evaluación de actividades biológicas de plantas utilizadas
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Evaluación de actividades biológicas de plantas utilizadas en la medicina
tradicional de la Zona huasteca de San Luis Potosí.
Responsable: Dr. José Roberto Macías Pérez
Unidad Académica Multidisciplinaria Zona Huasteca
Universidad Autónoma de San Luis Potosí
Antecedentes
En México la medicina tradicional es un recurso vigente de la cultura nacional que
se viene utilizando desde hace miles de años contribuyendo enormemente en la
prevención y curación de una gran diversidad de enfermedades. La Organización
Mundial de la Salud ha definido a la medicina tradicional como la suma total del
conocimiento, habilidades, y de prácticas basadas en las teorías, la creencia, y las
experiencias indígenas en diversas culturas, sean susceptibles de explicación o no,
utilizados en el mantenimiento de la salud así como en la prevención, la diagnosis,
la mejora o el tratamiento de la enfermedad física y mental, prácticas transmitidas
de generación en generación, sea oralmente o por escrito [1].
Debido a las propiedades curativas que tienen las plantas se han desarrollado
estudios mediante los cuales se pretende evaluar sus efectos curativos y esto ha
hecho posible identificar compuestos con actividad biológica, tal es el caso de
moléculas con actividad químioprotectora, que han sido identificados al estudiar
substancias purificadas a partir de extractos de productos naturales a los que la
medicina tradicional les ha atribuido propiedades terapéuticas. La quimioprotección
consiste en el uso de compuestos sintéticos o naturales para inhibir, retardar o
revertir la carcinogénesis. Se basa en la hipótesis de que la interrupción de los
eventos biológicos involucrados en la carcinogénesis inhibirá este proceso y que
puede aplicarse en cualquier etapa [2, 3].
Un ejemplo es la Rhoeo discolor, una planta herbácea perteneciente a la familia de
las cornelináceas ampliamente utilizada en la medicina tradicional mexicana para
tratar el cáncer, las enfermedades venéreas y la micosis superficial. En reportes
científicos se ha reportado que el extracto de esta planta tiene efectos
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antimutagénicos ante el estrés oxidativo inducido experimentalmente, y también ha
mostrado in vitro proteger a las células hepáticas contra la síntesis no programada
de DNA la cual se induce a través de diferentes carcinógenos químicos y además
se ha manifestado que tiene la capacidad de atrapar radicales libres de oxígeno en
la misma magnitud que el α-tocoferol y con mayor capacidad que el ácido ascórbico.
Es importante señalar que este extracto no es mutagénico ni genotóxico como
previamente se ha demostrado en diferentes ensayos, incluso a concentraciones de
entre 4 y 166 veces la concentración necesaria para obtener su máximo efecto
antimutagénico y quimioprotector [4, 5].
En otro ejemplo de reportes científicos a partir de extractos naturales se utilizó un
modelo animal, las ratas Sprague Dawley tratadas con el carcinógeno
metilnitrosourea presentan una variedad de alteraciones que iban desde severas
reacciones inflamatorias en la piel y en los pulmones hasta adenocarcinoma de
colon, las pruebas bioquímicas mostraron algunos marcadores de estrés oxidativo
elevados, pero cuando se les dio a estas ratas granos de Nigella Sativa con miel de
abeja, una dosis diaria por seis meses iniciando una semana después de la
administración del carcinógeno, se encontró que este tratamiento tenia actividad
quimioprotectora y protegió en un 100% el estrés oxidativo inducido por el
carcinógeno [6]. Por lo tanto, eI uso de modelos animales permite el estudio de las
actividades biológicas observadas en diversas plantas, así como de los compuestos
químicos que contiene. Cada compuesto de interés puede ser estudiado bajo
diferentes condiciones en un modelo, por ejemplo en diferente etapa de la
carcinogénesis y variando la dosis o vía de administración.
Al igual que la miel, el propoleo ha sido ampliamente utilizado por muchas culturas
para diferentes propósitos, así como en la medicina tradicional. El propoleo es una
mezcla resinosa compleja colectada de plantas y utilizada por las abejas en sus
colmenas, y es un producto de interés tanto en el campo de la medicina como en la
industria farmacéutica, ya que se le atribuyen numerosas propiedades como
antiinflamatorio, inmunoestimulate, hepatoprotector, quimioprotector, antibiótico,
anestésico entre otras. Se ha demostrado que induce apoptosis de cultivos celulares
de hepatomas humanos. En el propoleo se encuentran una gran variedad de
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compuestos polifenólicos, varios de estos compuestos aislados han mostrado
actividad quimioprotectora. Los polifenoles se encuentran ampliamente distribuidos
en el reino vegetal y muestran una variedad de actividades biológicas, tal es el caso
del ácido cafeico y el éster fenetílico del ácido cafeico (CAPE), están presentes en
altas concentraciones en plantas medicinales y el propoleo, y se ha investigado su
actividad antitumoral tanto in vivo como in vitro. Orsolic y colaboradores,
encontraron que el ácido cafeico así como su derivado CAPE administrado por
inyección subcutánea en el tejido tumoral causó un retraso significativo en la
formación del tumor e incrementarón la esperanza de vida un 29.3 y 51.73%
respectivamente. Además tanto el ácido cafeico y el CAPE, suprimieron de forma
significativa, la proliferación in vitro de células HeLa procedentes de carcinoma
celular humano [7]. Actualmente se sabe que el CAPE tiene una amplia variedad de
actividades biológicas, tanto antibacterial, anti-inflamatoria, antioxidante,
antitumoral, antiproliferativa y neuroprotectora [8-14], en un modelo carcinogénico
ha mostrado disminuir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la
peroxidación lipídica al ser administrado en la etapa de promoción o en la etapa de
iniciación de la carcinogénesis [15-17].
Así como CAPE, sus análogos se encuentran ampliamente distribuidos en el reino
vegetal como en el café, olivos, propoleo y frutas. Estos compuestos se encuentran
como derivados simples del ácido cinámico incluyendo amidas, ésteres de azúcar y
glicósidos, o en formas más complejas como el ácido rosmarínico, ácido
litospérmico, verbascósido y derivados enlazados a flavonoides. Estos compuestos
se conocen por tener propiedades antibacteriales, antiinflamatorias,
inmunoestimulatorias, antiateroscleróticas, neuroprotectivas, antiproliferativas,
antivirales y antioxidativas [18, 19].
La huasteca potosina presenta una gran variedad de plantas medicinales nativas de
uso popular, a las que la medicina tradicional y estudios científicos avalan sus
actividades biológicas, de las cuales algunas llaman la atención como la actividad
antioxidante, la capacidad de atrapar radicales libres entre otras. Estas actividades
son comunes de los compuestos que se han empleado como quimioprotectores[20-
24].
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El hígado es un órgano expuesto efectos tóxicos debido a que es el responsable de
la biotransformación, metabolismo y eliminación de agentes potencialmente tóxicos.
Por esta razón, el daño hepático tanto agudo como crónico se está convirtiendo en
un importante problema de salud pública debido al uso de medicamentos, drogas
de abuso o agentes hepatotóxicos que promueven su degeneración, tal es el caso
del abuso del alcohol. La causa del CHC en la mayoría de los casos es el continuo
daño celular del hígado, por lo que algunos factores de riesgo son la Infección con
los virus de la hepatitis tipo C y tipo B, Cirrosis inducida por consumo de alcohol
combinado con el hábito de fumar, consumo de micotoxinas como la aflatoxina,
factores genéticos y hormonales, la obesidad y la exposición a carcinógenos
químicos como las nitrosaminas [25]. De ahí la importancia de estudiar las
actividades biológicas que pueden tener las plantas medicinales a nivel hepático,
ya sea hepatotóxicas o hepatoprotectoras.
Justificación
En un esfuerzo por sanarse de diversas enfermedades, los enfermos prueban
compuestos naturales. Se estima que en diferentes regiones del mundo, del 10 al
80 por ciento de pacientes con cáncer emplean algún tipo de medicina
complementaria a su terapia y para muchos de esos pacientes una parte de esa
terapia complementaria es el uso de compuestos naturales, sin la asesoría de su
oncólogo o la guía de estudios científicos. Las plantas medicinales son eficaces, no
hay duda de ello ya que la gran cantidad de tratados de plantas medicinales,
farmacognosia y homeopatía que se han escrito en todo el mundo lo confirma. Pero
su eficacia dependerá en gran medida del uso correcto que se haga de ella. Estudiar
las actividades biológicas de los productos naturales permitirá emplearlos
apropiadamente para diversas patologías[26, 27].
En el conocimiento tradicional de plantas medicinales se pueden reportar muchas
especies con características importantes para aliviar muy diversos problemas de
salud, principalmente en las áreas rurales, donde el uso de estos recursos es muy
elevado, incluso llega a sustituir casi de manera completa en las partes más
alejadas de las ciudades, a la medicina científica. Por lo que la estandarización de
productos naturales es necesaria así como el estudio de sus componentes, dado
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que frecuentemente se han encontrado substancias con actividad biológica
mientras se estudian substancias obtenidas de productos naturales a los que la
medicina tradicional le atribuye propiedades terapéuticas. Muchos productos
naturales, varios de ellos los encontramos en la dieta, son quimioprotectores, y
experimentos con cultivos celulares y modelos animales revelan su posible
mecanismo de acción, que muchas veces se encuentra relacionado con la
capacidad de prevenir o reducir ampliamente la iniciación de la carcinogénesis o la
proliferación celular.
Entre las opciones terapéuticas para el tratamiento del CHC se encuentran la
resección, el trasplante hepático, la quimioembolización y la ablación por
radiofrecuencia. Pero sólo una cuarta parte de pacientes con CHC pueden
beneficiarse de los tratamientos previamente expuestos, debido a los
inconvenientes que se presentan como son mortalidad operatoria, limitada
disponibilidad de órganos y una elevada tasa de recurrencia [28].
El CHC es un tumor con mínimas posibilidades de curación cuando el paciente
presenta síntomas como consecuencia del mismo, por lo cual la detección temprana
juega un papel trascendente para tener opciones de tratamiento y mayores
posibilidades de sobrevivencia. De ahí que el estudio del origen de la enfermedad y
de las etapas tempranas del CHC sigue siendo de gran interés en busca de métodos
de prevención, de diagnóstico temprano y de tratamiento [25].
Programa académico que se beneficiará con el proyecto
La Licenciatura de Química Clínica de reciente creación, a la cual estoy adscrito,
será impulsada con este proyecto ya que se contempla la participación de alumnos
de dicha carrera en esta investigación, principalmente como tesistas, pero también
será una opción de prácticas profesionales o servicio social para aquellos alumnos
que desean realizar investigación como preparativos para un posgrado al
graduarse, esto permitirá generar publicaciones científicas en las que dichos
alumnos serán autores, y ellos mismos serán los difusores de los resultados con su
participación en congresos.
Plan institucional de desarrollo 2013-2023
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El proyecto que se presenta incide en diferentes apartados del Plan institucional de
desarrollo 2013-2023, el apartado “II. El escenario de partida: Un diagnóstico de la
Universidad Autónoma de San Luís Potosí. Fortalezas, debilidades y retos. Sección
II.6 Investigación”, describe la situación de la universidad de la cual se parte y que
es importante para diseñar las estrategias de desarrollo en las que incidirá este
proyecto como a continuación se describe.
El apartado “V. Políticas generales, programas institucionales sus objetivos y
estrategias para el logro de la Visión UASLP 2023”, menciona que la investigación
es una de las funciones sustantivas de la UASLP, y da un panorama del crecimiento
que tiene la investigación en base a los productos obtenidos, distinciones u
obtención de recurso.
En el apartado “V.1 Políticas generales”, “Investigación”, se plantea entre otros
aspectos, impulsar la investigación relacionada con la docencia para fortalecer la
formación del alumno y del trabajo docente, promoviendo la publicación y
divulgación de los proyectos de investigación, así como promover la generación de
patentes y su transferencia a los sectores interesados.
Se puede apreciar que este proyecto contribuye en varios aspectos de las
estrategias para el desarrollo de la planta académica del apartado “V.2 Los
programas institucionales, sus objetivos y las estrategias para su implementación”,
“9 Fomento a la investigación, innovación y desarrollo tecnológico”, ya que se
incorporan alumnos para el desarrollo del proyecto que pretende que sus resultados
contribuirán a mejorar la calidad de vida de la sociedad potosina y de la región.
OBJETIVO Y METAS
Objetivo general
Estudiar actividades hepatoprotectoras en plantas de la Zona Huasteca de San Luis
Potosí empleadas en la medicina tradicional.
Objetivos Particulares.
Determinar alteraciones en los resultados de pruebas bioquímicas en plasma
como consecuencia del uso de extractos de plantas medicinales de la zona
huasteca.
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Determinar el efecto del pretratamiento con los extractos de interés sobre la
formación de lesiones preneoplásicas a los 30 días en el modelo modificado
del hepatocito resistente.
Determinar la actividad como antioxidantes de los extractos de interés.
Analizar el efecto de estos extractos sobre la proliferación celular
Evaluar su efecto sobre la vía de activación del Factor Nuclear-kappa B (NF-
κB).
Estudiar los efectos en la vía anti-oxidante del factor nuclear (derivado de
eritroide 2) similar al 2 (Nrf2).
Metas
Una publicación científica arbitrada de calidad internacional indizada en el JCR.
Al menos una tesis para la obtención del grado.
Memoria de presentación en un congreso.
Metodología
Se seleccionarán y colectarán muestras de plantas medicinales de la zona huasteca
a las que la medicina tradicional les atribuye actividades biológicas, y a partir de las
cuales se obtendrán extractos para determinar si presenta actividades
hepatoprotectoras. Se estudiarán efectos antioxidantes y su capacidad de capturar
radicales libres. Se emplearán tanto el modelo modificado del hepatocito resistente
en rata, que es un modelo de carcinogénesis química, así como el modelo de
cirrosis inducida por la intoxicación crónica con tetracloruro de carbono. Se
compararán grupos tratados y no tratados con los extractos de interés a través de
pruebas bioquímicas del perfil hepático como ALT, Fosfatasa alcalina, gama
glutamil transpeptidasa, bilirrubinas, glucógeno hepático, entre otras. Además se
empleará la técnica histológica con tinciones como hematoxilina eosina para
evaluar la estructura general del hígado, tricrómica de masson ver los efectos sobre
la fibrosis, inmunohistoquímicas e histoquímicas enzimáticas para comparar
marcadores neoplásicos como GSTp y GGT o marcadores de proliferación como
Ki67. Se estudiará también, mediante western blot, el efecto de estos extractos
sobre factores de transcripción como NfκB y Nrf2.
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Efecto de los extractos en la necrosis producida por DEN.
La muerte celular se observa con frecuencia como parte de los efectos tóxicos de
muchos productos químicos, y debido a la versatilidad para metabolizar estas
sustancias químicas, el hígado es especialmente vulnerable a estos compuestos.
Se ha propuesto que la necrosis en los tejidos puede actuar como un estímulo
proliferativo porque la pérdida de tejido se recupera por la proliferación del tejido
restante [29]. Para determinar el efecto de los extractos sobre la necrosis producida
24 h después de la administración del carcinógeno dietilnitrosamina (DEN), a grupos
de 4 ratas Fischer 344 con peso entre 180 y 200 g, se les administrará el extracto
por vía i.p. 12 h antes de haber administrado la DEN a una dosis i.p. de 200 mg/kg
de peso, y 24 h después de la administración de DEN serán extraídos los hígados
de los animales y, fijados con formaldehido para su posterior inmersión en parafina.
Con la tinción con hematoxilina-eosina se analizarán las alteraciones en la
estructura hepática, evidenciando la morfología estructural de los hepatocitos como
el núcleo en color azul y el citoplasma teñido de color rosa [17]. La magnitud de
necrosis será cuantificada en 10 campos por rata con el objetivo 10X de un
microscopio de campo claro acoplado a una cámara, que permita capturar las
imágenes en una computadora. El área necrótica se calculará cuantificando el área
normal y restándola al área total del campo.
Inmunohistoquímica.
Para evaluar el efecto de los extractos sobre la proliferación celular se empleará
como marcador de la proliferación celular a la proteína Ki-67, que es una proteína
nuclear estrechamente relacionada con el ciclo celular, será necesario realizar
inmunohistoquímicas en tejido hepático de ratas sacrificadas 24h posteriores a la
administración de DEN para determinar la expresión de esta proteína, Para la
cuantificación se empleará el software analySlS Opty Soft Imaging System GmbH
3.00 (Build 432), en tres ratas por grupo, 2 segmentos diferentes de hígado por rata
y 20 campos por segmento a un aumento de 10x.
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Efecto de los extractos en la modulación de la señalización intracelular pro-
inflamatoria de NF-κB y de la vía antioxidante de Nrf2.
Se evaluará el efecto de los extractos en la modulación de la señalización del factor
transcripcional de NF-κB (p65) [30] e IκB, así como de las citosinas pro-inflamatorias
como la Interleucina-1, Interleucina-6, el Factor de Necrosis Tumoral-alfa; así como
Nrf2, Hemo-oxigenasa 1 mediante la técnica de Western Blot. Para la determinación
de la subunidad p65 se empleará el anticuerpo MAB3026 el cual reconoce un
epítope que sobrelapa con la señal de localización nuclear y por lo tanto reconoce
selectivamente al NF-κB activo, por lo que se emplearán proteínas totales, las
cuales serán extraídas empleando el reactivo comercial TriPure Isolation Reagent®
de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Y se procederá con la electroforesis
en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) se transferirá a una
membrana de PVDF y se realizará en esta el Western Blot para p65 e IκB, la
cuantificación se realizará con tres ratas por grupo empleando el Software
MacBiophotonics lmageJ 1.43m.
Efecto de los extractos en la peroxidación lipídica.
Cuando DEN es metabolizado se producen especies reactivas de oxigeno (ROS),
induciendo un estado de estrés oxidativo. Para estudiar si los extractos tienen
actividad antioxidante, se evaluarán sus efectos sobre la peroxidación lipídica a nivel
membranal inducida por DEN en el hígado de rata. Se empleará la técnica de
especies reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), para determinar la concentración
de malonldialdehído, uno de los metabolitos resultantes de la peroxidación lipídica.
La reacción entre el ácido tiobarbitúrico (TBA) y el malondialdehido (MDA) forma un
producto colorido que se puede determinar a 532 nm [31]. Además, del
homogeneizado de hígado para para esta determinación, se tomarán 20 mL para
determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford [32].
Actividad antioxidante in vitro de los extractos.
Se comparará la actividad antioxidante de los extractos a estudiar. La 2’,7’-dicloro-
dihidrofluoresceína (DCFH) se preparará a partir de 2’,7’- dicloro-dihidrofluoresceína
diacetato (DCFH-DA) por el método de Cathcart y col. [33], desesterificando la
DCFH-DA con NaOH y neutralizada con NaH2PO4. La sonda fluorescente se utiliza
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para determinar el efecto de los compuestos en la reacción del peróxido con la 2,7-
diclorofluoresceina reducida (DCFH) para producir la 2,7- diclorofluoresceina
oxidada (DCF) [34]. La mezcla de reacción contendrá DCFH y CAPE o los análogos
de CAPE (excepto para el control positivo). Las reacciones se iniciarán por la adición
de H2O2 (H2O como control negativo), las reacciones se monitorearán durante 15
min utilizando un espectrómetro de fluorescencia PerkinElmer LS-45, con λEX = 488
nm (3 nm de ancho de banda) y λEM = 525 nm (20 nm de ancho de banda).
Efecto de los extractos en la cirrosis inducida con CCl4.
El modelo experimental del tratamiento crónico con tetracloruro de carbono (CCl4),
nos ayudara a producir en ratas wistar una cirrosis semejante a la cirrosis alcohólica
que se presenta en el humano, por lo que nos permitirá probar los diferentes
extractos para evaluar su posible efecto benéfico para el hígado. Las cirrosis será
inducida con la administración intraperitoneal de 0.4 g/Kg de CCl4 tres veces a la
semana durante ocho semanas, y los diferentes extractos serán administrados
antes y durante la inducción del daño hepatotóxico.
Efecto de los extractos en las lesiones preneoplásicas.
Mediante el uso de modelos experimentales en animales se ha podido estudiar la
carcinogénesis química y el efecto quimioprotector de diversos compuestos
químicos. Uno de estos modelos es el modificado del hepatocito resistente (MMHR)
en la rata, de Semple-Robert [15, 16]. Consiste en administrar ratas Fischer 344
por vía intraperitoneal (i.p.), el carcinógeno N-dietilnitrosamina (DEN) [35] a una
dosis de 200 mg/kg de peso, posteriormente los días 7, 8 y 9 se aplica una dosis
intragástrica (i.g.) diaria de 20 mg/kg de peso de 2-acetil-aminofluoreno (2-AAF) [36]
y se realiza una hepatectomía parcial el día 10 del tratamiento, lo que conduce a la
etapa de progresión en la que se pueden estudiar a partir de los 30 días las lesiones
preneoplásicas que presumiblemente progresarán a tumores en hígado alrededor
de los 12 meses [37]. Empleando este modelo se comparará el efecto del
pretratamiento con los extractos sobre las lesiones preneoplásicas, además de
emplearlos en lugar del carcinógeno iniciador o del promotor, para corroborar si el
extracto es o no carcinogénico.
Análisis estadístico.
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Todos los experimentos se repetirán por lo menos tres veces. Los resultados se
presentarán como promedios ± SEM. La significancia estadística será determinada
por el análisis de varianza (ANOVA), seguido por el test de Tukey, con una p <0,05
como nivel de significancia.
Infraestructura disponible
Las investigaciones de carácter experimental se realizarán en los laboratorios de la
propia Unidad Multidisciplinaria Zona Huasteca de la Universidad Autónoma de San
Luis Potosí, que cuenta con el material y equipo necesario para realizar este
proyecto:
Balanzas analíticas y granatarias
Bioterio
Espectrofotómetro de luz UV y visible
Microscopio de fluorescencia
Equipos de electroforesis
Fuentes de poder
Campanas de flujo laminar
Criostato
Centrífugas
Incubadoras
Equipos de bioquímica Clínica
Bibliografía
1. Rojas Alba, M., Tratado de Medicina Tradicional Mexicana. Tercera edición ed.
2009, Cuernavaca, Morelos: Tlahui. 1158.
2. Klaunig, J.E. and L.M. Kamendulis, The role of oxidative stress in
carcinogenesis. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2004. 44: p. 239-67.
3. Hursting, S.D., et al., Mechanism-based cancer prevention approaches: targets,
examples, and the use of transgenic mice. J Natl Cancer Inst, 1999. 91(3): p.
215-25.
12
4. Gonzalez-Avila, M., et al., Antigenotoxic, antimutagenic and ROS scavenging
activities of a Rhoeo discolor ethanolic crude extract. Toxicol In Vitro, 2003.
17(1): p. 77-83.
5. Rosales-Reyes, T., et al., Aqueous crude extract of Rhoeo discolor, a Mexican
medicinal plant, decreases the formation of liver preneoplastic foci in rats. J
Ethnopharmacol, 2008. 115(3): p. 381-6.
6. Mabrouk, G.M., et al., Inhibition of methylnitrosourea (MNU) induced oxidative
stress and carcinogenesis by orally administered bee honey and Nigella grains
in Sprague Dawely rats. J Exp Clin Cancer Res, 2002. 21(3): p. 341-6.
7. Orsolic, N., et al., Effects of local administration of propolis and its polyphenolic
compounds on tumor formation and growth. Biol Pharm Bull, 2005. 28(10): p.
1928-33.
8. Zhao, H., et al., Coumarin-based inhibitors of HIV integrase. J Med Chem, 1997.
40(2): p. 242-9.
9. Okutan, H., et al., Effects of caffeic acid phenethyl ester on lipid peroxidation
and antioxidant enzymes in diabetic rat heart. Clin Biochem, 2005. 38(2): p. 191-
6.
10. Wang, T., et al., DNA damage induced by caffeic acid phenyl ester in the
presence of Cu(II) ions: potential mechanism of its anticancer properties. Cancer
Lett, 2008. 263(1): p. 77-88.
11. Wei, X., et al., Caffeic acid phenethyl ester prevents neonatal hypoxic-ischaemic
brain injury. Brain, 2004. 127(Pt 12): p. 2629-35.
12. Rao, C.V., et al., Inhibitory effect of caffeic acid esters on azoxymethane-induced
biochemical changes and aberrant crypt foci formation in rat colon. Cancer Res,
1993. 53(18): p. 4182-8.
13. Khan, M., et al., Caffeic acid phenethyl ester reduces neurovascular
inflammation and protects rat brain following transient focal cerebral ischemia. J
Neurochem, 2007. 102(2): p. 365-77.
14. Wang, D., et al., Effect of caffeic acid phenethyl ester on proliferation and
apoptosis of colorectal cancer cells in vitro. World J Gastroenterol, 2005. 11(26):
p. 4008-12.
13
15. Carrasco-Legleu, C.E., et al., A single dose of caffeic acid phenethyl ester
prevents initiation in a medium-term rat hepatocarcinogenesis model. World J
Gastroenterol, 2006. 12(42): p. 6779-85.
16. Carrasco-Legleu, C.E., et al., Chemoprotective effect of caffeic acid phenethyl
ester on promotion in a medium-term rat hepatocarcinogenesis assay. Int J
Cancer, 2004. 108(4): p. 488-92.
17. Beltran-Ramirez, O., et al., Evidence that the anticarcinogenic effect of caffeic
acid phenethyl ester in the resistant hepatocyte model involves modifications of
cytochrome P450. Toxicol Sci, 2008. 104(1): p. 100-6.
18. Jiang, R.W., et al., Chemistry and biological activities of caffeic acid derivatives
from Salvia miltiorrhiza. Curr Med Chem, 2005. 12(2): p. 237-46.
19. Lin, C.F., et al., Synthesis of selenium-containing polyphenolic acid esters and
evaluation of their effects on antioxidation and 5-lipoxygenase inhibition. Chem
Pharm Bull (Tokyo), 2005. 53(11): p. 1402-7.
20. Alonso-Castro, A.J., et al., Pharmacological effects and toxicity of Costus
pulverulentus C. Presl (Costaceae). J Ethnopharmacol, 2016. 180: p. 124-30.
21. Alonso-Castro, A.J., et al., Use of medicinal plants by health professionals in
Mexico. Journal of Ethnopharmacology, 2017. Volume 198(23): p. 81-86.
22. Jimenez-Suarez, V., et al., Anti-inflammatory, free radical scavenging and alpha-
glucosidase inhibitory activities of Hamelia patens and its chemical constituents.
Pharm Biol, 2016. 54(9): p. 1822-30.
23. Alonso-Castro, A.J., C. Juarez-Vazquez Mdel, and N. Campos-Xolalpa,
Medicinal Plants from Mexico, Central America, and the Caribbean Used as
Immunostimulants. Evid Based Complement Alternat Med, 2016. 2016: p.
4017676.
24. Wong-Paz, J.E., et al., Total phenolic content, in vitro antioxidant activity and
chemical composition of plant extracts from semiarid Mexican region. Asian Pac
J Trop Med, 2015. 8(2): p. 104-11.
25. Naugler, W.E. and J.M. Schwartz, Hepatocellular carcinoma. Dis Mon, 2008.
54(7): p. 432-44.
26. Boik, J., Natural Compounds in Cancer Therapy. Oregon Medical Press, 2001.
14
27. Pahlow, M., El Gran Libro de Las Plantas Medicinales. Everest Pub, 1979.
28. A. Del Val Antoñana, I.O.P., A. López Serrano, E. Moreno-Osset., Tratamiento
del carcinoma hepatocelular. ANALES DE MEDICINA INTERNA, 2002. 19(10):
p. 533-538.
29. Tessitore, L., Apoptosis and cell proliferation are involved in the initiation of liver
carcinogenesis by a subnecrogenic dose of diethylnitrosamine in refed rats. J
Nutr, 2000. 130(1): p. 104-10.
30. Natarajan, K., et al., Caffeic acid phenethyl ester is a potent and specific inhibitor
of activation of nuclear transcription factor NF-kappa B. Proc Natl Acad Sci U S
A, 1996. 93(17): p. 9090-5.
31. Ohkawa, H., N. Ohishi, and K. Yagi, Assay for lipid peroxides in animal tissues
by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979. 95(2): p. 351-8.
32. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem,
1976. 72: p. 248-54.
33. Cathcart, R., E. Schwiers, and B.N. Ames, Detection of picomole levels of
hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem,
1983. 134(1): p. 111-6.
34. LeBel, C.P., H. Ischiropoulos, and S.C. Bondy, Evaluation of the probe 2',7'-
dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and
oxidative stress. Chem Res Toxicol, 1992. 5(2): p. 227-31.
35. Verna, L., J. Whysner, and G.M. Williams, N-nitrosodiethylamine mechanistic
data and risk assessment: bioactivation, DNA-adduct formation, mutagenicity,
and tumor initiation. Pharmacol Ther, 1996. 71(1-2): p. 57-81.
36. Semple-Roberts, E., et al., Alternative methods of selecting rat hepatocellular
nodules resistant to 2-acetylaminofluorene. Int J Cancer, 1987. 40(5): p. 643-5.
37. Perez-Carreon, J.I., et al., Gene expression profile related to the progression of
preneoplastic nodules toward hepatocellular carcinoma in rats. Neoplasia, 2006.
8(5): p. 373-83.