estudio del efecto in vitro del extracto hidroalcoholico crudo y fraccionado de las semillas de...

1

Justificacin

Las plantas han sido utilizadas desde tiempos remotos con fines curativos para buscar nuevos agentes teraputicos y siguen siendo una alternativa importante en la medicina moderna (Garca y Morales, 2005).

En la actualidad existe un inters creciente por el estudio y la utilizacin de las plantas medicinales, tanto en pases desarrollados, como en aquellos en vas de desarrollo (Garca y Morales, 2005). Se ha incrementado el inters por las sustancias extradas de plantas, debido quiz a la falta de eficacia de algunos tratamientos alopticos, al abuso o inadecuado uso de las drogas sintticas, incrementando as sus efectos secundarios y a que un gran porcentaje de la poblacin mundial no tiene acceso a los tratamientos farmacolgicos convencionales (Rates, 2001).

Los tratamientos tradicionales (folklricos) de plantas medicinales han sido utilizados en el manejo de diversas enfermedades. As por ejemplo, para el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson (EP), basados en los principios de la medicina Ayurveda, se recomienda una coccin en leche de varias especies de plantas: Mucuna pruriens (especie principalmente encontrada en India), semillas de Hyosciamus reticulates, Withania somnifera y races de Sida cardifolia. Por otro lado, ya existen preparados comerciales de M. pruriens que estn actualmente disponibles en India (Nagashayana et al, 2000).

Diferentes preparaciones de las semillas de M. pruriens se han utilizado en el manejo de la EP debido a que es una buena fuente de L-3,4-dihidroxifenil-alanina (L-Dopa). Estudios fitoqumicos del extracto alcohlico fraccionado de las semillas de esta planta, demostraron la presencia adems de otras sustancias qumicas, entre ellas, compuestos indlicos como la triptamina y la 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Tripathi y Upadhyay, 2001).

La EP es un sndrome clnico que se presenta principalmente en adultos mayores, en la mayora de los casos llega a ser incapacitante, y sus tres principales sntomas son el tremor en reposo, la acinesia y la bradicinesia, adems genera alteraciones de la marcha (Zigmond et al, 2002). La EP idioptica posee como caracterstica fisiopatolgica clsica, la prdida de neuronas dopaminrgicas pigmentadas de la parte compacta (pc) de la sustancia negra en el mesencfalo, que es la regin con mayor cantidad de clulas dopaminrgicas del sistema nervioso central (SNC) (Gibb, 1992).

Otro de los centros cerebrales de control del movimiento implicado en la EP, es el cuerpo estriado. Dentro de ste, existen interneuronas colinrgicas; las cuales reciben aferencias corticales glutamatrgicas excitatorias. Estas interneuronas son controladas colateralmente por la va dopaminrgica proveniente de la sustancia negra (pc), que al activarse inhibe la liberacin de acetilcolina de estas interneuronas. Es por esto, que uno de los tratamientos iniciales en la EP fueron los anticolinrgicos (Braunwald et al, 2001). En relacin con lo anterior, distintos metabolitos producidos por el gnero Mucuna, podran tener un efecto anticolinrgico, mejorando de esta manera los signos y sntomas de la enfermedad (Morais et al, 2004).

2

Hussain y Manyam (1997), evaluaron el efecto que produca un preparado de endocarpo de Mucuna pruriens mezclado con la alimentacin, en ratas macho Sprague-Dawley. Ellos compararon dos dosis de L-Dopa (125 y 250 mg/Kg) + carbidopa, utilizando para tal efecto, el modelo animal de lesin unilateral con 6-hidroxidopamina (6-OHDA). En este estudio, se demostr que Mucuna pruriens, posee casi el doble de la actividad antiparkinsoniana que la obtenida con L-Dopa + carbidopa. Basndose en lo anterior, los autores sugierieron que el endocarpo de M. pruriens adems de L-Dopa podra contener otros componentes con actividad antiparkinsoniana an no identificados, u otras sustancias que potencien la eficacia de ese compuesto.

En el trabajo de tesis realizado por Molina y Sols (2003), de manera anloga a Hussain y Manyam, se obtuvo evidencia del efecto antiparkinsoniano del extracto hidroalcohlico crudo de Mucuna urens, una de las especies de este gnero que se encuentra en C.R. El tratamiento con M. urens + carbidopa (intraperitoneal), mostr un efecto antiparkinsoniano mayor que el efecto obtenido utilizando L-Dopa + carbidopa administrado por la misma va (Molina y Sols, 2003).

En otro estudio del Dr. Fornaguera y la Dra. Badilla an no publicado, M. urens provoc una disminucin en la distancia recorrida por el carbn activado en la prueba de trnsito intestinal con ratas comparado contra solucin salina; sugiriendo de este modo, la presencia de componentes anticolinrgicos dentro del extracto crudo.

Adems, otros estudios preliminares an no publicados llevados a cabo en cultivos de clulas PC-12 (por inters del Dr. Jaime Fornaguera en Crdoba, Espaa), sugieren que el pretratamiento de dichas clulas con el mismo extracto de M. urens tiene un efecto neuroprotector ante dosis crecientes de 6-OHDA. En el mismo estudio se demostr adems un leve efecto de proliferacin celular.

Los hallazgos positivos encontrados hasta ahora en relacin con el extracto de M. urens (Molina y Sols, 2003) fundamentan este trabajo, el cual pretende implementar estudios experimentales que permitan por un lado, comprender mejor los mecanismos subyacentes de los efectos observados, y por el otro, intentar sugerir las molculas responsables.

Por otra parte, los efectos nocivos reportados en la literatura sobre la utilizacin crnica de L-Dopa en pacientes con la EP (Yahr, 1993), se convierten en una motivacin adicional para continuar con ms estudios experimentales sobre posibles tratamientos que permitan disminuirlos.

Objetivo General Evaluar el efecto muscarnico in vitro del extracto crudo y fraccionado de las semillas de Mucuna urens, mediante un modelo celular de receptores acoplados a protenas G.

3

Objetivos Especficos

Realizar la recolecta, el secado y la molienda de las semillas de Mucuna urens, para preparar el extracto hidroalcohlico.

Preparar por percolacin el extracto hidroalcohlico 8:2 de las semillas molidas de M. urens.

Elaborar un liofilizado a partir del extracto hidroalcohlico obtenido de las semillas de Mucuna urens.

Efectuar pruebas fitoqumicas preliminares en M. urens para la identificacin de grupos de metabolitos secundarios.

Determinar el efecto farmacolgico in vitro del extracto hidroalcohlico crudo de M. urens sobre receptores muscarnicos y sobre receptores para quimiocinas asociados con protenas G.

Obtener la huella digital cromatogrfica del extracto hidroalcohlico crudo de las semillas de Mucuna urens.

Llevar a cabo el fraccionamiento cromatogrfico biodirigido del extracto hidroalcohlico crudo de M. urens.

Determinar el efecto farmacolgico de las fracciones del extracto hidroalcohlico de M. urens separadas por HPLC sobre receptores muscarnicos asociados con protenas G.

Marco Terico Enfermedad de Parkinson

La EP, es un desorden progresivo del SNC, que se caracteriza por la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas en la sustancia negra, parte compacta. En muchos casos en estas neuronas ocurre adems la aparicin de inclusiones eosinfilas intracelulares, llamadas cuerpos de Lewy (Braunwald et al, 2001). En la EP, los sntomas caractersticos no aparecen hasta que el grado de prdida celular alcanza casi un 80 % de la poblacin de las neuronas en el caudado putamen y de un 60% en la sustancia negra (Braunwald et al, 2001; Zigmond et al, 2002). La EP se caracteriza clnicamente por: temblor en reposo, rigidez, bradicinesia (lentitud en los movimientos), dificultad con el balance corporal, depresin y demencia (Young, 1999).

4

Bases celulares de la EP

Resulta importante conocer los principios bsicos del funcionamiento cerebral, relacionados con la EP, puesto que este conocimiento, permite comprender los signos y sntomas de la enfermedad, as como las posibles dianas de tratamiento farmacolgico alopticas y folclricas. Las neuronas de la parte compacta de la sustancia negra envan impulsos dopaminrgicos hacia el cuerpo estriado (va nigroestriatal), el cual forma parte de los ganglios basales (Hardman et al, 2001).

A su vez, los ganglios basales se pueden considerar como un asa lateral reguladora que controla el flujo de informacin desde la corteza hacia las neuronas motoras de la mdula espinal. Un subgrupo pequeo pero importante, de las neuronas estriatales incluye interneuronas colinrgicas, las cuales dentro del cuerpo estriado hacen sinapsis con neuronas gabargicas (Hardman et al, 2001).

Figura 1. Diagrama de los circuitos cerebrales en los ganglios basales en estado normal (modificado de Hardman et al, 2001).

La emisin de impulsos desde el cuerpo estriado se efecta por dos vas distintas denominadas directa e indirecta (Hardman et al, 2001). La va directa est formada por neuronas del cuerpo estriado que se proyectan hacia la parte reticulada de la sustancia negra y la parte medial del

STR

SNpc GPL SNT

Tlamo VA / VL

SNpr / GPM

Corteza Cerebral

Neuronas Glutamatrgicas excitadoras. Neuronas Gabargicas inhibitorias. Neuronas Dopaminrgicas.

+

-

STR = cuerpo estriado (neoestriado) SN = sustancia negra, pc = pars compacta y pr = pars reticulata GP = globo plido, L = lateral (externo), M = medial (interno) STN = ncleo subtalmico VA = ventroanterior VL = ventrolateral

Va Indirecta

D2 D1

Va Directa

5

globo plido (ver figuras 1 y 2); mientras que la va indirecta est formada por neuronas estriato-palidales que se unen con la parte lateral del globo plido, luego otras neuronas conectan con el ncleo subtalmico, y este a su vez con el globo plido medial (Gerfen, 2006).

Figura 2. Diagrama de los circuitos cerebrales en los ganglios basales con Enfermedad de Parkinson (modificado de Hardman et al, 2001). En el diagrama las lneas punteadas representan una disminucin en la actividad de la va, mientras que las lneas ms gruesas simbolizan una actividad aumentada en la va esquematizada.

El neurotransmisor de la va directa es el cido -amino butrico (GABA), un neurotransmisor con funciones inhibidoras; cuyo efecto neto de estimulacin por la va directa, consiste en un incremento de la emisin de impulsos excitadores del tlamo hacia la corteza (ver figuras 1 y 2). Por tanto, la dopamina que se descarga en el cuerpo estriado tiende a incrementar la actividad de la va directa y a reducir la de la va indirecta, en tanto que, el agotamiento del neurotransmisor que ocurre en la EP tiene el efecto opuesto (ver figura 2) (Hardman et al, 2001).

El xito de este modelo de funcin de los ganglios basales, radica en que explica los sntomas observados en casos de EP, como una consecuencia de la prdida de neuronas dopaminrgicas por el efecto diferencial de la dopamina en las vas directa e indirecta (ver figura 2). Las neuronas dopaminrgicas de la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) inervan todas las partes del cuerpo estriado; sin embargo, las neuronas estriatales expresan dos tipos distintos de receptores de dopamina. Las neuronas estriatales que originan la va directa, expresan primordialmente el receptor dopaminrgico D1, cuya respuesta est asociada a un aumento de adenilatociclasa (AC). En tanto que las neuronas estriatales que forman la va indirecta, expresan fundamentalmente el D2 cuya respuesta est asociada a una disminucin de AC (Marsden, 2006).

SNpc PGL SNT

SNpr / GPM

Corteza Cerebral

STR Tlamo VA / VL

Va Indirecta

D1 D2

Va Directa

Neuronas Glutamatrgicas excitadoras. Neuronas Gabargicas inhibitorias. Neuronas Dopaminrgicas.

+

-

6

Manifestaciones clnicas

Algunas de las manifestaciones ms comunes y evidentes al avanzar la EP como se mencion anteriormente, son el temblor en reposo, la bradicinesia y la rigidez. El temblor empeora con la ansiedad. Suele comenzar con movimientos rtmicos de flexo-extensin de una o ambas extremidades del mismo lado, antes de generalizarse. La manifestacin ms incapacitante es la bradicinesia, que consiste en un enlentecimiento de los movimientos voluntarios asociado con una disminucin de los movimientos automticos, como el balanceo de los brazos al caminar. La fuerza en las extremidades se conserva, pero los movimientos finos y los movimientos alternos rpidos estn alterados (Braunwald et al, 2001). La expresin facial se vuelve fija, las hendiduras palpebrales se ensanchan y el parpadeo es escaso. La combinacin de temblor, rigidez y bradicinesia, hace que la letra se vuelva pequea, temblorosa y con frecuencia ilegible (Marjama-Lyons y Koller, 2001). La voz se vuelve hipofnica (dbil) y poco modulada. Los pacientes tienen dificultad para levantarse de la cama o de una silla, y tienden a adoptar una postura en flexin cuando estn de pie. Con frecuencia les cuesta iniciar la marcha, y tienen que inclinarse cada vez ms hacia adelante para conseguir comenzar a caminar. En los estadios finales, la marcha es a pasos cortos, arrastrando los pies, sin balanceo de los brazos, inestable en los giros, y pueden tener dificultad para detenerse. Algunos pacientes caminan con una marcha festinante, es decir con una velocidad cada vez mayor para evitar caerse, debido a que su centro de gravedad ocupa una posicin anormal (Braunwald et al, 2001; Marjama-Lyons y Koller, 2001).

Tratamiento farmacolgico sintomtico

Muchas investigaciones acerca del Parkinson y sus posibles curas se realizan en el mundo entero, pero pese a todos esos esfuerzos an no se dispone en el mercado de un tratamiento que logre revertir completamente la enfermedad. Los tratamientos actuales se dirigen a compensar los desajustes fisiolgicos y paliar los sntomas. Desde un inicio, el tratamiento de la EP se ha dirigido a restablecer la funcin del sistema dopaminrgico; el cual, como ya se mencion, se encuentra fuertemente afectado en esta enfermedad.

El tratamiento ms utilizado es la levodopa (L-Dopa) por sus evidentes beneficios teraputicos. El uso de la levodopa, precursor metablico de la dopamina provoca una mejora sintomtica especialmente sobre la bradicinesia. La presencia en la mucosa intestinal de la dopa descarboxilasa, que convierte la levodopa en dopamina, hace que se pierda la mayor parte de la dosis ingerida antes de que entre en la circulacin general. Por esa razn, la L-Dopa se administra con un inhibidor extracerebral de la dopa-descarboxilasa (carbidopa en EU y benserazida en Europa), el cual disminuye su transformacin perifrica en dopamina (que no pasa la barrera hematoenceflica). De esta manera se disminuye la incidencia de efectos secundarios perifricos producidos por ese neurotransmisor y se aumenta la biodisponibilidad del medicamento en sangre y en cerebro (Braunwald et al, 2001).

Los efectos secundarios iniciales ms frecuentes de la levodopa son: nuseas, vmitos, hipotensin postural y en algunos casos arritmias cardiacas. La utilizacin crnica de este tratamiento produce otros sntomas como movimientos anmalos (discinesias), inquietud motora (acatisia) y confusin (Braunwald et al, 2001). Un problema habitual es la aparicin del

7

fenmeno de desgaste; cada dosis de levodopa mejora de modo eficaz la movilidad durante cierto periodo, pero rigidez y acinesia vuelven pronto al final del intervalo entre dosis. En las etapas tardas de la EP, los pacientes pueden fluctuar con rapidez entre estar inactivos u off, sin efectos beneficiosos de sus medicamentos, y estar activos on pero con discinesias incapacitantes, situacin que se ha denominado fenmeno de actividad e inactividad (encendido on y apagado off) (Hardman et al, 2001; Marjama-Lyons y Koller, 2001).

Otro de los tratamientos ms utilizados, han sido los antagonistas de los receptores muscarnicos. Los cuales, actan dentro del cuerpo estriado disminuyendo su actividad anormalmente elevada en los pacientes con la EP (Hardman et al, 2001). Los antagonistas muscarnicos no selectivos (frmacos anticolinrgicos), pueden ser tiles sobre todo para mejorar el temblor. Diferentes preparados estn disponibles en el mercado, tales como el trihexifenidilo, mesilato de benztropina, clorhidrato de difenhidramina, la prociclidina y la orfenadrina (Braunwald et al, 2001). Los efectos adversos de estos medicamentos son el resultado de sus propiedades anticolinrgicas; causando as, problemas de sedacin y confusin mental. Tambin pueden provocar estreimiento, retencin urinaria y visin borrosa (Hardman et al, 2001).

Otros tratamientos tambin usados para la EP son los agonistas del receptor de dopamina, los inhibidores de la catecol-O-metil transferasa, los inhibidores de la enzima monoaminoxidasa (MAO) y la amantadina (Hardman et al, 2001).

Entre los agonistas del receptor de dopamina estn la bromocriptina (agonista D2 y antagonista D1), la pergolida (agonista mixto D1 y D2), el ropinirol y el pramipexol (agonistas selectivos D2). Esta clase de medicamentos tienden a ser ms selectivos en sus acciones que la levodopa, manifiestan buena selectividad por los diferentes subtipos de receptores; tienen acciones de duracin mucho ms prolongada que la levodopa, y en muchos casos resultan tiles para tratar las fluctuaciones del estado motor (Hardman et al, 2001).

Los inhibidores de la catecol-O-metil transferasa (COMT) como la tolcapona y la entacapona, potencian los efectos beneficiosos de la levodopa al disminuir la conversin de levodopa a 3-O-metildopa aumentando tanto la vida media plasmtica de levodopa, como la fraccin de cada dosis que llega al sistema nervioso central.

La MAO es la enzima encargada de oxidar las monoaminas, esta presenta dos isoenzimas A y B, que se encuentran tanto a nivel perifrico como cerebral. La isoenzima MAO-B es la modalidad predominante en el cuerpo estriado, y la que hace posible la mayor parte del metabolismo oxidativo de la dopamina a este nivel. A dosis bajas, la seleginina es un inhibidor selectivo de la MAO-B, lo cual da como resultado la inhibicin irreversible de la enzima aumentando la concentracin de dopamina disponible (Hardman et al, 2001).

Modelo experimental de la EP inducido por 6-hidroxidopamina

Ya que el presente trabajo se motiv en los resultados obtenidos por Molina y Sols en el 2003 es que se describe brevemente a continuacin el modelo de 6-OHDA empleado por ellos.

8

De manera general, el desarrollo de los modelos animales de EP se ha orientado a inducir modificaciones estructurales o funcionales de la transmisin dopaminrgica nigroestriada. As, estos modelos son de gran utilidad para el estudio del funcionamiento de los ganglios basales, la actividad antiparkinsoniana de determinadas sustancias y la eficacia de posibles tratamientos neuroprotectores (Luquin, 1998).

La 6-OHDA es un anlogo sinttico de la dopamina. El primer efecto descrito fue la capacidad de inducir deplecin noradrenrgica a nivel del sistema nervioso autnomo cardiaco. La accin de la toxina sobre las neuronas dopaminrgicas y noradrenrgicas se debe a su analoga estructural con las catecolaminas; as, cuando se administra en bajas concentraciones intracerebralmente, se introduce a la neurona presinptica dopaminrgica por medio de un sistema de recaptura de alta afinidad (Zigmond et al, 1992).

Una vez en el interior de la clula, la toxina provoca un aumento en el estrs oxidativo, que afectar la estructura y funcin del ADN, produce la peroxidacin lipdica, alterando las estructuras de las membranas celulares y de un gran nmero de protenas (principalmente los puentes disulfuro). Por otro lado se ha visto que el estrs oxidativo causa la inhibicin de la actividad mitocondrial del complejo I, el desacople de la fosforilacin oxidativa y la alteracin del potencial de membrana mitocondrial celular (Lambeng et al, 2002).

Incapaz de atravesar la barrera hematoenceflica, la 6-OHDA, no puede inducir lesin de la sustancia negra en la rata, a menos que sea inyectada estereotxicamente a nivel ventricular, en la sustancia negra o en el cuerpo estriado. Desde el punto de vista conductual, una lesin unilateral considerable del sistema dopaminrgico puede ser evidenciada mediante la administracin perifrica de apomorfina o de anfetamina. Estos frmacos producen un comportamiento giratorio caracterstico contra-lateral o ipsi-lateral respectivamente. As pues, el comportamiento giratorio, permite sugerir un ndice del grado de degeneracin neuronal en los animales y el efecto que pueden estar ejerciendo ciertas sustancias a este nivel (Lambeng et al, 2002).

Las plantas medicinales y su uso popular

En la actualidad existe un inters renovado y creciente por el estudio y la utilizacin de las plantas medicinales, tanto en pases desarrollados como en aquellos en vas de desarrollo. En pases desarrollados se trata, muchas veces de una moda, la cual intenta combatir el excesivo consumo de frmacos de sntesis o evitar los efectos secundarios que de ellos se derivan. En cambio, en los pases en desarrollo se trata ms bien de una opcin alternativa para una gran parte de la poblacin, ante la imposibilidad por limitaciones econmicas, de acceder a una terapia farmacolgica. Tanto en unos pases como en otros, el resultado del uso de plantas medicinales ha desembocado, en muchas ocasiones, en el abuso de drogas de origen vegetal, lo cual apunta a la importancia de validar cientficamente los efectos de las plantas de uso medicinal y popular (Garca y Morales, 2005).

La etnobotnica (o el estudio del uso de las plantas en las sociedades tradicionales) ofrece grandes posibilidades para descubrir nuevos productos tiles a la humanidad y para respaldar los usos tradicionales de las plantas (Acua, 1954).

9

Las diversas especies latinoamericanas de Mucuna, poseen una gran variedad de usos en la medicina popular, razn por la cual es importante comprobar cientficamente sus efectos y ms aun, realizar estudios fitoqumicos sobre los metabolitos que contienen y el efecto de estos a nivel fisiolgico.

Caractersticas y descripcin de la planta estudiada

Nombre cientfico: Mucuna urens (L.) DC: Fabaceae Nombre comn: Ojo de buey, pica-pica (Ocampo, 1987).

Ubicacin geogrfica: es un bejuco propio de tierra templada, que ha sido introducido en un gran nmero de pases. Se utiliza como alimento humano ya sea en forma de harina, espesante para sopas u condimento. El frijol entero (semilla), tambin es usado en los platos cotidianos de muchos pases de escasos recursos. Se usa adems como alimento para animales, forraje (pastura) y abono para suelos, ya que les proporciona nutrientes y minerales (aminocidos, calcio, magnesio e hierro). Su distribucin es muy amplia, se encuentra en pases de Amrica como Mxico, Guatemala, Salvador, Honduras, Belice, Costa Rica, Colombia, Argentina, Brasil, Estados Unidos y Hawai; as como en muchas partes de frica: Nigeria, Ghana, Zambia, Malawi, Repblica de Benn, Repblica de Guinea y Asia: China, Malasia, Madagascar, India, Sri Lanka, Indonesia, Filipinas y Java entre otros (Eilitt et al, 2002).

En Costa Rica, se puede encontrar este tipo de trepadoras en los bosques y malezas del Valle Central. Tambin crece en tierras calientes del Pacfico, en el bosque nuboso de Monte Verde, en manglares, cerros, crecimientos secundarios y hasta en las costas (Nez, 1982).

Existen muchas especies a nivel mundial, de las cuales la ms conocida y caracterizada es Mucuna pruriens (St-Laurent et al, 2000). En nuestro pas se encuentran aproximadamente 8 especies del gnero Mucuna identificadas y reportadas por el Instituto de Biodiversidad (INBIO): Mucuna urens, M. holtonii, M. andreana, M. argyropyilla, M. mutisiana, M. deeringiana, M. sloanei y M. rostrata. (a)

Descripcin botnica de Mucuna sp: es un bejuco leoso y de extenso crecimiento. Las hojas son grandes, suavemente vellosas en el dorso; pednculos grandemente alargados y pendientes; el fruto es una legumbre (vaina) de cerca de 18 cm de largo y 4.5 cm de ancho, con 3 a 4 semillas negras ovoides, de aproximadamente 3 cm de largo cada una (ver figura 3). El trmino ojo de buey se debe a la apariencia de las semillas (Agharkar, 1991; Caius, 1989; Rastogi y Mehrotra, 1994).

La planta Mucuna es una enredadera de brote anual, sus hojas son trifoliadas (tienen 3 lbulos), de forma elptica o rmbica y anchas en la base. Los pecolos son largos y sedosos, con un tamao entre 6.3 y 11.3 cm. Las flores se encuentran en racimos colgantes, con un color que va desde blanco hasta morado oscuro. El fruto de esta planta es una vaina gruesa y rugosa. La superficie total y los rebordes de la vaina estn densamente cubiertos por tricomas (pelos radicales o espinas) caf plido o amarillos, responsables del prurito al entrar en contacto con la piel (Sastry y Kavathekar, 1990; Verma et al, 1993).

10

Figura 3: Detalles morfolgicos de Mucuna sp. (www.waynesword; www.cybertufle)

Usos y composicin qumica de Mucuna sp

Las races, de acuerdo con Ayurveda (conocimiento concerniente a la longevidad), son antihelmnticas, diurticas, emolientes, afrodisacas, purgantes, febrfugas y tnicas (Warrier et al, 1996; Nadkarni, 2001). Son consideradas tiles para aliviar el estreimiento, los problemas menstruales, la amenorrea, la hidropesia, las neuropatas, las hemorroides, las lceras gstricas (Warrier et al, 1996).

Las semillas tienen conocido efecto astringente, expectorante y se usan en el asma, la tos y las infecciones de la lengua (Prakash et al, 2001). Sin olvidar su uso ms conocido en los sntomas de la Enfermedad de Parkinson (Hussain et al, 1997; Manyam et al, 2004 (a); Vaidya et al, 1978).

Para Mucuna pruriens ha sido establecida su actividad como antidiabtica (Akhtar et al, 1990; Grover et al, 2002; Grover et al, 2003; Rathi et al, 2002), antiprotozoaria (Ekanem et al, 2004), antiinflamatoria, antipirtica, analgsica (Hishikar et al, 1981; Lauk et al, 1993) y espermatognica (Saksena et al, 1987).

Hay pocas investigaciones sobre la composicin qumica de las semillas de Mucuna urens, por esto an no se tienen reportes sobre sus componentes. La nica informacin publicada hasta el momento, es la composicin de las semillas de Mucuna pruriens. Esta planta de la misma especie contiene una gran cantidad de compuestos, entre ellos: L-dopa de un 1% a un 5% (L-3,4-dihidroxi-fenilalanina), glutatin, cido glico, bufotenina, colina, lecitina, serotonina, cido 2-amino-3-(3,4-dihidroxifenil) propnico, mucunina, NADH (nicotina adenina dinucletido), coenzima Q-10, cidos grasos, prurienina, prurienidina y cido 1,2,3,4-tetrahidro-6,7-dihidroxi-3-isoquinolinico (Manyam et al, 2004 (b); Prakash et al, 2001). Es adems una buena fuente de minerales como: calcio, magnesio y hierro (Bell et al, 1971; Eilitt et al, 2002; Rastogi y Mehrotra, 1991 (a) y (b); Singh et al, 1995).

La actividad ejercida por las sustancias bioactivas que entran en contacto con los tejidos, se lleva a cabo a nivel molecular por unin a sus receptores que desencadenan una respuesta farmacolgica. En los ltimos aos ha ocurrido un veloz avance en el conocimiento de la estructura qumica y los mecanismos bioqumicos de accin de los receptores fisiolgicos.

11

Tipos de receptores fisiolgicos: Generalidades y clasificacin

Las molculas con que los frmacos son capaces de interactuar selectivamente, generndose como consecuencia de ello una modificacin constante y especfica en la funcin celular, se denominan receptores farmacolgicos (Flrez, 1997).

La decodificacin del genoma humano y la clonacin han permitido la identificacin y descubrimiento de nuevos receptores. Tambin se ha avanzado en la purificacin de muchas clases de receptores, protenas efectoras y protenas transductoras de seal mediante estrategias genticas de expresin celular. Con estos modelos, se logra inducir la expresin de receptores endgenos y exgenos en muy diversos tipos celulares para facilitar su purificacin y la caracterizacin de sus mecanismos de accin (Hardman et al, 2001).

Existen varios tipos de receptores y de mecanismos bioqumicos de transduccin asociados con ellos tenemos a los receptores de membrana como por ejemplo los receptores enzima, los canales inicos, y los receptores acoplados a protenas G. Adems existen los receptores intracelulares, como los receptores de hormonas esteroideas (Hardman et al, 2001; www.123bio.net). A continuacin se describirn en ms detalle los receptores acoplados a protenas G ya que sern objeto de estudio en el presente trabajo.

Receptores acoplados a protena G: es una gran familia de receptores conocidos como protenas G, que utilizan protenas reguladoras heterotrimricas que unen GTP, para realizar la transduccin de seales hasta las protenas efectoras. Los efectores regulados por protenas G incluyen enzimas como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C y los canales selectivos para calcio y potasio. Los receptores acoplados a protenas G, atraviesan las dos capas de la membrana plasmtica en forma de un haz de siete hlices alfa con el grupo amino en la cara extracelular y el grupo carboxilo en la cara intracelular. Los ligandos pueden unirse de tres formas diferentes al receptor: 1) los que se ligan a nivel de las regiones transmembrana del receptor sin interaccionar con su grupo amino terminal. 2) los que se unen a nivel de los bucles extracelulares e interaccionan con el grupo amino terminal del receptor. 3) los que se ligan al receptor solo por unin al grupo amino terminal de extremo largo. Las protenas G se ligan a la superficie citoplasmtica de los receptores. Los receptores de esta familia al ser estimulados por agonistas promueven la unin de GTP con la protena G y as la protena se disocia y queda en su forma activa. Los sistemas de protenas G forman redes complejas de interacciones divergentes y convergentes que permiten una regulacin multifsica de la funcin celular (Hardman et al, 2001).

Segundos mensajeros citoplasmticos

Algunas seales fisiolgicas asociadas con los mecanismos de transduccin anteriormente citados, se integran dentro de la clula como resultado de interacciones entre vas de segundos mensajeros. Entre los segundos mensajeros hidroflicos ms conocidos estn el AMP, GMP cclicos, el inositol trifosfato (IP3) y los iones calcio; entre los mensajeros hidrfobos estn el xido ntrico y el diacilglicerol.

12

Calcio: los iones de calcio constituyen un segundo mensajero bastante estudiado; su concentracin intracelular es regulada a travs de diversos mecanismos: receptores de membrana plasmtica asociados con protenas G; cambios en el potencial de membrana, los propios iones potasio o calcio, y receptores en regiones especializadas del retculo endoplasmtico que reaccionan al IP3. El calcio citoplasmtico es eliminado por extrusin y/o posterior retorno hacia el retculo endoplsmico (Hardman et al, 2001).

Regulacin de receptores

La estimulacin ininterrumpida de clulas por agonistas suele culminar en un estado de desensibilizacin (llamado tambin estado resistente o de regulacin sustractiva), de modo que disminuye el efecto que surge con la exposicin continuada o ulterior del frmaco a la misma concentracin. La desensibilizacin de la respuesta a un agonista, es llevada a cabo principalmente mediante cuatro mecanismos: disminucin de la concentracin de agonista por degradacin o recaptura pre-sinptica; desacople funcional por fosforilacin y unin de arrestinas; internalizacin de complejos fosforilados ligando-receptor y regulacin negativa del nmero de receptores en la superficie celular (disminucin de sntesis y degradacin) (www.123bio.net).

La inhibicin de seales por medio de retroalimentacin puede limitarse a las que enva solamente un receptor estimulado, llamado desensibilizacin homloga. Mientras que la desensibilizacin heterloga comprende la inhibicin o la prdida de una o ms protenas corriente abajo que participan en el envo y recepcin de seales de otros receptores (Hardman et al, 2001).

Dada la relacin de la acetilcolina con el funcionamiento general de los ganglios basales, a continuacin se describen los receptores para este neurotransmisor.

Receptores muscarnicos su y transduccin de seales

La acetilcolina es un neurotransmisor liberado de las terminales de nervios presinpticos en vesculas, actuando luego sobre receptores nicotnicos y muscarnicos. Dos tipos de receptores de acetilcolina, muy diferentes en cuanto a su estructura y funcin (Felder, 1995). La familia de receptores muscarnicos fueron descubiertos gracias a su habilidad de unir el alcaloide muscarina, derivado del hongo venenoso Amanita muscaria. Los receptores muscarnicos estn compuestos de una sola protena con el mismo conjunto de caractersticas estructurales unidas a la superfamilia de los receptores acoplados a protenas G (Felder, 1995).

La estimulacin del receptor M1 activa la fosfolipasa C, resultando en la liberacin del segundo mensajero inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y la subsiguiente movilizacin de calcio intracelular (ver figura 4). La activacin de receptores cuyos efectos son mediados por la fosfolipasa C, resulta en la liberacin de diacilglicerol (DAG) e IP3 a travs de la hidrlisis del fosfolpido de membrana fosfatidil inositol 4,5-bifosfato (PIP2). Mientras el DAG se une y estimula a la protena cinasa C (PKC), el IP3 por su parte saca el calcio almacenado en el retculo endoplasmtico por unin al receptor de IP3 (IP3R). La familia de enzimas fosfolipasa C (PLC) ha sido agrupada en tres clases , y ; de las cuales PLC ha sido sugerida en algunos experimentos, como el efector para el

13

receptor M1 (Berstein et al, 1992). La activacin del receptor M2 en contraste, atena la actividad de la adenilato ciclasa, reduciendo de este modo los niveles intracelulares de AMPc (ver figura 4).

Figura 4: Resumen de las vas de transduccin celular moduladas por receptores muscarnicos. 1) Receptores muscarnicos M2 y M4 correspondientes a la va celular acoplada a Gi. 2) Receptores muscarnicos M1, M3 y M5 correspondientes a la va celular acoplada a Gq. Modificado de Dautzenberg y Hauger, 2002 (Fig 2).

A travs de la clonacin, cinco subtipos de receptores muscarnicos han sido identificados y denominados de M1 hasta M5 de acuerdo con su orden de descubrimiento (Felder, 1995). Los receptores muscarnicos se agrupan generalmente de acuerdo con su acoplamiento funcional, por la movilizacin de calcio intracelular (M1, M3 y M5) o por su inhibicin de la adenilato ciclasa (M2 y M4). Cada subtipo M1, M3 y M5 tiene el potencial adicional de activar la fosfolipasa A2, las fosfolipasas C y D; adems favorecen el influjo de calcio. Los subtipos M2 y M4 solo juegan un rol adicional en el aumento de fosfolipasa A2 (Felder, 1995).

Dinmica de las concentraciones de calcio intracelular

La activacin de los receptores muscarnicos produce cambios tpicos en el calcio intracelular, caracterizados por una rpida espiga que representa la liberacin de calcio estimulado por el IP3 de los almacenes intracelulares, seguida en ocasiones de una fase de meseta luego de la espiga

14

rpida, que representa la entrada de calcio extracelular a travs de canales de calcio. En clulas excitables como las clulas musculares y las neuronas, el calcio pasa predominantemente a travs de un canal de calcio voltaje dependiente (VOCC) que se abre despus de la despolarizacin de la membrana. En clulas no excitables como las clulas epiteliales, el calcio pasa a travs de una familia poco caracterizada de canales de calcio insensibles a voltaje (VICC) (Felder, 1995).

Los VICC se abren en respuesta a la activacin de un receptor y han sido clasificados en tres grupos generales: 1) canales de calcio operados por receptor (ROCCs), los cuales son independientes de segundos mensajeros, 2) canales de calcio operados por segundos mensajeros (SMOCCs) y 3) canales de calcio operados por deplecin (DOCCs), los cuales se abren despus de la deplecin del almacn de calcio intracelular mediado por IP3 y proveen una fuente para volver a llenar los almacenes de calcio (ver figura 4A). La activacin de los VICC mediada por los receptores muscarnicos ha sido menos estudiada. Pero evidencia indirecta usando pruebas fluorescentes de calcio intracelular, apunta a un rol de interaccin de los receptores M1, M3 y M5 con todos los tipos de VICC mencionados (Felder, 1995).

Puesto que muchas patologas incluyendo la EP han sido asociadas con procesos inflamatorios, es que resulta interesante estudiar adems algunas de las vas relacionadas con la inflamacin como por ejemplo la de las citocinas de la familia CXCR.

Receptores para citocinas de la familia CXCR

Citocinas: las citocinas son protenas solubles secretadas por muy diversos tipos celulares hematopoyticos y no hematopoyticos. Su importancia es crucial para que las respuestas inmunitarias innata y adaptativa se desarrollen con normalidad; su expresin puede alterarse en la mayora de las enfermedades inmunitarias, inflamatorias e infecciosas (Braunwald et al, 2001).

Las citocinas participan en la regulacin del crecimiento y del desarrollo, as como en la activacin de las clulas del sistema inmunitario y en la mediacin de la respuesta inflamatoria. En general, las citocinas se caracterizan por una considerable redundancia, en el sentido de que diferentes citocinas comparten idnticas funciones. Adems, muchas citocinas son pleiotrpicas, es decir, son capaces de actuar sobre muy diversos tipos de clulas. Este pleiotropismo deriva de la expresin en mltiples tipos celulares de receptores para la citocina (Braunwald et al, 2001). Las quimiocinas son factores que regulan el desarrollo y la migracin de varios tipos de clulas; ms de 40 quimiocinas han sido identificadas en humanos hasta el momento (Spano et al, 2004).

Las quimiocinas pueden ser clasificadas dentro de 4 grupos (CC, CXC, CX3C y C), basados en la posicin de los residuos de cisteinas altamente conservados de la secuencia amino acdica. Los receptores de quimiocinas pertenecen al grupo de las protenas de siete dominios transmembrana, acoplados a las protenas G antes mencionadas (Schioppa et al, 2003).

La evidencia indica que la activacin inapropiada del receptor CXCR4 puede estar involucrada en enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas como por ejemplo la demencia asociada al virus de inmunodeficiencia adquirida (HIV) (Khan et al, 2003).

15

La quimiocina (citocina quimiotctica) factor derivado de las clulas del estroma (SDF-1) y su receptor CXCR4, estn constitutivamente expresados en el cerebro en desarrollo y adulto. Su expresin se da tanto en clulas neuronales como no neuronales, implicadas en varios procesos fisiolgicos (Spano et al, 2004).

Aunque el laboratorio colaborador de la Universidad Louis Pasteur en Estrasburgo Francia trabaja con varios de los receptores para quimiocinas, tales como: CXCR1, CXCR2, CCR5, CCR2 y CXCR4 (Zoffmann et al, 2002), se eligi probar el receptor CXCR4 antes que cualquier otro, porque se encuentra relacionado con la respuesta inflamatoria cerebral; y porque en el laboratorio colaborador de Estrasburgo, se posean la mayor cantidad de herramientas y de protocolos de medidas de unin ligando/receptor y respuesta celular puestas a punto para este receptor de quimiocina.

Para tratar de identificar posibles receptores involucrados en el efecto antiparkinsoniano la administracin de Mucuna urens; se estudi la actividad biolgica del extracto crudo y fraccionado de esa planta. La actividad biolgica de los compuestos presentes en el extracto de Mucuna urens, puede ser cuantificada mediante la respuesta de calcio desencadenada en las clulas al activarse diferentes receptores de 7 dominios transmembrana (muscarnicos, purinrgicos, etc).

Medicin de actividad biolgica y sondas fluorescentes

Los receptores investigados en este trabajo, se encuentran asociados con las protenas G, que son protenas integrales de membrana. Cuando los receptores se encuentran acoplados al tipo G q, su activacin provoca indirectamente la liberacin de calcio del retculo endoplasmtico. El calcio liberado puede ser medido mediante sondas fluorescentes especficas como indo-1, fura-2, fluo-3, fluo-4, entre otras (Takahashi et al, 1999). La unin del calcio a la sonda provoca un aumento ( una disminucin en otros tipos de sondas) en la emisin del espectro de fluorescencia de esta, el cual puede ser cuantificado por medio de un espectrofluormetro (Takahashi et al, 1999). Los distintos tipos de clulas, expresan diversos tipos de receptores; que pueden utilizar el mismo mecanismo de transduccin asociado con los niveles de calcio intracelular. Por esta razn y para obtener informacin especfica de la actividad sobre alguno de ellos, es que se hace imprescindible la utilizacin de tipos celulares que expresen diferencialmente los receptores que se desean estudiar.

Por otro lado, es posible sobreexpresar ciertos receptores de inters en tipos celulares que no los poseen, o los poseen en bajas proporciones. Este proceso se conoce como transfeccin celular, y se realiza utilizando plsmidos (Gonzlez y Coroas, 2002; Ovidio y Portelles, 1997; Rocha et al, 2002).

Algunos de los tipos de clulas utilizadas para mediciones de calcio por activacin de receptores asociados con protenas G son: las CHO (chinese hamster ovary; ovario de hamster chino) y las HEK-293 (human embryonic kidney; rin de embrin humano). En el caso de las CHO stas no expresan de manera endgena los receptores muscarnicos; lo cual concede especificidad a las respuestas del receptor muscarnico, ya que solo posee el M1 transfectado de forma estable (Sternfeld et al, 2007). En las clulas HEK-293 se expresan de manera endgena receptores

16

muscarnicos M3 entre otros; aparte de que pueden ser transfectadas con receptores para quimiocinas CXCR4, que s poseen, pero en baja proporcin (Sternfeld et al, 2007).

La fluorescencia es un tipo de emisin de luz producida por algunas molculas al relajarse; esta emisin proporciona un instrumento til para medir fenmenos biolgicos. La excitacin de molculas fluorescentes relacionadas con los procesos celulares y su dinmica de activacin en el transcurrir del tiempo, permiten cuantificar y comparar las respuestas de dichos sistemas biolgicos.

Procesos de fotoluminiscencia: la fluorescencia

El fenmeno de fotoluminiscencia ocurre cuando una especie qumica es excitada por medio de radiacin electromagntica y como consecuencia la especie pierde la energa adquirida reemitiendo sta en forma parcial o total (Skoog et al, 1994).

La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las molculas son excitadas a niveles energticos superiores por la absorcin de radiacin electromagntica. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energa en forma de fotones (Skoog et al, 1994).

La desactivacin o prdida de la energa en exceso se puede efectuar a travs de diferentes procesos. El camino ms probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado. Por tanto, si la desactivacin por fluorescencia es rpida con respecto a los procesos sin radiacin, se observa tal emisin.

La fluorescencia y la fosforescencia son dos manifestaciones diferentes del fenmeno fotoluminiscente. La fluorescencia cesa casi inmediatamente despus de que a la muestra se le ha suspendido la radiacin electromagntica (

17

La mayor parte de los indicadores fluorescentes de calcio, son aniones policarboxilados impermeantes. Para solucionar este problema, las molculas han sido permeabilizadas por adicin de un grupo acetoximetil ster (AM), destinado a enmascarar las cargas negativas. Bajo esta forma AM, la sonda puede atravesar la membrana celular, pero es insensible al calcio. La insensibilidad al calcio se soluciona por la accin de las esterasas celulares endgenas, que cortan los enlaces ster; permitiendo la acumulacin intracelular de sonda en su forma qumica funcional (Leclerc et al, 2004).

Existen varios tipos de sonda dependiendo de su estructura y funcin. En general, todas ellas permiten un marcaje fluorescente del sistema biolgico (una protena, un in, un nucletido, etc). Entre algunas de las ms utilizadas se encuentran: el Indo-1 y el Fluo-4.

Sondas Indo-1 y Fluo-4

Como ya se describi antes, estas sondas son molculas estructuralmente derivadas de quelantes de calcio, las cuales se unen a dicho in y cambian sus mximos de emisin de fluorescencia; adems, estas dos sondas requieren la desesterificacin a nivel intracelular para unirse al calcio y fluorecer. Estos marcadores permiten evidenciar los procesos intracelulares relacionados al calcio en tiempo real.

Tsien y colaboradores han utilizado como modelo estructural del Indo-1 y otras sondas fluorescentes el BAPTA y el EGTA (quelantes de calcio). El Indo-1 es uno de los llamados indicadores raciomtricos de calcio; ya que produce una longitud de onda () de emisin diferente al tener unido calcio o al estar sin l. As, la razn de ambas longitudes de onda (401 y 475nm) permite una estimacin ms exacta de la concentracin de calcio intracelular; independientemente de la distancia ptica y la concentracin total del marcador (Invitrogen, 2008).

La razn entre las longitudes de onda corrige diferencias como: cargas desiguales de la sonda, la fuga o expulsin, el fotoblanqueamiento y los cambios en el volumen celular (Takahashi et al, 1999). Las principales desventajas de Indo-1 son: el rpido fotoblanqueamiento que sufre y la necesidad de excitacin en el espectro UV que causa dao celular (Invitrogen, 2008).

El Fluo-4 es un anlogo del Fluo-3, con la sustitucin de dos tomos de cloro por tomos de fluor, correspondiente a la nueva generacin de sondas de excitacin en el espectro visible. Fluo-4 exhibe una alta Kd para el calcio (345 nM) y una fuerte seal de fluorescencia. La fuerte seal de fluorescencia resulta una ventaja particular al trabajar con clulas como las HEK-293, puesto que estn comnmente en menor nmero respecto al volumen usado para los ensayos de cribaje farmacolgico (Invitrogen, 2008). Los derivados esterificados de Fluo-3 y Fluo-4 no son fluorescentes por s mismos, diferencindose en esto de los derivados de Indo-1; esto disminuye el ruido de fondo. Otras de las ventajas del Fluo-4 son: sus cortos tiempos de incubacin para cargar las clulas (introduccin de la sonda al interior) y las menores concentraciones de sonda requeridas para realizar los anlisis (Invitrogen, 2008).

18

La mayor desventaja del Fluo-4 es que no exhibe un cambio en el mximo del espectro de emisin al unirse al calcio. Lo anterior, hace imposible realizar medidas raciomtricas de las concentraciones de calcio (Takahashi et al, 1999).

De acuerdo con los resultados de Molina y Sols, 2004 en los que se demostr en el extracto crudo, una actividad antiparkinsoniana mayor que la del L-Dopa, se supone que existen otras sustancias que potencian la actividad de este compuesto. Para corroborar tal suposicin, se pretende separar y purificar algunas de las fracciones del extracto crudo para caracterizar de una mejor manera el o los compuestos responsables de la actividad biolgica observada.

Tcnicas de separacin y purificacin de sustancias

Para tal efecto, el extracto crudo debe ser sometido a separacin qumica; siendo la cromatografa una de las tcnicas ms usadas y accesibles para este fin. La cromatografa es una tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos. La separacin se establece al ser arrastrados los solutos por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria (slida o lquida) (Skoog et al, 2001).

Segn la relacin que se establezca entre la fase estacionaria y la fase mvil, cabe distinguir entre: cromatografa de adsorcin, cromatografa de intercambio inico, cromatografa de exclusin (de geles) y cromatografa de afinidad (Morrison et al, 1992).

El principio ms comn y con mayor aplicacin entre las diferentes tcnicas cromatogrficas, es la cromatografa de adsorcin; en la cual, el slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en la fase mvil por medio de las fuerzas de Van der Waals (Morrison et al, 1992).

Determinacin de la huella cromatogrfica

Los anlisis de huella cromatogrfica han sido aceptados como criterio de calidad por la Organizacin Mundial de la Salud (WHO) y como un requerimiento de regulacin por la SDFA (State Food and Drug Administration of China) para productos naturales (Alaerts et al, 2007; Han et al, 2007; Jiang et al, 2007). Entre los mtodos para determinacin de la huella digital en general se encuentran: la electroforesis capilar, la cromatografa de gases, los rayos X, la cromatografa en capa fina y la cromatografa lquida de alta resolucin (Chen et al, 2007; Ma et al, 2007).

La huella cromatogrfica es una representacin grfica de las seales que producen el conjunto de componentes de un extracto de origen vegetal (Li et al, 2007). Las huellas cromatogrficas son normalmente cromatogramas complejos, que exigen una alta capacidad de resolucin en el proceso de separacin (Han et al, 2007; Jiang et al, 2007).

Es muy conocido que los efectos teraputicos de las plantas medicinales, se deben a los efectos sinrgicos de mltiples componentes bioactivos presentes en los extractos. De tal manera, la determinacin de control de calidad por medio de uno o unos pocos componentes del extracto natural no ha resultado ser suficientemente representativa. Por lo tanto, la implementacin de la

19

huella digital cromatogrfica como parmetro de control de calidad para plantas medicinales, se perfila como un mtodo de anlisis bastante integral (Chen et al, 2007; Wang et al, 2008).

La huella digital cromatogrfica es especfica para cada especie de planta o tipo de extracto natural, por lo que en la actualidad, se ha comenzado a usar como mtodo de identificacin de las plantas medicinales y sus derivados (Chen et al, 2007; Han et al, 2007).

Adems, la huella digital cromatogrfica tambin puede emplearse como un marcador de actividad farmacolgica; ya que si un patrn cromatogrfico es responsable de cierto efecto establecido por un modelo farmacolgico, se puede asumir que subsiguientes extractos de la planta que presenten el mismo cromatograma de huella digital, mantendrn las propiedades farmacolgicas determinadas por el modelo (Figueroa et al, 2007; Li et al, 2007).

Cromatografa lquida de alta resolucin

La cromatografa lquida de alta resolucin o High performance Liquid Chromatography (HPLC) es una tcnica en la cual la fase estacionaria es un slido y la fase mvil, es un lquido. Se utiliza para separar los componentes de una mezcla, basndose en los diferentes principios de interaccin qumica entre los analitos y la columna (Skoog et al, 1994).

En la HPLC, el analito disuelto en la fase mvil, pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase estacionaria a alta presin. Los componentes de la muestra analizada son detectados diferencialmente en el tiempo, dependiendo de las interacciones qumicas y fsicas que establezcan con la fase estacionaria y de la composicin qumica de la fase lquida. El tiempo que tarda un compuesto en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa del compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria a cierta temperatura. Para la fase mvil, los disolventes ms utilizados por sus diferentes caractersticas de polaridad son: el agua, el metanol y el acetonitrilo. Tambin se utilizan sustancias como tampones, sales, o el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos (Prez et al, 2002).

La fase mvil en el HPLC puede ser isocrtica o en gradiente; en el primer caso, la fase mvil permanece constante durante todo el anlisis, mientras que en el segundo, la fase mvil cambia su composicin durante el periodo del anlisis. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad de la fase mvil y busca separar los componentes de la muestra como una funcin de la afinidad del compuesto por la fase mvil utilizada, respecto a la afinidad por la fase estacionaria (Prez et al, 2002).

La deteccin de analitos en el HPLC puede llevarse a cabo mediante diferentes tipos de detector, tales como: ndice de refraccin, ultravioleta/visible, electroqumico, espectrmetro de masas y fluorimtrico (Skoog et al, 1994). De ellos, el ms utilizado es el detector ultravioleta/visible (UV/VIS), el cual consiste en un espectrmetro que excita los analitos con radiacin electromagntica fija o variable. Esta radiacin corresponde a longitudes de onda entre 200-380 nm en el UV y 380-780 nm en el VIS (visible). La absorcin de dicha energa depende de requisitos estructurales del analito como: presencia de dobles enlaces y grado de conjugacin en el UV y presencia de color en el VIS. As por ejemplo, la cantidad exacta de luz UV absorbida

20

por una sustancia se expresa como absortividad molar, la cual es una constante fsica caracterstica de cada sustancia en particular (McMurry, 2000).

Hiptesis

Existen efectos anticolinrgicos producidos por el extracto hidroalcohlico crudo de Mucuna urens.

Materiales y Mtodos

I Parte: Recoleccin y tratamiento del material vegetal I a) Recoleccin del material vegetal Los frutos de la planta Mucuna urens se recolectaron, secaron y separaron de las vainas en forma manual con ayuda de guantes y alicate.

Las semillas se recolectaron en la localidad de Fraijanes de Pos de Alajuela, Costa Rica. A una altitud de 1650 m.s.n.m. con las siguientes coordenadas Norte 10 7 40.8, Oeste 84 1146.3, con un error estimado de 5 metros. En el mismo sitio donde se haban llevado a cabo las colectas anteriores para la tesis de Molina y Sols, 2003. Depsito de la muestra en el herbario Juvenal Valerio Rodrguez de Heredia (UNA); recibido por don Marco Otrola Rojas. I b) Tratamiento del material vegetal Se recolectaron aproximadamente 600 gramos de material fresco (semillas). El material se separ de cualquier impureza y se sec en una bandeja al calor del sol (poca de verano) por aproximadamente 6 das. Una vez secas las vainas, se extrajeron las semillas; se molieron completas en un molino Dietz-motor WRB hasta ser convertidas en un polvo fino. Luego el polvo resultante se someti a extraccin por percolacin con una mezcla de etanol (95 ) y agua (8:2) por tres das. Para este fin, el material se introdujo en una bolsa de manta sellada; la cual, luego se coloc en un recipiente de vidrio que contena la mezcla hidroalcohlica. La percolacin se realiz dos veces, con el fin de maximizar la extraccin de los componentes presentes. El extracto obtenido de las dos extracciones se conserv en botellas mbar de vidrio debidamente tapadas y en refrigeracin por aproximadamente 15 das para su posterior concentracin. La concentracin del extracto por evaporacin se llev a cabo utilizando un evaporador rotatorio a presin reducida (rotavapor) Bchi R152 (de aprox. 10 L), a una temperatura entre 38-40 C, y el extracto acuoso obtenido, se conserv entre 4-7 das en refrigeracin (0-8 C) hasta ser liofilizado.

I c) Liofilizacin El extracto acuoso se congel a una temperatura aproximada de -40 C en frascos de vidrio especiales para liofilizador (Labconco 500 mL), el procedimiento anterior se realiz rotando el frasco con el concentrado en un bao de hielo seco (CO2), con etanol como sustancia criognica. Dicho proceso se llev a cabo hasta que la muestra estuviera completamente congelada. Los frascos se llenaron con el extracto acuoso sin exceder la tercera parte de su capacidad e inmediatamente congelados fueron unidos a los conectores del liofilizador Labconco. Para

21

asegurar un secado completo, las muestras se mantuvieron en el liofilizador por cerca de 48 horas, luego de lo cual el material se almacen en frascos de vidrio bien tapados (recubiertos adems con papel parafina) y guardados en un congelador a -20 C marca Forma Scientific modelo 8339 hasta el momento de su uso.

I d) Preparacin de soluciones madre del extracto liofilizado Se realizaron cuatro disoluciones en diferentes solventes de 100 mg del extracto hidroalcohlico liofilizado cada una. Estas diluciones se ajustaron a concentraciones finales de 50 mg/mL en uno de los siguientes solventes: 1) Solucin salina + 1% DMSO; 2) DMSO 100%; 3) Agua + 5% DMSO y 4) Etanol/Agua 8:2. Todas las disoluciones fueron agitadas fuertemente a temperatura ambiente por algunos minutos utilizando un vrtex; luego se centrifug cada solucin a 10000 r.p.m por 2.5 minutos. A continuacin, se filtr cada solucin resultante a travs de una membrana Millipore de 0.22 m. Los filtrados constituyeron las soluciones de 50 mg/mL de M. urens que se utilizaron sobre las clulas, en los experimentos de respuesta al calcio y en las inyecciones de HPLC.

II Parte: Pruebas para identificacin de metabolitos secundarios II a) Pruebas cualitativas para identificacin de grupos de metabolitos secundarios Se llevaron a cabo pruebas cualitativas de tubo de ensayo para alcaloides, taninos, flavonoides y glicsidos antracnicos con el extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens. Para estas pruebas, se coloc directamente 1 mL de extracto hidroalcohlico de M. urens o 1 mL de los residuos provenientes de extracciones aplicadas al extracto en cada tubo de ensayo. Se agregaron 3 4 gotas de uno de los reactivos de prueba a cada tubo de ensayo, repitindose el mismo procedimiento por separado hasta completar la lista de reactivos que se muestran en la Tabla 1. Luego de agregar cada reactivo, se permiti que sucediera la reaccin durante 2 minutos sin agitacin. Se observ cuidadosamente cada tubo de ensayo y se anotaron los cambios ocurridos. Finalmente, antes de descartar los tubos de reaccin, se sometieron a agitacin manual y se confirmaron las observaciones inicialmente realizadas (Lock, 1994; Harborne, 1973).

Las pruebas para flavonoides se realizan directamente con el extracto hidroalcohlico de M. urens, ya que el etanol extrae bien este tipo de compuestos, y los solventes utilizados son una mezcla mayormente etanlica (8:2). Para los dems grupos de metabolitos, se realiz la extraccin y separacin pertinente a partir del extracto inicial.

El procedimiento seguido para la separacin y extraccin de alcaloides, glicsidos y taninos fue el siguiente: se calentaron hasta ebullicin agitando peridicamente 20 mL del extracto hidroalcohlico 8:2 de M. urens con 20 mL de solucin HCl al 10% por 5 min. A continuacin, se dej enfriar la dilucin, se filtr y se extrajo 2 veces con 10 mL de cloroformo cada vez. La capa clorofrmica de ambas extracciones se coloc en un tubo de ensayo con tapa, se le adicionaron 5 mL de solucin de amoniaco al 10%, se agit fuertemente por 2 minutos y se dej cubierta reposar durante 2 horas; revisando peridicamente si ocurra un cambio de color en la capa amoniacal (prueba para glicsidos antracnicos).

22

En la Tabla 1 se describen algunos detalles del procedimiento especfico para cada tipo de metabolito:

Tabla 1: Pruebas y reactivos para la marcha fitoqumica de algunos grupos de metabolitos secundarios (Lpez, 1998).

Metabolito Secundario

Reactivos de prueba

Patrones

Alcaloides.

Reactivo de Mayer, Reactivo de Valser, cido Tnico, Reactivo de Dragendorff, Reactivo de Wagner y Reactivo de Reineckato.

Solucin acuosa de sales de Quinina, Cinchonina, Atropina y Estricnina al 0.5% cada uno.

Taninos.

Molibdato de Sodio, Ferrocianuro-amoniaco, solucin de iones Plomo (Pb(NO3)2), soluciones de patrones para alcaloides, Yodato de Potasio y Nitrito de Sodio.

Solucin acuosa de cido Tnico al 2%.

Flavonoides.

Reactivo de Shinoda o Cianidina, Reactivo de Wilson, cido Sulfrico y Cloruro Frrico.

Solucin hidroalcohlica de Quercetina al 1%.

Glicsidos Antracnicos.

Reaccin de Borrntraeger (o amoniaco diluido).

No se dispuso de patrn, pero se reporta resultado de acuerdo con la literatura (Robinson, 1967).

Con la capa acuosa restante de la extraccin, se continu trabajando de la siguiente manera: se coloc en un embudo separador limpio, se le agregaron 10 mL de solucin de amoniaco al 30% y se agit fuertemente. Tras la verificacin con un papel tornasol de que la solucin era alcalina (pH >7), se realizaron nuevamente 2 extracciones sucesivas con 10 mL de cloroformo. La capa clorofrmica obtenida de estas dos extracciones se uni y se coloc a secar en el evaporador rotatorio a presin reducida (rotavapor). El residuo resultante de la evaporacin se volvi a disolver en 10 mL de metanol, el cual constituy la solucin utilizada para hacer las pruebas de alcaloides. La capa acuosa remanente de la ltima extraccin se utiliz directamente para llevar a cabo las pruebas correspondientes a taninos.

23

III Parte: Ensayos biolgicos del extracto crudo y separado III a) Cultivo de Clulas Se cultivaron placas de 10 cm de dimetro (Falcon) de cada tipo celular: HEK-293, CHO, CHO-M1 y HEK CXCR4 a una temperatura de 37 C en atmsfera humedecida de 5% CO2 y 95% aire. Por ser lneas de clulas adherentes fueron despegadas de las placas en cada dilucin con tripsina 0.5% - EDTA. Las clulas HEK (transfectadas o no) se diluyeron a 1/4 cada 3 4 das; utilizan el mismo medio de cultivo descrito a continuacin: 500 mL de medio MEM (Minimum Essential Medium) con sales de Eagle, sin glutamina marca Gibco, ms 10% de suero fetal bovino (no descomplementado), ms 10 mL de PSG (100 U/mL final de Penicilina, 100 g/mL final de Estreptomicina y 2 mM final de L-Glutamina marca Invitrogen las tres).

Las clulas CHO (transfectadas o no) se diluyeron a 1/10 cada 4 das utilizando otro medio de cultivo comn entre ellas, descrito a continuacin: 500 mL de medio F-12 (Ham) marca Gibco, ms 5% de suero fetal bovino (no descomplementado), ms 5 mL de PS (100 U/mL final de Penicilina y 100 g/mL final de Estreptomicina marca Invitrogen ambos). Los subcultivos (diluciones de clulas) fueron realizados con el fin de mantener las clulas en fase de crecimiento y disponer de clulas en condiciones ptimas para los experimentos de respuesta al calcio (correcto % de confluencia). Se realizaron cada 3 4 das, segn la velocidad de crecimiento de cada lnea celular. Los subcultivos, se efectuaron en una cmara de flujo laminar vertical de seguridad biolgica marca Holten; se utilizaron materiales plsticos desechables de uso nico. Se siguieron en toda esta parte los mtodos del Laboratorio UMR 7175 del CNRS de Estrasburgo, Francia.

III b) Curva Dosis/Respuesta a la Acetilcolina (Ach) Antes de comenzar a probar el extracto sobre las clulas, se realiz una curva dosis respuesta con acetilcolina (agonista muscarnico). La curva dosis/respuesta se lleva a cabo para verificar que se obtiene una correcta respuesta celular del sistema biolgico, que el protocolo de carga es adecuado, que los parmetros del espectrofluormetro son correctos y que con un agonista conocido, el valor de EC50 es prximo al esperado.

Esta curva se llev a cabo mediante un experimento de respuesta al calcio en clulas CHO-M1 al 90% de confluencia, suspendidas en 15 mL de tampn Hepes/ BSA/ Probenecid 2.5 mM, utilizando como sonda Indo-1 AM 5 M final incubado por 1 hora a 37 C. Los tubos de suspensin celular una vez preparados se guardaron por 15 minutos protegidos de la luz en un bao-mara a temperatura regulada de 21 C antes de iniciar los ensayos. En los ensayos se emplearon cubetas de cuarzo provistas con una pequea barra de agitacin magntica y 1.0 mL de suspensin celular (~ 1 x 106 clulas/cubeta).

Los parmetros establecidos en el espectrofluormetro fueron los siguientes: Tiempo total: 240 s, tiempo de integracin: 0.3 s, tiempo de incremento: 0.3 s, (longitud de onda) de excitacin: 338 nm, de emisin: 401 nm y ancho de rendijas: excitacin 2 nm y emisin 4 nm.

Se prepararon por aparte diluciones seriadas de acetilcolina (Ach) a partir de una solucin madre en agua 100 mM; conservada a -20 C. Las diluciones de Ach usadas se presentan en la Tabla 2:

24

Adems se utiliz solucin madre de digitonina en agua 25 mM; almacenada tambin a -20 C. La digitonina se adicion a las clulas en una concentracin final de 50 M un minuto antes de terminar cada prueba. Todas las soluciones de trabajo de Ach y de digitonina se mantuvieron a 4 C durante el tiempo de experimentacin.

Tabla 2: Concentraciones de Ach realizadas para la curva dosis/respuesta sobre clulas CHO-M1.

Concentracin nM para la solucin de trabajo.

Concentracin nM final/mL en suspensin celular.

250 1 750 3 2500 10 7500 30

25000 100 75000 300

III c) Experimentos de respuesta por calcio Las clulas se diluyeron en el medio de cultivo respectivo descrito en la seccin IIIa, con 2 o 3 das de anticipacin. El da de la prueba se verific que se encontraran entre un 80-90% de confluencia para continuar con la carga (introduccin de la sonda). Las clulas se lavaron con PBS (tampn salino de fosfatos) y se colocaron a cargar por 45 minutos o por 1 hora en la incubadora a 37 C con una mezcla de tampn Hepes/BSA (NaCl 137.5mM, MgCl26H2O 1.25mM, CaCl22H2O 1.25mM, KCl 6mM, Glucosa 10mM, HEPES 10mM, NaH2PO4H2O 0.4mM pH: 7.4) + Indo-1 AM 5 M (o Fluo-4 AM 2 M). Despus, se lavaron nuevamente las clulas, se despegaron de la placa con una dilucin de Tripsina-EDTA (Gibco) al 0.5% y 0.2% respectivamente a 37C, se homogenizaron, se centrifugaron y el precipitado de clulas se resuspendi en 10 12 mL (de acuerdo con el % de confluencia) de solucin de Hepes/BSA a temperatura ambiente. La suspensin de clulas fue distribuida en viales de polietileno con capacidad para 1.5 mL protegidos de la luz y dejados a temperatura ambiente hasta que hubiesen transcurrido 30 minutos desde el momento en que se quit la sonda y se realiz el lavado posterior a la carga. Lo anterior, permiti la adecuada desesterificacin del Indo-1 AM o el Fluo-4 AM (acetoximetil ster). Alcanzado este paso se pudo comenzar las lecturas de fluorescencia en el espectrofluormetro con cubetas de cuarzo equipadas con una barra de agitacin magntica y 1.0 mL de suspensin celular a temperatura regulada (21 C 37 C). Las lecturas de fluorescencia pueden efectuarse por un periodo mximo de 90 minutos luego de concluido el paso de desesterificacin. Para marcaje con Indo-1 se excit a 338 nm y se colectaron las emisiones a 401 y 475 nm, por otro lado para Fluo-4, la excitacin se realiz a 494 nm y la emisin se colect a 516 nm. Para los anlisis con Indo-1, los resultados de la emisin fluorescente se presentan como una razn 401/475 nm.

En todos los ensayos celulares de esta seccin, se usaron 10 L de M. urens 50 mg/mL. Adems se realizaron controles positivos con agonistas conocidos, de acuerdo con el tipo de receptor estimulado. Se realizaron tambin controles negativos con un antagonista, de acuerdo con cada caso, para verificar el bloqueo de la respuesta. Para este trabajo, los marcajes del calcio se

25

efectuaron con dos tipos distintos de sondas fluorescentes: el Indo-1 y el Fluo-4 adquiridos de Molecular Probes. Como se menciono antes, se siguieron con cada tipo de clulas los mtodos del Laboratorio UMR 7175 del CNRS de Estrasburgo, Francia.

Clulas HEK-293 no transfectadas Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21C marcado con Indo-1 y Fluo-4, utilizando 4 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:

a) DMSO 100% b) Etanol/Agua 8:2 c) Solucin salina + 1% DMSO d) Agua + 5% DMSO

Como agonista muscarnico se utiliz carbacol 50 M final y como antagonista se utiliz atropina a 8 M o 10 M segn la efectividad del antagonismo.

Clulas CHO no transfectadas Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 C marcado con Fluo-4, utilizando las mismas 3 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:

a) DMSO 100% b) Etanol/Agua 8:2 c) Solucin salina + 1% DMSO

Como agonista se us el ATP 20 M ya que este tipo de clulas contienen receptores purinrgicos endgenos P2Y. No se realiz antagonismo a falta de disponibilidad de un reactivo con dicha funcin.

Clulas CHO-M1 transfectadas Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 C marcado con Fluo-4, utilizando las siguientes disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:


Como agonistas muscarnicos se utilizaron el carbacol 50 M final y en algunas ocasiones la acetilcolina (100 nM de acuerdo con la curva dosis/respuesta). Como antagonista se utiliz la atropina 8 M o 10 M.

Clulas HEK CXCR4 transfectadas Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 37 C marcado con Fluo-4 utilizando las mismas 3 disoluciones del extracto liofilizado de M. urens en:


Como agonista CXCR4 se utiliz SDF-1 5 nM (stromal-cell derived factor 1; factor 1 derivado de las clulas del estroma) y como antagonista se utiliz el pptido T-134 a 500 nM.

26

Para confirmar que las respuestas vistas sobre las clulas no correspondieran a la accin sobre receptores muscarnicos M3 endgenos, se realizaron bajo las mismas condiciones, experimentos de respuesta al calcio marcados con Fluo-4 para las 3 diluciones de M. urens. Como agonista muscarnico se utiliz el carbacol 50 M final y como antagonista se utiliz la atropina 10 M final.

III d) Espectros de emisin de fluorescencia de M. urens III d1) Separacin del extracto por HPLC para la elaboracin del espectro de emisin de fluorescencia Para esta prueba se us la columna C18 marca Beckman ya que result ptima para la separacin de los componentes del extracto en las pruebas anteriores. Adems, se conserv la misma variacin de fase mvil descrita en la seccin IV 1a) de Materiales y Mtodos. En este caso, se realiz una inyeccin de 20 L de M. urens 25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO a temperatura ambiente. La corrida se colect en fracciones de 1 ml/tubo para realizar los espectros de emisin del extracto fraccionado. El total de fracciones colectadas fue de 51; ya que se incluy todo el tiempo hasta alcanzar un 100% de solvente Y, ms 1 mL extra. El mL extra, contempla el retraso existente entre la seal del detector y la recoleccin hecha por el colector de fracciones; no obstante, los registros de los canales de deteccin se detuvieron automticamente en el minuto 45.

III d2) Espectros de Emisin de Fluorescencia para las fracciones del extracto Este experimento se divide en dos partes: la primera donde se excita y se colecta a las longitudes de onda () correspondientes al Indo-1 y la segunda, las correspondientes al Fluo-4.

Para la primera parte del experimento, en el espectrofluormetro Fluorolog ISA se estableci 338nm como longitud de onda de excitacin, la cual corresponde a la misma longitud de onda de excitacin del Indo-1. De manera que se simulan las condiciones de anlisis por fluorescencia en la respuesta celular. Las emisiones de fluorescencia fueron colectadas de 355-500 nm, con un incremento de 1 nm; un tiempo de integracin de 0.5 s, un ancho de rendijas espectrales de 2 nm y una temperatura ambiente de aproximadamente (~) 21 C. Bajo las condiciones descritas, se realiz la lectura de fluorescencia de cada una de las 51 fracciones colectadas.

Para la segunda parte del experimento, excepto las de excitacin y deteccin (emisin), todos los dems parmetros fueron iguales a los descritos arriba. Segn lo anterior, se estableci 494 nm como de excitacin (la cual corresponde a la excitacin del Fluo-4) y la emisin de fluorescencia fue colectada de 510-700 nm. De igual manera se realiz la lectura de fluorescencia de las 51 fracciones colectadas ms las lecturas de ambos solventes de cromatografa.

27

III e) Experimentos de respuesta al calcio en clulas CHO-M1 del extracto de M. urens separado

III e1) Pruebas de respuesta al calcio para los pooles inicialmente separados de M. urens Los pooles 1 y 2 provenientes de una corrida especfica (C2.001) se volvieron a ensayar sobre las clulas CHO-M1; procurando mantener las mismas condiciones experimentales que en las pruebas anteriores con el extracto crudo (no fraccionado).

Se realiz un experimento de respuesta al calcio a 21 C marcado con Fluo-4 para los pooles del extracto de M. urens resuspendidos en DMSO 100%; 5 L de cada pool por prueba. En este experimento se realiz como en todos los casos una prueba de control inicial solo con agonista y digitonina. Como agonista muscarnico se utiliz carbacol 50 M y como antagonista atropina 10 M.

III e2) Experimentos de respuesta al calcio en clulas CHO-M1 para el fraccionamiento final del extracto Todas las fracciones de 5 minutos pertenecientes a la corrida llamada Zao7.001, se probaron sobre las clulas CHO-M1. Las fracciones fueron resuspendidas en DMSO 100%; se procur mantener las mismas condiciones experimentales que en las pruebas anteriores.

Se realizaron experimentos de respuesta al calcio a 21 C marcados con Fluo-4 para cada una de las fracciones del extracto de M. urens, 5 L de cada fraccin por prueba. Simultneamente se realizaron pruebas de control con solventes, agonista y digitonina. Como agonista muscarnico se utiliz carbacol 50 M y como antagonista atropina 10 M.

IV Parte: 1) Anlisis de las disoluciones del extracto por HPLC IV 1a) Inyecciones cromatogrficas de prueba para definir condiciones de anlisis Las inyecciones se realizaron en un HPLC con inyector manual; cuya separacin se realiza por medio de una columna de fase estacionaria reversa C8 o C18. El gradiente de presin fue generado por dos bombas marca Gilson 306 y 307 conectadas a un mezclador tambin Gilson Dynamic mixer 811C. Se utiliz un detector UV-Visible marca Gilson 119 de deteccin variable. Los canales de deteccin fueron fijados en 219 nm y 280 nm debido a que corresponden con las longitudes de onda de mxima absorcin del Espectro ultravioleta-visible realizado para el extracto (ver anexos, figura 1).

Las especificaciones de las columnas analticas utilizadas fueron: C8 marca Zorbax Z5C8-25QS, dimetro de poro: 5 m, dimensiones: 4.6 mm x 25 cm. C18 marca Beckman, dimetro de poro: 5 m, dimensiones: 4.6 mm x 15 cm. C18 marca Phenomenex Luna, dimetro de poro: 5 m, 100 , dimensiones: 4.6 mm x 15 cm.

En esta seccin, las corridas fueron realizadas a temperatura ambiente, empleando una combinacin de fase mvil isocrtica y en gradiente, como se muestra en la Tabla 3. El solvente X corresponde a agua pura (Milli-Q), mientras que el solvente Y corresponde a acetonitrilo

28

(ACN) puro calidad HPLC. Las columnas fueron equilibradas con 100% X por 15 minutos, previo al inicio de las inyecciones.

Excepto en este experimento en particular, las condiciones de fase mvil para HPLC a lo largo de todos los ensayos, mantuvieron la adicin a ambos solventes (X y Y) de cido trifluoroactico (TFA). El TFA se agreg a una concentracin final de 0.1% a cada solvente para bajar el pH de la fase mvil.

Tabla 3: Fase mvil aplicada en cromatografa lquida de alta resolucin, X: H2O Milli-Q; Y: ACN calidad HPLC.

Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil Flujo (mL/min)

0 100 0 1.0 Isocrtica

10 100 0 1.0 Gradiente lineal




55 100 0 0.1

Se realizaron inyecciones de 10 L de Mucuna urens 50 mg/mL disuelta en DMSO 100% y de 20 L de M. urens 25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO. Para estas primeras inyecciones se utiliz la columna Zorbax C8. Luego se realizaron nuevas inyecciones de 20 L de M. urens 25 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO y solventes solos. En estas nuevas inyecciones, se emple una columna Beckman C18 en la separacin. El fin de estas mltiples inyecciones, fue determinar con cual columna (C8 u C18) se lograba resolver mejor los picos de las sustancias contenidas en el extracto de M. urens.

IV Parte: 2) Anlisis de las disoluciones del extracto por HPLC IV 2a) Inyecciones para determinacin de la huella digital del extracto de M. urens en diferentes solventes Se realizaron inyecciones cada una de 20 L de Mucuna urens 50 mg/mL disuelta en 4 diferentes solventes: DMSO 100%; en Etanol/Agua 8:2; en solucin salina + 1% DMSO y en agua + 5% DMSO utilizando la misma columna C18 Beckman previamente seleccionada. Las corridas se realizaron con el gradiente de fase mvil descrito en la seccin IV 1a); con la modificacin antes mencionada de agregar el cido trifluoroactico (TFA) 0.1% a cada una de las botellas de fase mvil. Todos los siguientes anlisis cromatogrficos de este trabajo incluyen ese cambio.

29

Para mejorar la repetibilidad, se decidi implementar entre cada inyeccin los siguientes pasos de limpieza: primero se hizo una inyeccin de agua Milli Q correspondiente al doble del volumen de la capacidad del lazo usado. Se dej el lazo en posicin de inyeccin (abierto). Luego, con un flujo de 1.0 mL/min se asciende hasta 100% ACN + 0.1% TFA en 10 minutos, se permiti que se estabilizaran las longitudes de onda con 100% ACN y luego se hace un gradiente hacia agua + 0.1% TFA en 10 minutos al mismo flujo. Para finalizar, se verific antes de volver a inyectar, la estabilidad de ambos canales de deteccin (seal en cero a lo largo de la lnea base para 219 nm y 280nm).

IV 2b) Inyeccin para determinacin de la huella digital mejorada del extracto de M. urens en DMSO 100% Luego de varias pruebas de separacin por HPLC, se realiz la huella digital del extracto disuelto en DMSO 100% con la mejor separacin obtenida. Se utilizaron 5 L de extracto crudo con un gradiente de fase mvil descrito en la Tabla 4.

Tabla 4: Fase mvil aplicada en cromatografa lquida de alta resolucin, X: H2O Milli-Q + 0.1% TFA; Y: ACN + 0.1% TFA calidad HPLC.









85 100 0 1.0

IV Parte: 3) Separacin y fraccionamiento inicial de las disoluciones del extracto por HPLC

IV 3a) Inyecciones de separacin y fraccionamiento inicial del extracto crudo Se realizaron dos inyecciones de 200 L de extracto de Mucuna urens 50 mg/mL disuelto en DMSO 100% bajo el mtodo de separacin C2 descrito en la Tabla 5. Solo se presentan los datos para una de las corridas aunque se analizaron ambas; adems en la colecta se contempla el retraso de 1 mL/min entre el detector y el colector de fracciones.

30

Tabla 5: Fase mvil aplicada en HPLC, para la corrida B de separacin, X: H2O Milli-Q + 0.1% TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.






62 100 0 0.1

Con la ayuda de un colector de fracciones Gilson FC 205 se colectaron las fracciones a 5 mL/tubo durante el tiempo de corrida (60 minutos), luego se eligieron los puntos de separacin de acuerdo con la polaridad de las seales obtenidas. Se establecieron los pooles 1 y 2 de caractersticas hidroflicas e hidrofbicas respectivamente (ver figura 35). El Pool 1 corresponde a las fracciones de los minutos 1-20 del cromatograma, y el Pool 2 a las fracciones comprendidas entre los minutos 20-60 del mismo cromatograma.

IV 3b) Preparacin, concentracin y redisolucin de los pooles establecidos en la separacin inicial Las fracciones colectadas cada 5 minutos en tubos de vidrio se concentraron utilizando una centrfuga de vaco marca Speed-Vac a velocidad baja por ~30 horas. Los residuos secos de las fracciones cada cinco minutos se diluyeron nuevamente por separado en un volumen de 5 L de DMSO 100% cada una y se agitaron en un vrtex a alta velocidad por 2 minutos. Luego de disueltas las fracciones, se juntaron las cuatro fracciones del minuto 1-20 en lo que constituy el Pool 1 (20 L) y las ocho fracciones del minuto 20-60 en lo que constituy el pool 2 (40 L).

Todo el proceso anterior se llev a cabo de la misma manera para las colectas de las corridas C2. Estas nuevas diluciones de los pooles del extracto separado constituyeron el material de prueba para continuar los ensayos sobre clulas CHO-M1.

IV 3c) Inyecciones para comprobacin de fraccionamiento inicial del extracto Con los pooles de las corridas C2 obtenidos en el paso anterior, se realizaron inyecciones de 5 L de extracto de la corrida C2.001 para verificar la separacin entre los pooles. La fase mvil empleada en este caso fue la misma que para la corrida de separacin IV 1a). Las inyecciones se realizaron a temperatura ambiente y adems se realiz al finalizar, una inyeccin de blanco con 5 L de DMSO 100% (solvente).

31

IV Parte: 4) Separacin y fraccionamiento final de las disoluciones del extracto por HPLC

IV 4a) Inyecciones de separacin y fraccionamiento final del extracto crudo Se realizaron varias pruebas de HPLC variando el gradiente de fase mvil, inyectando la disolucin de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% (datos no mostrados). Lo anterior con el objetivo de mejorar la separacin de los componentes de M. urens a partir directamente de la disolucin del extracto.

De estas pruebas, en la que comienza a observarse una mejor separacin de los componentes del extracto, es la corrida llamada Zhao.001. Se usaron 20 L de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100% con la fase mvil Zhao descrita en la Tabla 6.

Tabla 6: Fase mvil Zhao aplicada en HPLC, para los ensayos de separacin, X: H2O Milli-Q + 0.1% TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.

Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil 0 100 0 Isocrtica

10 100 0 Gradiente lineal

40 70 30 Isocrtica



70 100 0

Tabla 7: Fase mvil Zao7 aplicada en HPLC para los ensayos de fraccionamiento del extracto, X: H2O Milli-Q + 0.1% TFA; Y: ACN calidad HPLC + 0.1% TFA.

Tiempo (min) X% Y% Fase Mvil 0 100 0 Isocrtica


50 70 30 Isocrtica


70 0 100 Isocrtica


90 100 0

32

El registro de los canales de deteccin se detuvo a los 65 minutos y la velocidad de flujo durante la corrida completa fue de 1 mL/min.

Como prueba final, se llev a cabo una inyeccin de 400 L de extracto de M. urens 50 mg/mL en DMSO 100%, utilizando una fase mvil similar a la anterior. Los eventos de la fase mvil Zao7 se muestran en la Tabla 7. Ambos canales de deteccin se detuvieron a los 90 minutos. La corrida se colect cada 5 mL/tubo a partir del minuto 1 del cromatograma hasta el minuto 91; por el retraso existente entre el detector y el colector. El flujo de la fase mvil se mantuvo en 1 mL/min y los canales de deteccin a 219 y 280 nm.

IV 4b) Preparacin, concentracin y redisolucin de las fracciones provenientes de la separacin final Las fracciones colectadas cada 5 minutos en tubos de vidrio se concentraron utilizando una centrfuga de vaco marca Speed-Vac a velocidad baja por ~30 horas. Los residuos secos de las fracciones cada cinco minutos se diluyeron nuevamente por separado en un volumen de 20 L de DMSO 100% cada una y se agitaron en un vrtex a alta velocidad por 2 minutos. Luego de disueltas, se ensay en el modelo biolgico cada una de las fracciones (o sea 18 fracciones en total).

Resultados

I Parte: Pruebas para identificacin de metabolitos secundarios Tabla 8: Pruebas cualitativas para identificacin de alcaloides en el extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens.

Pruebas para Alcaloides

Reactivo de Mayer

Reactivo de Valser

Solucin de cido Tnico

Reactivo de Dragendorff

Reactivo de Wagner

Reactivo de

Reineckato

Patrn de alcaloides al 0.5% (Quinina, Cinchonina, Atropina y Estricnina)

Precipitado color blanco en el fondo

Precipitado color

amarillo en el fondo

Precipitado color

blanco en el fondo

Precipitado color naranja en el fondo

Precipitado color

marrn en el fondo

Precipitado color rosado floculante

Extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens

negativa

negativa

negativa negativa negativa negativa

33

Tabla 9: Pruebas cualitativas para identificacin de glicsidos antracnicos en el extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens.

Prueba para Glicsidos Antracnicos

Solucin amoniacal acuosa o reaccin de Borrntraeger


negativa

(color rojo cereza en la capa acuosa si es positiva la prueba)

Como se observa en las Tablas 8 y 9, no se detect ninguna reaccin positiva para alcaloides (Tabla 8), ni para glicsidos antracnicos (Tabla 9).

En la tabla 10 se observa como cuatro de las pruebas para taninos fueron positivas, por lo que se puede presumir que M. urens contiene componentes del grupo de los taninos.

Tabla 10: Pruebas cualitativas para identificacin de taninos en el extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens.

Pruebas para Taninos

Molibdato de Sodio

Ferrocianuro-amoniaco

Solucin de iones Plomo

Solucin de

alcaloides

Yodato de

Potasio Nitrito de

Sodio

Patrn de cido Tnico al 2%

Solucin translcida rojo-naranja

Solucin translcida

amarilla

Precipitado blanco en el

fondo (cristales)

Precipitado blanco en el

fondo (grnulos)

Solucin naranja oscuro

translcido

Reaccin burbujeante

que deja solucin amarillo oscuro


positiva negativa positiva negativa positiva positiva

34

Tabla 11: Pruebas cualitativas para identificacin de flavonoides en el extracto hidroalcohlico 8:2 de Mucuna urens.

Pruebas para Flavonoides

Reactivo de Shinoda o Cianidina

Reactivo de Wilson cido Sulfrico Cloruro Frrico

Patrn de Quercetina al 1%

Solucin translcida rojo

sangre

Solucin translcida amarilla que da fluorescencia

amarillo-verdoso a 365 nm (UV)

Solucin translcida

amarillo oscuro

Solucin opaca verde

oscuro


negativa negativa negativa positiva

Cabe la posibilidad de que algn (os) metabolito (s) con grupos estructurales similares a los flavonoides o con varios grupos OH, est presente en el extracto (ver tabla 11); ya que la prueba de cloruro frrico fue positiva. Sin embargo, si solo esa prueba fue positiva no se puede presumir que existan flavonoides en el extracto; pues la prueba de cloruro frrico, no es especfica de flavonoides (tambin se usa para taninos) y las dems pruebas del grupo fueron negativas.

II Parte: Ensayos biolgicos del extracto crudo y separado II 1) Experimentos de respuesta de calcio sobre receptor M3. Clulas HEK-293 no transfectadas

II 1a) Comparacin de disoluciones de extracto bruto en diferentes solventes La actividad que se busc en estas clulas fue aquella relacionada con el receptor M3 endgeno, aunque es importante mencionar que las clulas poseen otros receptores endgenos que podran ser susceptibles a activacin por las sustancias presentes en el extracto.

35

Figura 5: Respuesta al calcio desencadenada por el receptor M3 en clulas HEK-293 empleando como sonda Indo-1. Emisiones tomadas a 401 y 475 nm; temperatura regulada a 21 C. A) M. urens 50 mg/mL en solucin salina + 1% DMSO y solvente, datos brutos. B) Extracto y solvente de la misma prueba, con valores de fluorescencia normalizados.

En la figura 5A se observa como seala la primera flecha (tiempo 1 min) que se agrega extracto crudo disuelto en solucin salina o solvente segn corresponda; como puede notarse la adicin del extracto produjo un incremento sbito en el nivel de fluorescencia pero sin ninguna respuesta celular (auto fluorescencia del extracto). La adicin de solvente no mostr ningn efecto ni de fluorescencia, ni de liberacin intracelular de calcio sobre las clulas. A los 4 min y 4 min 40 s se sealan la adicin de carbacol, agonista que produjo la respuesta por movilizacin de calcio en ambas ocasiones. En la cuarta flecha (tiempo 7 min) se seala la adicin de digitonina, detergente que produce el aumento mximo posible de fluorescencia al tomar en c

estudio del efecto in vitro del extracto hidroalcoholico crudo y fraccionado de las semillas de...

Documents