evaluación del potencial antimicrobiano in vitro del
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Ingeniería de Alimentos Facultad de Ingeniería
2020
Evaluación del potencial antimicrobiano in vitro del extracto Evaluación del potencial antimicrobiano in vitro del extracto
fenólico obtenido de la Ibia (Oxalis tuberosa Mol) fenólico obtenido de la Ibia (Oxalis tuberosa Mol)
Jennifer Ortega Valencia Universidad de La Salle, Bogotá
Laura María Pulgarín López Universidad de La Salle, Bogotá
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Evaluación del potencial antimicrobiano in vitro del extracto fenólico obtenido de la Ibia
(Oxalis tuberosa Mol).
Jennifer Ortega Valencia
Laura María Pulgarín López
Universidad de La Salle
Facultad de Ingeniería
Programa de Ingeniería de alimentos
Bogotá D.C
2020
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Evaluación del potencial antimicrobiano in vitro del extracto fenólico obtenido de la Ibia
(Oxalis tuberosa Mol).
Jennifer Ortega Valencia
Laura María Pulgarín López
Trabajo de grado para optar al título de:
Ingeniera de Alimentos
Dirigido por: Alfredo López Molinello
Universidad de La Salle
Facultad de Ingeniería
Programa de Ingeniería de alimentos
Bogotá D.C
2020
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Agradecimientos
De manera especial queremos agradecer a todas las personas que de una u otra forma estuvieron
involucradas en la realización de este trabajo de investigación, especialmente a nuestras familias
por apoyarnos durante toda esta ardua etapa.
Agradecemos a nuestro director Alfredo López por su paciencia y dedicación, al Doctor Fabián
Rico quien con su experiencia, conocimiento y motivación nos orientó en la investigación, a Juan
Carlos Poveda y a Eduardo Rodríguez por su soporte incondicional durante toda la etapa
experimental.
A la Universidad de La Salle por ser nuestra Alma Mater y prestarnos sus instalaciones para el
desarrollo de esta investigación.
4
A Dios por darme la vida y guiarme en todo este camino
A mis padres, por su entrega durante estos años de estudio, por su comprensión y amor
incondicional, esto es por y para ustedes, el esfuerzo y las metas alcanzadas solo son el reflejo
de su excelente trabajo educando a sus hijos.
A mi hermano Mau, gracias por estar siempre para mí, animándome y llenándome de fuerza,
gracias por nunca permitir que me rindiera.
A mi familia, por su cariño infinito e incondicional durante todo este proceso, a mis abuelas
Abiga en el Cielo y Conchita aquí en la tierra, gracias por sus consejos y oraciones, hicieron de
mí una mejor persona y me permitieron culminar esta meta.
A mis amigos, gracias por estar siempre, por sus voces de aliento, las risas los buenos y los no
tan buenos momentos, me llevo lo mejor de cada uno.
Laura María Pulgarín
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A lo largo de la carrera profesional son muchas las personas y situaciones que hoy me permiten
dar este paso. Quiero dedicar este trabajo de grado y mis esfuerzos para culminar esta etapa
inicialmente a Dios, quien me ha brindado las oportunidades y con su guía espiritual me ha
permitido llegar al lugar en el cual me encuentro.
De igual forma dedico este trabajo de grado a mi familia, ya que sin sus esfuerzos, su amor,
apoyo incondicional y su sacrificio conmigo a lo largo de estos años este trabajo no habría sido
posible. Quiero agradecerles infinitamente, ya que junto a ellos he recorrido este camino y con
orgullo puedo decir que gracias a sus exigencias, sus aprendizajes y a su crianza estoy cerca de
culminar una etapa de gran valor en mi vida que me convierte no solo en una profesional, sino
en un ser humano con la clara visión de aportar un grano de arena en pro de la sociedad, de
dejar una huella que de ejemplo a las sociedades venideras por medio de mi trabajo y mi actuar.
Dedico igualmente este trabajo a Soraya Rodas, una amiga incondicional que pocos tenemos la
fortuna de encontrar en nuestros caminos. Su ejemplo, su amistad y generosidad han sido una
motivación para culminar esta etapa. Como pocos, ella conoció de cerca mi etapa universitaria
y su apoyo durante estos años fue el combustible que me permitió continuar con ganas de salir
adelante y desarrollar una carrera profesional llena de aprendizajes, de sacrificios que le dan el
valor a la vida y de enseñanzas que me hicieron entender el porqué de cada situación.
Finalmente, quiero dedicar este trabajo a mis profesores, amigos y todas aquellas personas que
tuve la fortuna de conocer y de encontrarme en la academia. Aquellas que directa o
indirectamente influenciaron y dejaron una huella en mi camino, ya que sin ellos el camino sería
distinto y no sería la persona que hoy en día soy, con los propósitos y metas que me mantienen a
flote para seguir adelante.
Jennifer Ortega Valencia
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RESUMEN
El presente trabajo de grado es una investigación en la que se evaluó el potencial antimicrobiano
in vitro del extracto fenólico obtenido de la Ibia (Oxalis tuberosa Mol) frente a dos hongos
fitopatógenos Botrytis Spp y Fusarium oxysporum. Para ello se determinó el contenido de
compuestos fenólicos del tubérculo luego de ser sometido a estimulación y estrés mediante
diferentes temperaturas (17-27°C) y cloruro de cobre (𝐶𝑢𝐶𝑙2). Se encontró que no hubo síntesis
de metabolitos secundarios de forma representativa; el análisis del conjunto de los resultados de
los bioensayos evidencia que los microorganismos no presentaron respuesta ante la acción de
estos metabolitos secundarios. Al no existir incremento en la concentración de compuestos
fenólicos se presume que no hay presencia de fitoalexinas sin embargo debido a la poca
información de los extractos, se recomienda que se realicen estudios fisicoquímicos para conocer
la naturaleza de los mismos y concluir su acción antimicrobiana.
Palabras claves: Potencial antimicrobiano, Botrytis Spp y Fusarium oxysporum, metabolitos
secundarios, fitoalexinas.
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INDICE
GLOSARIO .......................................................................................................................1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................ 3
OBJETIVOS .................................................................................................................... 5
Objetivo general .................................................................................................................. 5
Objetivos especificos ......................................................................................................... 5
1. MARCO DE REFERENCIA ................................................................................6
1.1 Marco teórico .................................................................................................. 6
1.1.1 La Ibia (Oxalis tuberosa Molina.)........................................................... 6
1.1.2 Metabolitos secundarios ....................................................................... 11
1.1.3 Aditivos alimentarios ........................................................................... 14
1.1.4 Microorganismos alterantes y patógenos en alimentos .......................... 16
1.2 Estado del arte ............................................................................................... 20
1.3 Marco legal .................................................................................................... 22
2. METODOLOGÍA ................................................................................................ 23
2.1 Preparación de los tubérculos de Ibia ........................................................... 23
2.2 Producción y extracción de fitoalexinas ........................................................ 23
2.2.1 Formación de fitoalexinas .................................................................... 23
2.2.2 Liofilización ......................................................................................... 25
2.2.3 Extracción de los metabolitos secundarios ........................................... 26
8
2.3 Determinación de compuestos fenólicos ....................................................... 27
2.4 Análisis estadístico ........................................................................................ 28
2.4.1 Análisis del tipo de distribución de datos .............................................. 28
2.4.2 Relación de tratamientos ...................................................................... 29
2.4.3 Análisis de varianza (ANOVA) ............................................................ 30
2.5 Evaluación de la capacidad antimicrobiana de los extractos ....................... 31
2.5.1 Preparación del agar PDA .................................................................... 31
2.5.2 Preparación del material biológico....................................................... 32
2.5.3 Preparación de los extractos ................................................................. 32
2.5.4 Evaluación microbiológica por sensidiscos ........................................... 32
2.5.5 Siembra por césped (GOTA) ................................................................ 33
3. RESULTADOS ................................................................................................... 34
3.1 Producción y extracción de fitoalexinas ........................................................ 34
3.2 Determinación de compuestos fenólicos ........................................................ 35
3.3 Análisis estadístico ........................................................................................ 39
3.3.1 Análisis del tipo de distribución de los datos (Test K-S) ........................ 39
3.3.2 Análisis de varianza (ANOVA) ............................................................ 40
3.4 Evaluación de la capacidad antimicrobiana de los extractos ....................... 41
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS .......................................................................... 43
4.1 Producción de fitoalexinas ............................................................................ 43
4.1.1 Efecto de la temperatura sobre la formación de fitoalexinas ................... 44
4.1.2 Efecto del rompimiento de los tejidos en tubérculos ............................. 46
4.1.3 Efecto de la aspersión de cloruro de cobre ........................................... 47
4.2 Síntesis de fitoalexinas ...................................................................................48
4.3 Obtención del extracto metanólico y determinación de compuestos fenólicos
……………………………………………………………………….50
4.4 Evaluación microbiológica frente a F. oxysporum y Botrytis spp ................. 54
5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 57
6. RECOMENDACIONES..................................................................................... 58
7. REFERENCIAS .................................................................................................. 60
ANEXOS .................................................................................................................... 65
9
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1. Características de variedades de Ibia cultivadas en dos zonas del altiplano de Bolivia
………………………………………………………………………………………9
Tabla 2. Composición nutricional de la Ibia ...................................................................... 10
Tabla 3. Descripción de tratamientos aplicados a tubérculos de ibias para formación de
fitoalexinas........................................................................................................................ 24
Tabla 4. Relaciones establecidas para las pruebas estadísticas........................................... 29
Tabla 5. Concentraciones y absorbancia para curva de calibración .................................... 35
Tabla 6. Concentración de compuestos fenólicos por tratamiento ...................................... 37
Tabla 7. Resultados no gráficos de análisis de varianza para todos los tratamientos ............40
Tabla 8, Resultados de la evaluación antimicrobiana de los extractos aplicados por sensidiscos
…………………………………………………………………………………41
Tabla 9. Resultados de la evaluación antimicrobiana por césped de los extractos ................ 42
10
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1. Tubérculos de ibia ............................................................................................. 6
Figura 2. Liofilización de tubérculos de ibia ....................................................................25
Figura 3. Proceso de extracción de los compuestos fenólicos ........................................... 27
Figura 4. Preparación de agar PDA ................................................................................ 31
Figura 5. Evaluación microbiologica por sensidiscos ....................................................... 33
Figura 6. Extractos metanolicos ...................................................................................... 34
Figura 7. Curva de calibración ......................................................................................... 37
Figura 8. Concentración de compuestos fenólicos de cada tratamiento en la curva de calibración
…………………………………………………………………………39
Figura 9. Proximidad de los tratamientos a la linea de tendencia normal ......................... 40
11
LISTADO DE ANEXOS
Anexo 1. Test de Kolmogorov-Smirnov (K-S)
Anexo 2. Análisis de varianza
Anexo 3. Resultados de ensayos microbiológicos: evaluación de los extractos sobre Botrytis spp
y Fusarium oxysporum
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GLOSARIO
Cultivos marginados: son aquellos cultivos alimenticios que a través de la historia han sido
reemplazados por otros cultivos introducidos, y abandonados por grupos sociales superiores,
conservándose su cultivo, manejo y utilización por poblaciones indígenas y/o muy pobres
(Hernández y León, 1992).
Ibia (Oxalis tuberosa Mol.): conocida comúnmente como Oca, es una planta herbácea perenne
cultivada por su crujiente raíz comestible característica por las altas concentraciones de almidón
que presenta en su composición. Se cultiva principalmente en las tierras altas de los Andes, México
y Nueva Zelanda (FAO, 2017).
Seguridad alimentaria: de acuerdo con el Instituto de Nutrición para Centroamérica y Panamá
(citado en PESA en Centroamérica, 2011) este concepto hace referencia al estado en el cual todas
las personas gozan, en forma oportuna y permanente, de acceso físico, económico y social a los
alimentos que necesitan, en cantidad y calidad, para su adecuado consumo y utilización biológica,
garantizándoles un estado de bienestar general que coadyuve al logro de su desarrollo (p.2).
Conservadores: Compuestos agregados con el fin de retrasar o prevenir el desarrollo de
microorganismos en alimentos, así como de prevenir la producción de toxinas generadas por
bacterias y mohos (Lück & von Rymon Lipinski, 2000).
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Compuestos fenólicos: compuestos que en su estructura presentan uno o más grupos hidroxilo
unidos a un anillo aromático. Se encuentran en alimentos como frutas, hortalizas, cereales y raíces
actuando como protector ante la presencia de patógenos o condiciones de estrés; entre otras
funciones (Peñarrieta, Tejeda, Mollinedo, Vila, & Bravo, 2014).
Fitoalexinas: Este concepto hace referencia a los metabolitos secundarios de bajo peso molecular
producidos por las plantas como un mecanismo de respuesta y defensa ante situaciones de
infección, agentes químicos, daño mecánico o estrés. Su producción y almacenamiento se da al
interior de las células ubicadas en los sitios circundantes al sitio de la infección (García M. R. &
Pérez L. R., 2003).
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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las alteraciones y descomposiciones en los alimentos se dan debido al resultado de las reacciones
químicas relacionadas con el deterioro y envejecimiento o por la acción microbiológica, por lo
cual el ser humano ha tenido la necesidad de prolongar la vida útil de sus productos de consumo
empleando diversas técnicas y alternativas para cumplir con este propósito, como el empleo de
antimicrobianos y conservantes de origen químico (Villada, 2010).
Según Rodríguez (2011) el uso de conservantes en la industria de alimentos es una práctica común
ya que por muchos años se han utilizado diversas sustancias antimicrobianas las cuales en algunos
casos, pueden causar afectaciones a la salud de los consumidores al ser empleadas en grandes
concentraciones por esto se debe tener en cuenta la ingesta diaria permitida, puesto que en una
investigación de Lueck y Remmert (1978, citado en Simal Gandara, Simal Lozano, & Paseiro,
1989) indican que la toxicidad de este tipo de sustancias está directamente relacionada con la dosis
de consumo.
Dentro de los conservantes químicos a los cuales se asocian afectaciones a la salud se encuentran
los sulfitos, benzoatos, nitritos y nitratos. A estas sustancias se les atribuyen enfermedades cuyos
efectos son agudos como la urticaria y las alergias en pacientes con alta susceptibilidad a los
mismos, además de manifestaciones clínicas como diarrea, dolor abdominal, náuseas e incluso se
pueden causar efectos crónicos como afectaciones el sistema cardiaco, producción de bronco
espasmos y en casos especiales puede producirse incluso perdida de la conciencia (Gonzales,
Castello , Miranda, & Pulido, 2015)
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Debido a las consecuencias que traen este tipo de sustancias, actualmente se deben desarrollar
mecanismos alternativos que permitan prevenir el crecimiento de microorganismos patógenos y
alterantes que causan la perdida de alimentos. Es allí donde el uso de extractos naturales tiene un
gran potencial. El contenido de ácidos orgánicos, aceites esenciales y compuestos fenólicos,
presentes en plantas, hiervas y especias que son empleados como antimicrobianos, se consideran
como fuentes potencialmente seguras. Su forma de acción varía según su procedencia, algunos
reaccionan con la membrana celular o alteran el material genético de los microorganismos
(Rodríguez, 2011).
Se requiere el desarrollo de estudios que demuestren el poder antimicrobiano de estas sustancias
y su aplicación en la producción de alimentos, es por esto que la presente investigación tiene como
objeto extraer los compuestos fenólicos (fitoalexinas) presentes en Oxalis tuberosa Mol.,
evaluando su acción antimicrobiana in vitro, por ello se plantea la siguiente pregunta ¿Los
extractos obtenidos de Oxalis tuberosa Mol. presentan acción antimicrobiana frente a
microrganismos alterantes y patógenos?
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OBJETIVOS
Objetivo general
Evaluar el potencial antimicrobiano in vitro del extracto fenólico obtenido de la ibia (Oxalis
tuberosa Mol.) frente a Fusarium oxysporum y Botrytis spp.
Objetivos específicos
Determinar la incidencia de la temperatura de incubación de las ibias sobre la producción de
fitoalexinas.
Evaluar la capacidad antimicrobiana in vitro del extracto fenólico obtenido de la ibia sobre
Fusarium oxysporum y Botrytis spp.
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1. MARCO DE REFERENCIA
1.1. MARCO TEORICO
1.1.1. La Ibia (Oxalis tuberosa Molina.)
- Descripción general
Figura 1. Tubérculos de ibia.
Fuente: Ortega J, Pulgarin L (2018).
La Oxalis tuberosa Mol., es una planta herbácea perenne perteneciente a la familia Oxiladaceae,
la cual se caracteriza por presentar en las primeras fases de desarrollo un tallo erguido y a medida
que madura pasa a postrarse más adelante. Esta planta presenta una raíz crujiente comestible, la
cual contiene una concentración de almidón importante debido a que lo almacena durante las
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épocas de invierno o en periodos fríos en los cuales no presenta crecimiento. Los tubérculos
presentan una forma cilíndrica y pueden ser de diversos colores (blanco, amarillo, rojo y púrpura),
con una longitud que varía entre 5 - 7,5 cm y con un diámetro de 2,5 - 3,75 cm (FAO, 2017).
Este producto es conocido con diferentes nombres como oca, ibias, tuba, timbo, quiba, papa roja,
papa colorada o papa extranjera; dependiendo la zona y se cultiva en gran parte de los Andes,
siendo Bolivia y Perú los sitios que presentan mayor diversidad tanto en formas cultivadas como
silvestres (FAO, 2006).
Hernández y León (1992) describen estos cultivos como marginados debido a que requieren de un
incremento en su uso y comercialización, ya que esto mejoraría las condiciones de vida y
alimentación de diversas poblaciones y etnias cuya economía no es amplia. La pérdida de
competitividad de estos cultivos frente a otros junto con razones de tipo cultural lleva a la
erradicación de cultivos, como el de la ibia, y su sustitución por cultivos de mayor rentabilidad.
- Origen
Su origen es incierto debido a la antigüedad que presenta el cultivo, sin embargo, se presume que
sus predecesores se dieron en las altas tierras del sur de Perú y a partir de allí, debido al desarrollo
del cultivo y las migraciones humanas, se extendió hacia la zona norte y el resto del sur del país.
Se dice que estas migraciones se dieron durante la expansión del imperio Inca, ya que en algunas
de representaciones fitomórficas y sus restos se observa la presencia de la ibia; sin embargo, no
hay evidencia de cómo se dio la distribución de este alimento en el Perú pre-colombino ni como
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se dio la expansión del cultivo a otros países. Su origen se supone en la región de Cuzco y Puno,
encontrando allí la mayor cantidad de variedades existentes (Obregoso, 1957).
El naturista chileno Juan Ignacio Molina, fue el primero en realizar una descripción sobre este
tubérculo en el año 1782 mencionando: “En el Perú crece una planta tuberosa, conocida con el
nombre de Oca, mas la creo diferente de la cultivada en Chile” A partir de ello, se supone una
diseminación inicial del cultivo hacia Chile, el cual posteriormente migro hacia los países de
Ecuador, Venezuela y Colombia (citado en Obregoso, 1957).
- Variedades de la Ibia
El cultivo de la ibia es de gran importancia, ubicado como segundo después de la papa entre los
tubérculos andinos. Este está difundido principalmente en la zona de Trujillo (Venezuela), el
Departamento de Nariño (Colombia), la Provincia de Jujuy (Argentina) y su mayor variabilidad
genotípica se encuentra en el altiplano peruano-boliviano. Como es característico de los tubérculos
andinos, la ibia presenta una gran cantidad de variedades que se diferencian en sus propiedades y
apariencia. En Perú, se han diferenciado al menos 86 variedades pertenecientes a diferentes países
entre las cuales las más frecuentes son la Kellasunta, keni, Janko Luque, Q’ello ojo rojo,
Chearaluke, Sabacire rojo y Waka Like (Robles, 2016).
Dicha variedad resulta en una diferencia en cuanto a sus características y el rendimiento. En la
Tabla 1. se hace una comparación de algunas de las características en diferentes variedades de Ibia,
cultivadas en el altiplano de Bolivia.
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Tabla 1. Características de variedades de Ibia cultivadas en dos zonas del altiplano de Bolivia.
VARIEDAD
COLOR DEL
TUBÉRCULO
FORMA DEL
TUBÉRCULO
RESISTENCIA A
ENFERMEDADES
PERIODO DE
CRECIMIENTO
(días)
Cuzco
Amarillo Ovoide
cilíndrico
Moderada
230
K’ayra Rosado a
violáceo
Claviforme
Moderada
230
Janko apilla Blanco Cilíndrica Muy resistente 215
Keny Violáceo a negro Claviforme Susceptible 220
Clon 191
Amarillo claro Ovoide
cilíndrico
Moderada
220
Clon 289 Amarillo
pigmentado
Ovoide
cilíndrico
Moderada
230
Fuente: Adaptado de Tapia y Fries (2007). Guía de campo de los cultivos andinos. Lima. FAO y
ANPE, p. 44.
- Cultivo y producción
Su cultivo se caracteriza principalmente por la baja incidencia de plagas y enfermedades que
presenta, lo que caracteriza su cultivo como rústico adaptado al riguroso clima de la Sierra. Es
susceptible a las heladas, pero presenta tolerancia en épocas de sequía. La Ibia prefiere suelos
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francos, profundos y con un alto contenido de materia orgánica y su siembra se realiza por medio
de tubérculos en buen estado sanitario. Existen dos formas de realizar su cultivo, como
monocultivo, rotando por lo general con cultivos de papa y en campos sembrados con otros tipos
de tubérculos, como el olluco y los cubios (Robles, 2016 & Tapia y Fries, 2007).
En Colombia, de acuerdo con estudios realizados por Aguirre, Piraneque y Pérez (2012), la
producción es muy escasa al igual que su comercialización. De igual forma, la población en general
desconoce este producto o no lo consume de forma habitual. Sus zonas de producción se localizan
principalmente en el Departamento de Boyacá y su aprovechamiento es principalmente para
autoconsumo por parte de los productores.
- Valor Nutricional:
En la Tabla 2., se presenta la composición nutricional de la Ibia, determinada para tres especies
diferentes de regiones de Sur América.
Tabla 2. Composición nutricional de la Ibia.
COMPONENTE %
Humedad 80.2 – 84.6
Carbohidratos* 83.0 – 88.8
Proteína* 3.0 – 8.4
Lípidos* 0.5 – 0.6
Minerales* 1.9 – 3.5
22
Fibra* 4.0 – 5.1
*Los valores de composición nutricional se presentan en base seca
Fuente: Adaptado de King S. R. y Gershoff S.N. (1987) Nutritional evaluation of three
underexploited Andean tubers: Oxalis tuberosa (Oxalidaceae) Ullucus tuberosus (Basellaceae),
and Tropaeolum tuberosum (Tropaeolaceae). Nueva York. Economic Botany, p. 508.
Como se observa en la Tabla 2., los rangos de composición nutricional de la Ibia son variables
teniendo en cuenta las diferencias que se presentan entre cada una de las especies. Los valores
presentados hacen referencia a los resultados obtenidos por King y Gershoff (1987) en los cuales
evaluaron la composición de tubérculos obtenidos de regiones de Colombia y Perú. En ellos se
presenta una gran variabilidad ya que en su composición hay una gran influencia de la zona
geográfica del cultivo, sin embargo, son resultados generales de su composición.
Otras fuentes determinan que la Ibia posee un valor nutricional variado, presentando una
humedad entre el 70-80%, carbohidratos entre 11-22%, son ricos en azucares de fácil digestión,
su contenido en grasas, cenizas es deficiente (1.0%), es un alimento rico en proteína ya que
puede llegar a contener más del 9% en base seca (León Marroú, Villacorta González, & Pagador
Flores, 2011).
1.1.2. Metabolitos secundarios
En los seres vivos se generan diversos cambios biológicos que se dan en las células. Este tipo de
reacciones se producen debido al desarrollo metabólico de las mismas, para ello los seres vivos
obtienen la energía del carbono y el nitrógeno y esta es dispuesta para el crecimiento y
23
reproducción de la planta. Sin embargo, la célula guarda parte de esta energía para la supervivencia
y “auto curación”. Dentro del metabolismo se encuentran los metabolitos primarios y secundarios,
moléculas que cumplen diferentes funciones dentro de la célula. Los aminoácidos, los nucleótidos,
azucares y lípidos son metabolitos primarios, actúan como catalizadores de muchas reacciones que
se generan en la célula y actúan directamente en su desarrollo biológico. Los metabolitos
secundarios son compuestos orgánicos que se sintetizan en el organismo ya que no tienen un rol
directo en el crecimiento o reproducción de las plantas, estos a su vez requieren de condiciones
específicas para su obtención, entre estos se encuentran las fitoalexinas (Ávalos & Pérez, 2009).
- Fitoalexinas
Las fitoalexinas son metabolitos secundarios empleados como mecanismos de resistencia ante la
amenaza de patógenos en las plantas. Su naturaleza química es diversa, son principalmente
flavonoides de bajo peso molecular que se sintetizan después de una infección microbiana (Gracia
y Pérez, 2003).
Según Doporto (2014), las plantas requieren condiciones de estrés para activar la producción de
este tipo de sustancias. Esto quiere decir que las fitoalexinas son post infecciónales, sin embargo,
se encuentran en bajas concentraciones en los tejidos sanos de las plantas. Cuando la panta es
sometida por el agente patógenos, produce sustancias endógenas que actúan rápidamente sobre la
zona afectada evitando el desarrollo de enfermedades producidas por el ataque de
microorganismos (Ringuelet & Viña, 2013).
24
Los primeros reportes sobre la acción de las fitoalexinas se evidencian en papa, esto debido a su
resistencia frente al hongo Phytophtora infestans en donde se evaluó la producción de diversos
compuestos que se desarrollaron posteriormente a la infección por el hongo donde por acción de
reacciones quimicas se produjeron compuestos identificados a nivel molecular como fitoalexinas.
(García & Perez, 2003).
- Acción antimicrobiana de las fitoalexinas
Las fitoalexinas son producidas por las plantas, se almacenan y son empleadas como mecanismos
de defensa frente al ataque de microorganismos. Su efecto antimicrobiano es generalmente activo
frente a hongos fitopatogenos, sin embargo, también presenta efecto inhibitorio sobre bacterias.
Según Intagri (2017) el efecto y mecanismo de acción de las fitoalexinas depende de la variación
de sustancias orgánicas que posea la planta y a su vez que tan tóxicos son estos frente a las
patologías que se presenten en la planta, sin embargo, estudios demuestran que tienen un alto
espectro frente a distintos microorganismos. En hongos estas sustancias evitan la elongación y el
crecimiento del tubo germinativo, el crecimiento del micelio, la absorción de glucosa y por ende
también disminuye el aumento de su peso seco (Smid & Gorris, 1999)
Entre los compuestos que conforman las fitoalexinas se encuentran el ácido jasmónico, el ácido
salicílico, el etileno, azucares como la sacarosa, glucosa y fructosa junto con diversos genes
involucrados en la defensa de las plantas. Se debe tener en cuenta que la acción de estas sustancias
depende de la magnitud de la infección y del tipo de inductor que la produzca (Intagri, 2017).
25
1.1.3. Aditivos alimentarios
De acuerdo a la Directiva L 40/27 del Diario Oficial de la Comunidad Europea (1998, citado en
Durán, 2001) definen aditivo alimentario como:
Cualquier sustancia que, normalmente, no se consuma como alimento en sí ni se use como
ingrediente característico en la alimentación, independientemente de que tenga o no valor
nutritivo, y cuya adición intencionada a los productos alimenticios, con un propósito tecnológico
en la fase de su fabricación, transformación, preparación, tratamiento, envase, transporte y
almacenamiento tenga, o pueda esperarse razonablemente que tenga, directa o indirectamente,
como resultado que el propio aditivo o sus subproductos se conviertan en un componente de dichos
productos alimenticios.
Estos tienen múltiples funciones en los alimentos, y teniendo en cuenta su función en los mismos
se clasifican en diferentes grupos como espesantes, gelificantes, estabilizadores, colorantes,
edulcorantes, aromas y sabores, antioxidantes, conservadores, entre otros.
- Conservadores
Los conservantes son sustancias adicionadas a los alimentos con el fin de evitar el crecimiento de
bacterias, mohos y levaduras. Estos son de gran importancia para la industria ya que permiten no
solo prolongar la vida útil de los alimentos, sino que a su vez ralentizan el deterioro de los
alimentos que puede generarse después de las operaciones de procesamiento y envasado;
26
garantizando así a los consumidores que los alimentos no causen ningún tipo de enfermedad
posterior a su consumo. Algunos de ellos son elaborados a partir de fuentes naturales, mientras
que otros son de origen artificial (Hamid, Ahmed, & Agboola, 2012).
De acuerdo con Anand & Sati (2013) los conservadores utilizados por la industria de alimentos
se clasifican de acuerdo con su naturaleza en Clase I, haciendo referencia a aquellos obtenidos de
fuentes naturales como la sal, vinagre, azúcar, entre otros; y Clase II, refiriéndose a aquellos
obtenidos de fuentes artificiales o sintéticos tales como los benzoatos, sorbatos, nitritos, etc.
Conservadores de origen natural: dentro de esta rama de conservantes, se encuentran aquellos
que provienen de origen animal, vegetal, por reacciones enzimáticas o incluso acción microbiana.
Estas sustancias se encuentran en cortezas ramas hojas flores y frutas, o tejidos de origen animal,
algunos sistemas enzimáticos, sustancia producida por microorganismos, entre otros muchos
compuestos.
Debido al contenido en componentes activos estas sustancias pueden extraerse mediante diversas
metodologías, esto depende del tipo de planta, la concentración y la solubilidad de los principios
activos y sus propiedades (Prieto, Zárate, & Hernández, 2013).
Conservadores de origen químico: estos compuestos hacen referencia a sustancias que se
agregan a los alimentos con el fin de retrasar o prevenir el crecimiento microbiano en ellos. Actúan
evitando las alteraciones visibles generadas por la acción microbiana y la producción de toxinas,
especialmente de bacterias y mohos. Este tratamiento químico se complementa con los métodos
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de conservación físicos aplicados a los alimentos durante su procesamiento, lo cual permite una
mayor efectividad del tratamiento barrera para proteger el alimento de ataques microbianos.
Adicionalmente, estos aditivos funcionan sobre los alimentos una vez estos tienen contacto con la
atmosfera exterior a su empaque, lo cual es independiente del efecto generado por el mecanismo
de conservación físico (Lück & von Rymon Lipinski, 2000).
La mayoría de estos compuestos son artificiales, como en el caso de ácido benzoico y el ácido
sórbico, sin embargo, existen estudios y reglamentaciones que determinan la concentración
máxima que se puede presentar en diversos tipos de alimentos, de acuerdo con sus características.
Por otra parte, también se utilizan en la industria conservadores de origen natural, como el ácido
cítrico, acético y láctico los cuales día a día tienen mayor aceptación por parte de los consumidores
teniendo en cuenta su origen natural (Durán, 2001).
1.1.4. Microorganismos alterantes y patógenos en alimentos
En la industria de alimentos los microorganismos juegan un papel muy importante puesto que
hacen parte de la producción de alimentos fermentados, trayendo consigo características deseables
como aroma, sabor y textura. A estos microorganismos se les conoce como alterantes, sin embargo,
muchos de estos también producen alteraciones no deseadas como las podredumbres, sin traer
consecuencias en la salud de los consumidores. Por otro lado, dentro de la industria, los alimentos
también corren el riesgo de ser infectados por microorganismos patógenos quienes pueden causar
afectaciones graves en la salud de los consumidores siendo los alimentos vehículos de infecciones
o intoxicaciones (Andino & Castillo, 2018)
28
La principal causa en la contaminación de los alimentos se debe a la deficiencia en las prácticas
de higiene, ya sea en el manejo poscosecha, para el caso de los alimentos de origen vegetal o el
tratamiento post mortem de los productos cárnicos, o la recolección de productos como la leche;
ya que debido al contacto con el ambiente el riesgo de contaminación es mayor, es por esto que se
deben mantener buenas prácticas de higiene y manufactura durante toda la cadena de
procesamiento hasta el momento de la comercialización evitando el desarrollo de microorganismos
y su crecimiento durante el almacenamiento (Andino & Castillo, 2018).
- Ascomicetos
Los ascomicetos son un taxón fúngico muy amplio que incluye mas de 64.000 especies entre
levaduras, mohos y setas. Estructuralmente, estos hongos poseen micelios septados, los cuales
permiten que los núcleos de cada septo emigren de una célula a otra. Adicionalmente, se
caracterizan por su facultad de reproducirse sexual y asexualmente. En su estructura presentan
ascos, células que contienen las ascosporas formadas tras la cariogamia y la meiosis y les dan la
facultad de reproducirse sexualmente; por otra parte, sus conidios les dan la capacidad de
reproducirse asexualmente, el cual es el mecanismo de reproducción mas común cuando se
encuentran en ambientes estables y permiten acelerar el proceso de propagación (Universidad de
Almería, s.f.).
Estos hongos son de gran importancia en la industria alimentaria debido a su capacidad de generar
intoxicaciones sobre los consumidores. De acuerdo con Israel (1878, citado en Villanúa & Torija,
29
2000) los ascomicetos tienen la capacidad de producir micotoxinas perjudiciales para la salud del
hombre, estos compuestos son un tipo de metabolitos secundarios generados por los mohos en las
ultimas etapas de la fase exponencial de crecimiento, son muy diversos y sus efectos varían
dependiendo el tipo de hongo, sin embargo, se les atribuyen efectos tóxicos a nivel del hígado,
tubo digestivo, sistema nervioso, entre otros. Se ha demostrado que los hongos del genero
Fusarium tienen la capacidad de producir este tipo de compuestos con efectos endocrinos.
Fusarium spp: esta comprendido por un alto grupo de especies las cuales se aíslan como saprófitos
y se encuentran en agua, suelo y sustratos orgánicos en descomposición. Es un hongo filamentoso
hialino, produce diferentes tipos de conidios asexuales los cuales son unicelulares, se les atribuye
el marchitamiento vascular en diversos cultivos, son patógenos y oportunistas en animales y
humanos ya que causan infecciones superficiales. Tienen la capacidad de producir micotoxinas,
las cuales representan un peligro importante en la salud humana. Bajo una temperatura de 28-37°C
y un pH de 9 presenta condiciones óptimas de crecimiento. Este microorganismo puede
encontrarse en muchos productos agrícolas, al ser oportunistas aprovechan las reservas de
nutrientes y son capaces de evadir barreras físicas eludiendo la respuesta inmune, lo que permite
que se genere la enfermedad.
Este microorganismo al encontrar los nutrientes y sustratos suficientes para su desarrollo genera
características de comportamiento fitopatógeno, tiene la capacidad de penetrar la corteza de raíces
lo que le permite posicionarse en el sistema vascular de la planta causando su marchitez, esta
capacidad está dada por su habilidad de adherirse a los tejidos e interferir con las funciones
celulares causantes de la enfermedad (Bohórquez & Díaz, 2010).
30
- Fusarium oxysporum: Este hongo perteneciente al género Fusarium es uno de los mas
importantes a nivel fitopatogeno debido a las afectaciones que presenta sobre una gran variedad
de plantas. Se caracteriza por su rápido crecimiento y producción de tres tipos de esporas:
microconidias, macroconidias y clamidosporas. No se han encontrado estudios que evidencien
patogenicidad sobre el hombre, sin embargo, con responsables de la perdida de cultivos, ya que
generan marchitamientos vasculares y muerte de una gran variedad de plantas de interés
económico en distintas regiones (Arbeláez, 2000).
Botrytis spp: Este género fúngico es de gran relevancia en la industria hortofruticola al ser el
responsable de la perdida de innumerables cantidades de alimentos por podredumbres en frutas y
hortalizas en las diferentes etapas de su cultivo, cosecha y almacenamiento. Su principal especie
(Botrytis cinérea), causal del denominado moho gris puede afectar cualquier parte de las plantas o
frutos que desarrolle. Este microorganismos desarrolla conidias, ascosporas, fragmentos de
micelios y esclerocios que pueden dispersarse fácilmente en el ambiente; sin embargo, las conidias
son las únicas estructuras capaces de germinar, colonizar y esporular tejidos de plantas vivas o
muertas (Poveda, 2006).
Estudios han demostrado que su patogenicidad puede afectar mas de 200 especies de plantas, gran
parte de ellas de alto interés económico, por lo que se han desarrollado diversos estudios biólogicos
que además de dar a conocer su caracterización y mecanismo de acción permiten identificar las
interacciónes que desarrolla y como controlar su efecto patógeno. Estos mecanismos de control
basados principalmente en el uso de agentes químicos, han desarrollado una gran problemática
debido a la resistencia desarrollada por el microorganismo hacia estos agentes, la contaminación
31
ambiental y problemas de toxicidad en el ser humano generadas por el uso de estas sustancias
(Benito, Arranz, & Eslava, 2000).
1.2. ESTADO DEL ARTE
Actualmente, hay una extensa investigación sobre la presencia y aislamiento de compuestos
antimicrobianos de origen natural, que no afecten la salud de los consumidores y sean sintetizados
por mecanismos económicos y sencillos.
A partir de ello, Rodríguez (2011) destaca las diversas fuentes naturales que pueden ser utilizadas
por la industria alimentaria, describiendo cada una de ellas, su mecanismo de acción, su forma de
obtención, entre otras características. En el artículo, se recalca la importancia de los compuestos
antimicrobianos vegetales, como las fitoalexinas, que pueden ser producidos por las plantas o
partes de ellas y constituyen una fuente potencialmente segura para los consumidores y de alto
poder antimicrobiano.
Estudios realizados por Noritake, Kawakita y Doke (1996), demuestran la capacidad que tienen
los tubérculos de papa de producir fitoalexinas como respuesta a situaciones de estrés generadas
por ataque de microorganismos. En el estudio se realiza una inoculación de tejidos de papa con
inductores obtenidos de la pared celular de micelios de Phytophthora infestans, generando de esta
forma las condiciones de estrés que dan paso a la producción de especies de oxigeno reactivo que
permiten al tubérculo generar un mecanismo de defensa por medio de la producción de risitina, un
tipo de fitoalexina.
32
La obtención de fitoalexinas es generada por la producción de metabolitos secundarios en las
plantas como un mecanismo de defensa ante situaciones de estrés. Diversos estudios han
demostrado avances en la identificación de plantas productoras de estos compuestos y como
pueden ser aplicados con el fin de inhibir el ataque de microorganismos patógenos en plantas,
aumentando así la resistencia de los cultivos a las diferentes plagas, causadas principalmente por
hongos. De igual forma, actualmente se llevan a cabo estudios que prometen grandes avances en
el uso de fitoalexinas como potenciadores de antibióticos y atenuantes de virulencia sobre
microorganismos patógenos de gran importancia en salud pública, mostrando resultados
favorables sobre la inhibición de microorganismos como Staphylococcus aureus, Escherichia coli
y Pseudomonas aeruginosa (González-Lamothe et al., 2009).
El ácido jasmónico, es una molécula con relación a fitohormonas de origen lipídico la cual actúa
en respuesta en las plantas a diversas situaciones de estrés. Estudios realizados por Laredo,
Martínez, Ilina, Guillen & Hernández (2017) evidencian la producción de esta sustancia después
del daño generado por patógenos, provocando cambios en el material genético y la codificación
de proteínas y enzimas involucradas en la síntesis de flavonoides, osmotinas y lipoxigenasas;
sustancias relacionadas con la producción de fitoalexinas. La participación de dicho ácido es en
conjunto con otras moléculas como el etileno, causando reacciones desde hipersensibilidad,
oxidación y la muerte programada de las células alrededor del lugar infectado.
Sánchez, Vargas y Jiménez (2015), evaluaron la actividad antifúngica de extractos etanólicos de
dos morfotipos de Raphanus raphanistrum L. sobre tres hongos fitopatógenos, debido al alto
33
contenido de metabolitos secundarios presentes en los extractos como glucosinolatos y
fitoalexinas. Como resultado obtuvieron la inhibición de tipo fungistática de los extractos frente a
B. cinerea, C. acutatum y F. oxysporum.
1.3. MARCO LEGAL
Resolución 2606 de 2009: en la que se establece el reglamento técnico sobre los requisitos que
deben cumplir los aditivos que se fabriquen, procesen, envasen, almacenen, transporten, expendan
importen, exporten, comercialicen, y ser empleen en la elaboración de alimentos para el consumo
humano en el territorio nacional. El articulo 2 “Campo de aplicación” nombra las disposiciones
que se deben establecer y su aplicación en la industria de alimentos para el consumo humano,
además en el Artículo 3. se definen los aditivos, como cualquier sustancia que como tal no se
consume normalmente como alimento so se usa como ingrediente básico, tenga o no valor nutritivo
y cuya adición es intencional al alimento es con fines tecnológicos.
AOAC SMPR 2015.009: técnica empleada en la estimación del contenido total de compuestos
fenólicos y el seguimiento y requerimiento del método de Folin Ciocalteu.
ISO 9167 de 1992: establece un método especificado el cual se basa en la extracción mediante
metanol, purificación y la posterior determinación, usando la cromatografía de fase inversa. Para
la presente investigación se utilizará solamente la metodología para la extracción por metanol.
34
2. METODOLOGÍA
2.1. Preparación de los tubérculos de Ibia
Se trabajaron dos lotes de Ibias (A y B) de 10 kg cada uno, obtenidos en la plaza de mercado de
Paloquemao en Bogotá. Inicialmente se realizó una limpieza superficial de cada uno de los
tubérculos, con el fin de retirar las partículas de suciedad más grandes y posteriormente se realizó
un lavado con abundante agua garantizando la remoción de toda partícula de suciedad presente en
los tubérculos. Finalmente se realizó una desinfección de los tubérculos por inmersión en una
solución de agua y desinfectante de amonio cuaternario a 200 ppm durante 5 minutos.
2.2. Producción y extracción de compuestos fenólicos
2.2.1. Formación de fitoalexinas
Se tomaron los dos lotes de ibias (1 y 2), previamente lavados y desinfectados, se distribuyeron en
bandejas por separado y con ayuda de un asa de punta se realizaron múltiples perforaciones a lo
largo y ancho de los tubérculos. Este procedimiento se llevó a cabo en una cabina de flujo laminar,
con el fin de evitar la contaminación microbiana. Cada lote se separó en cuatro partes iguales y
dos partes de cada uno se asperjaron con una solución de cloruro de cobre 10 mM, las otras dos se
usaron como blanco, posteriormente se llevaron a incubación a 17 y 27 ºC como se describe en la
Tabla 3. La aspersión se repitió cada 24 horas durante un periodo de 48 horas (Granada, Salguero,
Murillo, Pelaez, & Rueda, 2011; Orozco, Hoyos, & Arias, 2002).
35
Tabla 3. Descripción de tratamientos aplicados a tubérculos de ibias para formación de
fitoalexinas.
TRATAMIENTO DESCRIPCIÓN
BLANCO 1 – 17ºC
Tubérculos del lote 1, sin aspersión de
cloruro de cobre, incubados a 17ºC por
48 horas.
BLANCO 2 – 17ºC
Tubérculos del lote 2, sin aspersión de
cloruro de cobre, incubados a 17ºC por
48 horas.
LOTE 1 – 17ºC
Tubérculos del lote 1, asperjados con
solución de cloruro de cobre 10 mM,
incubados a 17ºC por 48 horas
LOTE 2 – 17ºC
Tubérculos del lote 2, asperjados con
solución de cloruro de cobre 10 mM,
incubados a 17ºC por 48 horas.
BLANCO 1 – 27ºC
Tubérculos del lote 1, sin aspersión de
cloruro de cobre, incubados a 27ºC por
48 horas.
BLANCO 2 – 27ºC
Tubérculos del lote 2, sin aspersión de
cloruro de cobre, incubados a 27ºC por
48 horas.
36
LOTE 1 – 27ºC
Tubérculos del lote 1, asperjados con
solución de cloruro de cobre 10 mM,
incubados a 27ºC por 48 horas
LOTE 2 – 27ºC
Tubérculos del lote 2, asperjados con
solución de cloruro de cobre 10 mM,
incubados a 27ºC por 48 horas.
2.2.2. Liofilización
Pasadas las 48 horas luego de la aspersión, las diferentes muestras de tubérculos se llevan a
deshidratación por congelación, ya que al pasar de estado sólido a vapor (sublimación) no hay
perdida de compuestos volátiles de la Ibia. Para esto se congelaron los tubérculos de Ibia a -80°C
durante 24 horas, para posteriormente disponer las muestras en el equipo de liofilización
SuperModulyo Termo Electron (Ramírez, 2006; Lucy Torres, 2010).
Figura 2. Liofilización de tubérculos de Ibia
2.2.3. Extracción de los metabolitos secundarios
37
Los 8 tratamientos de los tubérculos liofilizados se pulverizaron con ayuda de un mortero con el
fin de disminuir el tamaño de las partículas. Este material pulverizado fue sumergido en metanol
al 97% hasta cubrir totalmente las partículas de tubérculo y se dejó en reposo durante 24 horas a
temperatura ambiente. Pasado este tiempo, se tomó un filtro de papel y se separó el metanol de la
fase sólida. El metanol obtenido se reservó bajo refrigeración y se repitió el proceso con la fase
sólida reservada anteriormente (tubérculos deshidratados) agregando nuevamente metanol hasta
cubrir totalmente los tubérculos. Pasadas las 24 horas, se filtró nuevamente y se mezclaron las dos
fracciones de metanol obtenidas en cada tratamiento. Este extracto metanólico se llevó a filtración
a vacío y se sometió a evaporación en rotavapor (200 mbar, 45ºC, 80 rpm) hasta eliminar por
completo el disolvente, el extracto obtenido se lavó 3 veces con porciones de 30 mL de
diclorometano y se sometió a evaporación hasta que el extracto quedara completamente seco
(Granada et al., 2011).
38
Figura 3. Proceso de extracción de los compuestos fenólicos
2.3. Determinación de compuestos fenólicos
Este método se basa la reacción de los compuestos fenólicos con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a
pH básico, dando lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada
espectrofotométricamente. Las muestras de los extractos obtenidos se disolvieron en agua
destilada en una relación 1:10, luego se tomaron 500 μL de cada dilución y se adicionaron 125 μL
del reactivo de Folin-Ciocalteu, seguidamente se agregaron 1250 μL de Na2CO3 al 20% y se
dejaron en reposo por 2 horas en la oscuridad. Finalmente, se midió la absorbancia de cada muestra
en un espectrofotómetro ThermoSpectronic a una longitud de onda de 760 nm.
39
La cuantificación de fenoles totales se realizó por medio de una curva de calibración elaborada
con ácido gálico a diferentes concentraciones y fue expresada como mg-eq de AG (Equivalentes
de Ácido Gálico) / mg de muestra (E. García, Fernández, & Fuentes, 2015; L. García, Salinas, &
Valle, 2012).
2.4. Análisis estadístico
2.4.1. Análisis del tipo de distribución de los datos
Con el fin de observar el ajuste de los datos a una distribución normal se llevó a cabo el test de
normalidad de Kolmogorov-Smirnov (K-S) con un nivel de significancia del 5% para las 12
relaciones mencionadas anteriormente y para la totalidad de los datos. El grado de ajuste de los
datos a un tipo de distribución permite determinar el tipo de análisis estadístico que se debe
emplear. La prueba de K-S es una prueba no paramétrica que compara la distribución acumulada
de una muestra con su distribución teórica y de esta forma evalúa el grado de ajuste de los datos a
una distribución teórica (normal, de Poisson o exponencial) (Gomez, Danglot, & Vega, 2003).
Las hipótesis planteadas fueron las siguientes:
Hipótesis nula (Ho): Los datos siguen una distribución normal.
Hipotesis alterna (Hi): Los datos no siguen una distribución normal.
40
Con un valor P > 0.05 se acepta la hipótesis nula, de lo contrario (P < 0.05) se rechaza la hipótesis
nula.
2.4.2. Relación de tratamientos
Para el análisis estadístico se utilizó el software estadístico Minitab® 2017 y se establecieron 12
relaciones entre tratamientos. En la tabla 4, se describen las 12 relaciones establecidas para llevar
a cabo las pruebas estadísticas, las cuales se basan en las variables aplicadas a cada tratamiento
con el fin de poder identificar las diferencias y/o similitudes entre ellas.
Tabla 4. Relaciones establecidas para pruebas estadísticas
RELACIÓN TRATAMIENTOS
RELACIÓN 1 BLANCO 1 – 17ºC vs BLANCO 2 – 17ºC
RELACIÓN 2 LOTE 1 – 17ºC vs LOTE 2 – 17ºC
RELACIÓN 3 LOTE 1 – 17ºC vs BLANCO 1 – 17ºC
RELACIÓN 4 LOTE 2 – 17ºC vs BLANCO 2 – 17ºC
RELACIÓN 5 BLANCO 1 – 27ºC vs BLANCO 2 – 27ºC
RELACIÓN 6 LOTE 1 – 27ºC vs LOTE 2 – 27ºC
RELACIÓN 7 LOTE 1 – 27ºC vs BLANCO 1 – 27ºC
RELACIÓN 8 LOTE 2 – 27ºC vs BLANCO 2 – 27ºC
RELACIÓN 9 BLANCO 1 – 17ºC vs BLANCO 1 – 27ºC
RELACIÓN 10 BLANCO 2 – 17ºC vs BLANCO 2 – 27ºC
RELACIÓN 11 LOTE 1 – 17ºC vs LOTE 1 – 27ºC
41
RELACIÓN 12 LOTE 2 – 17ºC vs LOTE 2 – 27ºC
2.4.3. Análisis de varianza (ANOVA)
De acuerdo con Pardo, Garrido, Ruiz, & San Martín, (2007), los modelos factoriales de análisis de
varianza son los más utilizados cuando se quiere observar la interacción entre los factores de un
estudio. Por tal razón, se llevó a cabo un análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de
significancia del 5%, que permitiera establecer si se presentan o no diferencias significativas en
las 12 relaciones planteadas y la totalidad de los tratamientos evaluados. Para ello se plantearon
las siguientes hipótesis:
Hipótesis nula (Ho): No existen diferencias significativas entre los tratamientos.
Hipótesis alterna (Hi): Si existen diferencias significativas entre los tratamientos.
Con un valor P > 0.05 se acepta la hipótesis nula, de lo contrario (P < 0.05) se rechaza la hipótesis
nula.
2.5. Evaluación de la capacidad antimicrobiana de los extractos
2.5.1. Preparación del agar PDA (Papa Dextrosa Agar)
El agar PDA (Papa, Dextrosa Agar) es usado especialmente para el aislamiento de hongos
fitopatógenos gracias a su alto contenido en nutrientes. Para su preparación se disolvieron 39 g de
42
polvo de agar en 1000 mL de agua, la mezcla fue llevada a ebullición y agitación constante con el
fin de disolver cualquier partícula que quedara en suspensión. El agar líquido fue llevado a
esterilización en autoclave por 3 horas, a 125°C y 15 lb de presión. Pasado el tiempo de
esterilización se sirvieron 20 mL de agar en cada una de las cajas de Petri y se llevaron a
refrigeración a 4°C hasta su solidificación.
Figura 4. Preparación del agar PDA
2.5.2. Preparación del material biológico
Se emplearon cepas de Fusarium oxysporum y Botrytis spp proporcionadas por el laboratorio de
microbiología de la Universidad de La Salle sede Candelaria – Bogotá, para ello siguiendo la
metodología propuesta por Rojas (2011), se realizó una siembra por punción central en las cajas
de Petri sobre agar PDA inoculando micelios de cada cepa, posterior a esto se llevaron a incubación
a 25°C por 5 días. Cada una de las cepas fue sembrada por triplicado.
43
2.5.3. Preparación de los extractos
Los extractos obtenidos para cada una de las muestras se presentaban en estado sólido, lo que
dificultaba su implementación en los ensayos microbiológicos. Para ello se diluyó el extracto en
agua destilada estéril llegando a una concentración del 3%.
2.5.4. Evaluación microbiológica Sensidiscos
2.5.4.1 Disco de 5mm de micelio
El potencial antimicrobiano de los extractos fenólicos se evaluó a partir de la metodología
propuesta por Villanueva-Arce et al (2013). A partir del corte de 5 mm de micelio de los hongos
crecidos, estos se dispusieron en el centro de cada una de las cajas con agar PDA. En sentido
opuesto se ubicaron sensidiscos estériles de 5mm de diámetro impregnados con las soluciones de
los extractos preparados. Las cajas se incubaron a 25°C por 5 días y el grado de inhibición se
observó mediante la formación y diámetro de los halos y el crecimiento de los hongos en el medio
de cultivo, el control positivo se evaluó mediante el diámetro de crecimiento de los
microorganismos al aplicar el antimicótico nistatina a una concentración de 100.000 UI/ml
impregnando un sensidisco de papel filtro estéril para posteriormente ser incubados bajo las
mismas condiciones (25°C por 5 días). Estas pruebas se realizaron por triplicado para cada extracto
sobre cada hongo evaluado.
44
Figura 5. Evaluación microbiológica por sensidiscos
2.5.4.2 Siembra masiva
Paralelamente se evaluó la acción antimicrobiana de los extractos usando la metodología de
sensidiscos pero sembrando de forma masiva el microorganismo. Para ello se realizó una dilución
del material biológico en 10 mL de agua destilada estéril, esta solución se sembró de forma masiva
sobre el agar PDA, cual se depositó un sensidisco impregnado con el extracto en el centro de la
caja, se incubaron las cajas a 25°C por 5 días. Cada extracto se evaluó por triplicado sobre cada
hongo y finalmente la acción antimicótica de los extractos se observó mediante el diámetro de los
halos de inhibición y el crecimiento de la colonia dentro del medio de cultivo.
2.5.5. Siembra por césped (Gota)
Otra metodología empleada para evaluar la actividad antimicrobiana in vitro, fue la técnica de
siembra en césped. Para ello se tomó una asada del material biológico y se diluyó en 10 mL de
agua destilada estéril, posterior a esto se realizó una siembra masiva sobre el agar PDA y se dispuso
una gota de extracto en el centro de la caja, esta metodología se aplicó para cada uno de los
microorganismos y los diferentes extractos por triplicado. Se incubaron las cajas a 25°C por 5 días,
pasado este tiempo se observó la acción antimicótica de los extractos mediante el diámetro de los
45
halos de inhibición formados y el crecimiento de la colonia dentro del medio de cultivo (ICA,
2011).
3. RESULTADOS
3.1. Producción y extracción de fitoalexinas
Se obtuvieron extractos por cada tratamiento a los cuales se les realizó una cuantificación de
compuestos fenólicos y una evaluación de su posible potencial antimicrobiano. La figura 6,
muestra los extractos obtenidos, los cuales se caracterizaban por presentar un color café oscuro y
una textura altamente viscosa debido posiblemente a la presencia de una alta concentración de
azucares .
Figura 6. Extractos metanolicos
Fuente: Ortega J, Pulgarin L (2018).
3.2. Determinación de compuestos fenólicos
A partir de una solución de ácido gálico en una concentración de 0,134 mg/ml se elaboró una curva
de calibración que permitió establecer la concentración de los tratamientos evaluados. Por medio
46
de una regresión lineal, se logró establecer la concentración presente en cada uno de los
tratamientos. En la tabla 5, se observan los puntos de la curva de calibración con su respectiva
absorbancia y la absorbancia de cada una de las muestras.
Tabla 5. Concentraciones y absorbancia para curva de calibración
CURVA DE CALIBRACIÓN
MUESTRA
CONCENTRACIÓN
(mg/mL)
ABSORBANCIA
(ABS)
B 0 0
1 0,0134 0,220
2 0,0161 0,294
3 0,0188 0,314
4 0,0214 0,338
5 0,0241 0,339
6 0,0268 0,413
7 0,0322 0,456
8 0,0348 0,490
9 0,0402 0,543
10 0,0429 0,674
TRATAMIENTOS
BLANCO 1 – 17ºC
0,323
0,332
0,294
47
BLANCO 2 – 17ºC
0,264
0,280
0,307
LOTE 1 – 17ºC
0,337
0,293
0,300
LOTE 2 – 17ºC
0,291
0,277
0,299
BLANCO 1 – 27ºC
0,342
0,298
0,327
BLANCO 2 – 27ºC
0,277
0,290
0,314
LOTE 1 – 27ºC
0,303
0,286
0,306
LOTE 2 – 27ºC
0,272
0,297
0,283
48
Figura 7. Curva de calibración
Como se puede observan en la regresión lineal realizada para la curva de calibración arrojó una
ecuación de la recta con una pendiente de 13,884 y un intercepto de 0,0293. A partir de estos datos
y teniendo en cuenta las diluciones de los extractos realizadas para esta metodología y el peso de
cada muestra, se obtuvieron las concentraciones registradas en la tabla 6.
Tabla 6. Concentración de compuestos fenólicos por tratamiento
TRATAMIENTO
CONCENTRACIÓN
(mg-eq AG/ml solución)
PROMEDIO
(mg-eq AG/ml solución)
Blanco 1 – 17ºC
0,0186
0,0182 ± 0,0007 0,0173
0,0186
Blanco 2 – 17ºC
0,0165
0,0172 ± 0,0008
0,0171
49
0,0181
Lote 1 – 17ºC
0,0194
0,0179 ± 0,0013 0,0170
0,0173
Lote 2 – 17ºC
0,0183
0,0180 ± 0,0008 0,0171
0,0186
Blanco 1 – 27ºC
0,0169
0,0175 ± 0,0004 0,0176
0,0178
Blanco 2 – 27ºC
0,0179
0,0185 ± 0,0006 0,0185
0,0190
Lote 1 – 27ºC
0,0177
0,0184 ± 0,0007 0,0183
0,0192
Lote 2 – 27ºC
0,0171
0,0178 ± 0,0006 0,0180
0,0182
En la imagen 8, se puede observar la distribución de cada uno de los tratamientos en la curva de
calibración.
50
Figura 8. Concentración de compuestos fenólicos de cada tratamiento en la curva de calibración
3.3. Análisis estadístico
3.3.1. Análisis del tipo de distribución de los datos (Test K-S)
Se desarrolló el test de Kolmogorov-Smirnov (K-S) para determinar si los datos cumplen con una
distribución normal. En las tablas presentadas en el anexo 1, se observa que los resultados de
todos los tratamientos se encuentran próximos a la línea de normalidad. El valor K-S en este caso
fue de 0.113, aceptando la Ho planteada.
51
Figura 9. Proximidad de los tratamientos a linea de tendencia normal
3.3.2. Análisis de varianza (ANOVA)
De acuerdo a los resultados estadísticos presentados en el anexo 2, el valor P de todas las relaciones
evaluadas es mayor a 0.05, lo cual permite aceptar la hipótesis nula: no se presentan diferencias
significativas entre los tratamientos de cada relación.
Adicionalmente, se realizó un análisis de varianza que involucra la totalidad de los tratamientos.
La tabla 7 refleja la ventana de resultados para el análisis estadístico de todos los tratamientos.
Tabla 7. Resultados no graficos de analisis de varianza para todos los tratamientos
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000041 0,0000006 0,94 0,503
Error 4 0,0000100 0,0000006
Total 5 0,0000142
52
S = 0,0007925
R-Sq = 29,18%
R-Sq (adj) = 0,00%
3.4. Evaluación de la capacidad antimicrobiana de los extractos
En las tablas 8 y 9, se observan los resultados microbiológicos obtenidos para cada tratamiento
frente a los dos microorganismos evaluados (Botrytis spp y Fusarium oxysporum) por medio de la
siembra con sensidiscos y por cesped, respectivamente.
Tabla 8. Resultados de la evaluación antimicrobiana de los extractos aplicados por sensidiscos
Tratamiento
Prueba en sensidiscos
Diámetro mm Halo
inhibidor del extracto
sobre F.oxysporum
Diámetro Halo inhibidor
sobre Bortritys spp
Blanco 1 -17°C 0 mm 0 mm
Blanco 2 -17°C 0 mm 0 mm
Blanco 1- 27°C 0 mm 0 mm
Blanco 2-27°C 0 mm 0 mm
L1 17°C 0 mm 0 mm
L2 17°C 0 mm 0 mm
L1 27°C 0 mm 0 mm
L2 27°C 0 mm 0 mm
Nistatina 25mm 40mm
53
Tabla 9. Resultado de la evaluación antimicrobiana por cesped de los extractos
Tratamiento
Prueba en cesped
Diametro mm Halo
inhibitor del extracto
sobre F.oxysporum
Diámetro Halo inhibidor
sobre Botritys spp
Blanco 1 -17°C 0 mm 0 mm
Blanco 2 -17°C 0 mm 0 mm
Blanco 1- 27°C 0 mm 0 mm
Blanco 2-27°C 0 mm 0 mm
L1 17°C 0 mm 0 mm
L2 17°C 0 mm 0 mm
L1 27°C 0 mm 0 mm
L2 27°C 0 mm 0 mm
Nistatina 20mm 35mm
54
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
4.1. Producción de fitoalexinas
Las fitoalexinas, que en su mayoría son compuestos fenólicos, son compuestos definidos como
antibióticos de bajo peso molecular producidas por diversos tipos de plantas debido al ataque de
microorganismos. Sin embargo, esta definición puede presentar inconvenientes, puesto que estas
sustancias son producidas por diversos factores y adicionalmente, no todas poseen actividad
antibiótica. Existen diversos agentes capaces de inducir la formación de estas sustancias en las
plantas. Estos pueden ser inductores bióticos, como hongos, bacterias, virus e insectos; o
inductores abióticos, de tipo físico o químico que al generar estrés sobre la planta producen este
tipo de sustancias (Echeverri, 1987).
Es importante tener en cuenta que estos compuestos son post-infecciónales, es decir, su síntesis se
genera debido al estrés causado sobre la planta y su producción está directamente relacionada con
los factores que generan perturbación metabólica sobre ella. De acuerdo con Maestro, León y Ruiz
(1993), las fitoalexinas, son producidas durante el metabolismo secundario de las plantas y su
síntesis implica una desrepresión de genes o la activación de un sistema enzimático que no existía
antes de la inducción, que como se mencionaba anteriormente, puede darse por una gran cantidad
de factores tanto bióticos como abióticos.
El ensayo realizado está basado en el sometimiento del tubérculo a condiciones de estrés que
puedan generar la producción de fitoalexinas. Estas condiciones de estrés están dadas por tres
55
factores abióticos: el incremento en la temperatura ambiental, la adición de una solución de una
sal metálica (como el cloruro de cobre) y el daño físico a los tejidos del tubérculo, los cuales se
comentarán a continuación:
4.1.1. Efecto de la temperatura sobre la formación de fitoalexinas
De acuerdo a los datos mostrados en la tabla 6, los compuestos fenólicos presentes en las muestras
de ibias incubadas a 17ºC en comparación con las muestras incubadas a 27ºC oscilan entre 0,0165
– 0,0194 mg-eq AG/ml solución, a pesar del estrés que provoca el incremento de la temperatura
ambiental sobre el tubérculo, este caso, no garantizó la formación de estos compuestos. Sin
embargo, en estudios realizados por Dahiya y Rimmer (1989) sobre Brassica spp resaltan la
disminución en la formación de fitoalexinas cuando los tejidos vegetales se someten a altas
temperaturas, pasando de una alta concentración cuando se incuban a temperaturas entre los 20-
25ºC a una baja concentración a temperaturas de 30-35ºC y una concentración nula a 40ºC. Como
se refleja en el análisis estadístico, los resultados no presentan una diferencia significativa en la
producción de estos compuestos debido a que las temperaturas empleadas no se encuentran dentro
del rango, es decir que a 17°C la temperatura es baja para la producción de altas concentraciones
de fitoalexinas, y a 27°C su concentración tiende a disminuir. Por otra parte, estudios realizados
por Classen y Ward (1985) reflejan que hay una menor acumulación de fitoalexinas en frijoles de
soya cuando se incuban a 32ºC que a 25ºC.
En este caso, no se lograron detectar diferencias significativas entre la concentración de
compuestos fenólicos presentes en las ibias incubadas a 17ºC con respecto a las ibias incubadas a
56
27ºC en ninguno de los lotes evaluados. Teniendo en cuenta la naturaleza de las fitoalexinas y al
no evidenciar una mayor concentración en la cantidad de compuestos fenólicos de ninguna muestra
con respecto a otra, podemos inferir que la diferencia de temperatura no influyó en la producción
de estos compuestos ya que todas las muestras reflejan una concentración uniforme, independiente
de la temperatura a la cual fue incubada durante el tratamiento. Este comportamiento puede
presentarse debido al tipo de producto que se está evaluando, ya que, al no tener evidencias previas
sobre el comportamiento de estos tubérculos, es posible que las temperaturas evaluadas, para este
caso, fueran demasiado altas y bloquearan la formación de fitoalexinas. Esta acotación se respalda
con el hecho de que la ibia es un tubérculo que, a pesar de soportar bajas temperaturas durante su
cultivo, no soporta las heladas ya que destruyen su follaje. De acuerdo con Villacrés, Quelal y
Álvarez (2016), sus temperaturas óptimas de crecimiento son de 6-15 ºC y temperaturas superiores
a los 28ºC pueden destruir la planta. La temperatura ambiental es el factor de mayor influencia
sobre la tasa de deterioro de cualquier producto hortofrutícola durante la poscosecha, llegando a
aumentar la tasa de deterioro de 2 a 3 veces cuando las condiciones térmicas del ambiente se
encuentran 10ºC por encima de su temperatura óptima. Como consecuencia, además de incurrir en
problemas fisiológicos (ablandamiento excesivo, desecación, blanqueamiento, quemadura o
escaldado de la superficie) favorece la germinación de esporas y el crecimiento de patógenos (Adel
Kader, 1992). Por otra parte, de acuerdo con Torres, Montesdeoca y Andrade (2011), las
condiciones de almacenamiento durante la postcosecha de estos tubérculos son similares a las de
la papa, la cual es almacenada en óptimas condiciones a temperaturas cercanas a los 10ºC
(Suquilanda, n.d.). En el presente estudio, se manejaron dos temperaturas que se encuentran fuera
de las temperaturas optimas de crecimiento y almacenamiento (17 y 27 ºC), lo cual repercute
57
directamente en el estrés causado al tubérculo. sin embargo, al parecer, no tuvieron diferencias
entre ellas, al momento de la producción de compuestos fenólicos.
4.1.2. Efecto del rompimiento de tejidos en tubérculos
Las punciones realizadas a lo largo y ancho de los tubérculos de ibia ayudan a generar mayor estrés
debido al daño mecánico ocasionado sobre los tejidos del tubérculo. Esto, además de deteriorar las
células, generan una liberación de sustancias que activan enzimas propias de la actividad
metabólica de los alimentos, además liberan fluidos que favorecen el crecimiento de
microorganismos fitopatógenos, aumenta las velocidades de respiración y producción de etileno,
generando altas condiciones de estrés sobre el tubérculo durante la poscosecha (Villaseñor et al.,
2006).
Este tipo de tratamientos permiten inducir la formación de fitoalexinas en tejidos vegetales. De
acuerdo con Darvill y Albersheim (1984) no se requiere la presencia de materiales exógenos para
fomentar la síntesis de fitoalexinas por factores abióticos, pues estas pueden producirse debido a
las lesiones o muerte de las células vegetales de los tejidos. Las hipótesis de este efecto señalan la
liberación de moléculas de la pared de las células que tienen la capacidad de inducir la formación
de fitoalexinas en las células circundantes al área sobre la cual se realizó el daño celular. Al generar
lesiones, se han logrado detectar enzimas que trabajan como intermediaras al liberar fragmentos
de la pared celular identificados como inductores de estas sustancias en las células circundantes.
En el presente estudio los tubérculos sufren un daño de tejidos y se someten a estrés ambiental, al
ser asperjados con cloruro de cobre e incubados a dos temperaturas que están fuera de sus
58
condiciones ideales de almacenamiento. Esta primera etapa hace referencia a la etapa de necrosis
inducida que inicia con la muerte celular en los tejidos del tubérculo, posteriormente, las células
detectan estos comportamientos e inician una etapa de respuesta hipersensitiva en la cual las
células circundantes a las zonas en las cuales se produjo el daño inician una serie de reacciones
que hacen frente a los daños ocasionados. Una de estas reacciones puede ser la síntesis de
compuestos como las fitoalexinas, así como el engrosamiento de la pared celular, la deposición de
calosa, entre otras (Camarena & De la Torre, 2007).
Con el fin de incrementar el estrés la idea era que las punciones en todos los tratamientos,
permitieran aumentar la síntesis de este tipo de compuesto fenólico. La unión de varios factores
pueden promoverla. Debido a que este fue este factor fue común entre todos los tratamientos, no
es posible determinar su capacidad de influir sobre la producción de fitoalexinas en algún
tratamiento específico, reflejado no se reflejan diferencias estadísticamente significativas entre
ellas.
4.1.3. Efecto de la aspersión con cloruro de cobre
Otro de los factores abióticos relacionado con la formación de fitoalexinas es la adición de sales
metálicas a las células vegetales. Para ello suelen usarse sales de Cadmio, Mercurio y/o Cobre.
Para el presente se utilizó una solución 10 mM de cloruro de cobre (Echeverri, 1987).
Existen diversos efectos de la acción de estas sales en la formación de fitoalexinas, que varían
debido a: la concentración de la solución salina, la naturaleza y la composición de las sales sobre
59
el material vegetal de estudio. Estudios realizados por Dahiya y Rimmer (1989) revelan el efecto
que tiene una solución de cloruro de cobre (20 mM) sobre plantas de Brassica spp, favoreciendo
la formación de dos tipos de fitoalexinas con respecto a soluciones en las que se emplean sales de
nitrato de níquel (Ni(NO3)2), sulfato de zinc (ZnSO4), nitrato de plomo (Pb(NO3)2) y cloruro de
mercurio (HgCl2). Sin embargo, Yoshikawa (1978) afirma que en algunos casos, concentraciones
de estas sales por encima de 10 mM, generan una alta toxicidad sobre las plantas, lo que ocasiona
una inhibición de la actividad sintética de fitoalexinas.
El uso de estos compuestos químicos como inductores de fitoalexinas debe ser objeto de estudios
posteriores, ya que los agentes químicos adquieren especificidad sobre especies de plantas y así
mismo sobre partes de la planta y requiere ser validado el tipo de compuesto y su concentración
para obtener una máxima producción de estas sustancias (Dahiya & Rimmer, 1989).
De acuerdo con los estudios mencionados, observamos que la concentración de las sales metálicas
son un factor importante en la producción de estos compuestos ya que se evidencian distintas
respuestas dependientes a el compuesto y la planta que se esté evaluando. Los resultados obtenidos
para el presente estudio no reflejan ninguno de los dos comportamientos, es decir, que las
aspersiones de cloruro de cobre no evidencian una respuesta favorable o desfavorable sobre los
tratamientos, con respecto a aquellos que no contenían este punto como parte del tratamiento,
además de ello, la concentración utilizada para este estudio se encontraba a una concentración
superior a la mencionada por Yoshikawa,(1978) en sus estudios, lo que pudo inhibir la síntesis de
estos compuestos.
60
4.2. Síntesis de fitoalexinas
Como se ha mencionado, la síntesis de fitoalexinas puede estar favorecida por un conjunto de
factores, tanto bióticos como abióticos. En este caso los factores a los cuales se sometieron los
tubérculos son abióticos de distintos tipos, es decir, se tienen factores que afectan el ambiente de
los tubérculos, la adición de compuestos químicos y un daño físico a los tejidos de las ibias.
A partir de la concentración de compuestos fenólicos es muy difícil determinar si los compuestos
que allí se cuantifican son o no son fitoalexinas, adicionalmente, entre tratamientos no fue posible
determinar la incidencia de los factores mencionados ante la síntesis de fitoalexinas. En primera
instancia, tenemos como factor común el daño de tejidos como consecuencia de las punciones
realizadas a los tubérculos, el cual debe repercutir de igual manera entre todos los tratamientos.
Por otra parte, tenemos un primer diferencial en los tratamientos aplicados y es la adición de una
solución de cloruro de cobre a ciertos tratamientos; del cual podemos inferir que en nuestro caso
no promovió ni interfirió en la síntesis de fitoalexinas. Finalmente, la temperatura tampoco generó
mayor influencia sobre los tratamientos, ya que independientemente de ésta, las concentraciones
de compuestos fenólicos se encuentran en un rango entre 0,0165 – 0,0194 mg-eq AG/ml extracto.
Cada planta presenta una resistencia sistémica adquirida especifica de su naturaleza. No todas las
plantas tienen la capacidad de producir fitoalexinas, así como no todas las fitoalexinas producidas
por las plantas son las mismas. La combinación de factores bióticos y abióticos a los cuales se ven
expuestas las plantas constantemente han generado la producción de más de 200 sustancias
diferentes. Es importante destacar que, aunque en la síntesis de fitoalexinas los inductores son
61
vitales y las plantas responden diferente dependiendo la naturaleza de estos, no se ha encontrado
evidencia que relacione la estructura de los inductores con la síntesis y acumulación de
fitoalexinas. Lo importante durante el tratamiento es generar una perturbación metabólica
suficiente que lleve a la producción de estas moléculas y es la relación huésped-hospedero la
encargada de dar especificidad a los compuestos producidos (García & Pérez, 2003).
En la producción de fitoalexinas para cualquier planta, éstas se ven influenciadas por un aspecto
especifico y es la interacción de tres rutas biosintéticas específicas. De acuerdo con Kuc (1995)
las rutas del ácido mevalónico, del ácido shikímico y del acetato-malonato de manera
independiente o la combinación de estas, son las encargadas de formar los precursores de las
fitoalexinas en todo tipo de plantas. Debido a los resultados obtenidos y la falta de estudios de esta
índole sobre tubérculos de ibias o de especies de la misma familia, no es posible tener datos para
establecer comparaciones, sin embargo, se abren posibilidades de investigación que incluyan el
estudio de estas rutas metabólicas en la posible formación de precursores de fitoalexinas sobre esta
especie o se pueden hacer pruebas más específicas como una cromatografía, que permitan
identificar las moléculas presentes en el extracto obtenido.
4.3. Obtención del extracto metanólico y determinación de compuestos fenólicos
Las concentraciones de compuestos fenólicos determinadas por medio de este estudio pueden o no
reflejar la concentración de fitoalexinas y se ven afectadas por diversas variables. De acuerdo con
los resultados obtenidos (ver Tabla 6) los valores promedio de compuestos fenólicos de las
muestras evaluadas oscilan entre 0,0172-0,0185 mg-eq AG/ml solución. De acuerdo con el análisis
62
estadístico, estos valores no presentan diferencias significativas entre tratamientos, lo cual permite
presumir que los factores que afectaron cada tratamiento no aumentaron los inductores de la
síntesis de fitoalexinas. Aunque no son muchos los estudios adicionales, existe evidencia de la
concentración de compuestos fenólicos en ibias determinados para otro tipo de estudios, como el
de Corzo et al (2016) donde reportan concentraciones de compuestos fenólicos en tubérculos de
ibias de 5,6 mg-eq AG/g Tubérculo Fresco, por otra parte, Chirinos et al (2009) reportan valores
que oscilan entre 0,408-1,618 mg-eq AG/g en peso fresco, para diferentes variedades. Otros
estudios realizados por Campos et al (2006) reportan resultados que oscilan entre 0,71-1,32 mg-
eq AC/g producto, usando como reactivo de referencia ácido clorogénico.
De acuerdo con los resultados mencionados existe una gran variación entre estos y los obtenidos
en las investigaciones mencionadas, lo cual puede dificultar una comparación entre los mismos.
Esto puede ocurrir por la variabilidad genética que se presenta dentro de una misma especie. Estos
estudios utilizan tubérculos de la misma especie (Oxalis tuberosa Mol.), sin embargo, allí se
mencionan las diferentes características que presentan a nivel físico y composicional, como la
diferencia en las concentraciones de compuestos fenólicos. Estas diferencias además de darse por
factores ambientales durante la precosecha y poscosecha, se dan como consecuencia de la varianza
genética dentro de la misma especie. Como lo mencionan Morillo, Morillo y Leguizamo (2018)
las ibias se han propagado a través de diferentes tubérculos lo que proporciona que se generen
especies con características como el color, la textura y la morfología del tubérculo, esto produce
que no haya una caracterización asertiva creando confusión entre las distintas especies ya que estas
plantas pueden compartir similitud en los fenotipos, pero no en los genotipos. En el caso de nuestro
estudio, no es posible identificar la variedad estudiada debido a que los tubérculos fueron
63
adquiridos en una plaza de mercado local y se desconoce tanto su variedad como los factores
ambientales que pudieron afectar sus características composicionales (Núñez, 2015).
El mecanismo de extracción de las fitoalexinas es igualmente un factor de gran relevancia en la
composición del extracto obtenido. Posterior al proceso de inducción, los tubérculos pasaron por
un proceso de extracción de estos compuestos por una inmersión en metanol al 97% durante 48
horas. En esta extracción hay tres factores principales que pudieron afectar los compuestos del
extracto. En primer lugar, la alta concentración del metanol pudo reducir la cantidad de compuestos
extraídos. De acuerdo con Soto y Rosales (2016) la eficiencia de la extracción está dada en gran
medida por la polaridad del solvente con los compuestos químicos presentes en el material de
extracción, razón por la cual se recomienda el uso de soluciones hidroalcohólicas con el fin de
mejorar la eficiencia de estos procesos. A pesar de no tener valores de referencia de mezclas que
favorezcan la extracción de estos compuestos, los autores recomiendan el uso de soluciones
hidroetanolicas entre el 30 al 70% de concentración para extractos en material vegetal.
En segundo lugar, las fitoalexinas pueden tener o no actividad antibiótica y su concentración puede
disminuir con el tiempo. De acuerdo con Echeverri (1987) estudios cinéticos realizados en
fitoalexinas producidas por hojas de banano reflejan la degradación de estos compuestos después
de 72 horas de su producción, lo cual se explica por medio de dos hipótesis: degradación
espontanea o regulación de las funciones celulares alteradas debido al agente inductor. En el
presente estudio es importante tener en cuenta este factor, ya que, debido al tiempo del proceso de
extracción, determinación de compuestos fenólicos y posterior evaluación microbiológica, que se
presentó después de la inducción de estos compuestos, transcurrieron más de 72 horas lo cual pudo
64
generar bien sea su degradación total o una disminución de la concentración de estos compuestos
a niveles que no lograran evitar el crecimiento de los microorganismos evaluados, como se
mencionará más adelante.
En tercera instancia, se pueden presentar inconvenientes con la composición química del extracto
si este presenta compuestos adicionales y en concentraciones suficientes podrían promover el
crecimiento del microorganismo a evaluar. La textura de los extractos evaluados era altamente
viscosa, lo cual puede ser debido a la presencia de compuestos como azucares simples y otros
carbohidratos que en este caso pueden promover el crecimiento fungico e interferir con la
cuantificación de compuestos fenólicos por medio del protocolo de Folin-Ciocalteau. De acuerdo
con Torres y Torrico (2004) las ibias presentan un contenido de fructosa entre 2.08 – 5.40 % en
harina de ibias y en la tabla 2 se observa una concentración aproximada de 83-88% de
carbohidratos en base seca. Debido a la alta concentración de estos compuestos, los extractos
obtenidos pueden contener de igual forma una alta concentración que podrían favorecer el
crecimiento microbiano. Por otra parte, Muñoz et al (2017) indica la interferencia de moléculas de
azúcar en la cuantificación de compuestos fenólicos por medio del método de Folin-Ciocalteau,
siendo la fructosa la responsable de sobreestimar la concentración de compuestos fenólicos en
extractos de material vegetal.
Por otra parte, otro factor que no permite comparar directamente los resultados obtenidos es el
método utilizado para la cuantificación de los mismos. De acuerdo con Londoño (2012) las
variaciones en el desarrollo del método de Folin-Ciocalteau para cuantificación de compuestos
fenólicos en diferentes muestras, imposibilita su comparación debido a condiciones críticas del
65
protocolo como las proporciones de reactivos, temperatura y tiempo de reacción, así como el ácido
de referencia utilizado para su cuantificación. Esto ocurre con los resultados reflejados por Campos
et al (2006) quien utiliza en su protocolo ácido clorogénico como reactivo de referencia.
4.4. Evaluación microbiologica frente a F. oxysporum y Botrytis spp
De acuerdo con las Tablas 8 y 9, ninguno de los microorganismos evaluados presenta inhibición
frente a ninguno de los tratamientos evaluados. La no inhibición pudo ser debido a que los
tubérculos de ibias no formaron fitoalexinas durante el proceso de inducción de estas, bien sea por
incapacidad del tubérculo o por bloqueo de su producción debido a los mecanismos de inducción
utilizados; o por degradación de estos compuestos como consecuencia del tiempo de cuantificación
y evaluación antimicrobiana después de su producción.
En las cajas de petri se observó un crecimiento favorable de los microorganismos en todos los
tratamientos evaluados, independientemente del mecanismo utilizado para la siembra y evaluación
del extracto. Esto ocurre debido a las condiciones favorecedoras del agar PDA utilizado para la
evaluación de los hongos. El agar PDA es el medio de referencia utilizado para análisis in vitro de
hongos, ya que contiene los nutrientes suficientes que aseguran el crecimiento de todo tipo hongos
(fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, entre otros), adicionalmente, su
composición retiene la humedad necesaria para el desarrollo de estos microorganismos, ya que al
verse limitados de humedad pueden disminuir el crecimiento y desarrollo del micelio (CIP, 2004).
66
Con respecto a los microorganismos evaluados, otra hipótesis de estos comportamientos es que en
investigaciones previas han reflejado resistencia frente a extractos vegetales. Pawar y Thaker
(2007), probaron la posible actividad antifúngica de 75 aceites esenciales sobre Fusarium
oxysporum obteniendo como resultado una eficacia muy pobre. Por otro lado, Sandoval (2006)
probó la actividad antifúngica de 13 extractos vegetales frente a Botrytis cinérea de los cuales solo
uno de ellos (extracto de ruda) tuvo efectos favorables. Esto refleja una alta resistencia de estos
microorganismos frente a fuentes vegetales utilizadas para su inhibición.
Fusarium oxysporum es un hongo que se caracteriza por presentar un rápido crecimiento y alta
resistencia a mecanismos de control convencionales. Su resistencia y supervivencia durante largos
periodos de tiempo se debe a su mecanismo de propagación compuesto por la formación de tres
tipos de esporas: microconidias, macroconidias y clamidosporas. Estas presentan estructuras y
características distintas, pero son las clamidosporas las encargadas de otorgar la resistencia a este
hongo, ya que debido a su pared gruesa tienen la capacidad de resistir condiciones ambientales
desfavorables y presentan alta sobrevivencia aún en tejidos muertos de plantas o en el suelo
(Arbeláez, 2000).
Por otro lado, Botrytis spp es un hongo que debido a la sobreexposición a diferentes fungicidas ha
generado alta resistencia a los mismos, razón por la cual actualmente no se tiene una medida de
control eficaz que modere su crecimiento. La evolución de este microorganismo esta remitida en
9 genes diferentes que actúan sobre la acción mitocondrial de la célula provocando estas
mutaciones mucho más resistentes a la acción de antibióticos (Cosseboom, Schnabel, & Hu, 2019).
67
Adicional a esto, existe un comportamiento particular de algunos hongos patógenos frente a la
acción inhibidora de las fitoalexinas. De acuerdo con Orozco, Garcés y Arbeláez (1997) los hongos
patógenos como Fusarium oxysporum, tienen la capacidad de metabolizar las fitoalexinas,
contrarrestando asi su efecto antimicrobiano y originando productos inactivos. De acuerdo con
López (2019), estudios realizados por la universidad de Murcia resaltan como el sistema
enzimatico lacasa-peroxidasa tienen la capacidad de inactivar el pterostilbeno, fitoalexina con gran
poder antifúngico producida por los arándanos. Este mecanismo utilizado por estos hongos frente
a la acción de las fitoalexinas pudo ser un factor de influencia en el estudio microbiológico
realizado.
68
5. CONCLUSIONES
No es posible determinar una influencia del efecto de la temperatura en la síntesis de fitoalexinas
por medio de los resultados obtenidos, debido a que las concentraciones de compuestos fenólicos
no reflejan diferencias significativas entre los tratamientos sometidos a 17ºC con respecto a los
resultados obtenidos a 25ºC. Se pudo presentar una incidencia de la temperatura afectando la
producción de estos compuestos, al generar un estrés muy alto sobre la planta debido a que las
temperaturas de incubación superan en todos los tratamientos las temperaturas ideales durante la
pre y poscosecha. Sin embargo, tampoco se puede afirmar que no hay una formación de estos
compuestos ya que se requiere conocer la composición exacta de estos
Ninguno de los extractos obtenidos demostró capacidad de inhibir el crecimiento de los hongos
evaluados, comportamiento que se puede ver afectado por diversos factores. Por un lado, tenemos
un posible bloqueo en la formación de fitoalexinas debido a que las condiciones de inducción no
parecen ser las más favorables para estos tubérculos. Por otra parte, es posible que el tubérculo no
tenga la capacidad de formar estos compuestos, razón por la cual no se observaron diferencias
significativas entre las concentraciones de compuestos fenólicos entre los tratamientos evaluados.
Finalmente, los hongos evaluados se caracterizan por la alta resistencia que presentan ante
sustancias que inhiben su crecimiento debido a su capacidad de metabolizar o inactivar
enzimáticamente las fitoalexinas, la evolución genética en el caso de Botrytis spp que le confiere
capacidad de resistir ambientes adversos y en el caso de F. oxysporum las clamidoesporas que
desarrolla y le confieren gran capacidad de resistencia a sustancias y ambientes que impidan su
crecimiento.
69
6. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar un estudio a profundidad de la composición fisicoquímica de los extractos
obtenidos, con el fin de identificar las estructuras moleculares presentes y las concentraciones en
las cuales se presentan. Para ello sería de gran utilidad centrar los estudios en determinar por medio
de una cromatografía de gases las sustancias presentes y poder identificar la posible presencia de
fitoalexinas. Adicionalmente, debido a la alta concentración de azucares y almidones propios del
tubérculo es importante determinar la concentración de estos compuestos en el extracto, ya que
estos favorecen el crecimiento microbiano en vez de inhibirlo en los ensayos microbiológicos.
Por otra parte, se recomienda realizar estudios que combinen factores bióticos y abióticos sobre
los tubérculos y con mayor variedad de tratamientos, con el fin de identificar la posible capacidad
de estos tubérculos de producir fitoalexinas y las condiciones ideales de inducción de estos
compuestos.
Se recomienda implementar ensayos microbiológicos con otro tipo de microorganismos, como
bacterias, ya que permite evaluar la capacidad de inhibición de los extractos sobre otro tipo de
estructuras.
Para la obtención del extracto metanólico, es importante revisar mezclas acuosas del solvente a
diferentes concentraciones para favorecer la polaridad del solvente y desarrollar procedimientos
de extracción más eficientes que permitan retener las moléculas de interés, en este caso las
fitoalexinas.
70
7. REFERENCIAS
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ANEXOS
ANEXO 1. Test de Kolmogorov-Smirnov (K-S)
En esta prueba, el valor K-S determina si los datos cumplen o no una distribución de tipo normal.
Teniendo en cuenta que el valos K-S de todas las relaciones es mayor a 0.05 se acepta la hipotesis
nula (Ho) de que todas las muestras siguen una distribución normal, lo cual puede corroborarse en
los graficos correspondientes a cada relación en la tabla observando que todos los puntos se
encuentran próximos a la linea de normalidad
RELACIÓN VALOR K-S GRAFICO
RELACIÓN 1
0.183
RELACIÓN 2
0.241
RELACIÓN 3
0.264
76
RELACIÓN 4
0.234
RELACIÓN 5
0.203
RELACIÓN 6
0.204
RELACIÓN 7
0.228
RELACIÓN 8
0.212
77
RELACIÓN 9
0.207
RELACIÓN 10
0.200
RELACIÓN 11
0.185
RELACIÓN 12
0.216
78
ANEXO 2. Analisis de varianza
En las tablas, se observa el análisis no grafico del análisis de varianza realizado para cada relación
planteada entre los tratamientos. Para cada relación, el análisis estadístico arroja una ventana de
resultado que permite determinar la varianza entre las muestras.
Relación 1 (Blanco 1 – 17ºC vs Blanco 2 – 17ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000014 0,0000014 2,38 0,198
Error 4 0,0000024 0,0000006
Total 5 0,0000038
S = 0,0007730
R-Sq = 37,29%
R-Sq (adj) = 21,61%
Pooled StDev = 0,000773
Relación 2 (Lote 1 – 17ºC vs Lote 2 – 17ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000000 0,0000000 0,02 0,884
Error 4 0,0000049 0,0000012
79
Total 5 0,0000049
S = 0,001102
R-Sq = 0,60%
R-Sq (adj) = 0,00%
Pooled StDev = 0,001102
Relación 3 (Lote 1 – 17ºC vs Blanco 1 – 17ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000001 0,0000001 0,12 0,744
Error 4 0,0000046 0,0000011
Total 5 0,0000047
S = 0,001072
R-Sq = 2,98%
R-Sq (adj) = 0,00%
Pooled StDev = 0,001072
Relación 4 (Lote 2 – 17ºC vs Blanco 2 – 17ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000010 0,0000010 1,47 0,292
80
Error 4 0,0000027 0,0000007
Total 5 0,0000036
S = 0,0008140
R-Sq = 26,92%
R-Sq (adj) = 8,65%
Pooled StDev = 0,000814
Relación 5 (Blanco 1 – 27ºC vs Blanco 2 – 27ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000016 0,0000016 6,08 0,069
Error 4 0,0000010 0,0000003
Total 5 0,0000026
S = 0,0005048
R-Sq = 60,33%
R-Sq (adj) = 50,42%
Pooled StDev = 0,000505
Relación 6 (Lote 1 – 27ºC vs Lote 2 – 27ºC)
Fuente DF SS MS F P
81
Muestra 1 0,0000006 0,0000006 1,40 0,303
Error 4 0,0000018 0,0000004
Total 5 0,0000024
S = 0,0006668
R-Sq = 25,87%
R-Sq (adj) = 7,34%
Pooled StDev = 0,000667
Relación 7 (Lote 1 – 27ºC vs Blanco 1 – 27ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000013 0,0000013 3,41 0,139
Error 4 0,0000015 0,0000004
Total 5 0,0000027
S = 0,0006083
R-Sq = 45,99%
R-Sq (adj) = 32,49%
Pooled StDev = 0,000608
Relación 8 (Lote 2 – 27ºC vs Blanco 2 – 27ºC)
82
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000008 0,0000008 2,52 0,188
Error 4 0,0000013 0,0000003
Total 5 0,0000021
S = 0,0005740
R-Sq = 38,61%
R-Sq (adj) = 23,26%
Pooled StDev = 0,000574
Relación 9 (Blanco 1 – 17ºC vs Blanco 1 – 27ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000007 0,0000007 1,89 0,241
Error 4 0,0000015 0,0000004
Total 5 0,0000022
S = 0,0006111
R-Sq = 32,13%
R-Sq (adj) = 15,17%
Pooled StDev = 0,000611
Relación 10 (Blanco 2 – 17ºC vs Blanco 2 – 27ºC)
83
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000025 0,0000025 5,32 0,082
Error 4 0,0000019 0,0000005
Total 5 0,0000045
S = 0,0006921
R-Sq = 57,08%
R-Sq (adj) = 46,35%
Pooled StDev = 0,000692
Relación 11 (Lote 1 – 17ºC vs Lote 1 – 27ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000004 0,0000004 0,38 0,573
Error 4 0,0000046 0,0000011
Total 5 0,0000050
S = 0,001071
R-Sq = 8,61%
R-Sq (adj) = 0,00%
Pooled StDev = 0,001071
84
Relación 12 (Lote 2 – 17ºC vs Lote 2 – 27ºC)
Fuente DF SS MS F P
Muestra 1 0,0000004 0,0000004 0,75 0,435
Error 4 0,0000020 0,0000005
Total 5 0,0000023
S = 0,0007019
R-Sq = 15,82%
R-Sq (adj) = 0,00%
Pooled StDev = 0,000702
85
ANEXO 3. Resultados de ensayos microbiológicos: evaluación de los extractos sobre Botrytis
spp y Fusarium oxysporum
Resultado de blanco 1-17°C sobre Botrytis spp
Resultado blanco 1 - 27°C sobre Fusarium oxysporum
Control positivo
86
Resultados del lote 2- 27°C sobre Fusarium oxysporum
Control negativo