efecto antimicrobiano del extracto de cubio (tropaeolum
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Ingeniería de Alimentos Facultad de Ingeniería
1-1-2017
Efecto antimicrobiano del extracto de cubio (Tropaeolum Efecto antimicrobiano del extracto de cubio (Tropaeolum
tuberosum) frente a Listeria monocytogenes en carne de tuberosum) frente a Listeria monocytogenes en carne de
hamburguesa hamburguesa
Lisa Marcela Poma Restrepo Universidad de La Salle, Bogotá
Claudia Fernanda Paz Cañón Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Poma Restrepo, L. M., & Paz Cañón, C. F. (2017). Efecto antimicrobiano del extracto de cubio (Tropaeolum tuberosum) frente a Listeria monocytogenes en carne de hamburguesa. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_alimentos/71
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UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE INGENIERÍA
Programa de ingeniería de alimentos
Efecto antimicrobiano del extracto de cubio (Tropaeolum tuberosum)
frente a Listeria monocytogenes en carne de hamburguesa
Autores: Lisa Marcela Poma Restrepo
Claudia Fernanda Paz Cañón
Dirigido por: Alfredo Lopez Molinello
BOGOTÁ
2017
AGRADECIMIENTOS
Mi gratitud, principalmente está dirigida a mis padres Claudia Ayde Cañón y Ruben Fernando
Paz quienes gracias a sus charlas y consejos útiles de vida me apoyaron moral y económicamente
en mi proceso de aprendizaje contribuyendo incondicionalmente a lograr mis metas.
Igualmente expreso un gran agradecimiento al profesor Alfredo Lopez Molinello por su
constante apoyo y contribución con su conocimiento y su tiempo para poder llevar a término el
presente trabajo.
A todos mis profesores de la Universidad de la Salle, quienes transmitieron todos sus
conocimiento para alcanzar este logro que está a punto de culminar.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco principalmente a mis padres William Pomar y Jeanet Restrepo quienes con su trabajo
y esfuerzo han apoyado mi proceso formativo profesional y personal, a mis hermanas Mayra
Pomar y Luna Pomar quienes de una forma u otra me han apoyado y alentado a seguir con mi
formación académica, a mis abuelos Paulino Pomar y Hernando Restrepo quienes me motivaron
y alentaron para alcanzar esta gran meta.
A mi compañera Claudia Paz por brindarme su amistad, apoyo y compañía durante nuestra
formación académica y en la elaboración de este documento, al igual que al docente Alfredo
López quien nos dio la oportunidad de realizar este trabajo, nos brindó su apoyo y guio durante
todo este proceso. De la misma forma agradezco a todos los docentes y directivos de la facultad
de ingeniería de alimentos. Finalmente doy gracias a dios por todas las bendiciones que me ha
brindado y por permitirme culminar mi formación académica.
RESUMEN
El cubio o mashua (Tropaeolum tuberosum) es un tubérculo originario de los andes que posee
propiedades medicinales debido a que entre sus componentes se encuentra los glucosinolatos
(GSL), compuestos que pueden tener efecto antimicrobiano. Por esto se evaluó la capacidad
antimicrobiana de un extracto etanolico de cubio in vitro y en una matriz alimentaria frente a
Listeria monocytogenes. En primer lugar, se sometieron los cubios a un proceso de liofilizado, la
extracción se realizó por medio de centrifugación usando como solvente etanol al 70%, se
extrajo el disolvente por rotaevaporación y se completó el proceso en estufa a 40°C por 24 horas.
Se determinó la mínima concentración inhibitoria en un estudio in vitro, obteniendo que el
extracto en concentración 1:2 y 1:4 (333 mg/ml y 200 mg/ml) inhibió el crecimiento, mientras
que las concentraciones 1:6 y 1:8 permitieron el crecimiento de la bacteria. Posterior a esto
se determinó la efectividad del mismo en carne de hamburguesa inoculada con la bacteria, con el
fin de reducir el contenido de nitritos, para lo cual se establecieron los siguientes
tratamientos: control negativo (sin nitritos ni extracto), control positivo corresponde a 200
ppm de nitrito de sodio, con adición de extracto de cubio a 200 mg/ml y 100 ppm de nitrito de
sodio. Las muestras se almacenaron a 4°C y el muestreo se realizó las horas 0, 6, 12, 24 y 5 días,
obteniendo que el extracto de cubio, a la concentración evaluada, no tuvo efecto antimicrobiano
frente a L.monocytogenes al ser incorporada en carne de hamburguesa lo que se puede atribuir al
contenido de grasa y proteína de la carne la cual puede disminuir la disponibilidad del extracto y
servir de protección a la bacteria.
Palabras clave: Cubio, Isotiocianatos, Listeria monocytogenes, carne de hamburguesa.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN
ABREVIATURAS
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................................1
OBJETIVOS ....................................................................................................................................3
1. MARCO REFERENCIAL ...........................................................................................................4
1.1 MARCO TEÓRICO ...............................................................................................................4
1.1.1 El cubio (Tropaeolum tuberosum) ..............................................................................4
1.1.2 Características del cubio .............................................................................................4
1.1.3 Efecto antimicrobiano del cubio .................................................................................5
1.1.4 Seguridad alimentaria..................................................................................................6
1.1.5 Productos cárnicos .....................................................................................................7
1.1.6 Microbiología de los derivados cárnicos....................................................................7
1.1.7 Los nitritos ..................................................................................................................9
1.2 REVISIÓN DEL ESTADO DEL ARTE ...............................................................................9
1.2.1 Extractos naturales como agentes antimicrobianos .........................................................9
1.2.2 Extractos de cubio con efecto antimicrobiano ..............................................................10
1.3 MARCO LEGAL .................................................................................................................11
2. METODOLOGÍA ......................................................................................................................12
2.1 ELABORACIÓN DEL EXTRACTO DE CUBIO ..............................................................12
2.2 DETERMINACIÓN DE LA MÍNIMA CONCENTRACIÓN INHIBITORIA (CMI) ......12
2.3 PROCEDIMIENTO PARA PRUEBAS EN MATRIZ ALIMENTARIA ...........................13
2.3.1 Elaboración muestras de carne de hamburguesa ...........................................................13
2.3.2 Inoculación y recuento de Listeria monocytogenes en producto cárnico ......................14
2.3.3 Pruebas Fisicoquímicas .................................................................................................15
2.4 DISEÑO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTO ESTADÍSTICO ..................................15
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...............................................................................................17
3.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ........................................................................................17
3.2 PRUEBAS in vitro ..............................................................................................................17
3.3 PRUEBAS EN MATRIZ CÁRNICA ..................................................................................19
3.4 PRUEBAS FISICOQUÍMICAS .........................................................................................24
CONCLUSIONES ........................................................................................................................26
RECOMENDACIONES ................................................................................................................27
REFERENCIAS .............................................................................................................................28
ANEXOS .......................................................................................................................................37
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Composición nutricional en 100g de cubio fresco ............................................................5
Tabla 2. Concentración para pruebas in vitro ...............................................................................13
Tabla 3. Formulación para el control negativo .............................................................................13
Tabla 4. Formulación para el control positivo ..............................................................................14
Tabla 5. Formulación para el tratamiento con adición de extracto de cubio ................................14
Tabla 6. Métodos estadísticos usados y valores de referencia ......................................................16
Tabla 7. Resultados de susceptibilidad antimicrobiana in vitro ...................................................17
Tabla 8. Conteo en placa de Listeria monocytogenes en carne de hamburguesa .........................20
Tabla 9. Velocidad de crecimiento ...............................................................................................21
Tabla 10. Análisis fisicoquímico de la carne de hamburguesa .....................................................27
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Extracto de cubio ...........................................................................................................17
Figura 2. Crecimiento in vitro control (+), concentraciones 1:2 y 1:4 ..........................................18
Figura 3. Crecimiento in vitro control (-), concentraciones 1:6 y 1:8 ...........................................18
Figura 4. Curva de crecimiento vs tiempo, 5 días .........................................................................20
LISTA DE ANEXOS
Anexo A. Diagrama de proceso elaboración del extracto de cubio. ............................................ 37
Anexo B. Diagrama de proceso activación de cepa de Listeria monocytogenes ATCC 19115. . 38
Anexo C. Diagrama de proceso pruebas in vitro. ........................................................................ 39
Anexo D. Diagrama de proceso elaboración de hamburguesas de carne. ................................... 40
Anexo E. Diagrama de proceso muestreo de hamburguesas. ...................................................... 41
ABREVIATURAS
GSL: Glucosinolatos
ITC´s : Isotiocianatos
CMI: Concentración mínima inhibitoria
µ: Velocidad de crecimiento
µmol/g: Micromoles por gramos
mg/ml: Microgramos por mililitro
mg/g: Microgramos por gramo
ppm: Partes por millon
1
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y el Centro Europeo para la Prevención
y el Control de Enfermedades (ECDC) reportaron para 32 países europeos un total de 43.183
casos humanos de enfermedades trasmitidas por alimentos en el año 2013, mostrando un
crecimiento de un 8,6% entre 2012 y 2013 solo para los casos de listeriosis que han ido en
aumento en los últimos cinco años (Chavarrías, 2015). En Estados Unidos, se considera a la
L.monocytogenes como el factor etiológico responsable de aproximadamente, 2.500 casos y 500
muertes al año, siendo una bacteria de difícil control por su gran habilidad para sobrevivir y
crecer bajo condiciones adversas, incluso en refrigeración (Medrano et al., 2006).
En Colombia en el año 2012 se notificaron 11.836 casos de enfermedades transmitidas por
alimentos, de los cuales el 51% de los casos se encuentran asociados a la identificación de algún
agente etiológico, dentro de los que se encuentran Listeria monocytogenes como bacteria
emergente (Muriel, 2008). Los reportes sobre enfermedades transmitidas por alimentos en
Colombia permiten evidenciar que, entre los alimentos procesados, los productos cárnicos y los
productos lácteos son los de mayor consumo en el país y los que frecuentemente están
relacionados como fuente de contaminación con Listeria monocytogenes (Campo et al., 2007).
En el caso de los cárnicos se han empleado diferentes agentes químicos como es el caso de los
nitratos y nitritos, los hidrocarburos aromáticos policíclicos y las aminas heterocíclicas, capaces
de inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos. Las carnes procesadas como la tocineta,
las salchichas, los salamis y jamones, y cualquier carne que haya sido ahumada, curada o se le
haya agregado los compuestos mencionados anteriormente, fueron clasificadas en el grupo 1 de
cancerigenos para los seres humanos, determinando que, aproximadamente 50 gramos de carne
procesada consumida diariamente aumenta en un 18% la posibilidad de que aparezca un tumor
maligno (OMS, 2015). Debido a estos hallazgos se han empezado a estudiar bioconservantes con
el fin de disminuir o sustituir completamente los conservantes usados actualmente, un ejemplo de
esto es el uso de extracto naturales con compuesto activos que han demostrado ser eficaces para
una gran variedad de bacterias de interés alimentario, como el extracto de semillas de mostaza
oriental, el cual se incorporó a muestras de pollo cocinado para el control de L.monocytogenes,
extracto que recibe su efecto antimicrobiano por el contenido de glucosinolatos (Olaimat et al.,
2016), compuestos presentes en las especies Cruciferae, Brassicaceae y en por lo menos 500
especies no crucíferas, entre las que se encuentra el cubio (Tropaelum tuberosum) (Cortez,
2011).
El cubio, es un tubérculo nativo que al ser una especie rustica puede crecer a temperaturas bajas
y suelos pobres, sin necesidad de fertilizantes ya que es resistente a insectos plagas (Capparelli et
al., 2012), lo que lo hace un cultivo de alto rendimiento a bajo costo. Investigaciones han
demostrado que este tubérculo posee compuestos químicos que le permitiría ser utilizado como
bactericida, insecticida y repelente de insectos (Manrique, 2013).
2
Con los datos teóricos recopilados surge el siguiente interrogante, ¿El extracto de cubio
(Tropaeolum tuberosum) puede tener efecto antimicrobiano frente a Listeria monocytogenes in
vitro y al ser aplicado en una matriz alimentaria?, para solucionar dicho interrogante el presente
trabajo evaluó la actividad antimicrobiana del extracto de cubio (Tropaeolum tuberosum) frente a
Listeria monocytogenes, por medio de un estudio en condiciones in vitro y en carne de
hamburguesa refrigerada. Adicionalmente se buscó la reducción del contenido de nitritos usados
en un derivado cárnico, reemplazando una parte de ellos por el extracto. Finalmente se
caracterizó el producto a través de pruebas fisicoquímicas de proteína, humedad y grasa.
3
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la capacidad antimicrobiana del extracto del tubérculo Tropaeolum tuberosum (Cubio o
Mashua) sobre Listeria monocytogenes in vitro y aplicado a un producto cárnico (carne de
hamburguesa).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar el potencial antimicrobiano del extracto de cubio in vitro sobre Listeria
monocytogenes a través de concentración mínima inhibitoria.
Evaluar el efecto de la adición del extracto de cubio sobre el crecimiento de Listeria
monocytogenes en carne de hamburguesa con reducción de nitritos.
4
1. MARCO REFERENCIAL
1.1 MARCO TEORICO
1.1.1 El cubio (Tropaeolum tuberosum).
El cubio o mashua, es un tubérculo originario de los andes, cultivado en Perú, Bolivia, Ecuador,
Venezuela y Colombia, su cultivo se extendió por migraciones del hombre precolombino hasta
Colombia, el norte de Argentina y Chile, aunque en la actualidad se conoce que ha sido
introducida con éxito en Nueva Zelanda (FAO, 2010). Este tubérculo es miembro de la familia
Tropaeolaceae y sus nombres comunes son isañu (Bolivia), cubio (Colombia), añu o mashua
(Ortega et al., 2006). Los cubios pertenecen a un grupo de productos denominados por la FAO
como marginados ya que no son cultivos tecnificados y además carecen de comercialización, sin
embargo, aún son sembrados por comunidades indígenas y campesinas (Clavijo, 2014).
Esta planta está adaptada a alturas entre 2500 y 4000 m.s.n.m; crece en suelos pobres,
temperaturas extremas y vientos fuertes, teniendo un alto rendimiento de hasta 70 toneladas por
hectárea (Chirinos et al., 2007). En Colombia los principales cultivos de cubio están localizados
en Nariño, Boyacá, Cundinamarca y Cauca (Clavijo, 2014). Se le cosecha entre 6 y 8 meses y los
tubérculos se pueden almacenar hasta seis meses en lugares fríos y ventilados, se conoce que en
Colombia se producen anualmente cerca de 75 toneladas por año (Rivera, 2010).
El cubio es una planta anual, de follaje compacto y flores con cinco sépalos rojos y cinco pétalos
amarillos. Cuando alcanza una altura de entre 20 y 80 cm, produce tubérculos de variados
colores los cuales contiene isotiocinatos (ITC’s) una sustancia que le confieren sabores amargos
y picantes parecido al sabor del rábano o la mostaza. Esta característica ha hecho que se le
consuma únicamente luego de cocinarla (Espin, 2013). El Tropaeolum tuberosum tiene algunos
usos medicinales, en la región andina se usa para tratar enfermedades del hígado, riñones y piel,
así como para tratar la amigdalitis (Flores et al., 2003).
1.1.2 Características del cubio
La color de la piel de los tubérculos varía desde blanca (siendo una de las variedades mas raras)
hasta el violeta-purpura muy oscuro, pasando por el amarillo (variedad difundida en paises como
Ecuador y Perù), naranja, rojo y rosado. La variedad blanca se encuentra comúnmente en
Colombia. Estas formas colombianas son inconfundibles, no solo por su color blanco con el
extremo distal pigmentado difusamente de lila o violeta, sino también por ser delgados y estar
provistos en los ojos de raicillas filamentosas, estos caracteres no aparecen en el material de
ninguna otra región de los Andes (Rivera, 2010).
5
Este tuberculo tiene caracteristicas nutriciones importantes, como contener todos los
aminoácidos esenciales (excepto histidina) y ser considerado como un cultivo altamente nutritivo
por su contenido de proteinas, minerales, vitaminas y fibra (Fandiño et al.,1987), como se puede
observar en la tabla 1, donde se determinó la composición por cada 100 gramos de cubio fresco.
Tabla 1. Composicion nutricional en 100 g de cubio fresco
COMPONENTE VALOR
Energía 52 kcal
Agua 87.4 g
Proteína 1.5 g
Grasa 0.7 g
Fibra 0.9 g
Calcio 12 mg
Hierro 1.0 mg
Vitamina A 12 mg
Vitamina C 77 mg
Fuente: FAO (2010).
Por su alto contenido en carbohidratos, la mashua tiene un importante valor calórico y es rica en
vitamina C, el cual contribuye al mantenimiento de los cartílagos, además ayuda a la absorción
del hierro que previene la anemia y genera resistencia contra las infecciones. Presenta un alto
contenido de fibra, por ende estimula a los músculos intestinales. También están presentes la
vitamina A y minerales como el fósforo y el calcio (Ministerio de cultura y patrimonio Ecuador ,
2013).
1.1.3 Efecto antimicrobiano del cubio
Los cubios (Tropaeolum tuberosum) contienen glucosinolatos (GSL), compuestos de azufre que
pueden controlar el crecimiento de microorganismos por tener efecto antimicrobiano. La
concentración de este compuesto se encuentra entre 0.27 - 50.74 µmol/g según la variedad
(Ortega et al., 2006). Para la variedad blanca-morada se ha establecido una concentración de
8.90 µmol/g (Cortez, 2011). Sin embargo, los GLS en grandes cantidades puede tener efectos
perjudiciales sobre el sistema nervioso, por lo que la dosis diaria admisible se encuentra entre 24
y 1200 mg /persona /día (Hernández et al., 1995).
Los glucosinolatos son hidrolizados por la enzima mirosinasa liberando isotiocianatos (ITC´s),
una sustancia que causa un efecto biocida, siendo usados en la industria agroindustrial en
fumigaciones de amplio espectro (Matthiessen et al., 2006). Los isotiocianatos han sido muy
exitosos en la reducción de hongos patógenos de suelo, nematodos, insectos y también se ha
evaluado su efecto en el mejoramiento del rendimiento de los cultivos (McGuire, 2004).
6
El mecanismo por el cual los ITC’s inhiben el crecimiento de microorganismos, aún no se
conoce bien. Algunas hipótesis proponen que los ITC’s actúan por 3 mecanismos: el primero es
por inactivación de las enzimas intracelulares por medio de la degradación oxidativa de los
puentes disulfuro, el segundo es desacoplando la fosforilación oxidativa y el tercer mecanismo
consiste en la inhibición de las enzimas metabólicas por la acción del radical tiocianato.
Al parecer, la alta reactividad de los ITC’s se debe principalmente a la fuerte naturaleza
electrofílica del grupo funcional Isotiocianato (-NCS) (Kroll et al., 1994). Experimentos in vitro
demostraron que el alil-isotiocianato puede formar enlaces covalentes con el grupo de azufre
reactivo, así como con los grupos amino y sulfhidrilo libres de los aminoácidos lo cual sugiere
que los ITC’s pueden reaccionar químicamente con las proteínas a través de los grupos aminos y
los grupos sulfhidrilos libres que están presentes en los grupos laterales de los residuos de
aminoácidos, tales como la lisina, la arginina y la cisteína (Cejpek et al.,2000).
1.1.4 Seguridad alimentaria
El incremento de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’S) en los últimos años, ha
aumentado la preocupación sobre la seguridad alimentaria entre las autoridades, el sector
productivo y los consumidores. Las nuevas formas de cocinar, con periodos de cocción cortos,
así como la tendencia a consumir alimentos crudos y congelados, contribuyen al aumento del
riesgo alimentario. Por esto es necesario introducir la tecnología adecuada y diseñar el proceso
de fabricación de los alimentos de manera tal, que los riesgos de toxiinfección alimentaria se
reduzcan a un nivel aceptable, asegurando la calidad microbiológica de los alimentos y su
inocuidad para el consumo humano (Muntal, 2007).
En Colombia la vigilancia de ETA’S empieza en el año 2000 con la notificación de 2983 casos,
en los años posteriores las notificaciones aumentaron hasta llegar a 11836 casos en el año 2012
(De la hoz et al., 2014). Los agentes etiológicos detectados en muestras biológicas, de alimentos
o restos de alimentos fueron Staphylococcus aureus coagulasa positivo, Salmonella spp,
Escherichia coli, Listeria monocytogenes y Hepatitis A (De la hoz et al.,2014). Estos
microorganismos probablemente logran vehiculizarse a través de alimentos y agua, los cuales al
ser consumidos pueden producir enfermedades de interés en la salud pública (CNE, 2005).
La listeriosis es una enfermedad infecciosa veterinaria bien documentada, históricamente se
pensó que ocurría rara vez en humanos y principalmente como resultado del contacto con
animales enfermos, de hecho, la comida ha sido reconocida como un modo primario de
transmisión para las enfermedades humanas solo en los últimos 25 años (Norton et al., 2007).
En Estados Unidos durante 1987, L.monocytogenes comenzó ser un problema en la carne
procesada y productos de aves de corral. En 1990, los departamentos estatales de salud y los
centros de control y prevención de enfermedades (CDC) investigaron un brote de enfermedades
7
transmitidas por alimentos en los que estaban implicados la salchichas usadas en la preparación
de perros calientes, encontrando cepas de L.monocytogenes en un paquete abierto y uno cerrado
provenientes de una sola planta, reportando 101 brotes por el consumo de dicho producto con 15
adultos muertos y 6 abortos espontáneos (Farber et al., 2007).
La presencia de L.monocytogenes se ha reportado en varios países a nivel mundial. En Australia
se encontró el género Listeria, en 50 muestras donde el 34% correspondió a carne fresca, 40% a
cordero y 30% a cerdo, para L.monocytogenes se halló 24% ,40% y 10% en carne fresca,
cordero y cerdo, respectivamente (Lahti et al., 2001). En Malasia L.monocytogenes se encontró
en el 50% de 12 muestras de carne de vacuno y en Japón se encontró una alta incidencia de
Listeria spp en carne fresca y cerdo con una tasa de incidencia de 40 y 61% y para
L.monocytogenes de 13 y 39% respectivamente (Rho et al., 2001).
1.1.5 Productos cárnicos
La carne es un ingrediente de gran importancia en la alimentación humana, debido
fundamentalmente a su contenido en proteínas de alto valor biológico, la cual se encuentra entre
16 y 23% por cada 100g de carne, sin embargo, es uno de los alimentos más perecederos debido
a su alto contenido en agua, composición y pH, lo que favorece la alteración y contaminación
microbiana, pudiendo constituir un riesgo para la salud (Carballo, 2001). Las alteraciones más
frecuentes en la carne son: enranciamiento, enmohecimiento, putrefacción y coloraciones
anormales (Garcia, 2014).
Los productos cárnicos procesados son aquellos elaborados a base de carne, grasa, vísceras u
otros subproductos de origen animal comestible, proveniente de animales de abastos, con adición
o no de sustancias permitidas o especias o ambas, sometido a procesos tecnológicos adecuados.
Las clasificaciones de los productos cárnicos son diversas y se basa en criterios tales como los
tipos de materias primas que los componen, la estructura de su masa, si están o no embutidos, si
se sometieron o no a la acción de calor o algún otro proceso característico en su tecnología de
elaboración, la forma del producto terminado, su durabilidad o cualquier otro criterio o nombres
derivados de usos y costumbres tradicionales, según la anterior definición, la hamburguesa es un
producto cárnico procesado, sometido o no a tratamiento térmico, elaborado con base en carne de
animales de abasto y la adición de sustancias de uso permitido, que es moldeado en formas
cuadradas o circulares (NTC 1325, 2008).
1.1.6 Microbiología de los derivados cárnicos
La carne (principalmente la cruda) además de ser altamente susceptible a deterioro, también
puede constituir un vehículo para la propagación de enfermedades transmitidas por alimentos
(ETA’s) (Datta et al., 2012). Los microorganismos patógenos que históricamente se han
8
asociado a brotes por el consumo de carne, incluyen Salmonella spp., E. coli O157:H7
productoras de toxina shiga (STEC), Listeria spp., Campylobacter spp., Clostridium perfringens
y Yersinia spp. (Koohmaraie et al., 2005). Se ha establecido que para algunos microorganismos
tales como L.monocytogenes, S.aureus y Clostridium spp, las principales medidas para lograr su
control se enfocan en intervenciones durante las últimas etapas de la producción de la carne
(Norrung et al., 2009).
La carne de hamburguesa, es clasificada como un producto picado (no embutido) y según los
métodos de procesado como producto cárnico fresco. Este alimento es, desde el punto de vista
microbiológico, más susceptible que los productos cárnicos enteros y embutidos, debido a que el
área superficial expuesta al entorno es mayor, facilitando la penetración y disponibilidad de
oxígeno a los microorganismos, por lo que se deben implementar buenas prácticas de
manufactura durante las operaciones de procesado, molido y adición de condimentos, ya que la
alteración del producto final dependerá de la calidad microbiológica de la materia prima, de la
flora microbiana intrínseca del animal vivo y de las condiciones sanitarias de la planta de
procesamiento (Jay et al., 2005).
Durante el almacenamiento de la carne de hamburguesa se deben controlar el tiempo y la
temperatura ya que diversos factores hacen de ésta un sustrato para el crecimiento de
microorganismos patógenos (Fernández et al., 2006).
Factores intrínsecos como la actividad acuosa de la carne, que por lo general se encuentra cerca
de 0.99, el pH de la carne de bovino, que varía entre 5.1 y 6.2 (valores cercanos a la neutralidad),
y su alta cantidad de nutrientes hacen que sean condiciones ideales para el crecimiento de
microorganismos como bacterias, levaduras, y mohos (Amerling, 2001). Por otro lado, aunque
las potencias de óxido reducción son bajas en la mayoría de las carnes, estas tienden a ser más
elevadas en las superficies, de modo que los organismos aerobios estrictos y los anaerobios
facultativos, así como los anaerobios estrictos encuentra condiciones apropiadas para su
crecimiento (Jay et al., 2005).
Existen también factores extrínsecos que influyen en la población microbiana tales como:
procesos tecnológicos aplicados para la elaboración de los diferentes productos cárnicos, empleo
de tratamientos térmicos, tipo y tecnología de empaque (empaque al vacío, atmósfera controlada
o modificada), además de las condiciones de almacenamiento (refrigeración o congelación) y
distribución del producto. Los factores implícitos son la ecología microbiana en la matriz
alimentaria, la cual depende en gran medida de la especie animal utilizada como materia prima
(carne de bovino, porcino, caprino y ovino); y el tipo de producto elaborado, como es el caso de
productos cárnicos fermentados en donde se incorporan bacterias ácidas lácticas para obtener las
características organolépticas deseadas en el producto final, ya que las bacterias incorporadas
establecen relaciones de competencia, antagonismo o coexistencia con los microorganismos que
ocupan naturalmente el alimento (Zaroide et al.,2004).
9
1.1.7 Los nitritos
La conservación de la carne, así como de casi todos los alimentos perecederos, se basa en la
teoria de obstaculos (Carballo, 2001), el cual combinan diferentes metodos de consevación. Uno
de ellos es el uso de nitritos y nitratos, cuya función es la conservación de los productos cárnicos,
por su poder bactericida y bacteriostático, además de evitar el enranciamiento durante el
almacenamiento y el crecimiento del Clostridum botulinum (Maya, 2010 ). El nitrito de sodio se
usa no solo como conservante, sino también como antioxidante, agente reductor o nitrosilante,
este es convertido en diferentes compuestos como ácido nitroso, oxido nitrico y nitrato (Honikel,
2008). Los nitritos en exceso son sales toxicas para los seres humanos, por esta razón las
cantidades en los alimentos han sido limitadas a través de las legislaciones sobre aditivos en la
mayoría de países. En los años 70 y 80 se encontró que los nitritos estan implicados bajo
determinadas condiciones en la formacion de nitrosaminas carcinogenicas (Ranken, 2013). La
formación endógena de N-nitrosocompuestos comienza cuando los nitratos son reducidos a
nitritos por los microorganismos de la cavidad bucal y estos nitritos se transforman después en
óxido nítrico en el estómago debido a las condiciones allí existentes, bajo circunstancias
específicas, como la gastritis crónica, los nitritos pueden oxidarse a agentes nitrosantes y
reaccionar para formar N-nitrosocompuestos. Esta reacción se produce con precursores
nitrosables, que incluyen una gran variedad de componentes de la dieta tales como: aminas
secundarias (pescados, huevos, quesos, carnes), precursores naturales en los alimentos (como
ciertos aminoácidos), los alcaloides presentes en especias que se emplean para curar carnes
(pimienta negra), y otros precursores que aparecen en los alimentos como contaminantes
(plaguicidas, aditivos o medicamentos) (Antón et al.,2008).
1.2 REVISIÓN DEL ESTADO DEL ARTE
1.2.1 Extractos naturales como agentes antimicrobianos
Los ITC’s se encuentran en alimentos de la familia de las Brasicaceas o crucíferas (brócoli,
coliflor, hojas y aceites de mostaza), Cucurbitaceae, Caracaceae y Tropaeolaceae (Palencia, 2010),
este compuesto ha mostrado ser una alternativa en el control de bacterias de interés alimentario
como lo es L. monocytogenes debido a su poder antimicrobiano.
En la investigación realizada por Bani (2011) se evaluó el potencial antimicrobiano de residuos
agroindustriales que contienen ITC’s sobre L. monocytogenes, obteniendo como resultado que el
extracto acuoso de tallos de brócoli, cascaras de calabaza y extracto clorofórmico de semillas de
papaya fueron eficaces a una CMI de 102,4 mg/ml, > 102,4 mg/ml y 6,4 mg/ml respectivamente
frente a L.monocytogenes.
10
El extracto de coliflor, el cual posee un contenido de GLS entre 0,61 – 1,14 mg/g, demostró ser
eficaz en la reducción de 2.25 Log ufc/ml en el crecimiento de L.monocytogenes con respecto al
control después de 20 días de exposición a una concentración de 15% y un temperatura de
incubación de 5ºC (Sanz et al., 2015). Otro ejemplo de la acción antimicrobiana de los ITC’s
presentes la coliflor es el estudio realizado por Brandi et al. (2006) en donde al usar una
concentración del 20% se alcanzó una disminución de 1 Log ufc/ml con respecto al control a
partir de la hora 2 y 3, hasta alcanzar una reducción de 2,5 Log ufc/ml hasta la hora 5 de
muestreo.
Además de estudiar el efecto antimicrobiano a nivel in vitro, se requiere comprobar su acción en
matrices alimentarias por lo cual se ha estudiado el efecto antimicrobiano de películas de
copolimero de polivinil polietilenglicol (PPG) con adición de mostaza oriental y amarilla en
salchicha Bologna. La salchicha se encontraba inoculada con Listeria monocytogenes a una
concentración de 4 Log ufc/g y las películas contenían 3, 5 y 6% (p/p) de extracto de mostaza,
encontrando que el patógeno fue indetectable en la salchichas envasadas con el extracto de
mostaza oriental a 52 días de almacenamiento y permaneció indetectable hasta los 70 días, por
otro lado la película con extracto de mostaza amarilla tuvo un efecto bacteriostático manteniendo
entre 1 y 3 Log ufc/g por debajo de los controles durante todo el ensayo (Lara- Lledó et al.,
2012). Asimismo el extracto de mostaza oriental se ha estudiado para inhibir L.monocytogenes a
concentraciones de 100 a 200 mg/g, incorporándolo como recubrimiento en pollo cocido,
obteniendo que el recubrimiento de mostaza y ácido acético disminuyo 4,1 a 4,6 Log ufc/g y 4,8
a 5,5 Log ufc/g para el recubrimiento que contenía mostaza y ácido málico a comparación del
control (Olaimat et al., 2015).
1.2.2 Extractos de cubio con efecto antimicrobiano
Los isotiocionatos son compuestos presentes en el cubio los cuales le proporcionan
características especiales tales como un posible poder antimicrobiano, de esto se derivan
investigaciones en las que se evaluaron diez isotiocionatos: el sulforafano, iberin, alilo, bencilo,
metil, fenil, feniletilo-, propil-, 3-methylthiophenyl-, y 3-metiltio-propilo ITC’s, se pusieron a
prueba contra una gama de bacterias de descomposición y patógenas en los alimentos, el
crecimiento de las bacterias se monitorizó por turbidimetría en un caldo de cultivo con reducción
de la tasa máxima de crecimiento y la reducción de tamaño de la población, como resultado se
obtuvo que entre las bacterias inhibidas se encontraron especies de Bacillus, Escherichia,
Klebsiella, Listeria, Salmonella spp., Serratia y Staphylococcus. Los valores más altos de
inhibición se obtuvieron en bencilo, y feniletilo (Adjelé et al., 20012).
Se ha evaluado la actividad antimicrobiana y la caracterización física de extractos de plantas
medicinales de tradición en el Ecuador (Daglia et al.,2013), encontrando que a partir de extractos
ácidos de cubio con hidrometanol y ácido formico al 50% y 90% se inhibió el crecimiento de
S.aureus; donde la CMI fue 500mg/ml, mientras que no se encontró inhibición sobre
Escherichia coli.
11
1.3 MARCO LEGAL
International Standarization Organization (ISO) 11290: por la que se establece el
método horizontal para la detección de recuento de Listeria monocytogenes para
alimentos de consumo humano y para animales.
Norma Técnica Colombiana (NTC) 1325: esta norma establece los requisitos que
deben cumplir los productos cárnicos procesados no enlatados, la presente norma no se
aplica a productos a base de pescado, mariscos o crustáceos crudos y análogos cárnicos.
Resolución 2674 de 2013 expedida por el Ministerio de Salud: dicha resolución tiene
por objeto establecer los requisitos sanitarios que deben cumplir las personas naturales
y/o jurídicas que ejercen actividades de fabricación, procesamiento, preparación, envase,
almacenamiento, transporte, distribución y comercialización de alimentos y materias
primas de alimentos.
Norma Técnica Colombiana (NTC) 1353: esta norma establece las sustancias que
pueden emplearse en la industria de alimentos para conservar sus productos y las
cantidades máximas que pueden utilizarse para ello, esta norma no aplica a las sustancias
antioxidantes.
International Standarization Organization (ISO) 9167 de 1992: establece un método
especificado el cual se basa en la extracción mediante metanol, purificación,
desulfuración enzimática y la posterior determinación, usando la cromatografía de fase
inversa. Para la presente investigación se utilizará solamente la metodología para la
extracción por metanol.
International Standarization Organization (ISO) 1443 de 1973: establece el método
oficial para la determinación del contenido total de grada en carne y productos cárnicos.
International Standarization Organization (ISO) 1442 de 1997: establece el método
oficial para la determinación del contenido de humedad en carne y productos cárnicos.
International Standarization Organization (ISO) 11261 de 1995: establece el método
oficial para la determinación del contenido nitrógeno total por el método de Kjendahl en
carne y productos cárnicos.
12
2. METODOLOGÍA
2.1 ELABORACIÓN DEL EXTRACTO DE CUBIO
Se lavaron y desinfectaron 3 kg de cubio, usando abundante agua para el proceso de lavado y
etanol al 70 % e hipoclorito de sodio a 150 ppm para la desinfección. Luego se adecuaron los
tubérculos desechando los estalones de los mismos y cortando en trozos el resto del tubérculo
para llevar a un proceso de despulpado, una vez obtenido la pulpa del cubio se disponen en
bandejas cuidando de que la cantidad dispuesta en cada una de ellas no sea superior a 1 cm de
grosor para posteriormente llevar a ultra congelación hasta que la muestra alcance -70°C, una
vez alcanza la temperatura adecuada se introdujo las muestras al liofilizador el cual debe estar a
-56°C y alcanzar una presión de 0,280 mbar durante 24 horas (Chabur, 2012).
Se pesaron 5g de cubio liofilizado en un tubo para centrifuga y se adicionaron 50 ml de etanol al
70% en ebullición, se mantuvieron los tubos en un serológico a 70°C durante 5 min, posterior a
esto se centrifugó a 3000 rpm por 10 min se reservaron los sobrenadantes en un recipiente de
vidrio con tapa y sobre el sólido se repitió el proceso para luego mezclar los sobrenadantes
obtenidos. Estos se llevaron a rotaevaporar a 50°C, 200 mbar y 20 rpm hasta evaporar el
solvente, para completar el proceso se llevó a estufa a 40°C por 24 horas y se almacenó a -20°C
hasta su uso (ver anexo A) (Cortez, 2011).
2.2 DETERMINACIÓN DE LA MÍNIMA CONCENTRACIÓN INHIBITORIA (CMI)
Se activó la cepa de Listeria monocytogenes ATCC 19115 adicionando la ampolla con la
bacteria crioconservada la cual venia a una concentración de ufc /g en 9 ml de caldo
nutritivo, el cual se llevó a incubación a 37°C x 24 h, luego se tomó una muestra del caldo con
ayuda de un asa metálica estéril y se sembró en agar PALCAM para posteriormente incubar a
37°C x 24 h una vez obtenido el crecimiento de la bacteria se tomaron 3 a 4 colonias bien
definidas que se adicionaron a 4 0 5 ml de agua estéril, a esta dilución se le midió la
absorbancia, la cual debía estar en 0,25 a una longitud de onda de 540nm correspondiente a una
concentración de 0.5 ( ufc /ml) en el patrón de Mc Farland (ver Anexo B) (Molina et al.,
2009).
Se prepararon diferentes concentraciones del extracto usando como solvente etanol/agua (75/25)
según la tabla 2, la cual se calculó para preparar 10 ml de cada concentración.
13
Tabla 2. Concentraciones para pruebas in vitro
CONCENTRACIONES EXTRACTO (g) SOLVENTE (ml)
1:2 3.3 6.7
1:4 2 8
1:6 1.4 8.6
1:8 1.1 8.9
En cajas de petri estériles se adicionó una parte de cada concentración en nueve partes de agar
Mueller- Hilton y se homogenizo hasta que el agar se solidifico, dejando una caja sin extracto
como control negativo y para el control positivo se preparó una solución de estreptomicina en
agua esteril a una concentración de 2000 µg/ml (Picazo, 2000), una vez solidificados los agares
se sembró en superficie con ayuda de un hisopo estéril la cepa de Listeria monocytogenes a una
concentración de ufc /ml previamente activada y llevada a la concentración requerida
(Malbran, 2012), finalmente se incubó a 37°C x 24 h (si después de la incubación por 24h no se
desarrollo de colonias es leve o no se observa se realizo una incubación adicional de 18 a 24h)
(ISO 11290, 1998) (ver Anexo C).
2.3 PROCEDIMIENTO PARA PRUEBAS EN MATRIZ ALIMENTARIA
2.3.1 Elaboración muestras de carne de hamburguesa
Para la elaboración de la carne de hamburguesa se adquirió carne de res, cerdo y grasa dorsal de
cerdo en un mercado local, una vez eliminado los cartílagos, huesos y grasa no deseada, la carne
se cortó en trozos y se llevó a molienda usando un disco de 10 mm para luego llevar a mezclado
aplicando la formulación correspondiente para cada tratamiento como se puede observar en las
tablas 3, 4 y 5, luego se porcionó la carne de cada tratamiento en muestras de 25g las cuales se
almacenaron a 4°C en cajas de petri estériles (ver Anexo D).
Tabla 3. Formulación para control negativo
Materia Prima Porcentaje (%)
Res 48
Cerdo 20
Grasa 12
Agua 15
Harina de trigo 4
Sal común 1
Nitrito de sodio 0
Extracto de cubio 0
14
Tabla 4. Formulación para control positivo
Materia Prima Porcentaje (%)
Res 48
Cerdo 20
Grasa 12
Agua 15
Harina de trigo 4
Sal común 1
Nitrito de sodio 0,02
Extracto de cubio 0
Tabla 5. Formulación para tratamiento con adición de extracto de cubio
Materia Prima Porcentaje (%)
Res 48
Cerdo 20
Grasa 12
Agua 15
Harina de trigo 4
Sal común 1
Nitrito de sodio 0,01
Extracto de cubio 10
2.3.2 Inoculación y recuento de Listeria monocytogenes en producto cárnico
Se inoculó la cepa de Listeria monocytogenes la cual se encontraba a una concentración de
ufc/ml, aplicando alícuotas de 100µl hasta completar 1 ml del patógeno por cada 10g de
producto sobre diferentes puntos de la muestra (Carrascal et al., 2010), una vez inoculada la
bacteria se almacenaron las muestras a 4°C para realizar un muestreo en las horas 0, 6, 12, 24 y 5
días.
Para el muestreo se tomaron 10g de muestra en 90 ml de agua peptonada (dilución ) para
luego realizar una dilución de tomando 1 ml de la dilución anterior en 9 ml de agua
peptonada, se sembró 0.1 ml de las diluciones en agar PALCAM al cual se le había adiciona un
vial de suplemento selectivo para cada 500 ml de agar fundido, realizando siembras por
duplicado e incubando a 37°C x 24 h (si después de la incubación por 24h no se desarrollo de
colonias es leve o no se observa se realizo una incubación adicional de 18 a 24h), transcurrido el
tiempo de incubación se realizó el recuento de colonias con base en la metodología descrita en la
ISO 11290 (ver Anexo E).
15
Con los datos del recuento reportados en ufc/g se calculó la velocidad de crecimiento (µ), por
medio de una linealización, calculando el logaritmo natural (ln) de los recuentos pertenecientes a
la fase exponencial y finalmente calculando la ecuación de la recta cuya pendiente corresponde a
la velocidad de crecimiento para cada tratamiento evaluado (Bikandi, 2014).
2.3.3 Pruebas Fisicoquímicas
Para las pruebas fisicoquímicas se usaron los protocolos oficiales de la Association of Oficial
Analytical Chemist para determinar los contenidos de grasa por el método de Soxhlet (AOAC
976.21) el cual se fundamenta en la gravimétria, por medio de la extracción solido – liquido con
disolventes para la separación de analitos de la muestra solida (Cela et al., 2003). Para la
determinación de proteína el método Kjendahl (AOAC 981.10), por medio de la digestión de
proteínas en una mezcla de ácido sulfúrico en presencia de catalizadores, convirtiendo el
nitrógeno orgánico en sulfato de amonio que se neutralizó con una base y se destilo, este
destilado se recogió en una solución de ácido bórico y se tituló con ácido clorhídrico para
determinar el nitrógeno contenido en la muestra (Santiago, 2011), por último la humedad se
determinó por secado en estufa de aire (AOAC 950.46) y se calculó el porcentaje en agua por la
perdida en peso debido a su eliminación por calentamiento bajo condiciones normalizadas
(García et al., 2012).
2.4 DISEÑO EXPERIMENTAL Y TRATAMIENTO ESTADÍSTICO
Los resultados del ensayo in vitro fueron analizados por medio de un test Q cochran, debido a
que son resultados no paramétricos, con variables dicotómicas, en la que los datos están medidos
en escala nominal para un número de tratamientos mayor o igual a 4 (Mongay, 2005). Para llevar
a cabo el analisis, a cada puntuacion favorable o de éxito se le asigno el valor de 1 (resistente), y
a cada fracaso o caso desfavorable el valor de 0 (sensible), posterior a esto se calculó el
promedio del número de exitos por tratamiento (G) dividiendo el número de respuestas de exito
(1) sobre el número de tratamientos que para el presente caso fueron 4. Una vez obtenido los
datos anteriores se calculo el valor de Q usando la ecuación 1 (Martin et al., 2007), donde k es el
número de tratamientos, Gj número total de exitos de cada tratamiento y L el número de exitos
para cada repetición.
Ecuación 1. Fórmula para calcular el estadístico Q de Cochran
16
El valor crítico usado para el test de cochran es el chi- cuadrado, que para el presente caso fue el
valor tabulado para 3 grados de libertad y una probabilidad de 0,005. Si Q es mayor que el valor
crítico se rechaza la hipótesis nula.
Para las muestras de la matriz alimentaria con ayuda del análisis de datos de Excel, se hizo una
prueba de normalidad calculando el Estadístico F de Snedecor, el cual fue mayor a la
probabilidad (0.005) indicando homocedasticidad entre tratamientos. Una vez confirmada la
distribución normal de los resultados se aplicó ANOVA de un factor por tener más de 2
tratamientos, con esta prueba se pudo identificar si existían diferencias significativas entre
tratamientos y posteriormente se realizó una prueba de Tukey con el fin de identificar cual era el
tratamiento diferente. Los resultados de los valores de referencia usados durante el tratamiento
estadístico se encuentran en la tabla 6.
Tabla 6. Métodos estadísticos usados y valores de referencia
Resultados Característica Método estadístico Valor de referencia
in vitro Susceptibilidad Test Cochran chi- cuadrado 7,8
En matriz
Log ufc/g Anova/ Tukey Valor P 0,05
Proteína Anova/ Tukey Valor P 0,05
Grasa Anova/ Tukey Valor P 0,05
Humedad Anova/ Tukey Valor P 0,05
17
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO
Después de obtener el extracto se observó que tenía una apariencia viscosa similar a la miel y
un color morado oscuro (Figura 1), estos atributos están directamente relacionados con los
compuestos como ácidos orgánicos, azúcares, pigmentos o proteínas que se pueden extraer
usando el etanol como solvente, el cual sustituyó al metanol propuesto en la ISO 9167 de
1992 por cuestiones de disponibilidad y costos. Al modificar el tipo de solvente, el extracto
final puede tener mayor cantidad de impurezas, lo que puede alterar la viscosidad y
apariencia final del extracto, como el caso del color obtenido el cual se atribuye al contenido
de antocianinas presentes en el cubio (3mg/g) tal y como lo demostró Chirinos et al. (2007)
en donde se encontró que el uso de etanol también puede extraer antocianinas.
Figura 1. Extracto de cubio
3.2 PRUEBAS in vitro
Para los resultados de las pruebas in vitro se pudo demostrar que el extracto de cubio en
concentración 1:2 y 1:4 (333 mg/ml y 200 mg/ml) inhibió el crecimiento de Listeria
monocytogenes (figura 2), mientras que las concentraciones 1:6 y 1:8 permitieron el
crecimiento de la bacteria (figura 3). Para confirmar las diferencias significativas entre los
tratamientos, con base en la investigación de Krauss et al. (2000) se empleó el test de
Cochran (gl=3 y P=0.05), obteniendo diferencias significativas entre tratamientos como se
observa en la tabla 7.
Tabla 7. Resultados de susceptibilidad antimicrobiana in vitro
Concentraciones Resultados
1:2 Sensible
1:4 Sensible
1:6 Resistente
1:8 Resistente
18
Control (-) Resistente
Control (+) Sensible
Nota: Prueba de Cochran para datos binarios, Q =18,75 y =7, 81.
Figura 2. Crecimiento de Listeria monocytogenes en agar Mueller- Hinton, a) control positivo,
b) concentración 1:2, c) concentración 1:4
Figura 3. Crecimiento de Listeria monocytogenes en agar Mueller- Hinton, a) control negativo,
b) concentración 1:6, c) concentración 1:8
Los ITC’s son compuestos con actividad antimicrobiana que se encuentra en las familias
Brassicaceae o crucíferas, Cucurbitaceae, Caracaceae y Tropaeolaceae, en algunos estudios
se ha demostrado la actividad antimicrobiana de estos compuestos a partir de extractos de
alimentos que los contienen, como Bani (2011) quien estudio el potencial antimicrobiano de
residuos agroindustriales entre los que se encontraban tallos de brócoli (Brassica oleracea
var. Itálica), cascaras de calabaza (Cucurbita máxima) y semillas de papaya (Carica papaya)
sobre Listeria monocytogenes, encontrando que el extracto acuoso de tallos de brócoli y
cascaras de calabaza fueron eficaces a una CMI de 102,4mg/ml y >102,4 mg/ml,
respectivamente y el extracto clorofórmico de semillas de papaya a 6,4 mg/ml tuvo efecto
antimicrobiano para L.monocytogenes, sin embargo, la CMI varía según el origen del
a) b) c)
19
extracto, ya que los ITC’s dependerán del contenido inicial de GSL que para el brócoli es de
6.11 mg/g, para la calabaza 0.26- 1.56 mg/g (Rincón, 2014) y para semillas de papaya de 3- 5
mg/g (Arrázola et al., 2013) a comparación de un contenido de GSL en el cubio que es de
0.002-0.003 mg/g (Cortez, 2011) siendo esta la razón por la que en la presente investigacion
se obtuvo una MCI de 200 mg/ml para un extracto a partir de cubio.
Otros estudios como el de Brandi et al. (2006), mostraron que el extracto de coliflor
(Brassica oleracea var. Botrytis) disminuyó el crecimiento de L. monocytogenes, a una
concentración de 10 y 20%, observando una disminución de 1 Log ufc/ml y de 2 Log ufc/g
respectivamente con respecto al control después de 5h de tratamiento, el efecto
antibacteriano parece ocurrir por vía bactericida ya que la reducción en las células viables
con respecto a la población inicial fue mayor a 1 Log ufc/ml, resultados similares a los
encontrados por Sanz et al. (2015), al evaluar el efecto frente a L.monocytogenes de un
extracto obtenido a partir de coliflor (Brassica oleracea var. Botrytis) a concentraciones de 0
- 15% y temperaturas de incubación de 5 – 22°C, obteniendo una reducción de 2.25 Log
ufc/g en la concentración final de la bacteria, al ser expuesta a una concentración de 15% y
5ºC después de 20 días de ensayo. Estos resultados están directamente relacionados con los
mecanismos de acción de los ITC’s los cuales inducen al estrés oxidativo inactivando
enzimas metabólicas y desacoplando la fosforilación oxidativa, lo cual causa la acción
bactericida de los extractos frente a la bacteria.
Rhee et al. (2003), investigaron los efectos individuales y combinados de harina de mostaza
(0, 10 o 20%) y acido acético (0, 0.5 o 1%) en la inactivación de tres bacterias de importancia
en alimentos, entre las que se encontraba L.monocytogenes, observando que la combinación
de 20% de mostaza y 0,5% de acido acético redujo la bacteria más rápidamente que el
tratamiento con 10% de mostaza y 0,5% acido acético después de 5 días, mientras que los
tratamientos con harina de mostaza sin adición de acido acético no mostraron inhibición en el
crecimiento de L.monocytogenes, lo cual se puede atribuir a que la bacteria no se encuentra
directamente expuesta a los GLS (22 – 52 mg/g) de la mostaza, debido a que los mismos se
encuentran inmersos entre un gran número de proteínas, carbohidratos y minerales que
interfieren en la concentración final de compuesto activo.
3.3 PRUEBAS EN MATRIZ CÁRNICA
Se encontró que los Log ufc/g en el tratamiento con adición de extracto de cubio (100 ppm de
nitrito de sodio y extracto de cubio) no obtuvo diferencias significativas (P>0.05) frente al
control positivo, lo cual indica que la acción de los nitritos en 100 ppm con el extracto de cubio
es similar a usar solo nitrito de sodio a 200 ppm, además se demostró que estos dos tratamientos
20
fueron estadísticamente diferentes al control negativo (P≤0.05) para las 120 h evaluadas, sin
embargo, el comportamiento de la curva de crecimiento es similar para los tres tratamientos
como se puede ver en la tabla 8.
Tabla 8. Conteo en placa de Listeria monocytogenes en carne de hamburguesa
Tiempo (h) Control Negativo Control Positivo
Tratamiento con extracto de
cubio
UFC/g Log UFC/g UFC/g Log UFC/g UFC/g Log UFC/g
0 ±0,09 4,911±0,0005 ±1,003 4,623±0,01 ±1,13 4,591±0,01
6 ±3,54 5,219±0,009 ±0,062 4,778±0,0004 ±1,50 4,881±0,009
12 ±0,06 5,021±0,0002 ±1,22 4,736±0,01 ±0,50 4,863±0,003
24 ±2,44 5,143±0,007 ±0,41 4,816±0,003 ±0,13 4,875±0,0007
120 ±3,26 5,288±0,007 ±0,41 5,102±0,001 ±1,91 4,966±0,009
El comportamiento de estos resultados para los 5 días de estudio se observa en la figura 4, la cual
muestra que la fase de latencia ocurrió en un tiempo corto, por lo que no se evidenció en la
gráfica, dicho comportamiento se debe principalmente a que la carne le brinda a la bacteria un
medio optimo por sus características fisicoquímicas como la actividad de agua (Aw 0.99), su pH
(5.1 y 6.2), y su alta cantidad de nutrientes (Amerling, 2001), los cuales ayudaron a que el
microorganismo se adaptará fácilmente al medio llegando rápidamente a la fase exponencial.
Figura 4. Curva de crecimiento vs tiempo, 5 días, ( ) control negativo, ( ) control positivo,
( ) Tratamiento con adición de extracto de cubio
La fase exponencial se presentó durante las primeras 6 horas de muestreo, en las que el control
negativo y el tratamiento con adición de extracto de cubio tuvieron un crecimiento de 0,3 Log
ufc/g, mientras que el control positivo obtuvo un crecimiento de 0,2 Log ufc/g, esto se puede
atribuir a que el crecimiento de Listeria monocytogenes se ve afectado por las condiciones de
refrigeración en las cuales se almacenaron las carnes a través del tiempo, lo que impidió que el
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
0 20 40 60 80 100 120
Log
ufc
/g
Tiempo (h)
21
crecimiento fuera más acelerado. Bajo condiciones de refrigeración este microorganismo es
capaz de sobrevivir pero a una muy baja velocidad de crecimiento, como lo demostró Annous et
al. (1997) evidenciando que las membranas citoplasmáticas de bacterias cultivadas a bajas
temperaturas contienen una mayor proporción de ácidos grasos de cadena larga en la membrana,
que son determinantes principales de un estado de membrana suficientemente fluido para
permitir el crecimiento a bajas temperaturas, con un cambio en la ramificación de iso a anteiso
sin embargo, las bajas temperaturas tienen efectos profundos en el crecimiento de las bacterias a
través de la influencia en el ribosoma y la membrana citoplasmática que generan alteraciones en
la síntesis de proteínas y absorción de solutos (Berry et al., 1997).
Durante esta fase fue posible calcular las velocidades de crecimiento de L. monocytogenes (µ),
resultados que se encuentran en la tabla 9, en donde se puede observar que µ fueron semejantes
entre el control negativo y el tratamiento con adición de extracto de cubio; mientras que para el
control positivo fue levemente más bajo.
Tabla 9. Velocidad de crecimiento
Tratamientos µ ( )
Control Negativo 0.118±0,00004
Control Positivo 0.059±0,0005
Tratamiento con extracto de cubio 0.111±0,0002
Estos resultados se encuentran en el rango de las velocidades obtenidas por Sanz et al. (2014)
quienes evaluaron diferentes concentraciones de extracto de coliflor frente a L.monocytogenes
encontrando que para el tratamiento sin extracto (a temperatura de almacenamiento de 5ºC)
obtuvieron una velocidad de 0,12 en comparación con el control negativo de esta
investigación donde se obtuvo un valor de 0,118 . En cuanto al tratamientos con 15 % de
extracto de coliflor (a temperatura de almacenamiento de 5ºC) la velocidad de crecimiento
correspondió a 0,04 , valor inferior al obtenido con el extracto de cubio correspondiente a
0,111 . Este resultado se debió posiblemente al contenido de GLS presentes en la coliflor el
cual corresponde a 0,61 – 1,14 mg/g , mientras que el cubio contiene 0,002 - 0,003 mg/g, por lo
que la velocidad de crecimiento fue menor a mayores concentraciones de GLS. Otro factor que
puede incidir en las diferencias entre el ensayo del extracto del coliflor y el extracto de cubio es
que el primero se realizó en condiciones in vitro. Con respecto al control positivo estudios como
el de Bover et al. (2014) los cuales elaboraron un modelo para predecir el crecimiento de
L.monocytogenes en productos cárnicos, muestra que la adición de altos contenidos de nitrito de
sodio (150ppm) frente a condiciones bajas de pH (5,4), temperatura (5ºC) y altas dosis de cloruro
de sodio (3%) pueden disminuir la velocidad de crecimiento en productos cárnicos llegando a
0,0022 , comparado con una µ de 0,059 obtenido para el control positivo en el que se
adicionó 200 ppm de nitrito de sodio, almacenado a 4ºC y 1% de cloruro de sodio.
22
Al no obtener una disminución de la población de L.monocytogenes en las muestras del control
positivo, se encontró que se deben tener en cuenta diversos factores que puedan llegar a tener
influencia en el crecimiento bacteriano como lo es la combinación de nitrito de sodio con niveles
bajos de temperatura, pH y oxígeno, junto con concentración de cloruro de sodio altas, lo cual
puede llegar a inhibir el crecimiento de esta bacteria aumentando la fase de latencia y el tiempo
de generación a medida que la concentración de nitritos aumenta (Beatrice et al., 2007). Como lo
demostró Buchanan et al. (1989) citado por Beatrice et al. (2007) quienes encontraron que en
carne a pH≤ 5.5, 3.5% de cloruro de sodio y 103 ppm de nitrito de sodio, no tuvo efectos sobre el
crecimiento de L.monocytogenes. En contraste, al cambiar las condiciones usando nitrito de
sodio a una concentración de 156 ppm, cloruro de sodio de 5 a 7,8%, pH de 4.4, una actividad de
agua entre 0.79 – 0.86 en salami almacenados a 4°C, el crecimiento del patógeno disminuyo
significativamente durante más de 12 semanas (Cammack et al., 2000).
Se esperaba que el tratamiento con adición de extracto de cubio, inhibiera L.monocytogenes a
una concentración de 200 mg/ml, debido a los resultados encontrados en las pruebas in vitro. Sin
embargo los resultados fueron negativos. Los factores que pudieron influir en este resultado son
variados, una de las hipótesis por la cuales la adición de extracto de cubio fue ineficaz en la
inhibición de L.monocytogenes es el contenido de proteína presente en la carne de hamburguesa,
ya que Cejpek et al.(2000) demostraron que los ITC`s pueden reaccionar químicamente con las
proteínas a través de los grupos aminos y los grupos sulfhidrilos libres, que están presentes en los
grupos laterales de los residuos de aminoácidos, revirtiendo la acción antimicrobiana de los
ITC`s como lo mostraron Brandi et al.(2006) quienes encontraron que la inhibición del
crecimiento de Salmonella enteritidis inducida por el extracto de coliflor a 20% se invirtió por
adición de cisteína a concentraciones de 75 – 300µM, mecanismo que para el presente caso se
pudo replicar para L.monocytogenes, permitiendo el crecimiento de la misma al adicionar el
extracto de cubio.
Además de lo mencionado anteriormente Moreira et al. (2007) encontraron que el efecto de
aceite de clavo fue menos eficaz para carne cocida que para espinaca escaldada, postulando que
la estructura de la carne podría tener algunos efectos protectores sobre los microorganismos o
absorber el compuesto antimicrobiano del aceite de clavo, razón que respaldan autores
como Burt (2004) quien indico que las grasas, proteínas, contenido de agua, antioxidantes,
conservantes, pH, sal y otros aditivos pueden afectar la sensibilidad bacteriana a
los bioconservantes. Así mismo, se ha informado que la adición 1,7% de sodio disminuye los
efectos bactericidas de aceites esenciales y que según la matriz alimentaria las concentraciones
que fueron eficaces para estudios in vitro no lo serán para el producto (Canillac et al., 2004), por
lo que la concentración de extracto usada (200 mg/ml) pudo ser insuficiente para inhibir el
crecimiento de L.monocytogenes en un derivado cárnico. Además los altos niveles de grasa y/o
proteína en los alimentos protegen a las bacterias de la acción de bioconservantes como los
aceites esenciales, ya que estos se disuelven en la fase lipídica del alimento y serian menos
23
disponibles para actuar sobre bacterias que están presentes en la fase acuosa (Mejholm et al.,
2002), otro ejemplo es que las proteínas de los alimentos y la grasa pueden unirse y/o solubilizar
compuesto fenólicos para reducir la disponibilidad de estos lo que disminuye o elimina la
actividad antimicrobiana durante el almacenamiento (El Abed et al.,2014).
Seguido a esto inicia la fase estacionaria la cual es resultado del agotamiento de los nutrientes
disponibles o del efecto de acumulación de productos tóxicos de metabolismo que tienen como
consecuencia la disminución de la velocidad del crecimiento. La transición entre la fase
exponencial y la fase estacionaria se caracteriza por un crecimiento desequilibrado, estas
pequeñas variaciones en el crecimiento se dan debido a que los diversos componentes celulares
son sintetizados a diferentes velocidades (Agatangelo,2007), este crecimiento desequilibrado se
observó en las horas 6 a 12 en las que se mostro una disminución de 0, 2 Log ufc/g para el
control negativo y aproximadamente 0,05 Log ufc/g para el control positivo y el tratamiento con
adición de extracto de cubio, seguido de un crecimiento de 0,1 Log ufc/g para el control negativo
y el tratamiento con adición de extracto de cubio, para finalmente terminar con un crecimiento
constante a partir de la hora 12 hasta los 5 días de muestreo aumentando solo 0,3 Log ufc/g para
el tratamiento con adición de extracto de cubio, 0,1 Log ufc/g para el control positivo y 0,2 Log
ufc/g para el control negativo.
Por último, en el seguimiento realizado no se evidencia la fase de muerte de la población
microbiana al no encontrar una disminución en la población para ninguno de los tratamientos,
esto debido a que el tiempo de evaluación no fue suficiente para identificar esta etapa.
Al indicar los diferentes factores que pueden interferir en una inhibición se hace evidente la
discrepancia de los resultados obtenidos con los de otros estudios donde ha sido eficaz el uso de
extractos con ITC´s en la conservación de productos cárnicos como Lara-Lledó et al. (2012),
que estudio el efecto antimicrobiano de una película con adición de mostaza oriental y mostaza
amarilla las cuales contiene ITC’s en una salchicha Bologna, a concentraciones de 3, 5 y 6%, la
película con mostaza amarilla tuvo un efecto bacteriostático en el crecimiento de
L.monocytogenes manteniendo entre 1 y 3 Log ufc/g por debajo de los controles durante todo el
ensayo que se llevó a cabo por 70 días, por otro lado la película con mostaza oriental obtuvo un
efecto bactericida frente a la bacteria llevándola hasta valores indetectables a partir del día 52,
esto puede ser comparable con los resultados obtenidos por Olaimat et al. (2015) quienes
realizaron un estudio con extracto de mostaza oriental para inhibir L.monocytogenes en pollo, en
donde demostró que el extracto de mostaza tuvo acción antimicrobiana al incorporarlo a un
recubrimiento en pollo cocido en una concentración de 100 a 250 mg/g, teniendo una
disminución de 4,1 a 4,6 Log ufc/g para el recubrimiento con ácido acético, k-carragenano /
quitosano/ extracto de mostaza y 4,8 a 5,5 Log ufc/g para un recubrimiento con acido málico /k-
carragenano /quitosan y extracto de mostaza a comparación del pollo sin recubrimiento, la
diferencia entre recubrimientos se le atribuye a la acción antimicrobiana que puede tener los
24
demás compuestos del mismo, los estudios mencionados muestran que factores externos
pudieron afectar el efecto antimicrobiano del extracto.
3.4 PRUEBAS FISICOQUÍMICAS
Tabla 10. Análisis fisicoquímico de la carne de hamburguesa
Tratamiento % Proteína %Humedad %Grasa
Control Negativo 14,55±0,019 77,27±0,081 11,74±0,0004
Control Positivo 16,72±0,027 66,67±0,054 11,56±0,0007
Tratamiento con
extracto de cubio 16,09±0,028 78,83±0,181 11,44±0,0004
Los resultados de los análisis fisicoquímicos se encuentran adjuntos en la tabla 10, donde por
medio de un análisis estadístico se determinó que existen diferencias significativas en el
porcentaje de humedad entre los tratamientos (P≤0.05), dando como resultado que la diferencia
se encuentra en el control positivo con un porcentaje de humedad menor a los demás
tratamientos, este comportamiento se pudo presentar debido a que se dio una pérdida del agua
libre presente en la muestra ya que esta se mantiene únicamente por fuerzas superficiales,
generando pérdidas por evaporación, esto es el resultado de la liberación superficial que
ocurre por una diferencia de la tensión de vapor entre la superficie de la carne y el aire
ambiental, originándose así un considerable paso de vapor de agua (Moron et al., 2004),
adicional se pudo presentar una perdida por goteo durante el almacenamiento por posibles fallas
del equipo manejando temperaturas superiores a 4,4°C lo que genera liberación de agua de las
células que componen el musculo (USDA, 2007), otra de las posibles razones por las cuales se
obtuvo este resultado es que el nitrito de sodio y la harina de trigo utilizados en la elaboración de
la carne tienen una capacitad de retención de agua significativa, la harina de trigo tiene un
porcentaje de retención de agua de 65.5% como lo demostró Horra et al. (2012) quienes
evaluaron los indicadores de calidad de las harinas de trigo utilizando siete muestras de diversas
marcas, en cuanto a los nitritos se conoce que son utilizados como sal de curado (Apango, 2009)
que extrae el agua presente en las células que componen la carne mediante un proceso de
osmosis (Ventanas et al., 2004).
En lo concerniente al contenido de proteína estadísticamente no se encontraron diferencias
significativas (P>0.05), tal y como se muestra en la tabla 9. Sin embargo, se puede observar
que control positivo y el tratamiento con adición de extracto de cubio tienen valores similares
entre sí, los cuales se asemejan al evaluado por Landeta et al. (2012) quienes determinaron el
contenido de proteína para hamburguesas crudas, obteniendo como resultado un porcentaje de
17.4±1.4. Mientras que para el control negativo se evidencio un nivel de proteína inferior en
comparación con los demás tratamientos, comportamiento que se puede atribuir a que
la mezcla de la carne para este tratamiento no presenta un homogeneidad total, ya que este
proceso de mezclado se realizó de forma manual, por lo que se pudo presentar que al momento
de la toma de la muestra a la cual se le realizaría la valoración de proteína, pudo contener trozos
del extendedor utilizado en la mezcla o tener mayores proporciones de contenido graso, lo cual
25
pudo haber influenciado significativamente el resultado obtenido para este tratamiento; esto
genera errores en la cuantificación del contenido de nitrógeno orgánico, generando así menores
cantidades de sulfato de amonio durante la digestión.
Para el contenido de grasa de los tratamientos, el tratamiento estadístico no arrojó diferencias
significativas entre estos, obteniendo una valor promedio entre muestras de 11,58%, este
parámetro al igual que los demás evaluados concuerdan con lo establecido en la NTC 1325 los
cuales corresponden a min 14% proteína, max 40% de grasa y max 90% de humedad.
26
CONCLUSIONES
El extracto de cubio tuvo efecto antimicrobiano frente a Listeria monocytogenes a
concentraciones de 200 mg/ml y 333 mg/ml en las pruebas in vitro. Concluyendo que el
extracto de cubio puede ser un bioconservante prometedor para la industria de alimentos.
En el ensayo en producto cárnico el extracto de cubio no tuvo un efecto antimicrobiano a la
concentración evaluada de 200 mg/ml, posiblemente debido a que el contenido de grasa y
proteínas puede proteger a las bacterias de la acción de los bioconservantes disolviendo o
solubilizando los compuestos activos para reducir su disponibilidad en el producto.
El contenido de proteína y grasa del producto no fue estadísticamente diferentes con
respecto a los controles evaluados. Los contenidos de las pruebas fisicoquímicas evaluadas
no exceden el valor admitido para derivados cárnicos crudos establecidos por la NTC
1325.
27
RECOMENDACIONES
Se sugiere evaluar el efecto del extracto de cubio sin la adición de nitritos, con el fin de
determinar si el extracto por si solo tiene efecto antimicrobiano en un producto cárnico,
además de realizar pruebas sensoriales para evaluar el nivel de aceptación del producto
adicionado con extracto de cubio y así determinar si tiene incidencia sobre las
características organolépticas en el producto en fresco y luego de un proceso de cocción.
Se recomienda evaluar el efecto antimicrobiano del extracto de cubio en otras matrices
alimentarias para observar la incidencia de la composición del alimento en el efecto
antimicrobiano del extracto.
Se sugiere calcular la concentración mínima inhibitoria (CMI) en productos cárnicos
usando concentraciones del extracto superiores a las ensayadas en el presente estudio.
El rendimiento de la extracción fue del 1%, por lo que se recomienda reevaluar otros
métodos de extracción más eficientes.
28
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37
Anexo A
Diagrama de proceso elaboración del extracto de cubio.
1.Lavar y desinfectar
2. Adecuar
3. Despulpar
4. Liofilizar
7. Centrifugar
8. Rotaevaporar
5. Diluir
6. Calentar
9. Secar
3000 g Cubios
Cubios
2846,5 g Cubios
2487,73 g Pulpa de Cubios
200,1 g Pulpa de cubio
liofilizado
153,6 g Desechos
2287,6 g Agua
2173,5 g Etanol 70%
Pulpa de cubio liofilizado y etanol
Pulpa de cubio liofilizado y etanol 394,58 g Pulpa de cubio
humedecido
1620,5 g Sobrenadante 1057 g Etanol
563,5 g Extracto de cubio
24,2 g Extracto de cubio
544 g Etanol
558,9 g Desechos
T= - 56 °C, P= 0,280 mbar, t= 24 h
T= 70 °C, t= 5 min
RPM= 3000, t= 1min
T= -50 °C, P= 200 mbar, RPM= 20
T= 40 °C, t= 24 h
10. Almacenar T= - 20 °C
Repetir 1 vez
38
Anexo B
Diagrama de proceso activación de cepa de Listeria monocytogenes ATCC 19115.
1. Resuspender
2. Incubar
3. Sembrar
4. Incubar
5. Diluir
Ampolla de L.monocytogenes ATCC 19115
9 ml de caldo nutritivo
T= 37°C, t= 24h
T= 37°C, t= 24h
Agar PALCAM
L.monocytogenes activada
L.monocytogenes activada
L.monocytogenes activada
4 - 5 ml de agua estéril 3 o 4 colonia de L.monocytogenes
6.Medir absorbancia
L.monocytogenes diluida
ƛ= 540 nm, A= 0,25
L.monocytogenes diluida a UFC/ml
39
Anexo C
Diagrama de proceso pruebas in vitro.
Cajas petri
L.monocytogenes activada
1.Diluir
2. Mezclar
4. Enfriar
3. Servir
5. Sembrar
6. Incubar
7. Interpretar
Extracto de cubio
Etanol / Agua (75/25)
Extracto de cubio diluido Agar Mueller Hinton
fundido
T= 40 – 45°C (Agar)
Extracto de cubio diluido con agar
Hasta solidificación del agar
UFC/ml
T= 37°C, t= 24 h
Sensible /resistente
Extracto de cubio diluido con agar
Extracto de cubio diluido con agar
Extracto de cubio diluido con agar y Bacteria
Extracto de cubio diluido con agar y Bacteria
Extracto de cubio diluido con agar y Bacteria
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Anexo D
Diagrama de proceso elaboración de hamburguesas de carne.
1.Adecuar
2. Moler
5. Separar
3. Adicionar
4. Mezclar
8. Porcionar
9. Inocular
10. Almacenar
Res = 900 g , Cerdo = 500 g ,Grasa = 250 g
Desechos = 140 g
Res = 845 g , Cerdo = 420 g ,Grasa = 250 g Desechos = 300 g
Res = 720 g , Cerdo = 300 g ,Grasa = 180 g
500 g por tratamiento
C (-) = 500 g , C (+)= 500 g ,T3 = 500 g
Harina de trigo= 60g, Agua= 225g, Sal =15 g
C(+) = 0,1 g nitrito de sodio ,T3= 0,05 g nitrito de sodio
y 50g de extracto diluido
C (-) = 500 g , C (+)= 500 g ,T3 = 500 g mas aditivos
Carne de hamburguesa = 1500g sin conservantes
7.Mezclar
Carne de hamburguesa = 1500g sin conservantes
6. Adicionar
25g por porción en cajas de petri estériles
C (-) = 500 g , C (+) = 500 g ,T3 = 500 g mas aditivos
L.monocytogenes a UFC/ml
1 ml x 10 g de producto
C (-) = 500 g , C (+) = 500 g ,T3 = 500 g mas aditivos
C (-) = 500 g , C (+) = 500 g ,T3 = 500 g mas aditivos
C (-) = 500 g , C(+) = 500 g ,T3 = 500 g mas aditivos
T= 4°C, t= 5 días
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Anexo E
Diagrama de proceso muestreo de hamburguesas.
1.Pesar
2. Diluir ( )
4. Diluir ( )
5. Sembrar
6. Incubar
7. Recuento
3. Homogeneizar
Muestra
10 g Muestra 90 ml agua peptonada
Dilución ( )
Tomar 1 ml de Dilución ( ) 9 ml agua peptonada
Tomar 0,1 ml de cada Dilución
Agar PALCAM
Siembra en superficie y por duplicado
T= 37°C, t= 24 h
Conteo de colonias