte del insecto).

Figura 2 1. Acción sobre la broca del café de un extracto inactivo (desarrollo del ciclo biológico).

36

7. CONCLUSIONES

� Siete extractos metanólicos presentaron posibles compuestos bioactivos contra la broca del café.

� La actividad biológica en los extractos metanólicos podría

explicarse por la presencia de esteroles, triterpenos, saponinas, fenoles, flavonoides o taninos.

� Los extractos de diclorometano fueron inocuos, permitiendo a la

broca del café la perforación del grano y el desarrollo completo del ciclo biológico en su interior.

37

8. RECOMENDACIONES

� No sólo realizar para los ensayos un control negativo, introducir un testigo libre de solvente para garantizar que la humedad del grano es apta para el desarrollo del insecto y descartar posibles efectos del solvente.

� Realizar ensayos con los extractos metanólicos donde se evalúen

mayor cantidad de muestras (100 aproximadamente) y en una sola revisión seleccionar las plantas activas, teniendo tres repeticiones para cada extracto a evaluar.

� Realizar un análisis del efecto subletal en las plantas que

presentan actividad, siguiendo en estos ensayos el ciclo biológico de la broca.

� Realizar la separación e identificación de los metabolitos

secundarios de los extractos metanólicos que presentaron mayor actividad contra la broca del café.

� Efectuar evaluaciones in vivo de los extractos activos.

� Continuar los estudios de actividad contra la broca del café de las

plantas de la flora regional.

38

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xliii

ANEXOS

xliv

Anexo 1. Preparación de 800 mL de dieta artificial Cenibroca D-200.

Transferir a un erlenmeyer 800 mL de agua

Adicionar 22.4 g de Agar

Calentar hasta disolución

Esterilizar la mezcla por 20 minutos Adicionar 106.06 g de café molido estéril

Adicionar 14.9 g de sacarosa

Adicionar 21.4 g de caseína Adicionar 21.4 g de levadura torula

Adicionar 0.85 g de benzoato de sodio Adicionar 1.06 g de Nipagin Adicionar 0.64 g de colesterol Adicionar 1.3 g de ácido ascórbico

xlv

Adicionar 2.14 g de Sales de Wesson Adicionar 2.4 mL de derosal Adicionar 10.36 mL de etanol Adicionar 2.3 mL de formaldehído 37 % Licuar los ingredientes hasta completa homogenización, teniendo el vaso, la tapa y la cuchilla de la licuadora previamente esterilizados

Realizar la infestación con brocas adultas recién emergidas, previamente desinfectadas Anexo 2. Datos obtenidos en las revisiones de los bioensayos

Extractos metanólicos

EXTRACTO Rep t H L P C A T 120 1 4 0 0 0 0 0 0 120 1 8 0 0 0 0 1 1 120 1 12 1 0 0 0 1 2 120 1 16 0 2 0 0 1 3 120 1 20 1 4 0 0 1 6 120 1 24 0 3 0 0 1 4 120 1 28 2 0 0 0 1 3 120 2 4 5 0 0 0 1 6 120 2 8 0 0 0 0 1 1 120 2 12 1 0 0 0 1 2 120 2 16 1 1 0 0 1 3 120 2 20 0 2 0 0 1 3 120 2 24 0 2 0 0 1 3 120 2 28 0 1 0 0 1 2

Servir en una bandeja y poner en la estufa por 48 horas a 50ºC

Servir en cajas petri esterilizadas y dejar en cabina de flujo laminar por 24 horas para que seque

completamente.

Rep= repetición t= tiempo (Días) H= huevos L= larvas P= pupas C= carmelitas A= adultos T= total indivíduos

xlvi

121 1 4 1 1 0 0 1 3 121 1 8 0 0 0 0 0 0 121 1 12 0 1 0 0 1 2 121 1 16 5 0 0 0 1 6 121 1 20 0 0 0 0 0 0 121 1 24 0 0 0 0 0 0 121 1 28 0 0 0 0 0 0 121 2 4 3 0 0 0 1 4 121 2 8 1 2 0 0 1 4 121 2 12 2 1 0 0 1 4 121 2 16 1 1 0 0 1 3 121 2 20 0 1 0 0 1 2 121 2 24 0 2 0 0 1 3 121 2 28 0 1 0 0 1 2 122 1 4 0 0 0 0 0 0 122 1 8 0 0 0 0 1 1 122 1 12 2 0 0 0 1 3 122 1 16 0 4 0 0 1 5 122 1 20 0 4 0 0 1 5 122 1 24 0 2 0 0 1 3 122 1 28 0 0 0 0 0 0 122 2 4 5 0 0 0 1 6 122 2 8 1 0 0 0 1 2 122 2 12 1 1 0 0 1 3 122 2 16 4 0 0 0 1 5 122 2 20 0 0 0 0 0 0 122 2 24 0 0 0 0 0 0 122 2 28 2 1 0 0 1 4 123 1 4 0 0 0 0 0 0 123 1 8 2 4 0 0 1 7 123 1 12 2 0 0 0 1 3 123 1 16 0 2 0 0 1 3 123 1 20 0 0 0 0 0 0 123 1 24 0 2 0 0 1 3 123 1 28 2 3 0 0 1 6 123 2 4 3 0 0 0 1 4 123 2 8 1 0 0 0 1 2 123 2 12 2 0 0 0 1 3 123 2 16 0 3 0 0 1 4 123 2 20 1 3 0 0 1 5

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123 2 24 0 2 0 0 1 3 123 2 28 0 0 0 0 0 0 124 1 4 0 0 0 0 1 1 124 1 8 2 0 0 0 1 3 124 1 12 0 0 0 0 0 0 124 1 16 0 0 0 0 0 0 124 1 20 0 0 0 0 0 0 124 1 24 0 0 0 0 0 0 124 1 28 0 0 0 0 0 0 124 2 4 4 0 0 0 1 5 124 2 8 0 0 0 0 1 1 124 2 12 0 0 0 0 0 0 124 2 16 0 1 0 0 1 2 124 2 20 1 0 0 0 1 2 124 2 24 1 0 0 0 1 2 124 2 28 1 2 0 0 1 4 125 1 4 2 0 0 0 1 3 125 1 8 0 0 0 0 0 0 125 1 12 0 0 0 0 0 0 125 1 16 0 1 0 0 1 2 125 1 20 0 0 0 0 0 0 125 1 24 0 0 0 0 0 0 125 1 28 0 0 0 0 0 0 125 2 4 5 0 0 0 1 6 125 2 8 4 0 0 0 1 5 125 2 12 0 0 0 0 0 0 125 2 16 1 2 0 0 1 4 125 2 20 1 0 0 0 1 2 125 2 24 0 1 0 0 1 2 125 2 28 0 1 0 0 1 2 126 1 4 0 0 0 0 1 1 126 1 8 0 0 0 0 1 1 126 1 12 0 0 0 0 0 0 126 1 16 2 3 0 0 1 6 126 1 20 2 3 0 0 1 6 126 1 24 0 4 0 0 1 5 126 1 28 0 2 0 0 1 3 126 2 4 2 0 0 0 1 3 126 2 8 1 0 0 0 1 2 126 2 12 0 0 0 0 0 0 126 2 16 0 0 0 0 0 0

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126 2 20 1 1 0 0 1 3 126 2 24 0 0 0 0 0 0 126 2 28 0 0 0 0 0 0 127 1 4 0 0 0 0 1 1 127 1 8 1 0 0 0 1 2 127 1 12 0 0 0 0 0 0 127 1 16 0 0 0 0 0 0 127 1 20 0 2 0 0 1 3 127 1 24 0 0 0 0 0 0 127 1 28 0 0 0 0 0 0 127 2 4 1 0 0 0 1 2 127 2 8 2 0 0 0 1 3 127 2 12 1 1 0 0 1 3 127 2 16 0 2 0 0 1 3 127 2 20 1 1 0 0 1 3 127 2 24 0 2 0 0 1 3 127 2 28 1 1 0 0 1 3 128 1 4 1 0 0 0 1 2 128 1 8 0 0 0 0 0 0 128 1 12 0 0 0 0 0 0 128 1 16 0 0 0 0 0 0 128 1 20 0 0 0 0 0 0 128 1 24 0 0 0 0 0 0 128 1 28 0 0 0 0 0 0 128 2 4 2 0 0 0 1 3 128 2 8 0 0 0 0 0 0 128 2 12 1 0 0 0 1 2 128 2 16 1 0 0 0 1 2 128 2 20 0 0 0 0 0 0 128 2 24 0 0 0 0 0 0 128 2 28 1 0 0 0 1 2 129 1 4 0 0 0 0 1 1 129 1 8 0 0 0 0 1 1 129 1 12 0 0 0 0 0 0 129 1 16 0 0 0 0 0 0 129 1 20 1 0 0 0 1 2 129 1 24 1 0 0 0 1 2 129 1 28 0 0 0 0 1 1 129 2 4 1 0 0 0 1 2 129 2 8 2 0 0 0 1 3 129 2 12 2 0 0 0 1 3

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129 2 16 0 0 0 0 0 0 129 2 20 1 3 0 0 1 5 129 2 24 1 1 0 0 1 3 129 2 28 0 0 0 0 0 0 130 1 4 0 0 0 0 1 1 130 1 8 8 0 0 0 1 9 130 1 12 2 0 0 0 1 3 130 1 16 0 2 0 0 1 3 130 1 20 2 0 0 0 1 3 130 1 24 0 2 0 0 1 3 130 1 28 2 1 0 0 1 4 130 2 4 0 0 0 0 1 1 130 2 8 0 0 0 0 0 0 130 2 12 2 0 0 0 1 3 130 2 16 2 1 0 0 1 4 130 2 20 1 0 0 0 1 2 130 2 24 0 0 0 0 0 0 130 2 28 2 1 0 0 1 4 131 1 4 0 0 0 0 0 0 131 1 8 0 0 0 0 0 0 131 1 12 0 2 0 0 1 3 131 1 16 0 1 0 0 1 2 131 1 20 3 4 0 0 1 8 131 1 24 0 4 0 0 1 5 131 1 28 0 0 0 0 0 0 131 2 4 3 0 0 0 1 4 131 2 8 2 0 0 0 1 3 131 2 12 0 0 0 0 0 0 131 2 16 0 0 0 0 0 0 131 2 20 1 0 0 0 1 2 131 2 24 0 1 0 0 1 2 131 2 28 1 0 0 0 1 2 132 1 4 1 0 0 0 1 2 132 1 8 1 0 0 0 1 2 132 1 12 1 0 0 0 1 2 132 1 16 1 0 0 0 1 2 132 1 20 3 0 0 0 1 4 132 1 24 3 0 0 0 1 4 132 1 28 0 0 0 0 0 0 132 2 4 2 0 0 0 1 3 132 2 8 0 0 0 0 1 1

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132 2 12 0 0 0 0 0 0 132 2 16 1 1 0 0 1 3 132 2 20 0 2 0 0 1 3 132 2 24 1 0 0 0 1 2 132 2 28 1 0 0 0 1 2 133 1 4 0 0 0 0 1 1 133 1 8 0 0 0 0 1 1 133 1 12 0 0 0 0 0 0 133 1 16 0 0 0 0 0 0 133 1 20 2 0 0 0 1 3 133 1 24 2 0 0 0 1 3 133 1 28 0 0 0 0 0 0 133 2 4 0 0 0 0 0 0 133 2 8 1 2 0 0 1 4 133 2 12 0 1 0 0 1 2 133 2 16 1 1 0 0 1 3 133 2 20 0 0 0 0 0 0 133 2 24 0 1 0 0 1 2 133 2 28 1 1 0 0 1 3 134 1 4 3 0 0 0 1 4 134 1 8 3 0 0 0 1 4 134 1 12 3 0 0 0 1 4 134 1 16 0 0 0 0 0 0 134 1 20 0 0 0 0 0 0 134 1 24 2 0 0 0 1 3 134 1 28 2 0 0 0 1 3 134 2 4 2 0 0 0 1 3 134 2 8 1 0 0 0 1 2 134 2 12 2 0 0 0 1 3 134 2 16 0 0 0 0 0 0 134 2 20 1 2 0 0 1 4 134 2 24 0 2 0 0 1 3 134 2 28 1 0 0 0 1 2 135 1 4 0 0 0 0 0 0 135 1 8 0 0 0 0 0 0 135 1 12 0 0 0 0 0 0 135 1 16 0 0 0 0 0 0 135 1 20 0 0 0 0 0 0 135 1 24 0 0 0 0 0 0 135 1 28 0 0 0 0 0 0 135 2 4 0 0 0 0 0 0

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135 2 8 1 0 0 0 1 2 135 2 12 2 0 0 0 1 3 135 2 16 0 1 0 0 1 2 135 2 20 1 2 0 0 1 4 135 2 24 1 0 0 0 1 2 135 2 28 2 1 0 0 1 4 136 1 4 0 0 0 0 0 0 136 1 8 0 0 0 0 0 0 136 1 12 3 0 0 0 1 4 136 1 16 3 2 0 0 1 6 136 1 20 2 4 0 0 1 7 136 1 24 2 4 0 0 1 7 136 1 28 2 4 0 0 1 7 136 2 4 1 0 0 0 1 2 136 2 8 0 0 0 0 1 1 136 2 12 0 0 0 0 0 0 136 2 16 1 0 0 0 1 2 136 2 20 0 1 0 0 1 2 136 2 24 0 3 0 0 1 4 136 2 28 0 0 0 0 0 0 137 1 4 0 0 0 0 0 0 137 1 8 0 0 0 0 0 0 137 1 12 0 0 0 0 1 1 137 1 16 0 0 0 0 0 0 137 1 20 0 0 0 0 0 0 137 1 24 3 2 0 0 1 6 137 1 28 2 0 0 0 1 3 137 2 4 1 0 0 0 1 2 137 2 8 4 0 0 0 1 5 137 2 12 0 0 0 0 0 0 137 2 16 0 0 0 0 0 0 137 2 20 0 0 0 0 0 0 137 2 24 0 1 0 0 1 2 137 2 28 1 2 0 0 1 4 138 1 4 2 0 0 0 1 3 138 1 8 2 0 0 0 1 3 138 1 12 0 0 0 0 0 0 138 1 16 0 0 0 0 0 0 138 1 20 0 0 0 0 0 0 138 1 24 0 0 0 0 0 0 138 1 28 0 0 0 0 0 0

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138 2 4 0 0 0 0 1 1 138 2 8 1 0 0 0 1 2 138 2 12 0 2 0 0 1 3 138 2 16 2 1 0 0 1 4 138 2 20 1 3 0 0 1 5 138 2 24 0 1 0 0 1 2 138 2 28 0 1 0 0 1 2 139 1 4 0 0 0 0 0 0 139 1 8 1 0 0 0 1 2 139 1 12 0 0 0 0 0 0 139 1 16 0 0 0 0 0 0 139 1 20 2 5 0 0 1 8 139 1 24 2 5 0 0 1 8 139 1 28 0 0 0 0 0 0 139 2 4 0 0 0 0 0 0 139 2 8 2 0 0 0 1 3 139 2 12 1 1 0 0 1 3 139 2 16 0 0 0 0 0 0 139 2 20 1 0 0 0 1 2 139 2 24 0 2 0 0 1 3 139 2 28 0 0 0 0 0 0 140 1 4 0 0 0 0 0 0 140 1 8 0 0 0 0 0 0 140 1 12 0 0 0 0 0 0 140 1 16 1 1 0 0 1 3 140 1 20 0 0 0 0 0 0 140 1 24 0 0 0 0 0 0 140 1 28 0 0 0 0 0 0 140 2 4 1 0 0 0 1 2 140 2 8 0 0 0 0 0 0 140 2 12 2 0 0 0 1 3 140 2 16 1 0 0 0 1 2 140 2 20 1 0 0 0 1 2 140 2 24 0 0 0 0 0 0 140 2 28 1 1 0 0 1 3

Negativo 1 4 3 0 0 0 1 4 Negativo 1 8 2 0 0 0 1 3 Negativo 1 12 0 2 0 0 1 3 Negativo 1 16 4 3 0 0 1 8 Negativo 1 20 4 2 0 0 1 7 Negativo 1 24 1 2 0 0 1 4

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Negativo 1 28 2 1 0 0 1 4 Negativo 2 4 2 0 0 0 1 3 Negativo 2 8 2 0 0 0 1 3 Negativo 2 12 3 1 0 0 1 5 Negativo 2 16 2 0 0 0 1 3 Negativo 2 20 3 1 0 0 1 5 Negativo 2 24 1 1 0 0 1 3 Negativo 2 28 2 3 0 0 1 6 Positivo 1 4 0 0 0 0 0 0 Positivo 1 8 0 0 0 0 0 0 Positivo 1 12 0 0 0 0 0 0 Positivo 1 16 0 0 0 0 0 0 Positivo 1 20 0 0 0 0 0 0 Positivo 1 24 0 0 0 0 0 0 Positivo 1 28 0 0 0 0 0 0 Positivo 2 4 0 0 0 0 0 0 Positivo 2 8 0 0 0 0 0 0 Positivo 2 12 0 0 0 0 0 0 Positivo 2 16 0 0 0 0 0 0 Positivo 2 20 0 0 0 0 0 0 Positivo 2 24 0 0 0 0 0 0 Positivo 2 28 0 0 0 0 0 0

Resumen La broca del café Hypothenemus hampei (Ferrari) es la plaga más importante para el café en Colombia y hace el daño al atacar la cereza y reproducirse internamente en el endospermo, causando la pérdida del grano y muchas veces la caída prematura de los frutos. La zona cafetera Colombiana presenta altas densidades de siembra, topografía de difícil acceso para realizar las prácticas de control así como condiciones climáticas que favorecen la fructificación durante gran parte del año, lo cual hace que el ataque de la broca sea más severo que en muchas otras regiones del mundo cafetero. La mayoría de los países en los cuales la broca es un problema, la han atacado utilizando insecticidas sintéticos que causan efectos negativos en el ecosistema.

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En este trabajo se evaluaron 42 extractos de plantas pertenecientes a 6 familias botánicas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa, utilizando granos de café pergamino húmedo desinfectado y hembras adultas de broca recién emergidas y desinfectadas. Los resultados de este trabajo, revelan que 7 de los extractos metanólicos evaluados presentaron actividad insecticida contra Hypothenemus hampei (Ferrari), lo cual representa el 33.3% de los extractos crudos evaluados. El extracto metanólico de Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) presentó la mayor actividad insecticida contra la broca, seguido por los extractos metanólicos de Critoniella acuminata, Tilesia baccata, Lepidaploa lehmannii (Asteraceae); Alchornea grandis, Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae) y Faramea sp (Rubiaceae). La marcha fitoquímica para el extracto metanólico de Alchornea calophylla reportó la presencia de esteroles, saponinas, fenoles, flavonoides y taninos a través de cromatografía de capa delgada (CCD), los cuales podrían ser los responsables de la actividad contra la broca del café. Palabras claves: Alchornea calophylla, Bioprospección, Euphorbiaceae, Hypothenemus hampei Ferrari.

Abstract The coffee berry borer (CCB) (Hypothenemus hampei Ferrari) it is one of the most severe plagues for coffee plantations and it is destructive when attacking the cherry because CCB reproduce internally in the endosperm of the grain, causing the loss of the grain and in many cases the premature fall of the cherries. The Colombian coffee area presents high coffee trees densities, a topography with difficult access to carry out the control of agronomic practices as well as climatic conditions that favour the fructification during great part of the year, which makes the attack of the CCB more severe than in many other regions of the coffee producing areas. Most of the countries where the CCB has arrived have attacked the problem by using synthetic insecticides that cause negative effects in the ecosystem.

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This work evaluated the activity of 42 extracts of plants belonging to 6 botanical families collected at the Natural Bremen-La Popa Reservation, using previously disinfected parchment coffee and disinfected CCB mature females. The results of this work reveal that 7 of the extracts evalued presented inhibitory activity against the CCB, which represents 33.3% of the plants evaluated. The methanolic extract of Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) showed the main insecticide activity against the CCB, following by the methanolic extracts of the species belonging to the Asteraceae family: Critoniella acuminata, Tilesia baccata, Lepidaploa lehmannii; followed by the species of the Euphorbiaceae family: Alchornea grandis, Acalypha diversifolia and by one species of the Rubiaceae family: Faramea sp. The phytochemistry screening performed on the methanolic extract of Alchornea calophylla reported the presence of sterols, saponins, phenols, flavonoides and tannins by thin-layer chromatography (TLC) and these phytocompounds could be the responsible for the activity against the CCB. Passwords: Alchornea calophylla, Bioprospeccion, Euphorbiaceae, Hypothenemus hampei Ferrari.

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CONTENIDO Pág. Resumen............................................ ....................................................................

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Abstract........................................... .......................................................................

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Lista de figuras............................................ ..........................................................

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Lista de tablas.................................... ...................................................................

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Lista de anexos.................................... .................................................................

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1. Introducción.................................... ..................................................................

1

2. Marco teórico............................................ .........................................................

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2.1. Descripción zona de estudio: Reserva Natural Bremen-La Popa.................... 2 2.2. Descripción de la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari, Coleóptera: Scolytidae)....................................................................................

3

2.3. Estrategias para el control de la Broca del café.............................................. 5 2.3.1. Alternativas de manejo..................................................................................

5

2.3.2. Control cultural.............................................................................................. 5 2.3.3. Control biológico........................................................................................... 6 2.3.4. Control químico............................................................................................. 6 2.4. Descripción de las familias seleccionadas en el estudio................................ 7 2.4.1. Familia Asteraceae....................................................................................... 7 2.4.1.1. Actividad biológica..................................................................................... 8 2.4.3. Familia Euphorbiaceae................................................................................ 8 2.4.2.1. Actividad biológica..................................................................................... 9 2.4.4. Familia Rubiaceae....................................................................................... 9 2.4.3.1. Actividad biológica..................................................................................... 9 2.4.4. Familia Solanaceae..................................................................................... 10 2.4.4.1. Actividad biológica..................................................................................... 10 2.4.5. Familia Apocynaceae................................................................................... 11 2.4.5.1. Actividad biológica..................................................................................... 11 2.4.6. Familia Asclepiadaceae................................................................................ 12 2.4.6.1. Actividad biológica..................................................................................... 12 2.5. Teorías de defensa de las plantas................................................................... 12 2.6. Insecticidas naturales a partir de extractos vegetales..................................... 13 3. Justificación................................... ................................................................... 16

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4. Objetivos....................................... .................................................................... 17 4.1. Objetivo general............................................................................................... 17 4.2. Objetivos específicos....................................................................................... 17 5. Sección experimental............................ ........................................................... 18 5.1. Materiales.........................................................................................................

18

5.1.1. Reactivos...................................................................................................... 18 5.1.2. Controles....................................................................................................... 18 5.1.3. Material de vidrio.......................................................................................... 18 5.1.4. Equipos......................................................................................................... 18 5.1.5. Material vegetal............................................................................................. 19 5.1.6. Material biológico.......................................................................................... 19 5.2. Métodos........................................................................................................... 19 5.2.1. Proceso de extracción.................................................................................. 19 5.2.2. Proceso de desinfección del café................................................................. 20 5.2.3. Proceso de desinfección de la broca del café.............................................. 20 5.2.4. Dieta artificial para la cría de broca del café in vitro..................................... 21 5.2.5. Evaluación de los extractos vegetales.......................................................... 22 5.2.6. Marcha fitoquímica aplicada a los extractos crudos de n-hexano, diclorometano y metanol...............................................................................

22

6. Resultados y discusión.......................... .......................................................... 24

6.1. Recolección de plantas y obtención de extractos............................................ 24 6.2. Caracterización fitoquímica 25 6.3. Actividad contra la broca del café de extractos de diclorometano y metanol..

29

7. Conclusiones.................................... ................................................................ 33

8. Recomendaciones................................. ........................................................... 34

Bibliografía....................................... ..................................................................... 35

Anexos............................................. ...................................................................... 40

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Lista de figuras

Pág. Figura 1. Zona de Reserva Natural Bremen-La Popa.............................................. Figura 2. Ubicación geográfica zona de estudio Bremen-La Popa ......................... Figura 3. (A) Hembra de broca del café. (B) Macho de broca del café................... Figura 4. Ciclo de vida de la broca del café Hypothenemus hampei……………….. Figura 5. Tilesia baccata (Asteraceae)..................................................................... Figura 6. Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae)...................................................... Figura 7. Guettarda crispiflora (Rubiaceae)............................................................. Figura 8. Solanum acerifolium (Solanaceae)........................................................... Figura 9. Ervatamia divaricata (Apocynaceae)........................................................ Figura 10. Asclepias curassavica (Asclepiadaceae)............................................... Figura 11. Proceso de extracción del material vegetal y obtención de los extractos ................................................................................................. Figura 12. Proceso de desinfección para los granos de café pergamino…………. Figura 13. Proceso de desinfección de la broca del café para usar en ensayos con granos de café pergamino………….…………………....................... Figura 14. Proceso de desinfección para la broca del café usada en la dieta artificial Cenibroca D-200…………………………………………………… Figura 15. Proceso para evaluar los extractos vegetales contra Hypothenemus hampei en café pergamino....................................................................... Figura 16. Mapa de la Reserva Natural Bremen-La Popa y sitios de muestreo..... Figura 17. Brocas muertas hasta el día 28 en extractos MeOH.............................. Figura 18. Brocas muertas hasta el día 28 en extractos de diclorometano............. Figura 19. Extractos MeOH con posible actividad contra la broca...........................

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Figura 20. Acción sobre la broca del café de un extracto metanólico activo (muerte del insecto) ……………………………………………………….… Figura 21. Acción sobre la broca del café de un extracto inactivo (desarrollo del ciclo biológico) …………………………………………………………...…..

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Lista de tablas

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Pág.

Tabla 1. Enemigos naturales de la broca del café…………………………………... Tabla 2. Ejemplos de extractos de plantas que presentan actividad insecticida.... Tabla 3. Composición de la dieta artificial Cenibroca D-200 para la cría de broca del café...................................................................................................... Tabla 4. Patrones y reveladores utilizados en CCD para la detección de los núcleos fitoquímicos en estudio………………………….………………….. Tabla 5. Plantas recolectadas y peso de cada extracto obtenido del material vegetal recolectado en la Reserva Natural Bremen-La Popa (ventana 1: cuenca río La Vieja)………………………………………………………….. Tabla 6. Marcha fitoquímica de los 63 extractos de las plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa........................................................ Tabla 7. Plantas cuyos extractos presentaron actividad insecticida contra la broca del café............................................................................................

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Lista de anexos

Pág.

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Anexo 1. Preparación de 800 mL de dieta artificial Cenibroca D 200..................

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Anexo 2. Datos obtenidos en las revisiones de los bioensayos………………….

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evaluacion de 42 extractos vegetales para el control …

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