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UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Departamento de Química Orgánica y Fisicoquímica Laboratorio Bioelectroquímica
“ESTUDIO POLAROGRAFICO DEL COMPLEJO DE INCLUSIÓN PROGESTERONA-CICLODEXTRINA”
Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico
DANIELA SOLANGE NÚÑEZ VARGAS
Santiago, Chile 2008
Director de Memoria y Profesor Patrocinante Dra. Claudia Andrea Yáñez Soto
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AGRADECIMIENTOS
A mis padres, por todo su amor y el apoyo que me entregan. Porque nunca
perdieron la esperanza, por darme fuerza y no dejarme caer.
A mis hermanos Rodrigo y Karla, por soportarme y entenderme. Por ser los
que me recordaban que no todo era estudio y que soñar es importante.
A mi tío Daniel, por sus consejos y guiarme al momento de escoger una
profesión.
A Catta, Pancho, Cifu y Cristian, por estar a mi lado durante tanto tiempo.
Ellos me vieron elegir, disfrutar, sufrir y terminar mi carrera. Y aunque muchas
veces los deje solos, nunca se olvidaron de nuestra amistad.
A Catty, Natalia, Jo y Mapi. Compañeras, colegas y lo más importante,
amigas. Que compartieron en estos años, no solo los estudios, sino la vida misma.
A la Profesora Claudia Yáñez, por su paciencia y guía. Sin ella esto no tendría
este final.
A todos los estudiantes, docentes y funcionarios del laboratorio de
electroquímica, quienes me enseñaron que sin esfuerzo y sacrificio no se logran
resultados.
A mis Jefes, Jessica Nova y Marcelo Santibáñez, quienes confiaron en mis
capacidades, a pesar de mi juventud.
A toda la Orden Fanciscana, en especial a la Hna. Ramona, por enseñarme a
entender lo que significa la perfecta alegría.
Y finalmente a Dios, por todo lo anterior.
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RESUMEN
En la presente tesis se estudió el comportamiento electroquímico del complejo
de inclusión progesterona-ciclodextrina. Para esto se utilizó β-ciclodextrina (β-CD)
y el derivado sulfobutil-β-ciclodextrina (SB-βCD).
Este estudio electroquímico fue realizado usando la técnica de polarografía de
pulso diferencial (PPD), donde se observó una disminución de la corriente al
agregar ciclodextrinas (CDs), esta disminución se debe a que el complejo de
inclusión presenta un menor coeficiente de difusión comparado con la molécula
libre.
Se determinó la constante de asociación para el sistema progesterona-βCD a
distintos pH 2,0, 4,0 y 7,5 encontrándose valores de 32, 102 y 850 M-1
respectivamente, lo que muestra una relación entre la formación del complejo y el
pH.
Se estudió el efecto de la agitación en la formación del complejo a distintos
tiempos comparándose con soluciones en reposo. Esto también fue realizado a
dos pHs 4,0 y 7,5, donde se observó que, a pH 4,0 la agitación es desfavorable a
la formación del complejo; y que a pH 7,5 no tiene gran influencia en la formación
del complejo.
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POLAROGRAPHIC STUDY OF PROGESTERONE- CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES
SUMMARY
In the present thesis, the electrochemical behaviour of progesterone-
cyclodextrin inclusion complexes was studied. β-cyclodextrin (β-CD) and
sulfobutylether-β-cyclodextrin (SBEβCD) were analysed.
This study was carried out by differential pulse polarography (DPP) . A
decrease of the peak current was observed when cyclodextrins (CDs) were added,.
This decrease is explained due to the change of diffusion coefficient.
Association constants of progesterone-CD system at different pH 2,0, 4,0 y 7,5
were determined. Constants values of 32, 102 and 850 M-1, respectively were found.
These values show a relation between the formation of the complex and pH.
An study of the effect of the agitation in the formation of the complex at different
times comparing with solutions in rest was performed. This also was carried out at
both pH 4.0 and pH 7.5, where it is observed that the agitation is unfavorable to the
formation of the complex at pH 4.0 and there is not a great influence in the formation
of the complex at pH 7.5
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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN..................................................................................... 1
2. OBJETIVOS……………………................................................................ 10
2.1 Objetivo General............................................................................... 10
2.2 Objetivos Específicos........................................................................ 10
2.2.1 Influencia del sustituyentes……………………………………… 10
2.2.2 Influencia del pH……………………………………………..…… 10
2.2.3 Influencia de la agitación………………………………………… 10
3. MATERIALES Y MÉTODOS.................................................................... 11
3.1 Materiales y Equipos.......................................................................... 11
3.1.1 Reactivos y solventes............................................................... 11
3.1.2 Soluciones tampón………..…................................................... 12
3.1.3 Equipos específicos………………………………………………. 12
3.1.4 Equipos uso general………………………………………………. 13
3.1.5 Material de vidrio…………………………………………………… 13
3.2 Método………………........................................................................... 14
3.2.1 Solución tampón……................................................................. 14
3.2.2 Solución progesterona…………………………………………….. 14
3.2.3 Solución β-CD……………………………………………………… 15
3.2.4 Solución SB-β-CD…………………………………………………. 15
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3.3 Obtención constante de asociación………………………..…..…..….. 16
3.4 Estudio electroquímico…………......................................................... 17
4. RESULTADOS Y DISCUCIÓN.................................................................. 18
4.1 Constante de asociación. Efecto del pH…..…….……………………… 19
4.2 Efecto de la agitación en la formación del complejo de inclusión……. 21
4.2.1 Resultados obtenidos con β-CD a pH 4,0..................................... 21
4.2.2 Resultados obtenidos con SBEβ-CD a pH 4,0............................. 23
4.2.2 Resultados obtenidos con β-CD a pH 7,5……............................. 27
4.2.2 Resultados obtenidos con SBEβ-CD a pH 7,5............................. 28
5. CONCLUSIÓN………………….................................................................. 31
6. REFERENCIAS………………………………………………………………… 32
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1. INTRODUCCION
La progesterona (Fig.1.1) es una hormona sexual femenina que es
sintetizada durante la fase folicular, en una fase inicial por las células foliculares
y posteriormente en mayor cantidad por el cuerpo lúteo. Tiene diversas
funciones dentro del organismo como estimular el desarrollo y la actividad del
endometrio secretor, previamente estrogenizado, para ser receptivo al
blastocisto. En el útero gestante, la progesterona deprime su excitabilidad y, de
este modo, reduce la contractilidad. [1].
Farmacológicamente la progesterona se caracteriza por tener una vida
media de eliminación breve, y experimenta un extenso metabolismo de primer
paso hepático cuando se administra por vía oral; la biodisponibilidad oral es
muy baja aunque aumenta en cierto grado cuando se administra en un vehículo
oleoso y por micronización [2], por estas razones en la actualidad se prefiere
usar derivados de la progesterona (progestágenos). Existen múltiples derivados
sintéticos que pueden ser útiles por vía oral o que actúen durante varios meses.
O
O
C D
A B
Fig.1.1: Molécula de progesterona
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La utilidad farmacológica de la progesterona se da mayoritariamente en
terapias de anticoncepción y tratamiento de la menopausia. Se ha visto que
puede ser usada en tratamientos para prevenir partos prematuros en algunos
embarazos de alto riesgo [3].
Al carecer de una buena solubilidad en medio acuoso, la progesterona
resulta difícil de manejar al momento de trabajar en la forma farmacéutica y
limita las vías de administración (generalmente, inyectable en medio oleoso).
Es por esto que la posibilidad de trabajar con complejos de inclusión de
ciclodextrinas resulta interesante de estudiar, para encontrar una posible
solución a estos problemas.
Las ciclodextrinas (CD) se obtienen en la degradación enzimática del
almidón para producir un oligosacárido cíclico formado por distinto número de
residuos de D(+) glucopiranosa unidos mediante enlaces α (1-4) (Fig.1.2). Las
enzimas utilizadas se llaman ciclodextrin-glicosil-transferasas (CGT-asas).
Fig.1.2 Representación del enlace α (1,4) de la CD
En la producción de ciclodextrinas se obtiene distintos tipos de
ciclodextrinas siendo las más importantes: α-CD, β-CD y γ-CD, que contienen
6, 7 y 8 unidades de D(+) glucopiranosa, respectivamente.
OHO
OHO
OOH
O
HO OH O
OH
1 4
3
Las tres CDs difieren no solamente en su diámetro interior, relacionado
directamente con el número de unidades de glucopiranosa (Fig.1.3), sino
también en su solubilidad en agua y peso molecular (Tabla 1.1). La más
estudiada es la β-CD, porque presenta el tamaño y forma apropiada para
interactuar eficientemente con numerosos fármacos. [4, 5]
Fig. 1.3: Dimensiones de las moléculas de ciclodextrina.
Propiedades α CD β CD γ CD Unidades de D(+)-glucopiranosa 6 7 8
Masa molar (g/mol) 973 1135 1297 Diámetro de la cavidad (Å) 4.7-5.3 6.0-6.5 7.5-8.3
Temperatura de descomposición (oC) 250-260 255-265 240-245Solubilidad en H2O (g /100 mL a 25 C) 14.5 1.85 23.2
Profundidad de la cavidad (Å) 7.9 7.9 7.9 Diámetro de la periferia (Å) 14.6 15.4 17.5
Volumen aproximado de la cavidad: Por molécula (Å3) 174 262 972
Moléculas de H2O en el interior de la cavidad 8 11 17 Tabla 1.1: Propiedades fisicoquímicas de las ciclodextrinas [6]
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Es bien conocida la capacidad de las ciclodextrinas de formar complejos
de inclusión con una gran variedad de moléculas. Esta capacidad se basa en el
hecho que las ciclodextrinas proporcionan una cavidad hidrofóbica en solución
acuosa, (Fig.1.4 A) pudiendo unirse a compuestos hidrofóbicos o una parte de
la molécula que formará un complejo estable. (Fig.1.4 B). [7]
La principal característica de estos complejos es que no poseen enlaces
covalentes, las interacción entre las dos moléculas estaría dada por uniones de
baja energía, como puentes de hidrogeno y fuerzas de Van der Waals.
Fig.1.4 (A) Forma toroidal (cono truncado) de la molécula β-CD. (B) Esquema de
formación de un complejo de inclusión con una molécula hidrofóbica (xileno)
6.5 Aº6,5 Å AAº
B
A
5
En general las ciclodextrinas se utilizan para obtener ciertas ventajas
que resultan de la complejación con éstas. Estas incluyen el aumento de la
solubilidad del compuesto huésped, aumento de la estabilidad disminuyendo
los efectos de la luz, calor, y oxidación sobre la molécula, enmascaramiento de
efectos indeseados como olor y sabor, reducción de la volatilidad, y otras. En
algunos casos, se obtiene más de una ventaja por la complejación con
ciclodextrinas. [8]
El estudio de los complejos de inclusión de CD con distintos fármacos ha
demostrado que no tan solo se puede obtener una mejoría en la solubilidad en
medio acuoso de los fármacos, también se ha visto mejorías en parámetros
farmacocinéticos [9].
Debido a sus características de bioadaptabilidad y multifuncionalidad, las
ciclodextrinas pueden ser empleadas para ser administradas por diferentes
vías. Así, por ejemplo, la ciclodextrina y sus derivados permiten una efectiva
administración oral en varios fármacos [10] mejoran la biodisponibilidad y por lo
tanto los efectos farmacológicos de drogas subcutáneas [11] y pueden reducir
los efectos laterales. [12]
La β-CD (Fig.1.5 A) es usada principalmente en formulaciones orales y
ungüentos. Su uso parenteral esta restringido debido a que presenta
nefrotoxicidad aguda. Los derivados sintéticos como sulfobutileter-β-CD
(SBEβCD) (Fig.1.5 B), presentan una mayor solubilidad en agua lo cual
disminuye su toxicidad renal permitiendo su administración parenteral [13].
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A B
Fig.1.5 Representación grafica de la estructura de (A) ciclodextrina y (B) su
derivado sulfobutilciclodextrina (R= (CH2)4 SO3Na)
La toxicidad antes mencionada de la β-ciclodextrina esta dada porque es
reabsorbida por las células epiteliales del tubulo proximal, esto al parecer
aumenta la actividad lisosomal lo que causa necrosis lo que llevaría a la
nefrotoxicidad. También precipita en el torrente sanguíneo al formar complejos
con otras moléculas como fármacos existentes o colesterol.
En solución acuosa, la formación del complejo de inclusión es un
equilibrio dinámico de fármaco libre (E), CD libre (CD) y el complejo (E-CD).
E + CD E-CD [Ec.1.1]
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En el caso de complejos de inclusión 1:1, la constante de asociación
(Ka 1:1) se puede definir como:
Ka 1:1 = [E-CD] [Ec. 1.2] [E] [CD]
Donde:
[E]: concentración del fármaco libre
[CD]: concentración de CD libre
[E-CD]: concentración del complejo de inclusión
Ka 1:1: constante de asociación para la formación del complejo de inclusión
La determinación de la constante de asociación del complejo de
inclusión es importante ya que da cuenta de cambios en las propiedades
fisicoquímicas de la molécula al ser incluida. La mayoría de los métodos para
obtener los valores de constante de asociación están relacionados con el
estudio de cambios en las propiedades fisicoquímicas de las moléculas
huésped, estimando las dependencias con la concentración. Varias técnicas
han sido aplicadas con el fin de determinar la constante de asociación de un
amplio número de complejos de inclusión: absorción UV-visible [14], H-NMR
[15], fluorescencia [16], dicroísmo circular [17], HPLC [18,19] y métodos
electroquímicos [20]
Las técnicas electroquímicas ofrecen una alternativa, mostrando ser lo
suficientemente sensibles para bajas concentraciones de diversas especies
electroactivas, combinando rapidez de medición y selectividad. La polarografía
8
de pulso diferencial ha mostrado dar buenos resultados en el estudio de los
complejos de inclusión de ciclodextrinas [21].
El interés de esta memoria es estudiar algunos factores que pueden
afectar este equilibrio cuando se utilizan técnicas electroquímicas para
determinar las constantes de asociación.
Estos factores pudieran resultar determinantes al crear una formulación
con el complejo de inclusión. Determinar su estabilidad a diferentes pHs nos
daría una guía del comportamiento del complejo en el organismo por ejemplo
como un fármaco por vía oral, ya que en el tracto digestivo encontramos pHs
muy diferentes.
El comportamiento frente a la agitación nos ayudaría a optimizar los
procesos industriales al producir el fármaco y además un posible
comportamiento frente al organismo.
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2. OBJETIVOS
2.1.- Objetivo General
Estudiar el efecto del pH y del tiempo de agitación en el equilibrio de
formación del complejo de inclusión ciclodextrina-progesterona mediante
polarografía de pulso diferencial (PPD)
2.2.- Objetivos Específicos
2.2.1 Influencia del sustituyente
Comparar el comportamiento que presentan dos tipos de
ciclodextrina, β-ciclodextrina y un derivado sulfobutil-β-ciclodextrina
con progesterona.
2.2.2 Influencia del pH
Determinar el efecto del pH sobre la asociación de progesterona y
ciclodextrina a pH ácido (pH 2,0 y 4,0) y otro neutro (pH 7,5)
2.2.3 Influencia del tiempo de agitación
Estudiar como afecta el tiempo de agitación en la formación y
estabilidad del complejo de inclusión.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales y Equipos
3.1.1 Reactivos y Solventes
• Progesterona (99%), Sigma.
• β-ciclodextrina (99,9%), βCD, Calbiochem.
• Sulfobutileter-β-ciclodextrina, SBEβCD, Captisol©.
• Ácido bórico (99%) p.a. Merck.
• Ácido acético glacial p.a. J. T. Baker
• Ácido fosfórico (85%) p.a. Merck.
• Fosfato dibásico de sodio anhidro. J. T. Baker
• Agua desionizada pureza milli-Q (18,2 MΩ cm.)
• Etanol absoluto (EtOH) (99,8%) p.a., Merck.
• Hidróxido de sodio (pellets) p.a. Merck.
• Ácido clorhídrico fumante (37%) p.a. Merck.
• Nitrógeno extra puro (99,9%) AGA Chile S.A.
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3.1.2. Solución tampón
• Buffer Britton Robinson 0,1 M
3.1.3 Equipos específicos
• Analizador voltamétrico con adquisición digital BAS CV-50W
• Celda electroquímica:
a) Celda electroquímica BAS (25 mL)
b) Electrodo de trabajo: Goteante de Mercurio.
c) Electrodo de Referencia: Ag/AgCl.
d) Electrodo Auxiliar: Alambre de Platino.
• Sistema Computacional Atlhon 900 MHz, Pentium III, para
adquisición y tratamiento de datos.
3.1.4 Equipos uso general
• Agitador magnético Heidolph MR 3002.
• Balanza de precisión Precisa 40SM-200ª (sensibilidad 0,01 mg).
• Balanza granataria PJ Precisa Junior 500C (sensibilidad 1 mg).
• Medidor de pH WTW modelo pMx 3000.
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• Medidor de pH WTW modelo pH537.
• Sistema purificador de agua Milli-Q Ultra- Pure Water System.
• Sonicador Bransonic Branson 2210.
3.1.5. Material de Vidrio
• Todo el material de vidrio utilizado fue clase A.
3.2 Método
3.2.1. Solución tampón: buffer Britton Robinson 0,1 M
En un matraz de 500 mL se agregan 3,09 g de H3BO4, 3,37 mL
H3PO4 y 2,86 mL CH3COOH, se afora con agua Milli-Q
3.2.2. Soluciones de progesterona.
Se prepara una solución de progesterona 0,02 M en etanol en un
matraz de 5 mL, como solución stock.
De esta solución se toma una alícuota para generar una solución 0,1
mM en un matraz de 100mL, se agrega 20mL etanol absoluto y se
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completa el volumen con Buffer Britton Robinson 0,1 M y se lleva al
pH de trabajo con pequeños volúmenes de hidróxido de sodio
concentrado
3.2.3. Solución de βCD.
Se pesa 0,0227 g de βCD necesarios para producir 10 mL de una
solución 2mM. Se disuelve directamente con la solución de
progesterona 0,1mM 20/80 etOH/buffer con el pH ajustado a 4,0 ó
7,5
3.2.4. Solución de SBEβCD.
Se pesa 0,04164 g de SBEβCD necesarios para producir 10 mL de
solución 2mM. Se disuelve directamente con la solución de
progesterona 0,1mM 20/80 etOH/buffer con el pH ajustado a 4,0.
Se pesa 0,02082 g de SBEβCD necesarios para producir 10 mL de
solución 1mM. Se disuelve directamente con la solución de
progesterona 0,1mM 20/80 etOH/buffer con el pH ajustado a 7,5.
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3.3 Obtención de la constante de asociación.
Para obtener la constante de asociación mediante polarografía de pulso
diferencial (PPD), se prepararon soluciones de trabajo de una concentración de
0,1 mM de progesterona en mezclas buffer Britton Robinson 0,1 M/etanol
(80/20) a pH 2,0, 4,0 y 7,5. Se adicionaron cantidades adecuadas para obtener
distintas concentraciones de β-CD. Previo a cada determinación, las soluciones
fueron burbujeadas con nitrógeno extra puro por 5 minutos.
Para evaluar la constante de formación se utiliza la corriente medida en
ausencia (io) y presencia (i) de diferentes concentraciones de CD [22, 23]:
[ ]( )
aa KiiAK
CD−
−−
=0/1
11 [Ec.3.1]
Donde,
Ka = Constante de asociación.
i = Corriente de pico en presencia de CDs.
io = Corriente de pico en ausencia de CDs.
A = Constante.
[CD] = Concentración molar de CDs.
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3.4 Estudio electroquímico
Para el desarrollo de estos estudios se prepararon soluciones de trabajo
de 10 mL en una concentración de 0,1 mM de progesterona en buffer Britton
Robinson 0,1M y EtOH en una proporción 80/20 con una concentración de βCD
o SBEβCD de 2 mM para pH 4,0. Para pH 7,5 se utilizó la misma concentración
de βCD pero se utilizó 1mM de SBEβCD.
Se utilizó una celda electroquímica de 25 mL formada por electrodo
goteante de mercurio como electrodo de trabajo, electrodo de Ag/AgCl como
electrodo de referencia y alambre de platino como electrodo auxiliar. Antes de
cada medición se burbujeó con N2 extra puro 5 min.
Se realizaron estudios de efecto del tiempo de agitación sobre el
equilibrio de la formación de complejos. Se trabajo con 4 sistemas
• Tiempos cortos de agitación (15, 30 y 60minutos)
• Tiempos largos de agitación (14 horas)
• Tiempos cortos sin agitación (15, 30y 60 minutos)
• Tiempos largos sin agitación (14 horas)
Las soluciones que tuvieron un tiempo de 14 horas, se les dejó 2 horas
de reposo antes de comenzar las mediciones.
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Estudios electroquímicos: polarografía de pulso diferencial (PPD)
La formación del complejo de inclusión es un proceso en equilibrio que
puede ser descrito de manera general como:
Fármaco + βCD ↔ Fármaco-βCD
En estudios realizados previamente para el sistema progesterona-
ciclodextrina [20] se ha encontrado que existe una disminución de la corriente
de reducción de la progesterona en presencia de ciclodextrina. Esta
disminución es explicada porque el complejo presenta un coeficiente de
difusión menor comparado con la molécula libre.
De esta manera, al aumentar la concentración de CD, disminuye la
concentración de progesterona libre que es la que difunde más rápido hacia la
superficie del electrodo y por lo tanto, disminuye la corriente de reducción.
En este trabajo de memoria se estudia el efecto del pH y tiempo de
agitación sobre el equilibrio de formación del complejo de inclusión mediante
PPD.
Se evaluó la formación del complejo de inclusión a distintos pH 2,0, 4,0 y
7,5. Esto para revisar el comportamiento del complejo frente a los distintos pHs
que podría encontrar en el organismo al formularse como producto
farmacéutico.
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Además se evaluó el tiempo de agitación con el objeto de obtener una
relación entre tiempo de agitación y formación complejo. Esto es para verificar
si tiene influencia en la formación del complejo
4.1 Constante de asociación. Efecto del pH 4.1.1. Caracterización electroquímica del complejo de inclusión de
progesterona con βCD a pH 2,0, 4,0 y 7,5.
La interacción entre progesterona y βCD se estudió mediante
polarografía de pulso diferencial. Se registró la corriente de progesterona 0,1
mM en buffer Britton Robinson/etanol (80/20) a pH 2,0, 4,0 y 7,5, en ausencia y
presencia de distintas concentraciones de βCD. Las soluciones fueron
preparadas agitando durante 10 minutos cada muestra
La progesterona presenta una única señal de reducción la cual ha sido
atribuida a la reducción vía 2 electrones del doble enlace conjugado con el
grupo carbonilo (-C=C-C=O) presente en el anillo A de la molécula. La señal se
desplaza a valores más negativos a medida que aumenta el pH. El potencial de
pico (Ep) se desplaza con el pH encontrando la señal a -1,03, -1,15 y -1,39 V
a pH 2,0, 4,0 y 7,5, respectivamente, lo que implica que el proceso de
reducción se dificulta con el aumento del pH.
Se observa en los polarogramas (Fig. 4.1) que al aumentar la
concentración de βCD, existe claramente una disminución de la corriente de
pico. Es interesante destacar que a pH 2,0 se puede trabajar con altas
concentraciones de βCD sin que el complejo precipite en la solución. También
existe un cambio gradual del Ep a medida que aumenta la concentración de
18
CD. Este cambio en presencia de CD alcanza los 30 mV con respecto a la
señal de reducción de progesterona libre.
-1000 -1200 -1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
-1200 -1400 -1600
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
-1000 -1200
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
I /µA
E /mV (Ag/AgCl)
[β-CD] /mM 0.0 1.0 2.0 3.0 3.5 4.0
C)B)A)I /µA
E /mV (Ag/AgCl)
[β-CD] /mM 0.0 0.25 0.50 0.75 1.0 2.0
[β-CD] /mM 0 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10
I /µA
E /mV (Ag/AgCl)
Fig. 4.1: Polarogramas de pulso diferencial de soluciones progesterona 0,1mM a A) pH 2,0 B) pH 4,0 y C) pH 7,5. Con concentraciones crecientes
de β-CD
En el caso de pH 4,0 existe este cambio gradual de Ep, siendo un poco
mayor que a pH 2,0 alcanzando los 40 mV de la señal de reducción. A este pH,
se observa precipitación posiblemente del complejo a concentraciones de βCD
ligeramente superiores a 4mM.
19
A pH 7,5 prácticamente no se observa cambio de potencial de la señal
de reducción. Sin embargo, se debieron utilizar concentraciones aun más bajas
de βCD, ya que cuando la concentración es de 2,0 mM, la corriente ha
disminuido casi a un tercio del valor inicial y se observa una señal a potenciales
más negativos. Además, comienza a observarse precipitación. Es muy
probable que las dos señales observadas puedan corresponder a la reducción
de la progesterona libre y de la progesterona formando complejo, el cual
ocurriría a un potencial más negativo.
La disminución de la corriente se ha explicado en base a la disminución
del coeficiente de difusión observado de progesterona formando un complejo
de inclusión con CD comparado con el coeficiente de difusión de progesterona
libre. Esta disminución en el coeficiente de difusión ha sido verificada mediante
cronoculombimetría [24]. A partir de la disminución de la intensidad de la
corriente observada mediante polarografía de pulso diferencial y utilizando la
ecuación 3.1, se obtienen los valores de la constante de asociación
determinada a cada pH utilizando βCD (tabla 4.1)
Tabla 4.1: Constantes de asociación
Ka pH
32 ± 6 2,0
102 ± 8 4,0
126 ±5 5,0*
850 ±27 7,5
(*): El valor a pH 5,0 fue obtenido previamente [25]
20
La constante de asociación (Ka) esta relacionada a las concentraciones
de las especies que se encuentran en la solución, por lo que los factores que
pueden hacer variar estas concentraciones tienen influencia directa sobre Ka.
Tanto el pH como la agitación pueden variar las concentraciones.
La agitación puede hacer variar la Ka ya que puede provocar un cambio
en las concentraciones de equilibrio favoreciendo o no la formación del
complejo y por consiguiente, modificando las concentraciones de CD y
progesterona libres.
El pH causa una variación en la ionización de las especies, lo que afecta
su solubilidad o concentración en la solución, además influye en la estabilidad
de los complejos, la afinidad entre las dos moléculas que lo forman. En el caso
del pH, se puede ver que Ka aumenta a medida que aumenta el pH, esto nos
indica que el complejo es más estable a estos pHs. Llama la atención que se
observa un cambio en el potencial de pico a pH 2,0 y 4,0 con la adición de CD
mientras que a pH 8,0 eso no se observa. Aunque no tenemos certeza aun del
factor que provoca este efecto, una razón que explicaría el cambio de potencial
tiene relación con una energía extra requerida para que el anillo A reaccione
sobre la superficie (la parte electroquímicamente activa de la progesterona). El
hecho de no observar dicho cambio de potencial a pH 8,0 podría ser explicado
por un cambio en la orientación de la molécula a ser incluida, dejando hacia el
exterior el grupo electroactivo (anillo A). Es posible también, que a pH básico
se puedan separar las señales de reducción de progesterona libre y del
complejo, lo que explicaría que disminuye la intensidad de la señal sin cambio
de potencial con la concomitante aparición de una señal a potenciales más
negativos.
21
4.2 Efecto de la agitación en la formación del complejo de inclusión.
4.2.1 Resultados obtenidos con β-CD a pH 4,0.
Para realizar el estudio se utilizan soluciones de progesterona de
concentración constante en presencia de 2 mM de βCD, las cuales son
agitadas durante distintos tiempos (15, 30, 60 minutos y 14 horas). Cabe hacer
notar que todas las soluciones fueron preparadas en las mismas condiciones
variando únicamente el tiempo de agitación durante la preparación de la
solución.
Como se mencionó anteriormente, la corriente disminuye en presencia
de CD. Sin embargo, la agitación parece afectar el equilibrio. Como se observa
en la figura 4.2 A, la corriente inicialmente disminuyó cuando la solución se
agitó durante 15 minutos, pero luego se observó ligero aumento, en forma
proporcional al tiempo de agitación (15, 30, 60 minutos y 14 horas). Cabe
destacar que a pesar de observar un aumento de la corriente, ésta permanece
inferior a la corriente observada en ausencia de CD. Este resultado observado
se explicaría en función a una posible disociación del complejo producto de la
agitación.
En forma paralela se realizó un estudio del efecto del tiempo sin
agitación, de manera de comprobar si es posible alcanzar un equilibrio bajo
estas condiciones y si éste permanece estable al estar en ausencia de
agitación.
Cuando las soluciones permanecen sin agitación, la corriente disminuye
debido a la formación del complejo y se mantiene constante, sin existir cambios
22
significativos en función del tiempo, lo que demuestra que se puede alcanzar
un equilibrio sin necesidad de agitación y que el complejo es estable cuando la
solución está en reposo. (Fig.4.2B). La corriente disminuye más con el tiempo
más largo de reposo, sin embargo, la disminución no es tan relevante
comparada con el tiempo tan largo utilizado.
-900 -1000 -1100 -1200 -1300 -1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
-900 -1000 -1100 -1200 -1300 -1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
CD pH 4,0 Sin agitación
E / mV (Ag/AgCl)
Progesterona 0,1mM CD 2mM 15 minutos CD 2mM 30 minutos CD 2mM 60 minutos CD 2mM 14 horas
I / µAI / µA
B)A) CD pH 4,0 Con agitación
E / mV (Ag/AgCl)
Progesterona 0,1 mM CD 2mM 15 minutos CD 2mM 30 minutos CD 2mM 60 minutos CD 2mM 14 horas
Fig. 4.2: Polarogramas de pulso diferencial de soluciones de progesterona β-CD
2 mM a pH 4.0 A) con agitación y B) sin agitación, en tiempos de 15, 30, 60 minutos y 14 horas
23
4.2.2 Resultados obtenidos con SBEβCD a pH 4,0
En el caso de las soluciones de progesterona con SBEβCD sucede algo
muy semejante a lo que ocurre en el caso de la βCD. En presencia de SBEβCD
se observa una disminución de la corriente debido a la formación del complejo
de inclusión. Al igual que en el caso de la βCD la agitación parece afectar el
equilibrio provocando un cambio en la corriente a medida que aumenta el
tiempo de agitación. (Fig. 4.3 A). De esta manera, la agitación de la solución
pareciera disociar el complejo de inclusión en lugar de favorecer su formación.
-900 -1000 -1100 -1200 -1300 -1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
-900 -1000 -1100 -1200 -1300 -1400
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
I / µAI / µAB)A) SBCD pH 4,0 Con agitación
E / mV (Ag/agCl)
Progesterona 0,1mM SBCD 2mM 15 minutos SBCD 2mM 30 minutos SBCD 2mM 60 minutos SBCD 2mM 14 horas
SBCD pH 4,0 Sin agitación
E / mV (Ag/AgCl)
Progesterona 0,1 mM SBCD 2mM 15 minutos SBCD 2mM 30 minutos SBCD 2mM 60 minutos SBCD 2mM 14 horas
Fig. 4.3: resultados de soluciones de progesterona SBEβCD 2 mM a pH 4.0 A)
con agitación y B) con reposo en tiempos de 15, 30 y 60 minutos
24
La única diferencia es que en este caso se ve un descenso de la
corriente cuando tenemos 14 horas de agitación.
En el caso de las soluciones que permanecen en reposo, también se
obtuvo un resultado semejante al de las soluciones con βCD. Se observa una
disminución de la corriente en presencia de CD, en comparación con la
solución de progesterona. Esta intensidad de corriente se mantiene más o
menos constante, independiente del tiempo. (Fig.4.3 B). Aunque también
notamos una disminución de la corriente a las 14 horas de reposo. Esto podría
significar que en tiempos prolongados se puede alcanzar un equilibrio con o sin
agitación.
Para reflejar el efecto de la agitación, se han graficado la diferencia de
corriente medida en cada experimento con su respectiva desviación estándar
(la cual es obtenida con al menos tres repeticiones en cada caso). Mayor
diferencia entre la señal del complejo y la señal de progesterona libre, es un
reflejo de que el equilibrio está más desplazado a la formación del complejo de
inclusión. (Fig. 4.4)
25
15 30 45 60 840-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
15 30 45 60 840-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
B)A)∆ I (I CD- I prog)
∆ I
Tiempo / minutos
Agitación Reposo
∆ I
∆ I (I SBCD - I prog)
Agitación Reposo
Tiempos / minutos
Fig. 4.4: Gráficos de diferencia entre intensidad de corriente de solución de
progesterona y solución de complejo de inclusión progesterona con A) βCD y B)
SBEβCD a pH 4,0
Para el caso de βCD se ve una mayor diferencia en las soluciones que
tuvieron reposo. Además se ve claramente el efecto del tiempo de agitación en
la formación y estabilidad del complejo, donde a mayor tiempo menor es la
diferencia entre las corrientes; aunque a las 14 horas se puede apreciar un
pequeño aumento de la diferencia lo que indicaría un aumento de la constante
de asociación.
En el caso de las soluciones con reposo, la formación del complejo
parece ser independiente del tiempo de reposo. Esto cambia cuando tenemos
un largo tiempo de reposo (14 horas) donde se ve un aumento considerable de
26
la diferencia, esto indica que a mayor reposo hay una mayor formación del
complejo. (Fig. 4.4A). Sin embargo, el tiempo empleado es sumamente largo.
Los resultados obtenidos con SBEβCD nos muestran un comportamiento
semejante al caso de la βCD, pero más acentuado. Se ve que en las soluciones
con reposo se mantiene una diferencia constante con respecto a los tiempos de
reposo.
En las soluciones con agitación se ve claramente la influencia del tiempo
de agitación en la formación del complejo, y como en el caso de βCD
encontramos un aumento de la diferencia a 14 horas, pero este aumento es
mucho mayor, llegando a ser semejante a lo obtenido en las soluciones con
reposo, lo que nos podría indicar que en este caso tanto con reposo como con
una gran periodo a de agitación se alcanzaría un equilibrio en la formación del
complejo. (Fig. 4.4B)
27
4.2.3 Resultados obtenidos con βCD a pH 7,5
A pH 7,5 se observa que la corriente disminuye en presencia de βCD
debido a la formación del complejo y que dicha disminución es prácticamente
independiente del tiempo, ya sea con agitación o sin ella. La corriente se
mantiene constante en los distintos tiempos, lo que podría mostrar una mayor
estabilidad del complejo a este pH. (Fig.4.5)
-1100 -1200 -1300 -1400 -1500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
-1100 -1200 -1300 -1400 -1500-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
CD pH 7,5 Con Agitación
E / mV (Ag/AgCl)
Progesterona 1mM CD 2mM 15 minutos CD 2mM 30 minutos CD 2mM 60 minutos CD 2mM 14 horas
I / µAI / µA
B)A) CD pH 7,5 Sin Agitación
E / mV (Ag/AgCl)
Progesterona 1mM CD 2mM 15 minutos CD 2mM 30 minutos CD 2mM 60 minutos CD 2mM 14 horas
Fig. 4.5: Polarogramas de pulso diferencial de soluciones de progesterona βCD 2
mM a pH 7.5, con reposo en tiempos de 15, 30, 60 minutos y 14 horas
De esta manera podemos ver que la estabilidad del complejo se ve
afectada por el pH, ya que en el caso de las soluciones a pH 7,5, no se observa
un efecto en la corriente con agitación de la solución.
28
4.2.4 Resultados obtenidos con SBEβCD a pH 7,5
Los resultados obtenidos a pH 7,5 son interesantes en el caso de
SBEβCD, puesto que no se observa un efecto de la agitación en la corriente
medida en su presencia. Se aprecia que la corriente disminuye al formarse el
complejo de inclusión y se mantiene más o menos constante independiente del
tiempo y de la agitación, lo que podría ser evidencia de una mayor estabilidad
del complejo a este pH. (Fig. 4.6)
-1100 -1200 -1300 -1400 -1500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
-1100 -1200 -1300 -1400 -1500
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
I / µAI / µA
SBCD pH 7,5 Sin agitaciónSBCD pH 7,5 Con agitación
E / mV (Ag/AgCl)
Progesterona 0,1mM SBCD 1mM 15 minutos SBCD 1mM 30 minutos SBCD 1mM 60 minutos SBCD 1mM 14 horas
A) B)I /
µA
E / mV (Ag/AgCl)
Progesterona 0,1mM SBCD 1mM 15 minutos SBCD 1mM 30 minutos SBCD 1mM 60 minutos SBCD 1mM 14 horas
Fig. 4.6: Polarogramas de pulso diferencial de soluciones de progesterona
SBEβCD 1 mM a pH 7.5 (A) con agitación y (B) con reposo en tiempos de 15, 30,
60 minutos y 14 horas
29
Al igual que en el caso de pH 4,0 para reflejar el efecto de la agitación a
pH 7,5, se ha graficado la diferencia de corriente medida en cada experimento
con su respectiva desviación estándar (la cual es obtenida con al menos tres
repeticiones en cada caso) (Fig. 4.7)
15 27 39 51 63 840-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
15 27 39 51 63 840-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
B)A)∆ I (I CD- I prog)
∆ I
Tiempo / minutos
Agitación Reposo
Agitación Reposo
Tiempos / minutos
∆ I
∆ I (I SBCD - I prog)
Fig. 4.7: Gráficos de diferencia entre intensidad de corriente de solución de
progesterona y solución de complejo de inclusión progesterona con (A) βCD y
(B) SBEβCD a pH 7,5
30
En este caso se ve una mayor diferencia tanto para las soluciones con
βCD como las con SBEβCD.
En el caso de las soluciones con βCD se aprecia que tantos las
soluciones con agitación, como las con reposo muestran un resultado muy
similar, de lo que podemos concluir que el tiempo de agitación no influye en la
formación del complejo o la estabilidad de este. Incluso los resultados a
tiempos mayores (14 horas) son semejantes a los resultados obtenidos a
tiempos mayores. (Fig.4.7A)
Los resultados obtenidos con las soluciones con SBEβCD son
semejantes a lo obtenido a pH 4,0. Una diferencia mayor en las soluciones con
reposo, y una semejanza en el resultado a 14 horas. (Fig.4.7B)
31
5. CONCLUSIONES
a. La agitación de las soluciones de progesterona- ciclodextrina, puede
afectar el equilibrio del complejo de inclusión. Debemos considerar que
tal vez el equilibrio podría ser diferente y más complejo para derivados
de ciclodextrina.
b. Los complejos de inclusión que se formaron con SBEβCD son más
estables y parecen menos afectados por la agitación. Los sustituyentes
de las ciclodextrinas derivadas serian las responsables de este
comportamiento.
c. El complejo muestra distinto comportamiento a diferente pH, donde a pH
7,5 parece ser más estable y no necesitar, necesariamente, de agitación
para una buena formación.
32
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