estudio de los microorganismos responsables del …
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UNIVERSIDAD DE LEÓN
FACULTAD DE VETERINARIA
Departamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos
ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS
RESPONSABLES DEL PROCESO MADURATIVO
DEL QUESO SAN SIMÓN DA COSTA
ARTESANAL CON VISTAS A LA ELABORACIÓN
DE UN CULTIVO INICIADOR PROPIO PARA
ESTA VARIEDAD.
María Araceli Fernández Cuadrillero
León, 2012
UNIVERSIDAD DE LEÓN
FACULTAD DE VETERINARIA
Departamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos
Estudio de los microorganismos responsables del
proceso madurativo del queso San Simón da Costa
artesanal con vistas a la elaboración de un cultivo
iniciador propio para esta variedad.
Memoria presentada por
María Araceli Fernández Cuadrillero
Para optar al grado de Doctora por la Universidad de León
León, Enero de 2012
UNIVERSIDAD DE LEÓN
INFORME DE LA DIRECTORA DE LA TESIS (Art. 11.3 R.D: 56/2005)
Las Drs. Dña. Ana Bernardo Álvarez y Dña Mª Eugenia Tornadijo
Rodríguez, como Directoras de la Tesis Doctoral titulada "Estudio de los
microorganismos responsables del proceso madurativo del queso San
Simón da Costa artesanal con vistas a la elaboración de un cultivo iniciador
propio para esta variedad" realizada por Dña. María Araceli Fernández
Cuadrillero en el Departamento de Higiene y Tecnología de los alimentos,
informan favorablemente el depósito de la misma, dado que reúne las condiciones
necesarias para su defensa.
Lo que firmamos para dar cumplimiento al art. 11.3. del R.D. 56/2005, en
León a 20 de enero de 2012
Fdo.: Ana Bernardo Álvarez Fdo.: Mª Eugenia Tornadijo Rodríguez
UNIVERSIDAD DE LEÓN
ADMISION A TRAMITE DEL DEPARTAMENTO Art. 11.3 R.D. 56/2005 y
Norma 7ª de las Complementarias de la U.L.E.
El Departamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos en su reunión
celebrada el día 24 de enero de 2012 ha acordado dar su conformidad a la
admisión a trámite de lectura de la Tesis Doctoral titulada "Estudio de los
microorganismos responsables del proceso madurativo del queso San
Simón da Costa artesanal con vistas a la elaboración de un cultivo iniciador
propio para esta variedad", dirigida por las Dra. Dña. Ana Bernardo Álvarez y
Dra. Dña. María Eugenia Tornadijo Rodríguez, elaborada por Dña. María Araceli
Fernández Cuadrillero.
Lo que firmo, para dar cumplimiento al art. 11.3 del R.D. 56/2005, en León a ___
enero de 2012
Esta Tesis Doctoral ha sido subvencionada por el Ministerio de Educación y
ciencia a través del Proyecto de Investigación: Proyecto ALI 96-1218-
CO202(CICYT)
A Juan Ramón
y Caterina.
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento:
A las Doctoras Ana Bernardo Álvarez y Mª Eugenia Tornadijo
Rodríguez, directoras de la presente Tesis, por su paciencia, confianza,
apoyo e inestimable ayuda.
A las personas relacionadas con el Departamento de Higiene y
Tecnología de los Alimentos de la Universidad de León que durante estos
años me han demostrado con su ayuda y comprensión una amistad que
conservaré siempre.
Quiero agradecer la colaboración de mi sobrino Javier Trobajo
Velado en el diseño de la portada.
Es imposible mencionar a todas las demás personas que de una u
otra forma han influido para que, a pesar de las dificultades, pueda
decir: "Finis coronat opus".
GRACIAS A TODOS
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Índice:
Pág.
I.- INTRODUCCIÓN
I.1. El queso definición y orígenes……………....……………….…..…..….……….…….…………..» 01
I.2. Caracterización de quesos tradicionales………….………...……….….……...…………….» 05
I.3. Microbiota de los quesos...........……….…………….…….…………..…...………………………..» 09
I.3.1. Las bacterias lácticas. ..…………………………...………….…………..…………...» 10
I.3.2. Micrococcaceae. .…….…………….………..………...…………………………………» 21
I.3.3. Las bacterias propiónicas ……..………………………………….……….………..» 23
I.3.4. Enterobacteriaceae…………..…………………..….………………..…………………» 24
I.3.5. Mohos y levaduras...…………..……………...….……………………….….………….» 24
I.4. Producción, consumo y comercio exterior de queso en España ..…….……...…» 29
I.4.1. Producción, consumo y comercio exterior de queso .…………….…..» 29
I.5. Los quesos españoles con distintivo de calidad. .…………………….………………….» 31
I.5.1. Los quesos gallegos con D.O.P. ……………………………...…….……….….» 38
I.5.1.1. El queso Arzúa-Ulloa .……………..………..……………………………………….» 38
I.5.1.2. El queso de tetilla. .……………………………..……………………………..………» 42
I.1.5.1.3 El queso de Cebreiro…….………..…………………….…………………..……..» 45
1.5.1.4 El queso San Simón da Costa….….………………….………….……………..» 47
Pág.
* Proceso de Elaboración ……….………….……..……………….……………….» 48
* Fabricación artesanal ………….………………………….………………………..» 49
* Fabricación industrial ………………………………………..…………….………» 52
I.6 Justificación y objetivos de esta Tesis Doctoral……..…………………….……..………» 58
II.- MATERIAL Y MÉTODOS
II.1.- Material de laboratorio …………………………………..…………..………………….…..……….» 60
II.2.- Elaboración de quesos y toma de muestras ………..………..……….…………………..» 61
II.3.- Análisis químicos y físico-químicos ………....………………………..….…………………..» 62
II.3.1.- Determinación de Humedad ………………………………………..….……………» 62
*II.3.1.1.- Determinación de humedad en leche ..………………………….……….» 62
*II.3.1.2.- Determinación de humedad en el queso. ………………..…………….» 63
*II.3.2.- Determinación de cloruros …………………………………………..………….» 64
*II.3.2.1.- Determinación de cloruros en la leche …………………….……………» 64
*II.3.2.2.- Determinación de cloruros en el queso ……………………..………….» 65
II.3.3.- Determinación de la lactosa …………………………..…………………….………» 67
II.3.4.- Determinación de ácidos D- y L-láctico ……………………………………….» 69
II.3.5.- Determinación de la actividad del agua ……………………………….………» 71
Pág.
II.3.6.- Determinación del pH ………………………………………………………..…………» 72
*II.3.6.1.- Determinación del pH en la leche ……………….…………..…….….……» 72
*II.3.6.2.- Determinación del pH en el queso. ……….……………………..…….…..» 72
II.3.7.- Determinación de la acidez titulable ……………………………..………….….» 73
*II.3.7.1.- Determinación de la acidez titulable en la leche………..….….……» 73
*II.3.7.2.- Determinación de la acidez titulable en el queso…................…….» 73
II.4.- Análisis microbiológicos ..………………………………….…………………………….…..…….» 75
II.4.1.- Homogenización de las muestras y preparación de las diluciones….…» 75
II.4.2.- Recuentos microbianos ….…………………………………………………..………..» 75
*Recuento de aerobios mesófilos totales ………………….……..…..…….» 76
*Recuento de psicrotrofos ……………………………………….……..………….» 76
*Recuento de bacterias lácticas …………….……………………...……………» 76
*Recuento de enterococos ………………………….…………………..…………» 77
*Recuento de micrococáceas …………………..………………………………..» 77
*Recuento de enterobacteraceas …………………………………………..…..» 78
*Recuentos de mohos y levaduras …………………………………..………..» 78
II. 4.3. Aislamiento de cepas …………………………………………………………………..» 78
Pág.
II.4.4. Identificación de cepas aisladas.…………………………..….……………………» 079
*Pruebas de adscripción a genero……………………..………….……………» 079
*Pruebas de adscripción a especie…………………..…………….…………..» 083
*Pruebas efectuadas para adscribir a especie……………..……….….....» 088
II.4.5.-Caracterización genética de cepas de bacterias lácticas….………...…» 089
II.5.- Caracterización tecnológica de cepas de bacterias lácticas aisladas del Queso San Simón da osta…………………………………………….………………………..….…..……» 093
II.5.1.- Actividad acidificante de las cepas de bacterias lácticas……………..» 093
II.5.2.- Actividad proteolítica de las cepas de bacterias lácticas….….…..….» 093
II.5.3.-Detención de la actividad enzimática por el sistema API-ZYM…………...» 093
II.6.-Tratamiento estadístico…………………………………………….…….…………………..........…» 094
III.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III.1.- Evolución de los principales parámetros químicos y fisicoquímicos del queso San Simón da Costa elaborado de forma artesanal a lo largo de la maduración………………………….……………………………………………………….………………..…...» 095
III. 2.- Evolución de los recuentos microbianos a lo largo de la elaboración del queso san simón da costa elaborado de modo artesanal ……………….….…….………..» 101
III.3.- Aislamiento de cepas de bacterias lácticas en Agar M17, MSE y Rogosa..………………………………………………………….………………………………..……………...…» 110
III.4.- Identificación de las cepas aisladas en Agar M17, Agar MSE y Agar Rogosa…………………………………………………………………………………………….…………………» 111
*Cepas adscritas al género Lactococcus……………..…..…………………» 111
Pág.
*Cepas adscritas al género Leuconostoc………………….....….…………» 113
* Cepas adscritas al género Lactobacillus ………………………..……….» 115
*Cepas adscritas al género Enterococcus …………………………………» 119
III.5.- Evolución de las especies de bacterias lácticas durante la elaboración y maduración del Queso San Simón da Costa. ………………………..….………………………..» 122
III.6.- Confirmación por técnicas genéticas de la identificación de las cepas sometidas a ensayo de aptitud tecnológica. …………………………….…..……………………» 127
III.7.- Estudio de la aptitud tecnológica de bacterias lácticas del Queso San Simón da Costa. …………………………………………….......………………………………………………» 130
III.7.1.- Actividad acidificante …………………………………………………………………» 131
III.7.2.- Actividad Proteolítica …………………………………………………………………» 137
III.7.3.- Actividad enzimática de las bacterias lácticas aisladas del Queso San Simón da Costa …………………………..…………………………………………....…………………»
143
III.8.- Criterios de selección de las cepas de bacterias lácticas aisladas del queso San Simón da Costa. ………………………………………………………………………….……»
150
IV.- CONCLUSIONES ……………………………………………………………………………….…………» 153
V.- BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………….…………………………………….» 156
Índice de figuras
Pág.
I.- INTRODUCCIÓN
Fig. 1.- Diagrama del flujo del proceso general de elaboración de queso…………..» 008
Fig. 2.- Formación del lactato por la ruta homofermentativa……………………………….» 013
Fig. 3.- Formación del lactato y otros compuestos por la ruta homofermentativa…….» 014
Fig. 4.- Distribución de los tipos de quesos con D.O.P. e I.G.P. en el territorio español. ……………………………………………………………………………………………………….……..» 034
Fig. 5.- Distribución de la comercialización total de quesos españoles amparados con figuras de calidad………………………………………………………………………» 035
Fig. 6.- Diagrama de flujo del proceso de fabricación artesanal del queso San Simón da Costa…………………………………………………………………………………………………..» 051
Fig. 7.- Diagrama de flujo del proceso de fabricación industrial del queso San Simón da Costa……………..……………………………………………………………………………………» 053
III.- RESULTDOS Y DISCUSIÓN
Fig. 8.- Evolución de los parámetros químicos y físico-químicos de la parte profunda del queso San Simón da Costa a lo largo de su maduración……………....» 097
Fig. 9.- Evolución de los parámetros químicos y físico-químicos de la parte superficial del queso San Simón da Costa a lo largo de su maduración……….……» 098
Fig. 10.- Evolución de los recuentos de los principales grupos microbianos de las muestras tomadas en leche, cuajada y porción profunda de los quesos a lo largo de su maduración………………………………………………………………………………………» 103
Fig. 11.- Evolución de los recuentos de los principales grupos microbianos de las muestras tomadas en la porción superficial de los quesos a lo largo de su maduración…………………………………………………………………………………………………..……..» 104
Pág.
Fig. 12.- Electroforesis de los productos PCR obtenidos con los primers 8-806.C: Control. ADN de fago Lambda digerido con HindIII. Orden del 1-10: Cepas lácticas aisladas del queso de San Simón artesanal: SS 1239, SS 13, SS 26, SS 193, SS 194, SS 1437, SS 1439, SS 2379, SS 163, SS 2068…………………..…..» 129
Fig. 13.- Electroforesis de los productos PCR obtenidos con el primer 8-806.C: Control. ADN de fago Lambda digerido con HindIII. Orden del 1-8: SS 1615, Control negativo sin ADN, SS 1594, SS 263, SS 1293, SS 1614, SS 2363, SS 164…………………………………………………………………………………………………………………..….» 129
Índice de tablas
I.- INTRODUCCIÓN
Tabla I.- Evolución nacional de la producción de queso industrial por categorías (miles tm.)……………………………………………………….....…………………..………… » 029
Tabla II.- Quesos españoles amparados con Denominación de Origen…………..…» 033
III.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla III.- Evolución de los principales parámetros químicos y físico-químicos en la leche, cuajada y porción profunda del queso San Simón da Costa a lo largo de la elaboración y maduración (valores medios de los 4 lotes ± desviación estándar…………………………………………………………………………..………………..» 095
Tabla IV.- Evolución de los principales parámetros químicos y físico-químicos en la porción superficial del queso San Simón da Costa a lo largo de la maduración (valores medios de los 4 lotes ± desviación estándar)……………………» 096
Tabla V.- Valores medios de los recuentos (log. UFC/g ± desviación estándar) de los principales grupos microbianos a lo largo de la elaboración y maduración en la porción profunda de 4 lotes de queso San Simón da Costa elaborado de forma artesanal……………………………………………………………………………………………..…….» 101
Tabla VI.- Recuentos medios (log UFC/g ± desviación estándar) de los principales grupos microbianos obtenidos durante la elaboración y maduración en la porción superficial de 4 lotes de quesos San Simón da Costa elaborado de forma artesanal…………………………………………………………………………………………..……….» 102
Tabla VII.- Características bioquímicas de las cepas de lactococos aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da Costa…………..……» 112
Tabla VIII.- Características bioquímicas de las cepas de leuconostoc aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da Costa………………..» 114
Pág.
Tabla IX.- Características bioquímicas de las cepas de lactobacilos aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da Costa………………..» 117
Tabla X.- Características bioquímicas de las cepas de lactobacilos heterofermentadores aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da Costa……………………………………………………………………………………..…….» 118
Tabla XI.- Características bioquímicas de las cepas de enterococos aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da Costa………………..» 121
Tabla XII.- Distribución de las cepas de bacterias lácticas aisladas en agar M17 durante la fabricación y maduración del queso San Simón da costa. …………….….» 124
Tabla XIII.- Distribución de las cepas de bacterias lácticas aisladas en agar MSE durante la fabricación y maduración del queso San Simón da costa………………….» 125
Tabal XIV.- Distribución de las cepas de bacterias lácticas aisladas en agar Rogosa durante la fabricación y maduración del queso San Simón da costa…….» 126
Tabla XV.- Actividad acidificante de 20 cepas de bacterias lácticas aisladas del queso de San Simón da Costa. ………………………………………………………………………..…» 132
Tabla XVI.- Actividad proteolítica de 20 cepas de bacterias lácticas aisladas del queso de San Simón da Costa………………………………………………………………….…………» 138
Tabla XVII.- Actividad enzimática 1
144
(valores aproximados), detectados por medio del sistema API-ZYM, de células enteras de 20 cepas de bacterias lácticas aisladas del queso San Simón da Costa…………………………………………………………..…»
Tabla XVIII.- Niveles relativos de la aptitud tecnológica (actividades acidificante, proteolítica, lipolítica y aminopeptidasa) de las bacterias lácticas aisladas del queso de San Simón da Costa. ………………………………………………………………………..…» 152
Intr
od
uc
ció
n
____________________________________________________________Introducción
1
I. INTRODUCCIÓN
I.1. EL QUESO. DEFINICIÓN Y ORÍGENES.
Según el Código Alimentario Español el queso es el producto fresco o
madurado, obtenido por coagulación, bajo acción del cuajo u otros coagulantes
apropiados, de la leche natural, de la desnatada total o parcialmente, de la nata,
del suero de mantequilla o de una mezcla de algunos o todos estos productos,
una vez separado el suero. Cabe destacar que esta definición no incluye los
procesos de elaboración, ni menciona las manipulaciones de la leche o la cuajada
en las diferentes etapas del proceso de fabricación, que son las principales
responsables de las diferencias entre los distintos tipos de quesos.
Desde un punto de vista etimológico la palabra "queso" proviene del latín
"formos", que se utilizaba para designar al canasto de mimbre donde se
desueraban los quesos. Españoles, portugueses, holandeses, alemanes e
ingleses usaron la raíz latina (queso-queijo-kaas-käse-cheese), mientras que
italianos y franceses se volcaron hacia la denominación griega
(formaggi~fromage).
El origen de este producto se remonta a épocas y civilizaciones muy
antiguas. De hecho, once mil años antes de Cristo los habitantes de Europa y
Medio Oriente habían aprendido el valor de la ganadería y domesticado unos
bóvidos llamados uros. Desarrollaron métodos de ordeño y comprobaron que la
leche que obtenían de los animales que criaban constituía una de las materias
primas de mayor valor nutritivo pero también que era un alimento que se alteraba
fácilmente. Las deficientes condiciones higiénicas y los escasos o rudimentarios
____________________________________________________________Introducción
2
métodos de conservación de los que se disponía favorecían el crecimiento
microbiano y la acidificación de la leche, originando la formación de un coágulo
que podía consumirse y conservarse durante ciertos períodos de tiempo. El
hombre también observó que la leche que se almacenaba en los odres fabricados
a partir de estómagos de rumiantes se cuajaba antes y que al separar el suero se
obtenía un producto de la misma naturaleza que el coágulo láctico pero de
diferentes características. Este nuevo producto poseía una mayor capacidad de
conservación e incluso sus características organolépticas podían mejorar con el
transcurso del tiempo.
Las primeras civilizaciones que se asentaron en el área mediterránea, a
orillas de los ríos Tigris, Ganges, Éufrates e Indo, contaban con una abundante
cabaña caprina y ovina y en muchas ocasiones, se han hallado vestigios de
vasijas que contuvieron queso o también inscripciones que se refieren a las
labores de pastoreo, ordeño y elaboración de queso. La primera noticia escrita
sobre el queso es una tabla de arcilla sumeria de hace 6.000 años en la que se
llevaban las cuentas del queso del rey. En un friso sumerio de hace unos 5.000
años, conservado en el Museo Nacional de Irak, se relata todo el proceso de
ordeño y elaboración de queso. Posteriormente, con la expansión de estas
culturas se consiguió trasladar estas prácticas a otras civilizaciones. También hay
datos que evidencian el conocimiento del queso en textos antiguos de autores
como Hipócrates, Aristóteles, Platón, Epicuro o Virgilio.
En la Península Ibérica se encontraron vasijas perforadas para la
elaboración del queso con la misma antigüedad, del Neolítico y de la Edad del
Bronce.
El queso adquirió un momento álgido en Grecia y en la época del Imperio
Romano, extendiéndose dicha popularidad por todo el imperio donde procuraban
que los quesos más apreciados, tanto de provincias cercanas o remotas,
____________________________________________________________Introducción
3
pudiesen ser degustados en Roma y no faltasen en las comidas de los
emperadores.
Tras la caída del Imperio Romano, el desarrollo de la tecnología quesera
atravesó una época crítica que se prolongó durante la Edad Media estando a
punto de estancarse por la oleada de guerras y enfermedades. Sin embargo, los
monasterios, abadías y estados feudales, al funcionar como comunidades
independientes y autosuficientes, contribuyeron a su desarrollo y evolución,
apareciendo nuevas variedades de quesos. Por poner algún ejemplo, cabe
destacar que entre los quesos franceses, el popular Münster nació en las abadías
situadas en la ladera del Vosgos, mientras que el Trappiste de Citeaux fue una
creación de la congregación del mismo nombre que vivía en la zona de Borgoña.
La tecnología quesera se inició de forma muy rudimentaria, basándose en
la transmisión de conocimientos adquiridos por la experiencia que formaban parte
del acervo cultural de los pueblos. Estas técnicas se fueron perfeccionando
gracias al desarrollo científico y tecnológico que tiene lugar a partir del siglo XVI.
Con la industrialización en los siglos XVII y XVIII la tecnología de elaboración de
quesos experimentó un fuerte impulso, mejorando los sistemas de prensado y
realizándose los primeros procesos de centrifugación. Los avances científicos
que se produjeron en el siglo XIX, entre los que cabe destacar, los
descubrimientos de Pasteur y Metchnikoff, permitieron conocer la implicación de
los microorganismos en los procesos de fermentación de los alimentos y el efecto
del calor sobre la conservabilidad de los mismos. De hecho, el desarrollo de la
pasterización adquirió una gran importancia para la tecnología quesera, al permitir
elaborar productos con mayores garantías higiénico-sanitarias y uniformidad en
los lotes de fabricación.
A mediados del siglo XIX se instalaron las primeras queserías industriales
en Estados Unidos y Europa. Aunque la reacción española fue algo más tardía,
su desarrollo posterior fue muy llamativo, representando actualmente la principal
____________________________________________________________Introducción
4
actividad de las industrias lácteas que, a lo largo del siglo XX, han ido
incorporando cambios notables en los sistemas productivos, que llevaron, no sólo
a la introducción de mejoras en el proceso de fabricación y a la automatización de
los procesos, sino también a la elaboración de nuevas variedades de quesos para
poder cubrir la necesidad de ofrecer a los consumidores nuevos productos,
fabricando quesos muy diferentes que van desde los más tradicionales hasta
modernos quesos “light” o con diferentes propiedades funcionales. La
pasterización de la leche constituye además una garantía sanitaria en aquellos
quesos que se consumen con un tiempo de maduración inferior a dos meses.
La industria quesera incorpora posteriormente aspectos económicos de la
producción y los conocimientos científicos que se han ido adquiriendo, así como
nuevas tecnologías destinadas a dar respuesta a la protección del medio
ambiente, constituyendo un sector que continúa en expansión, aunque sus
principales objetivos se centran en la obtención de productos de mejor calidad, en
la mejora de la producción, en la diversificación de productos, y en el
aprovechamiento de subproductos.
En los países tradicionalmente productores de quesos, especialmente en el
área mediterránea surge, a mediados del siglo XX, una demanda hacia los
productos tradicionales elaborados artesanalmente instalándose un gran número
de queserías artesanales próximas a lugares de elaboración de variedades
tradicionales, lo que ha contribuido de modo notable al incremento de la
producción quesera que se observó en nuestro país desde los años 80. Estas
iniciativas han permitido industrializar algunos quesos cuya producción se limitaba
al autoconsumo o a la venta directa y han contribuido al mantenimiento de estos
productos específicos y singulares que constituyen un interesante patrimonio
gastronómico. La exigencia de información sobre el origen y el proceso de
elaboración de estos quesos tradicionales hizo surgir la necesidad de instaurar
sistemas que certificaran su excelencia, de tal forma que en 1992 se impulsaron
____________________________________________________________Introducción
5
las figuras de calidad y nacieron en la Comunidad Europea sistemas generales de
promoción y defensa de aquellos productos alimenticios que mantienen una
estrecha relación entre sus características y el origen geográfico, resultando
imprescindible para preservar las peculiaridades de estos productos, abordar su
caracterización, que, en el caso de los quesos artesanales, implica la
estandarización del proceso de elaboración tradicional y el conocimiento de la
evolución de las características físico-químicas, microbiológicas, bioquímicas y
sensoriales a lo largo de la maduración.
I.2. CARACTERIZACIÓN DE QUESOS TRADICIONALES.
Los estudios de caracterización o tipificación de quesos han contribuido a
la recuperación y difusión de variedades tradicionales, permitiendo además
aumentar la productividad y la diversidad de quesos existentes en el mercado.
Tienen como objetivo conocer en profundidad la tecnología de elaboración, los
principales parámetros físico-químicos y bioquímicos, así como las principales
transformaciones bioquímicas que tienen lugar en el transcurso de la maduración
y la evolución de las poblaciones microbianas a lo largo de la misma. Dicha
información nos permitirá comprender mejor los mecanismos que intervienen en
la maduración de los quesos y los factores de los que depende la calidad de los
mismos, con el fin de mejorar la tecnología de elaboración e intentar obtener un
"starter propio" para cada una de las diferentes variedades.
Estos estudios tienen interés desde un punto de vista científico,
socioeconómico y tecnológico.
Científico, por el desarrollo y aplicación de métodos de análisis
encaminados a conocer los parámetros físico-químicos y la composición química
de la materia prima y del queso a lo largo de la maduración, así como la evolución
que experimentan los diferentes grupos microbianos durante el transcurso de la
____________________________________________________________Introducción
6
misma. Asimismo, nos permiten conocer los principales microorganismos
implicados en la maduración y sus propiedades, con el fin de definir un cultivo
iniciador adecuado, cuyo uso resulta imprescindible en la fabricación de quesos
elaborados con leche tratada térmicamente para sustituir la microbiota natural
inactivada en la pasterización.
Socioeconómico, al contribuir a incrementar el volumen de producción. En
este sentido, cabe señalar que muchos de los quesos conocidos y apreciados
internacionalmente, con volúmenes de producción importantísimos, han resultado
de la evolución de quesos artesanales que inicialmente tenían un ámbito de
distribución muy local y una producción limitada. Es evidente que la instalación
de queserías artesanales en áreas rurales además de contribuir al mantenimiento
de razas autóctonas y a conservar tradiciones culturales y gastronómicas, puede
suponer un beneficio económico para la zona, ya que, el aumento de producción,
impulsará el desarrollo de industrias en zonas rurales, aumentando también el
atractivo turístico.
Tecnológico, al permitir definir y poner a punto una tecnología de
elaboración, que garantice la calidad higiénico-sanitaria y permita uniformizar el
producto.
El proceso general de elaboración de queso comprende diversas etapas,
que, si bien pueden diferir en función del tipo de queso, se pueden englobar de
modo general en el diagrama de flujo indicado en la Fig. 1.
La calidad de los quesos va a estar condicionada por la composición
química y microbiológica de la leche de partida, por el proceso tecnológico de
elaboración, las condiciones higiénicas mantenidas durante el mismo y las
condiciones de maduración. En los quesos amparados con denominaciones
específicas de calidad, los Consejos Reguladores son los encargados de controlar
____________________________________________________________Introducción
7
la producción, la calidad de la materia prima, vigilar la elaboración y supervisar las
características del producto final.
La leche destinada a la elaboración de una variedad concreta debe
proceder de aquellas especies o razas autorizadas en el Reglamento y criadas en
la zona de producción, de animales sanos, estar exenta de calostros, de
medicamentos y conservantes y tener una baja carga microbiana y una
composición equilibrada, exigiéndose en ocasiones unas determinadas
características químicas o fisicoquímicas. Los componentes de la leche
desempeñan un papel fundamental. El agua influye en el rendimiento y favorece
el crecimiento microbiano. La grasa, en la textura, sabor y color. La lactosa en el
pH, regulando el desuerado y la maduración, además de en la textura y sabor. La
caseína en el rendimiento, sabor y olor. Las proteínas del suero en el proceso de
coagulación, así como los minerales que también contribuyen en la eficacia del
desuerado y en la textura de la cuajada.
La tecnología de elaboración va a repercutir no sólo en las características
finales del producto, sino también el rendimiento quesero y se define sobre todo
respecto al tipo de coagulación, desuerado y condiciones de maduración
(temperatura y humedad relativa de los locales de maduración), así como el
tiempo.
A medida que transcurre la maduración se van produciendo modificaciones
en los componentes y en los parámetros fisicoquímicos determinadas por la
microbiota, que a su vez también van a influir en la evolución de los grupos
microbianos y que finalmente, van a dar origen a las características específicas de
cada tipo de queso.
____________________________________________________________Introducción
8
Recepción y tratamientos previos de la leche
- Refrigeración
- Pasterización (opcional)
- Adición de CaCl2 (20 g/100 L)
- Adición de fermentos lácticos
Maduración de la leche
Incremento de la acidez de la leche en 2-3º Dornic
Adición de cuajo (10 a 30 mL de fuerza 1:10.000/100
L leche)
Coagulación
Operaciones de corte y trabajo de la cuajada
Desuerado del coágulo
Moldeado
Prensado
Salado
- En seco o en salmuera (18-25% de riqueza en sal)
Maduración - En cámaras con control de Tª y H.R.
Conservación
Control de calidad, envasado y distribución del producto
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso general de elaboración de queso
____________________________________________________________Introducción
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I.3.- MICROBIOTA DE LOS QUESOS.
La microbiota de los quesos, está constituida fundamentalmente por
bacterias lácticas, que juegan un papel esencial en la acidificación inicial de la
leche, repercutiendo por tanto en la coagulación de la misma. De hecho, la
velocidad de acidificación es una de las propiedades más importantes de la
microbiota láctica (Cogan y col., 1997). En general, se puede afirmar que este
grupo microbiano posee la capacidad de adaptarse a medios con propiedades
físico-químicas y biológicas muy diferentes. También participan otros grupos
microbianos que, aunque no contribuyen a la producción de ácido, desempeñan
un papel significativo durante la maduración, siendo los más representativos los
micrococos, las enterobacterias, y las levaduras y mohos, que pueden crecer
interna o externamente en los quesos.
La evolución que siguen los diferentes grupos microbianos a lo largo de la
maduración va a estar determinada tanto por factores extrínsecos (proceso
tecnológico de elaboración o condiciones de maduración de los quesos) como
intrínsecos, considerando aquí las características y peculiaridades de cada queso.
Estos factores están interrelacionados entre sí, incluso las características físicas y
químicas de los quesos van a estar determinadas, en parte por la microbiota
característica. Por consiguiente, el transcurso del proceso madurativo va a estar
condicionado por la interacción que se produce entre la misma y determinados
factores bióticos y abióticos con influencia sobre las reacciones y las
adaptaciones fisiológicas y morfológicas de los microorganismos al medio.
Los factores abióticos comprenden las características del medio de cultivo,
son por tanto de naturaleza química y físico-química (pH, actividad del agua, (aw),
concentración salina, temperatura, disponibilidad de O2, etc.) Los factores bióticos
están determinados por la presencia de otros microorganismos. De hecho,
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podemos considerar el queso como un sistema biológico en el que varios grupos
microbianos comparten un mismo hábitat, estableciéndose entre ellos relaciones
de competencia o asociaciones de tipo simbiótico. La competencia que se
establece por los nutrientes hace que los grupos microbianos mejor adaptados a
las condiciones abióticas en ese momento o con un metabolismo más activo se
acaben constituyendo como dominantes respecto al resto. Cuando se modifican
esas condiciones, como consecuencia de la propia actividad microbiana o de
diversas reacciones bioquímicas, puede favorecerse el crecimiento de otro grupo
microbiano. Las asociaciones de tipo simbiótico también son frecuentes. Mientras
ciertos microorganismos poseen capacidad enzimática suficiente para llevar a
cabo la degradación de proteínas y péptidos de alto peso molecular, otros, en
cambio, sólo son capaces de degradar los péptidos de bajo peso molecular y los
aminoácidos, dependiendo, por tanto, de la acción microbiana de los primeros
para poder acceder a los nutrientes. Lo mismo se podría considerar con respecto
a la intensidad de la actividad lipolítica.
I.3.1. Las bacterias lácticas
En este grupo, "bacterias lácticas" (BAL), se engloban diversas bacterias
con las siguientes características: Gram positivas, no esporuladas, catalasa
negativa, aerotolerantes, ácido-tolerantes, con capacidad de fermentar
carbohidratos con producción de ácido láctico como principal producto. Se
incluyen una diversidad de géneros con aplicaciones en procesos de fermentación
de alimentos: Carnobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus,
Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus y Weisella. (Wessel y col., 2004), siendo los géneros Lactococcus,
Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus y Enterococcus los que posen mayor
interés en tecnología quesera. A veces, también se considera dentro de este
grupo al Bifidobacterium, ya que comparte con el resto de los integrantes el
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11
metabolismo fermentativo y la producción de ácido láctico, aunque
filogenéticamente no están relacionados (Stiles y Holzapfel, 1997).
La evolución que las BAL experimentan durante la maduración de los
quesos se caracteriza, en líneas generales, por un rápido crecimiento de los
lactococos, que comienzan a fermentar la lactosa en las etapas previas de la
maduración. Los leuconostocs tienen una capacidad inferior a la de los lactococos
para metabolizar los carbohidratos y requieren su acción previa, mientras que los
lactobacilos se mantienen en un segundo plano, ya que el metabolismo de la
lactosa es más lento en éstos, pero a medida que va transcurriendo la
maduración, los lactococos y leuconostocs van siendo reemplazados por los
lactobacilos.
Las bacterias lácticas llevan a cabo el transporte de la lactosa (sin fosforilar
y fosforilada) hacia el interior de la célula a través de dos mecanismos: el sistema
permeasa o el sistema fosfotransferasa, dependiente del fosfoenolpiruvato. El
primero, el sistema permeasa, está presente en las bacterias termófilas
(Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus y Lactobacillus lactis) y en
los leuconostocs, mientras que el segundo, el sistema fosfotransferasa es propio
de los lactococos. En todos los casos la lactosa es hidrolizada a glucosa,
galactosa o galactosa 6 P, que siguen posteriormente rutas diferentes en función
del tipo de microorganismo.
Las BAL pueden tener un metabolismo homo o heterofermentativo. Las
homofermentativas degradan las hexosas por la vía glucolítica, rindiendo ácido
láctico como producto final (ver Fig. 2). Las heterofermentativas siguen la ruta de
las pentosas-fosfato y producen ácido láctico, acético o etanol y CO2. (Ver Fig. 3).
En el primer grupo se incluyen los lactococos, que producen L(+) lactato como
único producto final de la fermentación de los carbohidratos cuando las bacterias
crecen con exceso de glucosa o lactosa. Los leuconostocs, en cambio,
pertenecen al grupo de las bacterias lácticas heterofermentativas, produciendo a
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partir de la glucosa, lactato, acetato, etanol y CO2, ya que, en lugar de llevar a
cabo la degradación de la glucosa por la ruta glucolítica, al carecer de la enzima
glucosa (1,6) difosfato, emplean la de las pentosas fosfato. Los lactobacilos
pueden ser homo o heterofermentativos, o también heterofermentativos
facultativos, en función de las características del medio de cultivo, pudiendo llevar
a cabo isomerizaciones y racemizaciones del ácido láctico, produciendo D(-)
lactato y DL- lactato.
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13
FRUCTOSA GLUCOSA
ATP
ATP
ADP
ADP
Glucosa-6-fosfato
Fructosa-6- fosfato
ATP
ADP
2Gliceraldehido-3 fosfato
2 P1
2NDA+ 4 ATP
NADH 4 ADP
2 Piruvato
NDA+ ATP
NADH AD
2 Lactato
Figura 2. Formación de lactato por la ruta homofermentativa
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Glucosa Fructosa
ATP ATP
ADP ADP
Glucosa-6-fosfato Fructosa-6fosfato
NAD
NADH
6-phosphogluconate
NAD
CO2 NADH
Ribulose-5-fosfato
Xylulose-5-fosfato
P1
ADP ATP
Glyceraldehydo-3-Fosfato Acetyl fosfato Acetato
P1 Ca
NAD 2 ADP P1
NADH 2 ATP
Piruvato Acetil- CoA
NADH NADH
NAD NAD
Acetaldehido
Lactato NADH
NAD
Etanol
Figura 3. Formación de lactato y otros compuestos por la ruta heterofermentativa
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Las BAL desarrollan un papel principal en el inicio de la fermentación,
produciendo acidez, (pueden disminuir el pH de la leche a valores inferiores a 5,3
tras 6 horas de incubación a 30-37º C), favoreciendo la coagulación y
promoviendo la maduración de los quesos (Ross y col., 2000). También activan
la sinéresis de la cuajada y solubilizan el calcio micelar, influyendo en la textura
de los quesos. Con el inicio de la maduración comienzan a multiplicarse
activamente, pudiendo alcanzar concentraciones del orden de 108 UFC/g Los
lactobacilos (pH óptimo de crecimiento de 5,5, a 6,2) son más ácido-tolerantes
que los lactococos y los leuconostocs (pH óptimo de 6,3 a 6,5). La sensibilidad de
cada especie bacteriana al pH del medio es uno de los elementos determinantes
de la competencia entre grupos microbianos. Los valores de pH finales que se
alcanzan también son más bajos respecto al género Lactobacillus (3,2 a 3,5) que
a los otros dos (4,0 a 4,5 en Lactococcus y en torno a 5,0 en Leuconostoc).
Las BAL, además de ácido láctico pueden producir otros compuestos
aromatizantes responsables del desarrollo de las características organolépticas
de los quesos, o incluso participar, aunque sea ligeramente, en algún estadío del
proceso de degradación proteica. Sus enzimas pueden participar en la proteolisis
y en la conversión de aminoácidos en compuestos responsables del aroma.
Algunas cepas tienen proteasas asociadas a la pared celular que hidrolizan
preferentemente la caseína. Los péptidos generados pueden ser luego
hidrolizados a péptidos más pequeños y aminoácidos por las peptidasas extra e
intracelulares. Las proteasas de las BAL han sido detalladas por Desmazeaud y
Zevaco (1979) y su esquema de actuación ha sido resumido por Thomas y
Pritchard (1987), Fox y col., (1993), Monnet y col., (1993), Visser (1993),
Bockelmann, (1995), Exterkate, (1995) y Law y Haandrikman, (1996) entre otros.
Su intervención en la proteolisis no debe ser considerada aisladamente ya que la
acción de las bacterias lácticas es complementaria a la del cuajo y otras
proteasas presentes en la leche, originando péptidos cortos y aminoácidos, a
____________________________________________________________Introducción
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partir de los péptidos liberados en los estadios iniciales de la maduración, que van
a ser los principales precursores del aroma del queso.
Algunas especies de bacterias lácticas tienen cierta actividad lipolítica,
pudiendo hidrolizar la grasa de la leche o algunos triglicéridos (Gobbetti, y col.,
1996), aunque la lipolisis de los quesos atribuible a la microbiota ácido láctica es
muy limitada, dirigiéndose principalmente la acción de sus lipasas sobre mono y
diglicéridos formados previamente por la lipasa nativa de la leche (Stadhouders y
Veringa, 1973). La hidrolisis es lenta y la concentración de ácidos grasos libres es
escasa, por lo que su contribución al aroma del queso parece no resultar
demasiado importante (Law, 1984b; Olson, 1990).
En general, tanto las lipasas de lactococos como las de lactobacilos liberan
específicamente ácidos grasos libres de cadena corta (El-Soda y col., 1986;
Kamaly y Marth, 1989), aunque se ha observado, en algunos casos como con
Lactobacillus casei (Yu, 1986), liberación, en cantidad importante, de ácidos
grasos de cadena larga C16 y C18:1.
Las condiciones óptimas para el funcionamiento de las lipasas son valores
de pH próximos a la neutralidad y temperaturas entre 35 y 40º C, aunque existen
pequeñas diferencias dependiendo de la especie implicada. Así, mientras que las
lipasas de de Lactococcus lactis y Lactococcus cremoris funcionan mejor a pH 7-
8,5 y 37º C (Kamaly y col. 1990), las de Lactobacillus plantarum tienen un pH
óptimo de actuación entre 6-7 y temperaturas de 40ºC, aunque estas últimas son
más activas frente a sustratos en solución, lo que hace pensar que sean
esterasas. Parece demostrado que tanto los lactococos, los más lipolíticos, como
los lactobacilos, poseen normalmente mayor actividad esterasa que lipasa
(Piatkiewicz, 1987). Su localización es fundamentalmente citoplasmática, por lo
que resulta necesaria la lisis bacteriana para que puedan funcionar. No obstante,
en L. casei, Yu (1986) ha demostrado la existencia de lipasas exocelulares
capaces de liberar grandes cantidades de C9 y C10.
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En Enterococcus faecalis, ha sido puesta de manifiesto una lipasa
intracelular (Chander y col., 1979), estable entre valores de pH 6 - 8, con gran
afinidad sobre triglicéridos de cadena corta.
Entre los derivados lácteos son muchos los que se obtienen por la acción
de las BAL. De hecho, como ya se comentó, tienen un importante papel en el
proceso de elaboración y maduración de los quesos. Están presentes en quesos
artesanales, fabricados con leche cruda así como en quesos elaborados con
leche pasterizada a la que se añadieron como cultivos iniciadores.
Si se emplea leche cruda es posible elaborar queso sin la adición de
cultivos iniciadores, pero esta práctica puede llevar en muchas ocasiones a la
obtención de un producto final de características no uniformes o con defectos y
alteraciones. En la actualidad, se añaden cultivos para fabricar quesos, a partir de
leche cruda y pasterizada, permitiendo restaurar o potenciar el desarrollo de la
microbiota beneficiosa y proporcionando productos higiénicamente aceptables.
Estos cultivos iniciadores pueden estar constituidos por una sola cepa (cultivos
puros) o una asociación de dos o más (cultivos mixtos). Los que se suelen
emplear en la fabricación de la mayoría de las variedades de quesos incluyen
microorganismos acidificantes, generalmente Lactococcus lactis subsp. lactis, L.
lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis, que
además de acidificante también es aromatizante, o alguna especie de
Leuconostoc productora también de compuestos responsables del aroma. Otras
especies como Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp.
delbrueckii, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis o Lb.
helveticus, constituyen los cultivos termófilos, que se emplean en la elaboración
de quesos como el Gruyère o el Emmental.
Los enterococos, juegan un papel beneficioso, contribuyendo al desarrollo
de las características organolépticas de los quesos debido a que pueden
desarrollar una intensa actividad proteolítica y lipolítica. Además de su resistencia
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al calor, su capacidad de crecer en ambientes restrictivos de salinidad alta y bajo
pH, su poder de acidificación y su capacidad para utilizar citratos, algunas cepas
producen enterocinas inhibidoras de algunos microorganismos patógenos.
Los enterococos tienen una gran capacidad de supervivencia en
condiciones adversas de pH, sal, temperatura o actividad del agua, y se han
llegado a aislar de quesos elaborados con leche pasterizada, debido a su elevada
termorresistencia (Sanz Pérez y col., 1982; Magnus y col., 1986, 1988; Huycke y
col., 1998; Martínez y col., 2003 a, b), habiéndose descrito que son capaces de
sobrevivir a un tratamiento de 60ºC durante 30 minutos (Hardie y Whiley, 1997;
Morrison y col., 1997). Se desarrollan en gran variedad de quesos, especialmente
en los fabricados de forma artesanal en el sur de Europa (Portugal, España, Italia
y Grecia), como los de cabra, crudos o pasterizados (Tornadijo y col., 1995;
Zárate y col., 1997; Freitas y Malcata, 2000; Suzzi y col., 2000; Andrigheto y col.,
2001; Gómez y col., 2007) y en los de oveja o vaca (Ordóñez y col., 1978;
Trovatelli y Schliesser, 1987; Coppola y col., 1988; Fernández del Pozo y col.,
1988a; Litopoulou-Tzanetaki, 1990; Litopoulou-Tzanetaki y Tzanetakis, 1992;
Poullet y col., 1993; Kalogridou-Vassiliadou y col., 1994; Torri Tarelli y col., 1994;
Macedo y col., 1995; Centeno y col., 1996; Cuesta y col., 1996; Zárate y col.,
1997; Aran, 1998; Bouton y col., 1998; Pérez Elortondo y col., 1999; Xantophoulos
y col., 2000; Sarantinopoulos y col., 2002 b; Litopoulou y col., 2003).
Todo ello conduce a que hayan sido propuestos en numerosos ocasiones
como parte de los cultivos iniciadores de un gran número de quesos, sobre todo,
de algunos típicos de determinadas regiones europeas, como el de Cebreiro
(Centeno y col., 1996, 1999), el Mozarella (Coppola y col., 1988; Parente y col.,
1989), el Feta ( Sarantinopoulous y col., 2002a ) y el San Simón da Costa ( García
y col., 2002), o en otros, como el Ras de Egipto (Awad y col., 2007), así como de
____________________________________________________________Introducción
19
yogures (El-Samragy y col., 1988) y helados (Carter y col., 1990, Gutkevich,
2002).
Los enterococos se han utilizado también como co-cultivos iniciadores en la
elaboración de otros quesos como el Cheddar, Feta, Mozarella, o Venado
(Moreno y col., 2006). En la mayoría de estos casos se han utilizado cepas de
Enterococcus faecalis, a excepción del queso Feta en el que se emplearon cepas
de las especies E. faecium y E. durans (Litopoulon-Tzanetaki y col., 1993;
Sarantinopoulos y col., 2002).
Aunque los enterococos han sido considerados microorganismos inocuos
o con bajo potencial patógeno (Moellering, 1990; Jordens y col., 1994; Leclercq,
1997), se ha descrito que pueden afectar a personas especialmente
predispuestas (inmunocomprometidas o pacientes de oncología, hematología,
nefrología o de unidades de trasplante), encontrándose entre los principales
agentes patógenos nosocomiales responsables de bacteriemias, endocarditis e
infecciones del aparato urinario, con una incidencia aproximadamente del 12%,
(Murray, 1990; Marrison y col., 1997; Woodford 1998; Linden y Miller, 1999),
siendo Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium las especies más
importantes (Facklam y col., 2002). Por ello, la selección de cepas de
Enterococcus con aplicación en tecnología quesera debe realizarse también
atendiendo a diversos aspectos que puedan indicar una potencial patogenicidad:
actividad β-hemolítica, resistencia a la vancomicina, producción de toxinas y
producción de aminas biógenas, entre otras.
Los lactobacilos mesófilos y los pediococos, que constituyen una parte
significativa de la microbiota de muchas variedades de quesos, se incluyen en el
grupo de bacterias lácticas "non starter" (NSLAB). Las NSLAB normalmente
encontrados en los quesos suelen pertenecer a las especies Lactobacillus casei,
Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus y Lb. curvatus.
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20
Para la utilización de las BAL en tecnología quesera hay que tener en
cuenta que no entran en la categoría de aditivos, por lo que están exentos de los
requerimientos que la U E exige a los mismos. En cambio, en algún país pueden
estar considerados como tales, por lo que debe asegurarse su seguridad y
eficacia antes de su utilización y ésta debe ser notificada a las autoridades
pertinentes. En EEUU, es la industria la que cataloga una nueva cepa
microbiana, con aplicación en alimentos, como un aditivo o sustancia GRAS
(sustancia generalmente reconocida como segura). La UE no tiene legislación
que regule el uso de BAL en los alimentos con finalidad de cultivo iniciador
tradicional, suplemento o cultivo probiótico. Solamente se contempla legislación
específica para cultivos modificados genéticamente y para cultivos empleados
para alimentación infantil. Para cultivos probióticos empleados para alimentación
animal hay una detallada legislación europea desde 1994 (Reglamentos de la
Comisión: 1288/2004, 2148/2004, 1200/2005, 1290/2008, 899/2009 y 911/2009).
Las bacterias lácticas también pueden ejercer un efecto protector frente al
crecimiento de microorganismos patógenos. La producción de compuestos
antimicrobianos de diferente naturaleza (ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno
o bacteriocinas) es una característica de este grupo, que puede hallar
aplicaciones muy diversas. Las bacteriocinas (sustancias antimicrobianas de
naturaleza proteica) pueden tener una aplicación tecnológica en el control de
ciertos patógenos Gram (+) como Listeria spp. o algunas cepas de
Staphylococcus aureus. La bacteriocina mejor caracterizada y hasta el momento
la única aceptada como aditivo alimentario y reconocida por la FDA con la
categoría GRAS (Generally Recognized As Safe) es la nisina. Fue descrita en
1928 y se aisló a partir de Lactococcus lactis subsp. lactis (Mattick y Hurst, 1944;
Delves-Broughton, 1990; Delves-Broughton y col., 1996). Se utiliza como
conservante en quesos, postres, yogures, bebidas fermentadas, carne, pescado y
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productos enlatados, comercializándose mezclada con sólidos lácteos bajo la
denominación de Nisaplina (Castro y col., 2004).
Debido a las potenciales aplicaciones de las bacteriocinas, actualmente
hay numerosos estudios acerca de la producción de estos compuestos por las
bacterias lácticas. Una de estas aplicaciones es garantizar la salubridad de los
alimentos en los que estos microorganismos se encuentran presentes, pudiendo
jugar un papel importante en los productos mínimamente procesados (Villani y
col., 1993; Franz y col., 1996; Bennik y col., 1998; Floriano y col., 1998).
También las bacteriocinas producidas por enterococos, tienen un
importante potencial tecnológico, dado su elevado efecto inhibitorio frente a
patógenos, como Bacillus spp. y Staphylococcus spp. (Gálvez, 1987), algunas
especies de Salmonella (Audisio y col., 1929), algunas cepas de Listeria
monocytogenes (Parente y Hill, 1992a; Giraffa, 1995; Parente y col., 1997) y
varias especies de Clostridium, incluyendo Cl. botulinum, Cl. perfringens y Cl.
tyrobutyricum (Torri Tarreli y col., 1994; Franz y col., 1996). Además, Wachsman y
col. (1999) describieron una actividad antiviral para la Enterocina CRL 35, que
inhibe la multiplicación intracelular del virus del Herpes simplex. Las enterocinas
tienen gran resistencia a condiciones extremas, de forma que algunas de ellas se
mantienen estables durante los procesos de fermentación, pasterización,
refrigeración, congelación/descongelación y liofilización (Castro y col., 2004),
siendo muy útiles como bioconservantes alimentarios, dando óptimos resultados
la combinación de las enterocinas con el almacenamiento a bajas temperaturas
(Genigeorgis, 1993; Schellekens, 1999).
I.3.2. Micrococcaceae.
Las micrococáceas constituyen otro de los grupos microbianos que se
aíslan comúnmente de los quesos. Esta familia comprende los géneros
Staphylococcus y Micrococcus, hallándose el primero, generalmente, en mayor
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proporción que el segundo (Fischer y Schleifer, 1980). Su presencia debe ser
evaluada desde un punto de vista higiénico-sanitario, ya que algunas cepas
pueden ser responsables de la producción de enterotoxinas en el alimento, y
tecnológico pues también contribuyen a la maduración de los quesos. En las
primeras etapas de la maduración los recuentos de este grupo microbiano se
suelen mantener en bajos niveles ya que las bacterias lácticas, que llevan a cabo
la degradación de la lactosa y se encuentran en proporciones altas, ejercen un
efecto inhibidor, pero cuando las condiciones del medio se hacen menos ácidas
los recuentos de micrococáceas suelen experimentar un ligero incremento.
Entre sus características podemos señalar que son microorganismos
cuyos sistemas enzimáticos son sensibles a los bajos valores de pH, por lo que la
acidificación que se produce durante la elaboración y maduración de los quesos
contribuye al control de su crecimiento. Por otro lado, son microorganismos
resistentes a altas concentraciones de sal, pudiendo crecer en presencia de un
7,5% de sal, si bien los pH ácidos pueden incrementar su sensibilidad a la sal. La
reducción de la actividad del agua que se va produciendo con la maduración
tampoco va a influir sobremanera en su metabolismo, ya que algunos de ellos
pueden crecer e incluso producir toxinas a valores de aw de 0,90 ó 0,88 (Ordóñez
y de la Hoz, 2001). Las micrococáceas participan en las reacciones de
degradación proteica y lipídica mostrando capacidad para actuar incluso sobre las
caseínas (Ordóñez y Col., 1999), habiéndose descrito que poseen tanto actividad
proteásica exocelular (García de Fernando y Fox, 1991) que dirige su acción
principalmente sobre las s- y -caseínas como intracelular (Bhowmik y Marth.
1988), que actúa principalmente sobre la -caseína.
Además, también pueden contener otras enzimas que actúan
catabolizando los aminoácidos liberados durante la proteolisis, como
decarboxilasas, desaminasas que liberan amoniaco con la formación de ácidos
orgánicos y aldehídos, y transaminasas que pueden formar nuevos aminoácidos.
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En quesos fabricados con leche cruda la presencia de micrococos puede
repercutir positivamente en las características organolépticas, ya que sus lipasas
van a contribuir de manera notable en la producción de compuestos responsables
del aroma. Los micrococos poseen una lipasa intracelular activa a pH 5-6 y otra
exocelular activa a pH 8-8,5, capaces de actuar sobre triglicéridos con ácidos
grasos, tanto de cadena corta como larga; además, poseen actividad esterasa
que puede funcionar a pH entre 5-8 y concentraciones de sal/humedad menores
de 5% liberando ácidos grasos de cadena corta (Bhowmik y Marth, 1990).
I.3.3. Las bacterias propiónicas.
Otro grupo microbiano característico de muchas variedades de quesos,
como el Emmental, Gruyére o Comté son las bacterias propiónicas, que
metabolizan el lactato rindiendo propionato, acetato, CO2 y H2O. La producción de
ácido propiónico, acético y CO2 da lugar a la formación de “grandes ojos” en estos
quesos, contribuyendo al desarrollo de sus características organolépticas,
originando su aroma característico (Langsrud y col., 1978; Law, 1984a),
habiéndose demostrado también su participación en la liberación de la prolina,
agente responsable de su sabor.
En los quesos "tipo suizo" elaborados con leche pasterizada se deben
añadir estas bacterias a la leche, en cantidad tal que asegure unos niveles de 103
UFC/g. Por ello, se suele incorporar Propionibacterium freudenreichii subsp.
shermanii junto con bacterias lácticas termófilas en su fabricación, incrementando
durante la maduración la temperatura de las cámaras desde 18 hasta 22º C, con
el fin de alcanzar niveles del orden de 108 – 109 UFC/g. para inducir la
fermentación propiónica. Una vez que el queso ha adquirido las características
deseables se requiere un descenso de la temperatura para disminuir el desarrollo
y el crecimiento de las bacterias propiónicas
____________________________________________________________Introducción
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I.3.4. Enterobacteriaceae.
De interés higiénico-sanitario resulta el estudio del grupo de las
enterobacteriáceas, ya que su presencia se relaciona con contaminación de
origen fecal. Las enterobacteriáceas con capacidad de fermentar la lactosa y que
forman parte de la microbiota normal del tracto gastrointestinal del hombre y los
animales se agrupan bajo el término de coliformes. Se consideran excelentes
indicadores de contaminación de origen fecal, pudiendo en algunos casos tener
carácter patógeno por ser enteroinvasivos o por la producción de enterotoxinas,
destacando algunos géneros como Salmonella, Escherichia, Shigella y Yersinia.
También tienen interés tecnológico, ya que algunas enterobacteriáceas son
psicrotrofas y pueden producir lipasas y proteasas muy termorresistentes.
Además, pueden ocasionar hinchazones precoces en los quesos.
La evolución de este grupo microbiano en los quesos va a venir
determinada por los niveles iniciales en la leche y por las características
fisicoquímicas, bioquímicas y microbiológicas de los quesos y las condiciones de
maduración. Algunas especies son relativamente acidotolerantes, pero la mayoría
desaparecen en las etapas tempranas de la maduración. Además, poseen una
baja resistencia a los valores de aw que se instauran en el transcurso de la
maduración, repercutiendo también de modo eficaz en el control de este grupo
microbiano el efecto combinado de varios factores de inhibición.
I.3.5. Mohos y levaduras
Los mohos y levaduras constituyen también parte de la microbiota normal
de los quesos, viéndose su crecimiento favorecido por los bajos valores de pH,
bajos contenidos de humedad, baja temperatura de maduración y altos niveles de
sal que se instauran en el transcurso de la maduración.
____________________________________________________________Introducción
25
Las levaduras pueden crecer en amplios rangos de pH, si bien los valores
óptimos están comprendidos entre 3,5 y 6,5. Llevan a cabo la degradación de la
lactosa, contribuyendo al descenso del pH que tiene lugar en las etapas
tempranas de la maduración de los quesos. Pueden además fermentar la lactosa
en presencia de concentraciones relativamente altas de sal y degradarla
completamente a CO2 y H2O, contribuyendo así a la formación de compuestos
que son responsables del desarrollo del aroma y sabor del producto final.
Algunas especies pueden tener capacidad proteolítica y lipolítica, lo que
contribuirá al incremento del pH que se observa en las etapas finales de la
maduración.
En los quesos madurados por limo superficial o “smear-ripened cheeses”
hay levaduras que crecen durante las etapas tempranas de la maduración,
contribuyendo a su desacidificación. Estas levaduras además de metabolizar el
lactato también desaminan aminoácidos, originando cetoácidos y NH3. Al
desacidificar la superficie puede crecer la bacteria Brevibacterium linens, en la
que se ha descrito una actividad exopeptidásica cuyo nivel y naturaleza varía
según las cepas (Sorhaug, 1981; Hayashi y col., 1990; Gripon y col., 1991; Clancy
y O'Sullivan, 1993). El incremento del pH es relativamente rápido (pasando de 5 a
valores superiores a 7,5 en los primeros 10 días de maduración). Brevibacterium
linens confiere a los quesos un color rojo anaranjado, por difusión de un pigmento
a la superficie de los quesos, así como la textura untuosa que caracteriza la
corteza de este tipo de quesos, representados por el Limburger. El incremento
del pH al que contribuye el metabolismo de las levaduras, puede favorecer el
crecimiento superficial de otras bacterias como micrococos (Micrococcus luteus,
M. lylae) o estafilococos (Staphylococcus equorum, S. xylosus, S. saprophyticus).
Muchas preparaciones comerciales de “limo” contienen especies como Candida
utilis, Debaryomyces hansenii o Kluyveromyces lactis, con un gran potencial
____________________________________________________________Introducción
26
enzimático (proteinasas, peptidasas y lipasas) que originarán aminoácidos y
ácidos grasos, responsables del aroma de los quesos.
La presencia de mohos en los quesos determina las características finales
que adquieren ciertas variedades, debido a su intensa actividad proteolítica y
lipolitica.
Los quesos madurados por mohos se pueden dividir en dos grupos:
- Los madurados por la presencia de Penicillium roqueforti, que crece
formando venas azules en el interior. En este grupo se incluyen quesos como el
Roquefort, Gorgonzola, Danish Blue y Cabrales, entre otros.
P. roqueforti se puede inocular en la leche o bien en la cuajada. Su
crecimiento depende de la microbiota heterofermentativa que se desarrolle, de la
tecnología de elaboración (la cuajada debe quedar abierta, no se debe prensar) y
de la perforación de los quesos posteriormente al salado para así facilitar el
acceso de oxígeno.
- Los madurados por Penicillium camemberti, que crece en la superficie.
Como ejemplo podemos citar el Camembert y el Brie.
P. camemberti se siembra superficialmente en los quesos, por
nebulización. Al metabolizar el lactato a CO2 y H2O, contribuye a la
desacidificación de los quesos, originándose un gradiente de concentraciones que
tiene como resultado la difusión del lactato hacia el exterior. Los mohos
metabolizan el lactato en la superficie conduciendo a la neutralización del medio,
además, a partir de las proteínas pueden generar compuestos nitrogenados de
bajo peso molecular (principalmente amoníaco) que difunde al interior provocando
un incremento del pH que favorece la acción de la proteasa alcalina y del cuajo
residual, contribuyendo a la textura típica de este tipo de quesos.
____________________________________________________________Introducción
27
La evolución de los mohos y las levaduras está condicionada por el efecto
competitivo de otros microorganismos metabólicamente más activos y por las
condiciones del medio de crecimiento. En general, los mohos pueden crecer en
amplios rangos de pH y con concentraciones salinas incluso del 3%. Al ser
microorganismos resistentes a los bajos valores de aw, (toleran 0,94 - 0,96) que
normalmente se instauran en los quesos al final de la maduración, pueden crecer
en las etapas más avanzadas de la misma, cuando las condiciones se vuelven
adversas para muchos grupos microbianos. Tanto P. roqueforti como P.
camemberti producen aspartil y metaloproteasas (Kinsella y Hwang, 1977;
Gripon, 1987; Trieu-Cuot y col., 1982a y b). Estos microorganismos poseen un
sistema proteolítico complejo caracterizado por la presencia de endopeptidasas
exocelulares que degradan profundamente las caseínas s1 y , y varias
exopeptidasas que actúan de forma muy activa sobre los péptidos presentes y
dan origen a cantidades elevadas de aminoácidos (Desmazeaud y col., 1976;
Paquet y Gripon, 1980; Gripon y col., 1991).
Las lipasas fúngicas originan un elevado grado de lipolisis pudiendo llegar
a suponer los ácidos grasos libres en los quesos de vena azul el 25% del total de
los ácidos grasos presentes. A pesar de ello, su impacto en el aroma es menor
que el apreciado en otras variedades de queso, como el Romano o el Provolone,
en cuya maduración intervienen esterasas pregástricas. En los quesos
madurados por mohos el incremento del pH en la masa durante la maduración,
disminuye el umbral de percepción de los ácidos grasos libres; además, muchos
de ellos se transforman en metil cetonas y otros compuestos (Fox y col., 1993)
cuya repercusión en el aroma es más escasa.
La especificidad de las distintas lipasas fúngicas puede variar entre
especies. Así, mientras que la de Geotrichum candidum se caracteriza por actuar
sobre triglicéridos con ácidos grasos con un doble enlace en posición 9
(Sidebottom y col., 1991; Lesage y col., 1993), las de Penicillium roqueforti y
____________________________________________________________Introducción
28
Penicillium Camemberti muestran mayor especificidad en la liberación de ácidos
grasos de cadena corta (Ha y Lindsay, 1993).
También los pHs óptimos de actuación son diferentes. Así, por ejemplo, se
ha encontrado un óptimo a pH 9 para la lipasa exocelular de P. camemberti
(Lamberet y Lenoir, 1976), un pH 6 para la de G. candidum, mientras que P.
roqueforti produce una lipasa alcalina, más activa sobre la tributirina, con pH
óptimo de 7,5-8 (Eitenmiller y col., 1970) y una ácida, más activa sobre la
tricaproína, con pH óptimo de 6-6,5 (Lamberet y Menassa, 1983).
Por último, conviene resaltar que la concentración de cloruro sódico puede
modificar el grado de lipolisis debido a estas enzimas, habiéndose demostrado
(Godinho y Fox, 1981) que elevadas concentraciones de sal inhiben la lipolisis
asociada a P. roqueforti.
____________________________________________________________Introducción
29
I.4. PRODUCCIÓN, CONSUMO y COMERCIO EXTERIOR DE
QUESO EN ESPAÑA.
I.4.1. Producción, consumo y comercio exterior de queso.
La producción de queso en España se sitúa ligeramente por encima de las
301.000 toneladas anuales (Tabla I) y aunque está experimentando unos
importantes crecimientos interanuales, de más del 6,5%, no llega a alcanzar a los
principales productores europeos, Francia (1,85 millones de toneladas), Alemania
(1,6 millones) e Italia (con algo más de 1 millón de toneladas).
Tabla I. - Evolución nacional de la producción de queso industrial por
categorías (miles tm.)
Año 1998 2000 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Mezcla 103,8 111,5 103,8 114,1 121,5 121,0 126,9 121,0 122,4 125,4 116,8
Vaca (*) 110,2 116,0 110,2 134,4 130,0 134,2 129,5 131,4 129,0 123,5 124.1
Oveja 27,00 25,9 27,0 36,8 37,3 39,7 41,4 42,7 45,3 43,0 44,8
Cabra 8,80 11,8 4,9 13,1 14,9 14,1 16,7 21,6 20,4 20,9 16,2
Fundido n.d. n.d. 32,7 22,9 21,9 21,2 23,1 24,1 25,0 34,1 33,8
Producción
Total 262,1 265,2 278,6 321,3 325,6 330,2 337,6 340,8 342,0 346,9 301,9
Fuente: MAPA
(*) En los datos de producción de quesos de vaca se incluye el queso blanco pasterizado.
Las empresas españolas productoras de quesos constituyen un grupo
relativamente heterogéneo. Hay una amplia base de pequeñas y medianas
empresas de ámbito local, aunque tan solo siete grupos empresariales facturan
más de 200.000 toneladas anuales, entre ellas el Grupo TGT, Kraft Foods
____________________________________________________________Introducción
30
España, Mantequerías Arias, S.A., Lácteas García Baquero, S.A., Quesos
Forlasa, S.A., Quesería Ibéricas, S.A. y Lactalis Iberia, S.A.
El queso curado y semicurado constituye el 38,2% del mercado. A
continuación, figuran el queso fresco, con un porcentaje del 27,8%, el queso
fundido (17,4%) y otros quesos constituyen el 16,6% restante. El mayor
crecimiento corresponde a los quesos frescos. Por tipos de leche, los de vaca
son los más comunes (45,7% del total), seguidos de los de mezcla (41,7%), los de
oveja (9,5%), y los de cabra que, representan el 3,1%. (Tabla I.)
El consumo medio de queso en España, llega a alcanzar las 305.000
toneladas; por persona y año es de unos 6,69 Kg, de los que 1,83 Kg
corresponden a quesos curados y semicurados, 2,15 Kg a quesos frescos y 2,71
Kg a otros tipos de quesos. Canarias constituye la comunidad autónoma con un
consumo de quesos más elevado, seguido de Asturias. En el extremo opuesto
aparecen Castilla-La Mancha y la Comunidad Valenciana.
El consumo de quesos en España, aunque ha experimentado un fuerte y
permanente incremento en estos últimos años, sigue siendo bajo comparado con
otros países de la Unión Europea. Los países escandinavos, Francia, Grecia,
Italia, Suiza y Alemania, ostentan consumos que no bajan de 18 kilos por persona
y año.
Por lo que se refiere al volumen de quesos exportados, éste fue de
aproximadamente 43.300 toneladas (Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural
y Marino 2009), sin apenas variaciones con respecto al año precedente, por un
valor de unos 109,65 millones de euros, lo que supuso un incremento interanual
del 4,7%. Los principales destinos de las exportaciones fueron Italia, con más de
9.600 toneladas y Portugal, con cerca de las 8.000 toneladas. Estos dos países
acaparan el 77% de las ventas de quesos españoles en el exterior.
Las importaciones llegaron a representar las 219.500 toneladas, con un
descenso interanual en estos últimos 3 años del 7,6%; esta reducción se
____________________________________________________________Introducción
31
concentró en el segmento de los quesos rallados (13.000 toneladas en el año
2009, cuando en el año anterior superaron las 34.600 toneladas). Los quesos
Edam y Gouda constituyeron las ofertas más importantes, con alrededor de
121.076 toneladas en conjunto. A continuación figuran los quesos frescos (48.500
toneladas), los fundidos (24.650 toneladas y los quesos azules (8.110 toneladas).
Holanda, Francia, Alemania, Italia y Dinamarca acapararon el 85% de todas estas
importaciones. (Informe anual Alimarket/2009).
I.5. LOS QUESOS ESPAÑOLES CON DISTINTIVO DE CALIDAD.
El Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, (antiguo MAPA;
año 1990) recoge en el catálogo de quesos de España un total de 81 variedades
de quesos tradicionales, si bien en realidad el número de las existentes es aún
mayor. Entre estos quesos tradicionales españoles actualmente 24 gozan de
Denominación de Origen Protegida (DOP): Tetilla, Arzúa-Ulloa, Cebreiro, San
Simón da Costa, (Galicia); Cabrales, Gamonedo, Afuega„l Pitu, (Asturias);
Quesucos de Liébana, Picón Bejes-Tresviso, Queso de Nata de Cantabria,
(Cantabria); Idiazábal, (País Vasco); Roncal, (Navarra); L‟Alt Urgell y La
Cerdanya, (Cataluña); Zamorano, (Castilla y León); Manchego, (Castilla – La
Mancha); La Serena, Ibores, Torta del Casar, (Extremadura); Majorero, Palmero,
Queso Flor de Guía (Canarias) Mahón, (Baleares) Queso de Murcia, y queso de
Murcia al vino, (Murcia).
Están pendientes de ratificación por la Comunidad Europea el Reglamento
de la Denominación de Origen “Queso Casín (Asturias). Queso Sierras de Cádiz y
Ronda (Andalucia) y Queso Camerano (La Rioja).
Otros dos, el queso de Valdeón (Castilla y León) y el queso de los Beyos
(Asturias) se encuentran amparados con una Indicación Geográfica Protegida
(IGP).
____________________________________________________________Introducción
32
Las Denominaciones de Origen Protegidas (D.O.P.) se refieren al
nombre geográfico de la región, comarca, lugar o localidad, empleado para
designar un producto procedente de la respectiva zona, que tiene unas cualidades
y características diferenciales que se deben, exclusiva o fundamentalmente, al
medio natural (además de a su elaboración y maduración) y cuya producción,
transformación y elaboración se realiza en la zona geográfica delimitada.
El producto debe ser la consecución del efecto de ciertos factores ligados
al terreno pero también de una tecnología consagrada, resultado del esfuerzo de
generaciones sucesivas. Es decir, la leche de fabricación debe ser producida y
transformada en un área geográfica limitada y se procesará siguiendo
procedimientos tradicionales. Además, el queso obtenido debe poseer una calidad
elevada y constante y tener una originalidad y notoriedad evidentes.
Las Indicaciones Geográficas Protegidas (I.G.P.) se refieren al nombre
geográfico de una región, de un lugar determinado o, en muchos casos
excepcionales, de un país, que sirve para designar un producto agrícola o
alimenticio, originario de dicha región, y con una cualidad determinada, reputación
u otra característica que pueda atribuirse a dicho origen geográfico y cuya
producción y/o transformación y/o elaboración se realiza en la zona geográfica
delimitada.
En la Tabla II se resumen las principales características de los quesos
españoles amparados con Denominación de Origen. Su distribución geográfica
aparece en la figura 4.
____________________________________________________________Introducción
33
Tabla II. Quesos españoles amparados con Denominación de Origen.
QUESOS CON DENOMINACIÓN DE ORIGEN
TIPO DE LECHE TIPOS DE QUESOS
FRESCOS TIERNOS CURADOS Y AZULES ESPECIALES
SEMICURADOS
VACA CANTABRIA MAHÓN-MENORCA GAMONEDO
TETILLA LÁIT URGELL Y LA CERDANYA
ARZÚA ULLOA SAN SIMÓN DA COSTA
AFUEGA'L PITU
CEBREIRO FLOR DE GUIA
OVEJA IDIAZÁBAL
MANCHEGO
RONCAL
LA SERENA
ZAMORANO
TORTA DEL CASAR
CABRA DE MURCIA IBORES MURCIA AL VINO
PALMERO O PALMA
MAJORERO
CABRALES
MEZCLA QUESUCOS DE LIÉBANA PICÓN BEJES TRESVISO
____________________________________________________________Introducción
34
Figura 4.- Distribución de los tipos de quesos con D.O.P. e I.G.P. en el territorio español (Ministerio de Medio Ambiente y Medio rural y Marino, 2011)
____________________________________________________________Introducción
35
Por consiguiente, mientras que en la Denominación de Origen se establece
un vínculo “muy estrecho” con la tierra, ya que todo debe producirse, elaborarse y
transformarse en la zona, en cambio en la Indicación Geográfica Protegida se
establece un vínculo “más frágil” pues basta con que al menos una de las etapas
de la producción, transformación y/o elaboración tenga lugar en la zona y exista
una característica particular del producto que justifique su origen.
Figura 5.- Distribución de la comercialización total de quesos españoles
amparados con figuras de calidad (21.239 t.)
Fuente: Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino. (2011)
La comercialización de quesos amparados con figuras de calidad va
experimentando de forma continua un incremento interanual aproximadamente
del 12%, con una producción de 21.239 toneladas en el año 2009 (Ministerio de
Medio Ambiente y Medio Rural y Marino). En la Fig. 5 se muestran los porcentajes
____________________________________________________________Introducción
36
de comercialización total de los diferentes quesos con denominaciones de
calidad. El queso Manchego aparece como la primera oferta de este segmento,
con cerca de la mitad de la producción (41,83%). Le siguen en importancia el de
Arzúa Ulloa (14.06%), el de Mahón-Menorca (10.22%), el de Tetilla (9.89%) y el
de Idiazábal (6.51%). El queso San Simón da Costa representa alrededor del 2%
con una producción anual del orden de los 393.000 Kg, y habiendo experimentado
un incremento del 60% en los últimos 7 años (Garabal y col., 2008).
Otros quesos se amparan en otras figuras, tales como las Marcas de Calidad
establecidas por algunas Comunidades Autónomas que conllevan condiciones
administrativas menos exigentes respecto a su reglamento de uso y
responsabilidades; en Castilla y León se incluyen como Marcas de Calidad el
Queso de la Región del Duero y el de Arribes de Salamanca, y a partir de abril de
2010, la Consejería de Agricultura y Ganadería de la Junta de Castilla y León
mediante Orden AYG/473/2010 (BOCYL Nº 70), según el informe favorable del
Instituto Tecnológico Agrario de Castilla y León aprobó el reglamento de uso de la
marca "Queso Castellano". En Aragón se incluye el Queso Fresco de Aragón, el
Queso Curado de Aragón y el Queso de Teruel. En la Comunidad Valenciana, el
Queso Blanquet (o Queso de Cabra de Alicante), Queso de Cassoleta, Queso de
Servilleta, Queso de la Nucia y Queso Tronchón. En Cataluña, el Fromatge; en
Madrid el Queso de Cabra de Madrid y el Queso Puro de Oveja de Madrid; en
Murcia, el Queso de Cabra Curado a La Almendra y en la Comunidad de Baleares
el Queso de Mallorca (Baleares). (MERCASA 2009). Estas figuras de protección
han surgido con el fin de mejorar la elaboración, tipificación y comercialización de
algunos productos que no reunían los requisitos para su protección como DOP o
IGP.
____________________________________________________________Introducción
37
En el siguiente apartado se tratarán con mayor extensión los quesos
gallegos con DOP, especialmente el San Simón da Costa, objeto de estudio de
esta Tesis Doctoral.
____________________________________________________________Introducción
38
I.5.1.- Quesos gallegos con DOP
De gran vocación ganadera, Galicia es la comunidad autónoma española
con la mayor producción de leche de vaca, parte de la cual se destina a la
elaboración de diferentes variedades de queso. De hecho, en Galicia se localizan
4 quesos con DOP: Arzúa-Ulloa, (Orden de 26 de diciembre de 1997 de la
Consellería de Agricultura, Ganadería y Política Agroalimentaria), Tetilla (Orden
de 24 de noviembre de 1993 – B.O.E. de 25 de diciembre de 1993), reconocido
en el Reglamento de la C.E. 1107/1996, Cebreiro (Orden APA 1559/2005 de 17
de mayo – B.O.E. 25 de mayo de 2005) y San Simón da Costa (Orden APA
1540/2005 de 17 de mayo – B.O.E. de 30 de mayo de 2005).
I.5.1.1 El queso Arzúa-Ulloa
Características
También se conoce como "queso gallego" o "patela". Se elabora con leche
de vaca, principalmente en La Coruña y Lugo, salvo en aquellos enclaves en los
que existen otras variedades específicas como San Simón da Costa y Cebreiro.
____________________________________________________________Introducción
39
Se elabora en los ayuntamientos de Arzúa, Boimorto, Boqueixón, Curtis, Frades,
Melide, Mesía, Ordes, Oroso, O Pino, Santiso, Sobrado, Toques, Touro y
Vilasantar, en la provincia de La Coruña, y en Antas de Ulla, Carballedo,
Chantada, Friol, Guntín, Monterroso, Palas de Rei, Portomarín y Tabeada, en la
de Lugo. Es un queso madurado, de tierno a semicurado, de pasta compacta pero
blanda, cremosa y sin ojos, o con ellos pero de muy pequeño tamaño. De color
marfil o amarillo pálido, aunque desvaneciéndose un poco este color hacia el
centro del queso. La corteza es fina, lisa, cerrada, elástica, cerosa y de color
amarillo pajizo y sin crecimiento microbiano superficial. El aroma es muy intenso,
de tipo lácteo, resaltando un fuerte olor a mantequilla ligeramente rancia. El sabor
es franco, suave, ligeramente ácido y graso al paladar. La textura desde cremosa
fundente hasta seca friable, dependiendo fundamentalmente de la época del año
en que se ha elaborado (Prieto y col., 1997); y, con regusto fermentado y
ligeramente amargo para los quesos muy proteolizados, elaborados en la época
invernal o, por el contrario, ligeramente ácido para los quesos curados,
principalmente de verano.
Es un queso graso con un porcentaje de materia grasa del 40-55% sobre
extracto seco; un pH entre 5,1 y 5,4 y un extracto seco de al menos un 65%.
Este queso tiene forma discoidal y un tamaño de pequeño a mediano, con
pesos que oscilan entre 300 gramos y 2 Kg, si bien normalmente se presenta con
un peso de alrededor de 1 Kg.
Los tipos de quesos amparados por la denominación de origen Arzúa-Ulloa
son los siguientes:
a) Queso Arzúa-Ulloa, elaborado con leche pasterizada de vaca, con un
periodo de maduración de seis días como mínimo.
____________________________________________________________Introducción
40
b) Queso Arzúa-Ulloa de granja, elaborado con leche de vaca, cruda o
pasterizada; con la particularidad de que procede de vacas de la propia
explotación en su totalidad.
c) Queso Arzúa-Ulloa curado, elaborado con leche de vaca, cruda o
pasterizada, con un periodo de maduración de al menos 4 meses.
Proceso de elaboración
El queso Arzúa-Ulloa se elabora con leche cruda o pasterizada de vaca, de
la raza Frisona y sus cruces, Rubia Gallega y Pardo Alpina. A la leche
pasterizada se añaden cultivos iniciadores constituidos por Lactococcus lactis
subsp. lactis y L. lactis subsp cremoris. La coagulación de la leche se produce
con cuajo animal, siendo predominantemente enzimática. La cuajada se somete a
los tratamientos de corte, hasta tamaño de grano de maíz (5 - 10 mm.) y lavado
para rebajar la acidez de la cuajada hasta 4 -6 º D., y se introduce en moldes.
Tras el moldeado que se hace en paños comprimiendo manualmente la
cuajada se prensa durante al menos 2 horas. El salado de los quesos se realiza
en la cuba sobre la cuajada y/o introduciendo los quesos en una salmuera con
una concentración de 17º a 18º Baumé, en la que permanecerán un espacio de
tiempo no superior a las 24 horas.
La maduración tiene lugar por acción de bacterias ácido lácticas en
hórreos bien ventilados en las condiciones ambientales de la región (alrededor de
15º C) y HR altas (próximas a la saturación si se trata de zonas costeras) durante
unos 15 días, aunque puede prolongarse hasta dos meses. Su composición
química ha sido estudiada por Marcos y col., (1985) y el proceso madurativo por
Ordóñez (1974). La determinación y cuantificación de las fracciones nitrogenadas
clásicas determinadas por Ordóñez y Burgos (1977) a lo largo de la maduración,
indica que sufre una proteolisis bastante intensa. La proporción de algunos
____________________________________________________________Introducción
41
aminoácidos, como ácido glutámico, isoleucina, leucina, lisina e histidina
(Ordóñez y Burgos, 1977a) alcanzó valores similares en los quesos elaborados
con leche pasterizada y adicionada de un cultivo iniciador, propuesto por los
autores, que los que se alcanzaron en el queso hecho con leche cruda.
En otro trabajo, estos mismos autores (Burgos y Ordóñez, 1978)
encontraron que la principal diferencia entre los quesos elaborados con leche
cruda y pasterizada radicaba en que estos últimos presentaban contenidos más
altos de diglicéridos y ácidos grasos libres, aunque en líneas generales, el perfil
de los ácidos grasos libres resultó similar, siendo el mayoritario, el palmítico (C16)
seguido del oleico (C18:1) y del mirístico (C14).
Las características microbiológicas han sido también extensamente
estudiadas por Ordóñez y Burgos (1977b), Quinto y col., (1992); Centeno y col.,
(1994), Centeno y col., (1995a) y Menéndez y col., (2001).
También en algunos trabajos se abordó el estudio de la caracterización de
cepas de lactobacilos y las propiedades tecnológicas y enzimáticas de alguna
cepa aislada de queso (Centeno, Cepeda y Rodríguez-Otero, 1996a; Menéndez y
col., 1998 y Menéndez y col., 1999) así como el uso de cultivos iniciadores y su
incidencia en las características de los quesos obtenidos. (Menéndez y col.,
2000 y Menéndez y col., 2004.)
____________________________________________________________Introducción
42
1.5.1.2 El queso Tetilla
Características
La palabra “tetilla” define claramente la forma tradicional cónica, aplanada,
con un ligero pezón en su vértice. Es el queso más característico de Galicia,
definido y fácilmente reconocible por su formato y su corteza lisa y fina, de color
amarillo pajizo. A veces, al queso Tetilla le llaman también “Queso gallego” o
“Queixo do país” pero siempre añaden “de Tetilla”. Se produce en toda la
Comunidad de Galicia, aunque originariamente se elaboraba de modo artesanal
en el sur de La Coruña y en el norte de la provincia de Pontevedra.
El queso Tetilla es un queso madurado, de tierno a semicurado y graso. Se
caracteriza por su pasta blanda, cremosa y uniforme, compacta, con pocos ojos,
regularmente repartidos, textura cremosa y sabor suave y graso al paladar y color
que varía de blanco marfil a amarillento. Exteriormente presenta una corteza lisa y
elástica cerosa y limpia. El tamaño es de pequeño a medio, con pesos que
oscilan entre 0,750 Kg., y 1,5 Kg.
____________________________________________________________Introducción
43
Proceso de elaboración
Su elaboración es similar a la del queso de Arzúa-Ulloa, obteniendo su
forma mediante la utilización de moldes o cuncas, originalmente de madera, de
forma cónica o semiesférica.
Actualmente coexiste la elaboración tradicional, casera o en pequeñas
queserías de tipo artesanal, con la producción industrial, a partir de leche
pasterizada.
Es un queso de coagulación mixta, predominantemente enzimática que se
elabora con leche entera de vaca, cruda o pasterizada y preferentemente de la
raza Rubia Gallega, Pardo Alpina y Frisona.
La coagulación mixta se obtiene por adición de cuajo a la leche, mantenida
a una temperatura entre 28 y 32 ºC. Tras un período de coagulación de 1 a 2 h se
obtiene una cuajada compacta, que se corta o desmenuza suavemente hasta
conseguir gránulos de tamaño mediano. La masa se compacta a mano o se
prensa suavemente. En la elaboración artesanal el salado se realiza en la leche o
en la masa de cuajada, mientras que en la elaboración industrial el salado de los
quesos se realiza por salmuera o por frotación con sal sólida. Los quesos se
dejan orear en un ambiente fresco y ligeramente húmedo durante al menos una
semana. Opcionalmente se escalda con agua ligeramente salada para conseguir
una corteza lisa, cerrada y cerosa libre de crecimientos microbianos superficiales.
Los estudios referentes a los aspectos bioquímicos (Marcos y col., 1985),
han puesto de manifiesto que no difiere mucho en composición de otros quesos
de pasta blanda, siendo el calcio el componente mineral mayoritario, seguido del
fósforo y del sodio, y entre los microelementos, el zinc, seguido del hierro y del
manganeso. Los valores de aw son elevados y en cuanto a los ácidos grasos, el
____________________________________________________________Introducción
44
más abundante es el palmítico (C16) seguido del oleico (C18:1), el esteárico (C18) y
el mirístico (C14). Los valores hallados en las distintas fracciones nitrogenadas
revelaron que sufre una proteolisis moderada. Los parámetros proteolíticos a lo
largo del proceso madurativo han sido estudiados por Walser, (1990) y por.
Froufe, (1998), la composición de ácidos grasos, por La Fuente (1993)
habiéndose utilizado un análisis discriminante para la diferenciación con otras
variedades de quesos españoles (Millán y col., 1996). Mas recientemente se
realizó un estudio de caracterización de las bacterias lácticas principales
responsables de las características específicas de esta variedad. (Garabal y col.,
2008)
____________________________________________________________Introducción
45
1.5.1.3 El queso Cebreiro
Características
El queso Cebreiro se caracteriza por su forma de hongo, con una base
cilíndrica de diámetro variable y un sombrero ligeramente más ancho. Se elabora
en la provincia de Lugo, en los municipios de Piedrafita do Cebreiro, Folgoso do
Caurel, Cervantes, Triacastela, A consagrada, Láncara, As Nogais, Navia de
Suarna, Becerreá, Baleira, Baralla, Castroverde y Samos.
Es un queso de pasta blanda y untuosa, fundente al paladar, de textura
granulosa, color blanquecino y sabor lácteo ligeramente ácido. La corteza es fina,
firme, sin mohos y de color variable desde el blanco hasta el amarillento, según
sea el grado de maduración.
Su contenido en materia grasa está comprendido entre el 45 y el 60%. El
peso puede variar entre 300 gramos y 2 Kg.
Puede comercializarse fresco con una maduración mínima de dos días, o
curado con una maduración no inferior a dos meses.
Son varios los estudios existentes sobre la caracterización de este queso;
(La Fuente, 1993; La Fuente y col., 1995). Del análisis de 24 quesos obtenidos
en diferentes fabricaciones, resultó que su contenido medio global fue: Extracto
____________________________________________________________Introducción
46
seco: 45,4%. Proteína sobre ES: 39,1%. Grasa: 53,2%. Cenizas 2,95%. Lactosa:
3,61%. Ácido L-láctico: 1,18%. Ácido D-láctico: 0,3%. Cloruros: 1,57% Ca: 0,13-
0,74%. P: 0,41-0,93%. pH 4,3. Acidez titulable: 1,46 g de ácido láctico/100g de
ES; actividad del agua: 0,983-0,992. Resulta destacable el hecho de que el
contenido de cenizas fue muy bajo, debido a la baja proporción de sal que se
añade y a la desmineralización de la cuajada, a consecuencia de la acidificación
de la misma durante la elaboración.
También en estos estudios se comprobó que este queso sufre una
proteolisis muy escasa (NS del orden del 8%). El nitrógeno no proteico (NNP)
suponía alrededor del 3% del NT, representando el nitrógeno amínico (NA) un
0,67% del NT y el amoniacal del orden de un 0,4% Fresno y col., (1995)
estudiaron el contenido en macro y microelementos minerales encontrando que
posee una proporción baja de calcio, siendo el fósforo el macroelemento
cuantitativamente más importante, seguido del sodio y el potasio. Entre los
microelementos, el mayoritario fue el zinc, seguido del hierro y del cobre.
Posteriormente, Fernández-Albalat y col., (1996) determinaron la
composición química global (extracto seco, proteína y grasa) así como el pH de
esta variedad de queso fabricado de forma artesanal. Sus resultados coinciden
con los previamente descritos por La Fuente y col., (1995).
También han sido estudiadas sus características microbiológicas (Quinto y
col., 1994; Centeno y col., 1995b y La Fuente y col., 1995 Garabal y col., 2008)
Los microorganismos que se aislaron mayoritariamente fueron: Enterococcus
faecalis, Lactococcus lactis subsp. lactis y Leuconostoc mesenteroides,
habiéndose identificado también lactococos, leuconostocs y lactobacilos.
____________________________________________________________Introducción
47
1.5.1.4 El queso San Simón da Costa
Características
El Catálogo de quesos de España lo define como un queso madurado,
elaborado con leche de vaca de las razas Rubia Gallega, Pardo Alpina y Frisona y
de sus cruces. La leche empleada para su fabricación debe ser entera, limpia, sin
calostros, ni conservante alguno y con una composición equilibrada entre grasa y
proteína, conforme a las características de las razas de procedencia y estación
del año, para que el producto final tenga un contenido en materia grasa superior
al 45% sobre extracto seco.
El Reglamento admite dos tamaños diferentes, el grande y el pequeño o
bufón. El primero con una altura de 13 - 18 cm y un peso de 800 - 1500 g y el
segundo con 10 - 13 cm de alto y 400 - 800 g de peso.
La forma es de peonza o bala de cañón y la corteza es dura, de color
amarillo ocre, algo grasienta y lisa cerosa debido al escaldado que sufre después
de su fabricación. Es un queso graso, de pasta semidura, semielástica y prieta, de
color amarillento, con pocos ojos y pequeños. El olor, no muy apreciable en los
quesos frescos, es ligeramente ácido y agradable predominando una vez
madurado el olor a humo.
____________________________________________________________Introducción
48
Presenta un extracto seco mínimo de 55% y un contenido en grasa mínimo
de 45% y máximo de 60% sobre extracto seco.
El queso San Simón da Costa ha estado avalado por varias distinciones de
calidad aprobadas por la Comunidad Autónoma:
- Orde de 16 de abril de 1991 da Consellería de Agricultura, Gandería e
Montes, pola que se recoñece a denominación de Producto Galego de Calidade
para o Queixo de San Simón e se nomea o seu órgano rector provisional (DOG
9/05/91).
- Orde de 7 de julio de 1992 da Consellería de Agricultura, Gandería e
Montes, por la que se aprueba el reglamento del Producto Galego de calidade
Queso San Simón y de su órgano rector (DOG 22/07/92).
- Orde de 20 de abril de 1999 da Consellería de Agrilcultura, Gandería e
Política Agroalimentaria, pola que se recoñece a Denominación de Orixe Queixo
San Simón da Costa e se nomea o consello regulador provisional (DOG 4/05/99).
- Además en la Orden APA 1540/2005 de 17 de mayo (B.O.E. nº 128, de
30 de mayo de 2005); se ratificó el reglamento de la Denominación de Origen
Protegida “San Simón da Costa” y su Consejo regulador.
- Reglamento (CE) Nº 1229/2008 de 10 de diciembre de 2008, registra la
inscripción en el Registro de Denominaciones de Origen Protegidas Europeas de
la denominación "San Simón da Costa".
Proceso de elaboración
El queso San Simón da Costa se elabora actualmente de forma artesanal
e industrial, en el área geográfica que abarca la comarca de A Terra Chá, que se
compone de los siguientes términos municipales, todos ellos de la provincia de
Lugo: Villalba, Xemade, Abaín, Guitiriz, Begonte, Castro de Rey, Muras, Cospeito
y A Pastoriza.
____________________________________________________________Introducción
49
A continuación se describen las tecnologías de elaboración artesanal e
industrial de este queso:
Fabricación artesanal
El procedimiento de fabricación artesanal del queso de San Simón da
Costa se recoge en la fig. 6 de acuerdo con los estudios llevados a cabo por
diversos autores (Compairé, 1975; Fernández Martínez y col., 1990; Nhuch
2000).
Para la elaboración de este queso se calienta la leche hasta
aproximadamente unos 30º C, efectuando a continuación el salazonado, con una
cantidad de sal que oscila entre los 10 y los 20 gr/ L de leche. Para la coagulación
se emplea cuajo comercial o de preparación casera (utilizando los estómagos del
cerdo de la matanza domiciliaria, o cuajares de ternero). La cantidad de cuajo
empleada, su calidad y fuerza, son muy variables, suele ser en proporción alta del
orden de 100 mL/100 L de leche, para que la coagulación sea rápida, muy
compacta y muy elástica.
Una vez completada la coagulación se procede al corte de la cuajada en
cubos de 1 cm, a continuación se retira el suero y se vuelve a cortar en granos de
maíz, de manera que la rotura sea rápida pero poco intensa. Seguidamente se
deja un tiempo en reposo, siempre en caliente, para que se inicie el desuerado,
que dura de cinco a diez minutos aproximadamente. Transcurrido este tiempo se
efectúa el lavado y el primer prensado manual, presionando suavemente la
cuajada sin sacarla del recipiente hasta que ésta forme en el fondo de la vasija
una masa bien desuerada, homogénea y apelmazada. A continuación se procede
al escaldado (2 - 3 veces con agua a 90ºC), se pican con una aguja larga
presionando para lograr un mejor desuerado. Alisando la superficie y tapando los
agujeros formados en el picado. Se moldea empleando moldes con forma cónica
____________________________________________________________Introducción
50
(cuncas) y se introducen en las cámaras de maduración manteniéndolo 2 meses a
temperaturas en torno a 10 - 12ºC y humedad relativa del 70%.
La última operación que se realiza es el ahumado, que generalmente se
hace la víspera de su venta, con objeto de darles una presentación más
atrayente, llenar así una exigencia tradicional y característica, contribuir al
desarrollo de sus características organolépticas y a su conservación.
Generalmente se realiza esta operación en un cajón de dimensiones
variables, de fabricación rústica, en el que el fondo del cajón ha sido sustituido por
una serie de barrotes o varillas de madera, dispuestas paralelamente, dejando
entre sí un espacio de 3 a 4 cm para que el humo pueda entrar en el mismo. A
unos 40 cm del fondo del cajón se dispone un brasero con restos de madera de
abedul que se queman sin llama para que produzcan abundante humo. La
duración del ahumado viene a ser de unos treinta minutos. En muy contados
casos el ahumado se hace a mano, moviendo o girando el queso sobre la
columna de humo y en otros se ahuman con otras materias vegetales,
especialmente retama que en gallego se denomina "xestas".
____________________________________________________________Introducción
51
Leche entera de vaca (30 º C).
Salado (10 – 20 gr/ L leche)
Coagulación Adición de cuajo (comercial o casero)
(dosis variable)
Cuajada - Corte de la cuajada. Cubos de 1 cm
- Reposo de la cuajada. Desuerado
Nuevo corte (grano de maiz)
Desuerado total
Lavado
Escaldado
2-3 veces con agua a 90ºC
Picado con aguja
Alisado de la superficie
Moldeado
Maduración
Ahumado
Figura 6.- Diagrama de flujo del proceso de fabricación artesanal del queso San
Simón da Costa.
____________________________________________________________Introducción
52
Fabricación industrial
El procedimiento de fabricación industrial (Prieto y col., 1997) se resume en
la fig. 7. Se parte de leche entera pasterizada de vaca de las razas Frisona, Pardo
Alpina, Rubia Gallega y sus cruces, con una acidez de 16-17º D. La leche se
calienta a una temperatura de 33 a 35º C y se le añade un cultivo iniciador
constituido por Lactococcus lactis y L. cremoris en una proporción del 1 al 2%,
dejándolo actuar durante unos 30 minutos, de modo que la acidez se incremente
aproximadamente 1º D. A continuación, se añade cuajo animal (de fuerza
1:10.000) en dosis de 100 mL por cada 100 L. de leche, que permiten la
formación de una cuajada elástica, en unos 30 - 40 minutos. La cuajada se corta
en granos de diámetro comprendido entre 5 y 12 mm., sometiéndola a un
recalentamiento a 37-38ºC, para que la acidez del suero se incremente en unos
pocos grados Dornic. A continuación, se puede efectuar el lavado de la masa con
agua caliente (50ºC aproximadamente) hasta que adquiera la dureza y
consistencia deseadas, consiguiendo, al eliminar parte de la lactosa, incrementar
el desuerado y controlar la fermentación láctica. Después de efectuar un pre-
prensado de la cuajada en la cuba se desuera y se procede al moldeado. El
prensado se realiza sometiendo a presión los moldes en una prensa hidráulica,
comenzando con 1 Kg/cm2 y aumentando 1 Kg/cm2 cada hora transcurrida,
durante un mínimo de 3 horas. El salazonado se realiza por inmersión de los
quesos durante un tiempo máximo de 24 horas en una salmuera con una
concentración entre 14 y 17º Baumé. Tras el moldeado la maduración transcurre
en cámaras a temperaturas de 10 a 12ºC y humedades relativas cercanas al 70%.
El periodo mínimo de maduración será de 45 días para el formato grande y de 30
días para el formato pequeño o bufón, contados a partir de la finalización del
salazonado. Por último, unos días antes de su comercialización, los quesos son
ahumados con madera verde de abedul.
____________________________________________________________Introducción
53
Leche entera pasterizada de vaca
Calentamiento de la leche (30º -35º)
Adición de fermentos lácticos
(Lactocucus lactis y L. cremoris)
Maduración de la leche
Adición de cuajo animal. (30' – 40’) (fuerza 1:10.000) (100 ml/100 L de leche)
Coagulación
Corte de la cuajada.
Cubos de 1 cm.
Desuerado
Nuevo corte grano de maiz
Desuerado y moldeado bajo presión
Lavado de la cuajada con agua a 50ºC
Moldeado
(3 h.)
Prensado
Incremento de presión 1 kg/hora
Desmoldeado
Salado (Salmuera 14–17º Baumé 24 h.)
Maduración Tª: 10 – 12ºC. H.R: 70% t: 30 – 45 días
Ahumado
Comercialización y venta
Figura 7.- Diagrama del flujo del proceso de fabricación industrial del
queso San Simón de costa.
____________________________________________________________Introducción
54
Actualmente se dispone de datos relativos a las características físico-
químicas, bioquímicas y microbiológicas del queso San Simón da Costa,
fundamentalmente como resultado de trabajos de investigación enmarcados en
un proyecto desarrollado conjuntamente en la Universidad de León y la
Universidad de Vigo que abordaba su caracterización. Aunque previamente
existían algunos datos acerca de la composición de la leche utilizada para su
fabricación, la tecnología de la elaboración artesanal (Fernández Martínez y col.,
1990 b), alguna característica química y algunos parámetros fisicoquímicos
(Marcos y col. 1983 b; Marcos y col., 1985), el estudio bioquímico y microbiológico
de este queso a lo largo de la maduración no había sido abordado aún con
profundidad.
Los estudios realizados en el proyecto anteriormente señalado consistieron
fundamentalmente en la estandarización del proceso tecnológico de fabricación
artesanal e industrial de los quesos, en la determinación de los diferentes
parámetros químicos y físico-químicos de la materia prima utilizada y de los
quesos a lo largo de la maduración, fabricados de modo artesanal e industrial así
como en el estudio de los índices madurativos: parámetros glucolíticos,
proteolíticos y lipolíticos en el transcurso de la maduración, con el fin de
comprobar la existencia de diferencias y poder llegar a establecer pautas para la
adaptación del proceso industrial y conseguir una mayor calidad. (Nhuch, 2000;
Nhuch y col., 2008a, Nhuch y col., 2008b).
También se abordó el estudio de las características microbiológicas y la
evolución que experimentan algunos grupos microbianos a lo largo de la
elaboración y maduración, habiéndose identificado los microorganismos del
género Enterococcus aislados en Kanamycin Aesculin Agar base (KAA), (García
Fontán, 1999; García Fontán y col., 2001), asi como la microbiota halotolerante,
recontada en MSA (Mannitol Salt Agar), con el fin de determinar la implicación de
las cepas de la familia Micrococcaceae en la maduración de este queso
(Rodríguez Caeiro, 2000).
A partir de estos estudios se puede concluir que las principales diferencias
existentes entre los quesos fabricados de modo artesanal e industrial radicaron en
____________________________________________________________Introducción
55
el contenido en ácido D-láctico superior en los artesanales y en sal y cenizas, que
resultó más elevado en los industriales, que también presentaron un valor de pH
más alto.
El queso San Simón da Costa presenta una humedad comprendida entre el
40 y el 50% y un porcentaje de grasa sobre extracto seco, a los 45 días de la
maduración, de un 47,42%, por lo tanto, según el Código Alimentario Español, se
trata de un queso extragraso, con un bajo contenido en extracto seco, niveles
intermedios de actividad del agua, un pH relativamente alto y un elevado
contenido de minerales, especialmente calcio y fósforo.
La lactosa con cifras iniciales bastante altas se degradó rápidamente en los
dos tipos de queso durante los primeros 15 días de maduración, coincidiendo el
incremento en el contenido de ácido D–láctico con un ligero descenso del ácido
L–láctico, que pudo deberse a una reacción de racemización. Sin embargo, al
final de la maduración las proporciones de ambos ácidos permanecieron estables
lo que indica que el ácido L – láctico se debe originar de forma directa a partir de
la galactosa por la acción microbiana.
También es destacable el hecho de que el contenido en nitrógeno soluble,
expresado como % sobre NT, en torno al 6% al inicio de la maduración de los
quesos aumentó de forma significativa a partir de la primera semana, por lo que
parece importante el protagonismo de la microbiota presente en los procesos
proteolíticos (Nhuch, 2000). Los valores finales alcanzados para el NST, alrededor
del 25%, se encontraron dentro del rango descrito para otros quesos de vaca y
ponen de manifiesto que los procesos proteolíticos no son muy acusados en el
queso San Simón da Costa. Sin embargo, tanto la extensión como la intensidad
de la proteolisis resultaron distintas en los dos tipos de queso, presentando una
mayor degradación las fracciones nitrogenadas en los quesos artesanales, debido
a la mayor variación de la microbiota de estos quesos, lo que indica que con gran
probabilidad se prodrían mejorar las características de los quesos fabricados en
____________________________________________________________Introducción
56
las industrias mediante la utilización de bacterias lácticas con demostrada
actividad proteolítica.
El contenido de aminoácidos libres totales aumentó de forma progresiva a
lo largo de la maduración, alcanzando valores finales más elevados en los quesos
elaborados de forma artesanal lo que guarda relación con la variada microbiota de
los quesos artesanales, al no ser sometida la leche a un tratamiento de
pasterización, y con las endo y exopeptidasas de origen microbiano.
Los aminoácidos mayoritarios, en ambos tipos de queso, fueron el ácido
glutámico, el triptófano y la leucina, que representaron alrededor del 40% del total
de los aminoácidos existentes.
El índice de acidez de la grasa en los quesos aumentó significativamente a
partir de los 15 días de maduración, alcanzando cifras finales en torno a 0,6 mg
KOH/ g materia grasa. Los fenómenos lipolíticos no resultan de gran importancia
en el proceso madurativo del queso San Simón da Costa, lo que es común en
quesos con predominio de bacterias lácticas (cuya actividad lipolítica es bastante
moderada). El pérfil de ácidos grasos que presenta este queso no difirió
considerablemente del hallado para otros quesos de vaca, resultando los ácidos
grasos cuantitativamente más importantes, el oleico (C18:1) el palmítico (C16) y el
butírico (C4), por lo que también a partir de estos resultados se deduce que las
lipasas de las basterias lácticas son las responsables de las reacciones lipolíticas.
En relación a las características microbiológicas del queso San Simón da
Costa, a partir de los trabajos previos existentes se puede concluir que el
porcentaje de cepas adscritas a la familia Micrococcaceae representa menos del
20% respecto al total de cepas aisladas en MSA de leche, cuajada y profundidad
de los quesos a lo largo de la maduración y aproximadamente el 35% respecto a
las aisladas de la superficie. En todas las muestras el porcentaje de cepas
pertenecientes al género Staphylococcus superó al de Micrococcus,
constituyendo Staphylococcus sciuri la especie dominante, representando el 31%
____________________________________________________________Introducción
57
y el 46% del total de las micrococáceas aisladas de la profundidad y la superficie
de los quesos, respectivamente.
También se comprobó que durante el transcurso de la maduración el
porcentaje de micrococáceas fue disminuyendo mientras que el de enterococos
se fue incrementando, hecho que podría relacionarse con la mayor capacidad de
adaptación de los enterococos a las condiciones adversas que se van instaurando
en los quesos en el transcurso de la maduración.
Se puede considerar que la presencia de enterococos en los quesos varía
en función del grado de contaminación y de las condiciones del medio (pH, aw,
concentración de NaCl, etc.), si bien hay que tener en cuenta que son
microorganismos muy resistentes a las condiciones adversas y su aislamiento es
una constante en prácticamente todos los quesos mediterráneos (Tsakalidou y
col., 1993). Los enterococcos juegan un papel importante, y el medio KAA se
comportó como un medio selectivo, ya que el porcentaje de cepas adscritas al
género Enterococcus fue del 90% respecto a los aislamientos efectuados en este
medio a partir de la porción superficial de los quesos y del 80% respecto a los
aislamientos en leche, cuajada y porción profunda del queso. La especie
dominante fue Enterococcus faecalis (40% de los aislamientos efectuados en
KAA a partir de las muestras de la porción superficial de los quesos y 65% de los
de las muestras de leche, cuajada y porción profunda de los quesos).
____________________________________________________________Introducción
58
I.6. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DE ESTA TESIS DOCTORAL
Esta Tesis Doctoral forma parte de un Proyecto de Investigación más
amplio que se inició hace unos años, en colaboración con la Universidad de Vigo,
con la finalidad de caracterizar el queso San Simón da Costa. Como ya se
comentó, la caracterización de un queso exige el estudio y normalización del
proceso tecnológico de elaboración, el estudio de la evolución durante la
maduración de los principales parámetros composicionales, fisicoquímicos y
bioquímicos, así como de las poblaciones microbianas más representativas de los
quesos y el análisis sensorial para valorar las características organolépticas
peculiares de la variedad estudiada. Este trabajo de investigación se enmarca en
el estudio de los grupos microbianos de interés tecnológico, con especial
referencia a las bacterias acidolácticas, abordando su identificación y
caracterización.
Aunque las bacterias lácticas se están utilizando en la industria desde hace
tiempo, existe un interés creciente en el conocimiento de la microbiota de los
quesos fabricados con leche cruda debido a la necesidad de encontrar nuevas
cepas que complementen o que puedan llegar a reemplazar las bacterias lácticas
que se están utilizando. En este sentido, los quesos tradicionales constituyen un
importante depósito de diversidad microbiana que puede llegar a tener
importantes aplicaciones biotecnológicas, sobre todo, con vistas a la mejora de
las características peculiares de cada tipo de queso.
La posibilidad de emplear bacterias lácticas aisladas de quesos
tradicionales como cultivos iniciadores autóctonos en su elaboración industrial
daría la oportunidad de obtener quesos con mejores características
organolépticas en particular, aquellas relacionadas con la textura y el aroma.
Estos cultivos iniciadores autóctonos cuentan con la ventaja respecto a los
____________________________________________________________Introducción
59
comerciales de contribuir a la maduración aportando diversidad a las variedades
de quesos, bien sean fabricados con leche fresca o pasterizada, pero su posible
utilización exige la caracterización de un número representativo de cepas y la
selección de éstas en función de su aptitud tecnológica.
En concreto, los objetivos específicos de esta tesis fueron los siguientes:
1.- Estudiar la evolución que experimentan los principales grupos
microbianos a lo largo de la elaboración y maduración del queso San Simón da
Costa elaborado de modo artesanal y la evolución de los parámetros químicos y
físico-químicos.
2.- Identificar las bacterias lácticas aisladas en los medios específicos
(MRS, MSE y ROGOSA), con la finalidad de conocer los géneros y especies más
representativas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da
Costa elaborado de modo artesanal.
3.- Estudiar las principales características tecnológicas, como la actividad
enzimática (API-ZYM), la capacidad acidificante y la actividad proteolítica de un
número representativo de cepas de las especies de bacterias lácticas aisladas en
mayor proporción, comprobando previamente por técnicas genéticas la
adscripción a especie de dichas cepas.
4.- Seleccionar en función de su aptitud tecnológica las más apropiadas
para formar parte de cultivos iniciadores o adjuntos para su utilización en la
fabricación industrial de queso San Simón da Costa a partir de leche pasterizada.
. .................................................................................................... ..
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_____________________________________________________Material y Métodos
60
II. MATERIAL Y MÉTODOS
II.1.- MATERIAL DE LABORATORIO
- Para la trituración y homogeneización de las muestras se utilizó una picadora
MOULINEX y los homogeneizadores MASTICATOR (IUL instruments.
Barcelona, Spain) Y OMNI-MIXER 17220 (Sorvall, Newtown, USA).
- Las muestras y las cepas fueron mantenidas a –30ºC en un congelador
ZANUSSI.
- Las pesadas ordinarias se hicieron en un granatario electrónico CHYO MJ-
500 y para las de precisión se empleó una balanza digital PRECISA 303-A.
- Los agitadores magnéticos utilizados fueron BIBBY HB502, AGIMATIC-N
7000243 de SELECTA y el agitador de tubos MS1 MINISHAKER (IKA).
- El material de vidrio utilizado fue PYREX o de calidad semejante.
- Los microscopios ópticos que se usaron fueron NIKON 104 y UNI J.L. REGO.
- Para esterilizar los medios de cultivo, soluciones y determinados materiales
se empleó un autoclave RAYPA STERILMATIC-C AE-75 y una olla autoclave
CERTOCLAV CV-EL.
- Para la incubación de los microorganismos se utilizaron las estufas
MEMMERT BE-500, RAYPA I-90, SELECTA CONTERM 2000200 y HERAEUS
KELVITON, serie 6000.
- Los trabajos que requerían ambientes estériles se realizaron en una cámara
de flujo laminar TELSTAR BV-100.
_____________________________________________________Material y Métodos
61
- Los baños de agua empleados fueron TECTRON 3473100 de SELECTA, con
regulador de temperatura y agitación constante.
- Las medidas de pH se llevaron a cabo con un pHmetro CRISON modelo
MICRO pH 2002.
- La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue llevada a cabo en un
Hybaid PCR Sprint temperatura cycling system.
- Para secuenciar el DNA se empleó el secuenciador ABI PRISM 7000 (Applied
Biosystems) y las secuencias de DNA fueron analizadas con el Sequencing
Software Chromas (versión 2.23) Technelysium.
Reactivos químicos y medios de cultivo
Los productos químicos utilizados fueron de calidad apta para análisis:
(Panreac, Barcelona, España) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) (Merck,
Darmstadt) (Promega, etc.) y los medios de cultivos empleados, por lo general,
de la marca Oxoid.
II.2. ELABORACIÓN DE QUESOS Y TOMA DE MUESTRAS
Para la fabricación de los quesos se contó con la colaboración de
artesanos queseros que elaboraron 4 lotes de quesos, de acuerdo con el
procedimiento de fabricación artesanal que se muestra en la fig. 8.
Se tomaron muestras de leche, cuajada y queso de 1, 2, 4 y 6 semanas
de maduración que fueron transportadas al laboratorio en condiciones de
refrigeración. Cada muestra estuvo constituida por un queso entero, que se
dividió para su análisis en dos porciones: superficial (de 3 a 5 mm de corteza) y
profunda (resto del queso).
_____________________________________________________Material y Métodos
62
II.3. ANÁLISIS QUÍMICOS Y FÍSICO-QUÍMICOS
II.3.1. Determinación de humedad.
II.3.1.1. Determinación de humedad en la leche.
La determinación de humedad en la leche se realizó por desecación en
estufa de aire forzado caliente hasta peso constante siguiendo la norma de la
Federación Internacional de Lechería. FIL-IDF 21B (1987)
Procedimiento:
Se utilizaron cápsulas de aluminio con tapa, que se desecaron en una
estufa de aire forzado a 120 ± 2ºC durante 1 hora. Transcurrido este tiempo, se
colocaron en un desecador donde se dejaron enfriar a temperatura ambiente y
se pesaron. Se vertieron en ellas, aproximadamente, 3 g. de la muestra, se
taparon y se pesó el conjunto, colocando las cápsulas destapadas en un baño
de agua en ebullición durante 30 minutos. Seguidamente, con la tapa a su
lado, se situaron en una estufa de desecación a 102 ± 2ºC durante 2 horas.
Transcurrido este tiempo, se dejaron enfriar en un desecador a temperatura
ambiente para su pesado. Esta operación de desecación y enfriamiento se
repitió hasta pesada constante. El contenido en humedad se expresa como
porcentaje en peso de la muestra según la siguiente fórmula:
Contenido en humedad = (M1 – M2) x 100
(M1 – M0)
M0 = Masa, en gramos, de la cápsula y la tapa.
M1 = Masa, en gramos de la cápsula con la tapa y la muestra antes de desecar.
M2 = Masa, en gramos de la cápsula con la tapa y la muestra desecada.
_____________________________________________________Material y Métodos
63
II.3.1.2. Determinación de humedad en el queso
La determinación de humedad en el queso se realizó por desecación en
la estufa de aire forzado caliente hasta peso constante siguiendo la Norma FIL-
IDF 4 (2004).
Procedimiento:
Se pesaron 20 g de arena de mar lavada con ácido en una cápsula de
acero inoxidable, colocando a continuación en su interior una varilla de vidrio.
El conjunto se introdujo en una estufa donde se desecó durante 6 horas,
trasladándose, seguidamente, a un desecador donde se dejó enfriar a
temperatura ambiente para su pesada. Esta operación de desecación y
enfriamiento se repitió hasta pesada constante.
Se depositaron en la cápsula 3 g de queso aproximadamente,
mezclándose cuidadosamente con la arena con la ayuda de la varilla de vidrio y
se desecó de nuevo el conjunto a 102 ± 2º C durante 4 horas. Transcurrido
este tiempo, se enfrió en el desecador y se pesó, repitiéndose estas
operaciones hasta la obtención de pesada constante.
El contenido en humedad se expresa como porcentaje en peso de la
muestra según la siguiente fórmula:
Contenido en humedad = (M1 – M2) x 100
(M1 – M0)
M0 = Masa, en gramos, de la cápsula, varilla y arena.
M1 = Masa, en gramos de la cápsula, varilla, arena y la muestra antes de
desecar.
M2 = Masa, en gramos, de la cápsula, varilla, arena y muestra una vez
desecada.
_____________________________________________________Material y Métodos
64
II.3.2. Determinación de cloruros
II.3.2.1.- Determinación de cloruros en la leche.
La determinación de cloruros en la leche se realizó siguiendo el método
de Charpentier-Vohlard (Norma Francesa V 04-212, 1969).
Reactivos:
Disolución de nitrato de plata 0,1 N.
Disolución de ferrocianuro de potasio al 15%.
Disolución saturada de alumbre férrico: se disolvieron 140 g
de sulfato férrico amónico en 400 mL de agua caliente. Una
vez enfriada, se filtró y se completó a 500 mL con ácido nítrico
6 N hasta hacer desaparecer el color pardo-rojizo.
Disolución de sulfocianuro potásico 0,01 N.
Ácido nítrico ρ20 = 1,38 g/mL
Procedimiento:
Se pesaron aproximadamente 20 g de leche en un matraz aforado de
200 mL Seguidamente, se añadieron 2 mL de la solución de ferrocianuro y 2
mL de la solución de acetato, mezclándose adecuadamente después de cada
una de las adiciones. Se enrasó hasta 200 mL con agua destilada y se dejó en
reposo durante 10 ó 15 minutos y se filtró.
En un erlenmeyer de 250 mL se colocaron 100 mL del filtrado anterior
junto a un 1 mL de ácido nítrico, 5 mL de la disolución de nitrato de plata y 2
mL de la disolución de sulfato férrico-amónico. Finalmente, se agitó para su
_____________________________________________________Material y Métodos
65
homogeneización y se valoró con la disolución de sulfocianuro hasta una
coloración rojo débil persistente durante al menos 10 segundos.
El contenido en cloruros en la leche, expresada en g de NaCl por 100 g
de leche, viene dado por la siguiente fórmula:
% de cloruros = 0,00585 x (5 – n) x 200
E
n = ml de sulfocianuro gastados en la valoración.
E = masa, en gramos, de la muestra de leche.
II.3.2.2.- Determinación de cloruros en el queso.
La determinación de cloruros en el queso se realizó siguiendo el
procedimiento descrito por Vohlard siguiendo el método de la AOAC 935.43
(1990).
Reactivos:
Disolución de nitrato de plata 0,1 N.
Ácido nítrico al 60%.
Disolución saturada de permanganato potásico.
Disolución saturada de sulfato férrico-amónico.
Disolución de tiocianato potásico 0,1 N.
Procedimiento:
En un matraz redondo de fondo plano de 250 mL se pesaron 3 ± 0,1 g
de queso, añadiendo, a continuación, 25 mL de nitrato de plata 0,1 N y 25 mL
de ácido nítrico al 60%. Seguidamente, se agitó el conjunto y se introdujo,
_____________________________________________________Material y Métodos
66
ajustado a un refrigerante de reflujo, en una camisa calefactora donde se
calentó hasta ebullición, añadiendo, a continuación y muy lentamente, 15 mL
de la disolución saturada de permanganato potásico, manteniendo la ebullición.
Una vez decolorado el permanganato potásico se retiró el matraz de la
camisa calefactora y se añadieron 100 mL de agua destilada y 2 mL de la
disolución saturada de sulfato férrico-amónico, mezclando el contenido
adecuadamente. Finalmente, se valoró el exceso de nitrato de plata con la
disolución de tiocianato potásico 0,1 N hasta la aparición de un color marrón-
rojizo persistente durante 30 segundos.
Se efectuó un ensayo de un blanco con agua destilada siguiendo el
procedimiento descrito anteriormente, exceptuando la incorporación del
permanganato potásico para la digestión de la materia orgánica.
El contenido en cloruro sódico del queso, expresado como g de NaCl en
100 g de queso, viene determinado por la siguiente fórmula:
% de cloruro sódico = 0,00585 x (V0 – V) x 100
P
V0 = mL de tiocianato potásico 0,1 N utilizados en la valoración del
blanco.
V = mL de tiocianático potásico 0,1 N utilizados en la valoración de la
muestra
P = masa, en gramos, de la muestra de queso.
_____________________________________________________Material y Métodos
67
II.3.3. Determinación de la lactosa
Las determinaciones de lactosa en los quesos se efectuaron siguiendo el
método gravimétrico de Munson-Walker según la Norma FIL-IDF 43:1967.
Reactivos:
- Disolución de sulfato de zinc, obtenida disolviendo 30 g de sulfato de
zinc 7-hidrato en agua destilada y completando hasta un volumen final de 100
mL.
- Disolución de ferrocianuro potásico preparada con 15 g de ferrocianuro
potásico 3-hidrato en agua destilada y completando hasta 100 mL.
- Disolución se sulfato de cobre II formada por 70 g de sulfato de cobre II
5-hidrato de agua destilada; completar a 1 litro, dejar reposar y filtrar.
- Disolución de tartrato alcalino preparada disolviendo 350 g de tartrato
sódico-potásico 4-hidrato y 100 g de hidróxido sódico al 97% en agua destilada,
completando a 1 litro. Dejar reposar durante 2 días y filtrar.
- Ácido nítrico 15-20% (p/v)
- Alcohol etílico al 96%.
Procedimiento:
Se utilizaron crisoles filtrantes tratado con ácido nítrico y lavados
intensivamente con agua destilada caliente y 10 mL de alcohol etílico. A
continuación, se secaron en una estufa a 100 ± 2ºC durante 30 minutos y,
despues de enfriarlos en el desecador, se pesaron con una precisión de 0,1
mg.
_____________________________________________________Material y Métodos
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Se pesaron 10 ± 0.01 g de muestra en un mortero al que se añadió agua
destilada caliente (60-70ºC) para favorecer su trituración. El contenido se
trasvasó a un matraz aforado de 500 mL con un volumen de agua destilada de
aproximadamente 400 mL. Se añadieron 5 mL de la disolución de sulfato de
zinc y 5 mL de la disolución de ferrocianuro potásico, mezclándose
adecuadamente despues de cada una de las adiciones. El contenido del
matraz se enfrió a temperatura ambiente y se niveló a 500 mL con agua
destilada. Una vez agitado su contenido, se filtró eliminando los primeros
mililitros.
Se colocaron, en un vaso de precipitados de 250 mL, 25 mL de la
disolución de sulfato de cobre II y 25 mL de la de tartrato alcalino. La mezcla
se calentó hasta ebullición y se le añadió 100 mL del filtrado, cubriendo el vaso
con un vidrio de reloj. El calentamiento se detuvo a los 6 minutos de alcanzar
otra vez la ebullición y el contenido del vaso se filtró a vacio sobre un crisol
filtrante. Finalizada la filtración, el crisol se enjuagó con agua caliente y 10 mL
de alcohol etílico y se desecó durante treinta minutos en una estufa a 100 ± 2ºC
para posteriormente, una vez frio pesarse con exactitud.
La diferencia entre la pesada del crisol, antes y después de la filtración,
corresponde al óxido de cobre I formado y retenido en el mismo, el cual es
proporcional a la lactosa presente. Los mg de óxido de cobre I son convertidos
en gramos de lactosa anhidra, mediante tablas especiales, y el porcentaje de
lactosa anhidra presente en la muestra de queso ensayada se calculó mediante
la siguiente fórmula:
g lactosa/100 g queso
50000 x A
X 0.99
V x E
_____________________________________________________Material y Métodos
69
A = Masa, en gramos, de lactosa anhidra representada en la tabla de
equivalencia.
E = Masa, en gramos, de la muestra de queso ensayada.
V = Volumen, en milímetros, del filtrado utilizado.
0,99 = Factor correspondiente para compensar el error volumétrico
debido a la presencia en la muestra de grasa y proteina.
II.3.4.- Determinación de los ácidos D- y L-láctico
Las determinaciones de los ácidos D- y L-láctico en las diferentes
muestras se efectuaron siguiendo la técnica de Noll (1974) según el
procedimiento espectrofotométrico descrito para productos alimenticios en
Métodos de Bioanálisis de Alimentos de Boehringer Mannheim (1995).
Extración de muestras:
Se pesaron 1±0,1 g de queso en un matraz aforado de 100 mL al que se
añadieron 80 mL de agua destilada. Se introdujo en un baño de agua a 60ºC
durante quince minutos, agitando regularmente. Se enfrió a temperatura
ambiente y se niveló a 100 mL con agua destilada. A continuación, se introdujo
el matraz en un baño de hielo durante quince minutos para favorecer la
separación de la grasa, seguidamente se filtró la disolución, eliminando los
primeros mililitros.
Procedimiento de lectura:
El fundamento del método enzimático se basa en la oxisación de los
ácidos L- y D-láctico, por el dinocleótido de nicotinamida y adenina (NAD), a
_____________________________________________________Material y Métodos
70
piruvato, en presencia de los enzimas L-lactico deshidrogenasa (L-LDH) y D-
láctico deshidrogenasa (D-LDH), respectivamente.
L - Lactato + NAD L-LDH Piruvato + NADH + H+
D - Lactato + NAD D-LDH Piruvato + NADH + H+
El equilibrio de ambas reacciones queda casi completamente
desplazado hacia el lado del lactato. Sin embargo, por reacción del piruvato
formado en una reacción subsiguiente catalizada por el enzima glutamato-
piruvato transaminasa (GPT) y en presencia de L-glutamato, el equilibrio puede
desplazarse a favor del piruvato y del NADH.
Piruvato + L Glutamato GPT L - Alanina + 2 - oxoglutarato.
La cantidad de NADH formada, que se determina
espectrofotométricamente a 340 nm equivale a la concentración de los ácidos
D y L-láctico. Se utilizó un espectrofotómetro Kontron mod. Uvikon 810 y
cubetas de paso de luz de 1 cm.
Las determinaciones se realizaron tras la adición a la cubeta de:
- 1 mL de la solución tampón de glicilglicina (0,6 mol/L) y L-glutomato
(0,1 mol/L). pH10.
- 0,2 mL de una soloución de NAD (47 mmol/l).
- 0,02 mL de la suspensión de GPT (20 mg/mL).
- 0,9 mL de agua destilada.
- 0,1 mL de la muestra obtenida como se describen anteriormente.
_____________________________________________________Material y Métodos
71
Se realizó la primera lectura (A1) después de 5 minutos, añadiendo a
continuación:
- 0,02 mL de la solución de D-LDH (5 mg/mL).
Transcurridos 20 minutos se efectuó una segunda lectura (A2) añadiendo
seguidamente:
- 0,02 mL de la solución de L-LDH (10 mg/mL).
Pasados otros 20 minutos se realizó la tercera lectura (A3)
Se llevó a cabo igualmente un ensayo de un blanco que contenía todos
los reactivos anteriores, excepto la muestra.
Los resultados se expresaron en gramos de D- y L-láctico por 100 g de
queso, teniendo en cuenta que el coeficiente de absorción del NADH a 340 nm
es de 6,3 [ mmol-1. cm-1]
II.3.5. Determinación de la actividad del agua
La determinación de la actividad del agua se llevó a cabo en un aparato
AQUA LAB modelo CX-2 Water Activity Measurement (Decagon, WA, USA).
La actividad del agua nos indica el agua del producto que no está ni
química ni físicamente ligada. Se define como la relación entre la presión de
vapor relativa del agua en la muestra y la presión de vapor relativa del agua
pura bajo las mismas condiciones de temperatura.
El método empleado se basa en la técnica del punto de rocío en un
espejo enfriado, aprovechando la tendencia natural que tiene una sustancia
para equilibrarse con la humedad relativa del ambiente en el que se encuentra.
El porcentaje de humedad relativa en equilibrio equivale a la actividad del agua
de la muestra.
_____________________________________________________Material y Métodos
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Procedimiento:
Las cápsulas del equipo se llenaron, sin sobrepasar la mitad de su
capacidad total, con la muestra y se introdujeron en una cámara cerrada donde
se efectuó la medida. Dicha cámara fue sometida a calentamientos y
enfriamientos repetidos mientras circula aire para acelerar el equilibrio. La
condensación de las primeras gotas de agua en el espejo de acero inoxidable
nos indica que se ha alcanzado el equilibrio y que la humedad de la cámara
comienza a saturarse. En este momento el equipo nos da la lectura de la
actividad del agua y la temperatura de la muestra.
II.3.6. Determinación del pH.
II.3.6.1.- Determinación del pH en la leche.
La determinación del pH se realizó por lectura directa al introducir el
electrodo en 50 mL de leche, la cual había sido previamente calentada y
homogeneizada a 40º C para dispersar la materia grasa y posteriormente
enfriada a 20 ± 2º C.
II.3.6.2.- Determinación del pH en el queso.
La determinación del pH del queso se llevó a cabo siguiendo el método
de la AOAC 14022 (1980).
Procedimiento:
Se pesaron 10 ± 0,1 g de queso a los que se añadieron 100 mL de agua
destilada, previamente hervida y enfriada hasta 45 – 50º C, homogeneizando
_____________________________________________________Material y Métodos
73
seguidamente en un Omni-Mixer durante 3 minutos. Una vez filtrado el
homogeneizado, se midió su pH a 20º C frente a tampones patrón (pH = 4 y 7).
II.3.7. Determinación de la acidez titulable.
II.3.7.1.- Determinación de la acidez titulable en la leche.
La determinación de la acidez en la leche se realizó siguiendo el
procedimiento descrito por la AOAC 947.05 (1990).
Reactivos:
Disolución de hidróxido sódico 0,1 N.
Disolución de fenolftaleína al 1% (p/v) en etanol.
Procedimiento:
Se tomaron 9 mL de leche homogeneizada y se valoraron con la
disolución de hidróxido sódico 0,1 N en presencia de 0,5 mL de la disolución de
fenolftaleína al 1% hasta la aparición de una coloración rosa persistente
durante unos segundos.
Los resultados se expresaron como gramos de ácido láctico por 100 mL
de leche, dividiendo por 10 el número de mililitros empleados de la disolución
de hidróxido sódico gastados o bien multiplicando por 10 si se expresa como
grados Dornic.
II.3.7.2.- Determinación de la acidez titulable en el queso.
La determinación de la acidez titulable en el queso se llevó a cabo
siguiendo el método descrito por la AOAC 920.124 (1990).
Reactivos:
Disolución valorada de hidróxido sódico 0,1 N.
Disolución de fenolftaleína al 2% en etanol.
_____________________________________________________Material y Métodos
74
Procedimiento:
Se tomaron 50 mL del mismo filtrado utilizado para la medida del pH (ver
apartado II.3.4.2) al que se añadió 0,1 mL de la disolución de fenolftaleína al
2%, valorando, a continuación, con hidróxido sódico 0,1 N hasta la aparición de
un color rosado persistente durante unos segundos.
La acidez titulable, expresada en términos de porcentaje de ácido láctico
sobre extracto seco, viene determinada por la siguiente fórmula:
g de ácido láctico/100g ES= 90 x V
5 x ES
V = mL de hidróxido sódico 0,1 N gastados en la valoración.
ES = extracto seco del queso
La acidez titulable, expresada en términos de porcentaje de ácido
láctico, viene determinada por la siguiente fórmula:
g de ácido láctico/100 g queso= 90 x V
500
V = mL de hidróxido sódico 0,1 N gastados en la valoración
_____________________________________________________Material y Métodos
75
II.4. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
II.4.1. Homogeneización de las muestras y preparación de las diluciones
Se tomaron de modo aséptico 50 g de leche, cuajada y muestras de la
porción profunda de los quesos en diferentes etapas de maduración y se
homogeneizaron con 200 mL de una solución estéril al 2% de citrato sódico
tribásico a 40-45ºC, durante 2 minutos en un homogeneizador IUL modelo
MASTICATOR.
Para el estudio de la porción superficial de los quesos se tomaron 25 g
(de 3 a 5 mm de corteza) los cuales fueron homogeneizados con 100 mL de la
solución estéril de citrato sódico bajo las mismas condiciones señaladas
previamente.
En ambos casos se obtuvo la dilución 1/5, a partir de la cual se
prepararon diluciones decimales sucesivas, mezclando 10 mL de la dilución
madre con 90 mL de agua de peptona estéril al 0,1%, según la Norma FIL-IDF.
122B (1992).
II.4.2. Recuentos microbianos
Para el estudio de la evolución de los principales grupos microbianos
presentes durante la elaboración y maduración se emplearon los medios de
cultivo que se indican a continuación. Las placas se sembraron por duplicado.
Para efectuar el recuento se escogieron las placas con un número de
colonias entre 30 y 300, (15 -150 para el recuento de enterobacteriáceas) se
efectuaron los cálculos del número de colonias teniendo en cuenta las
diluciones efectuadas y el inóculo sembrado y los recuentos se expresaron en
unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g ó mL).
_____________________________________________________Material y Métodos
76
- Recuento de aerobios mesofilos totales
El medio empleado fue PCA (Plate Count Agar) de Oxoid, Basingstoke
UK. Las placas de petri se sembraron con 1 mL del inóculo, que se
homogeneizó con 15 mL de PCA. Una vez solidificado el medio las placas se
incubaron a 30ºC durante 48 horas (APHA, 1992).
- Recuento de psicrotrofos
Se realizó en PCA (Plate Count Agar) de Oxoid siguiendo la metodología
establecida por la APHA (1992). Las siembras fueron realizadas en placas de
petri, utilizando 1 mL de inóculo de cada dilución y 15 mL del medio.
Posteriormente, las placas fueron homogeneizadas e incubadas a 7ºC durante
10 días.
- Recuento de bacterias lácticas
Se emplearon diferentes medios de cultivo en función de su selectividad.
- Agar MSE (Biokar Diagnostics, Beavais, France): medio electivo para el
recuento y aislamiento de leuconostocs (Mayeux y col., 1962), tras incubación
a 22º C durante 4 días.
- Agar M17 (Biokar): medio electivo para el recuento y aislamiento de
lactococos (Terzagui y Sandine, 1975), tras incubación a 30º C, durante 18 a
24 horas. Es un medio parcialmente selectivo, muy rico en componentes
nutritivos.
- Agar Rogosa (Oxoid, Basingstoke, UK): medio selectivo para recuento
y aislamiento de lactobacilos (Rogosa y col., 1951), después de incubar a 30ºC
durante 5 días.
_____________________________________________________Material y Métodos
77
El agar Rogosa es un medio selectivo eficiente para lactobacilos y su
elevada concentración de acetato y pH bajo inhibe otras bacterias lácticas.
La adición de ácido acético glacial (1,32 mL/L medio) asegura la
selectividad del medio.
En la superficie de las placas de agar M17 y agar MSE se inocularon 0,1
mL de cada dilución, mientras que en las placas de agar Rogosa se inoculó 1
mL en la masa y tras la solidificación del agar se añadió una cobertura del
mismo medio para generar condiciones de microaerofilia que favorecen el
crecimiento de los lactobacilos.
- Recuento de enterococos
El medio empleado para el recuento de cepas de enterococos fue KAA
(Kanamycin Aesculin Azide Agar Base, Oxoid), siguiendo la metodología de
Mossel y col. (1978). El medio fue inoculado con 1 mL de cada dilución en las
respectivas placas de petri, homogeneizado y una vez solidificado se incubó a
37º C durante 24 horas por duplicado.
- Recuento de micrococáceas
Se empleó el medio MSA (Mannitol Salt Agar) o medio de Chapman
(Chapman, 1945). Este medio fue inoculado en superficie con 0,1 mL de cada
dilución. Incluye en su composición un elevado contenido de sal (75 g/L), por
lo que sólo crecerán en él los microorganismos halotolerantes. También incluye
en su composición manitol y un indicador del pH (rojo de fenol) para verificar la
formación de ácido a expensas de dicho compuesto. La utilización de manitol
con formación de ácido puede guardar relación con ciertas características del
microorganismo como la patogenicidad o la capacidad de producir coagulasa,
termonucleasa, etc.
_____________________________________________________Material y Métodos
78
- Recuento de enterobacteriáceas
El recuento se realizó en VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar, Oxoid)
siguiendo la metodología propuesta por Mossel y col. (1962). Se inoculó 1 mL
de cada dilución en las respectivas placas, por duplicado. Una vez
homogeneizadas y solidificadas se colocó una sobrecapa y se incubó a 37º C
durante 18-24 horas. Este medio posee glucosa, azúcar fermentable por todas
las enterobacteriáceas, con producción de ácido y rojo neutro como indicador
del medio. El cristal violeta inhibe a los microorganismos Gram (+), algo menos
a los estreptococos, mientras que favorece el crecimiento de las Gram (-). Las
sales biliares son agentes selectivos (las enterobacteriáceas se inhiben en
menor medida que otras bacterias).
-Recuentos de mohos y levaduras.
Para el recuento de la flora fúngica se empleó OGYEA (oxytetracycline
glucosa yeast extract agar) (Oxoid) (Mossel y col., 1970). El medio fue
inoculado con 1 mL de cada dilución, homogeneizado e incubado a 22º C
durante 5 días. El medio utiliza oxitetraciclina como agente selectivo.
II.4.3. Aislamiento de las cepas
En los medios agar M17, agar MSE y agar Rogosa se procedió al
aislamiento aleatorio de un número representativo de cepas. Se aislaron 10
cepas a partir de las muestras de leche, cuajada y porción profunda del queso
a lo largo de la maduración (1, 2, 4 y 6 semanas), es decir un total de 240
cepas por medio de cultivo (10 cepas x 6 puntos de muestreo x 4 lotes de
fabricación). De la porción superficial se aislaron 5 cepas por punto de
_____________________________________________________Material y Métodos
79
muestreo en cada lote, obteniendo un total de 80 cepas por medio de cultivo (5
cepas x 4 puntos de muestreo x 4 lotes de fabricación).
Todas las cepas aisladas fueron purificadas mediante pases alternativos
en agar y caldo MRS (De Man y col., 1960). Las cepas puras se almacenaron
a -30ºC y a -80º C, con glicerol al 20% como agente crioprotector.
II.4.4. Identificación de las cepas aisladas.
Las cepas fueron revitalizadas en caldo MRS y sometidas a diferentes
pruebas, descritas a continuación, para su adscripción a nivel de género y
posteriormente a especie.
Pruebas de adscripción a género:
- Gram y morfología.
- Catalasa.
- Producción de CO2 a partir de la glucosa.
- Desaminación de arginina.
- Crecimiento a 10ºC.
- Crecimiento a 45ºC.
- Crecimiento en presencia del 6,5% de NaCl.
- Gram y morfología: La tinción de Gram se hizo a partir de un cultivo
en MRS incubado a 30º C durante 14 - 17 horas; se extendió una gota del
cultivo en un porta y se dejó secar al aire, luego se fijó al calor y se hizo la
tinción. Se observó con el objetivo de inmersión el carácter Gram (+) ó (-), la
morfología y la disposición de las células.
-Catalasa: A un cultivo en agar MRS obtenido tras incubación a 30º C
durante 24 horas, se le añadieron unas gotas de agua oxigenada al 30%. La
_____________________________________________________Material y Métodos
80
producción de burbujas debido al desprendimiento de O2 ocasionado por la
descomposición del H2 O2 indica la positividad de la reacción.
-Producción de CO2 a partir de la glucosa: Se utilizó el medio
semisólido de Gibson (Gibson y Abd-El-Malek, 1945). Tras la inoculación de
la cepa en tubos que contenían el medio se añadió un tapón de agar que se
dejó solidificar, tras lo cual se leyeron los resultados a las 24, 48, 72 horas y a
los 7 días de incubación a 30º C. La producción de gas se puso de manifiesto
por la formación de burbujas que a veces conllevó agrietamiento del medio y
desplazamiento del tapón de agar. A los 7 días los tubos que dieron un
resultado negativo fueron introducidos en un baño de agua a 30ª C para dilatar
el gas que hubiera podido quedar retenido sin que se apreciara previamente.
Esta prueba permite discernir entre bacterias homofermentativas y
heterofermentativas, si bien hay que tener en cuenta que ciertos lactobacilos
homofermentadores pueden volverse heterofermentadores en determinadas
condiciones, como por ejemplo ante bajas concentraciones de glucosa (Moat y
col., 1988).
- Desaminación de arginina: A una gota de un cultivo de caldo MRS
con un 0,3% de monoclorhidrato de L-arginina, incubado a 30º C durante 3
días, se le añadió una gota del reactivo de Nessler con el fin de demostrar la
producción de amoníaco. La aparición de un color naranja-marrón indica la
positividad de la reacción. La prueba se realizó siempre comparando con un
testigo positivo y otro negativo.
En la prueba de producción de amoníaco a partir de la arginina es
importante la composición del medio, siendo crítica la concentración de
glucosa. Con una concentración de glucosa del 2% sólo las especies de
_____________________________________________________Material y Métodos
81
lactobacilos heterofermentadores producen amoníaco (Briggs, 1953), con una
baja concentración de glucosa no sólo las especies heterofermentadoras
producen amoníaco sino que también algunas cepas de Lactobacillus plantarun
pueden producirlo (Keddie, 1959). Un medio que resulta adecuado para este
fin es el caldo arginina MRS, que lleva un 0,3% de arginina y un 2% de glucosa
(Sharpe, 1962).
La prueba de desaminación de la arginina permite diferenciar los
lactobacilos heterofermentadores de los leuconostocs; a veces
morfológicamente son difíciles de separar, ya que los lactobacilos pueden
adoptar una morfología cocoide y los leuconostocs pueden aparecer como
cocobacilos o bacilos cortos. Lactobacillus viridescens, dentro del grupo de los
lactobacilos heterofermentadores, así como todos los leuconostocs, no llevan a
cabo la desaminación de la arginina, por lo que, en función del perfil de
fermentación de azúcares, la prueba de la producción de amoníaco va a
permitir discernir en estos casos a nivel de género.
En los lactococos es una prueba de adscripción a especie, permite
distinguir Lactococcus Lactis supsp. lactis de L. Lactis subsp. cremoris.
- Crecimiento a 10 ºC: Para lactococos y leuconostocs es una prueba
que confirma la adscripción a género. Se realizó en caldo MRS incubando
durante 7 días. El crecimiento en ambos casos fue, en general, positivo.
- Crecimiento a 45ºC: Se observó en caldo MRS después de 48 horas
de incubación, permitiendo diferenciar entre lactococos y enterococos.
- Crecimiento en MRS con un 6,5% de NaCl: Se apreció la presencia o
no de crecimiento tras incubar a 30º C durante 2 días.
_____________________________________________________Material y Métodos
82
Estas dos últimas pruebas permitieron diferenciar entre lactococos y
enterococos (ambos son cocos homofermentadores). Los lactococos no crecen
a 45º C y/o 6,5% NaCl, mientras que los enterococos sí pueden crecer en esas
condiciones.
Los cocos Gram (+), catalasa (-) homofermentadores, que crecen a 10ºC
y a 40ºC pero no lo hacen a 45º C ni al 6,5% NaCl y que pueden o no
desaminar la arginina se consideraron lactococos. Aparte Las cepas que
crecieron a 45º C y/o 6,5 NaCl fueron sometidas a pruebas para confirmar su
adscripción al género Enterococcus.
Se consideraron enterococos los cocos Gram (+), agrupados en parejas
o cadenas cortas, catalasa (-), anaerobios facultativos, homofermentadores
(producen L-lactato como producto principal de la fermentación de la glucosa),
que crecieron a 10ºC, 37ºC, 40ºC y por lo general a 45ºC, en presencia del
6,5% NaCl, a pH 9,6 y en presencia del 40% de bilis, que formaron colonias
rojas o rosas, normalmente con halo amarillo en agar KF y que sobrevivieron
tras un calentamiento a 60º C durante 30 minutos.
En los medios de cultivo M17, MSE y ROGOSA se aislaron algunas
cepas pertenecientes al género Enterococcus que presentaron morfología
cocoide y crecieron a 45ºC y/o 6,5% NaCl. Estas cepas fueron identificadas de
acuerdo con los métodos y criterios de Schleifer y Kilper-Bälz (1984) Devriese y
col., (1995) y Orvin Mundt (1986).
Las formas cocoides o cocobacilares, Gram (+), catalasa (-)
heterofermentadores, que no desaminan la arginina y no crecen a 45º C, se
consideraron leuconostocs.
Los bacilos o cocobacilos, Gram (+), catalasa (-) con metabolismo homo
o heterofermentativo, se consideraron lactobacilos, pudiendo los
_____________________________________________________Material y Métodos
83
homofermentadores crecer a 15º C (grupo Streptobacterium) o ser incapaces
de crecer a esa temperatura (Thermobacterium).
Pruebas de adscripción a especie:
- Crecimiento a 37ºC (Leuconostoc): en caldo MRS durante 3 días.
- Crecimiento a 40ºC (Lactococcus): En caldo MRS durante 2 días,
permite diferenciar Lactococcus lactis subsp. lactis y L. Lactis subsp. cremoris.
- Crecimiento a 45ºC (en caldo MRS durante 2 días) y Crecimiento a
15º C (en caldo MRS durante 10 días). Estas dos pruebas permiten establecer
dos subgrupos dentro de los lactobacilos homofermentadores:
Thermobacterium, que se corresponde con los lactobacilos
homofermentadores obligados y Streptobacterium, con los
heterofermentadores facultativos. El crecimiento a 45ºC no es discriminativo, ya
que el grupo Thermobacterium crece a 45-50º C y el grupo Streptobacterium
puede o no crecer a esa temperatura. Sin embargo, el crecimiento a 15º C sí
permite diferenciar entre ambos subgrupos, los lactobacilos del grupo
Thermobacterium no crecen a 15º C, los Streptobacterium siempre crecen a
15ºC y por lo general también a 6ºC.
Los heterofermentadores obligados (subgrupo betabacterium) no crecen
a 45º C (sólo Lactobacillus fermenti) y crecen a 15ºC (salvo L. fermenti).
-Crecimiento en caldo MRS en presencia del 4% de NaCl (
Incubación a 30º C durante 48 horas): El crecimiento en presencia de sal
discrimina entre Lactococcus lactis subsp. lactis y L. lactis subsp. cremoris.
También permite discriminar entre las distintas especies de Leuconostoc.
_____________________________________________________Material y Métodos
84
-Crecimiento en caldo MRS en presencia del 6,5% de NaCl.
(Incubación a 30º C durante 48 horas): Esta prueba permite discriminar a nivel
de especie dentro del género Leuconostoc; pudiendo crecer Leuconostoc
mesenteroides y L. paramesenteroides, con ese porcentaje de sal.
-Crecimiento en MRS en presencia del 10% de etanol (Leuconostoc):
Tras incumbar a 30º C se observó la existencia de crecimiento a las 24, 48 y
72 horas, lo que permite diferenciar entre la especie Leuconostoc oenos, que
crece en presencia del 10% de etanol, y el resto de los leuconostocs que no lo
hacen (Garvie, 1967).
-Producción de dextrano (Leuconostoc): Se empleo el medio Agar
sacarosa (Evans y col., 1955; Garvie, 1960) que lleva en su composición un 5%
de sacarosa. La producción de dextrano se pone de manifiesto por la formación
de colonias mucosas y permite diferenciar especies dentro de los leuconostocs;
dado que L. mesenteroides y L. dextranicum producen dextrano y el resto no.
- Prueba de Voges-Proskauer y utilización del citrato: Estas dos
pruebas se realizaron con las cepas del género Lactococcus y permiten
diferenciar L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis.
La prueba de Voges-Proskauer permite comprobar la producción de
acetoína a partir de la glucosa, utilizando como medio de cultivo el caldo
glucosa-fosfato. La acetoína (diacetilmetilcarbinol) es un compuesto
intermediario en la síntesis del butanodiol a partir del ácido pirúvico.
La adición de un álcali al medio asegura que la acetoína presente se
oxide a diacetilo; el diacetilo combinado con arginina, creatina o creatinina dará
un color rosado.
_____________________________________________________Material y Métodos
85
Para detectar la producción de acetoína se siguió el método de Barrit
(1936), que es muy sensible dado que consigue detectar 1 ppm de acetoína.
A 1 mL del cultivo (en caldo glucosa-P, incubado durante 2 a 7 días a 30º C) se
añadieron 0,5 mL de una solución de α-naftol al 6% y 0,5 mL de KOH al 16%.
Tras agitar el tubo la formación de precipitado rojo (generalmente al cabo de 5
minutos) indica la positividad de la reacción.
La prueba de utilización de citrato emplea como medio el agar citrato de
Simmons que lleva en su composición citrato sódico al 2%.
El sedimento de los cultivos en caldo MRS, seguidamente se
resuspenden en una solución de NaCl (8,5 g/L) centrifugando de nuevo. Las
células son lavadas con una solución salina y sembradas posteriormente en
agar citrato de Simmons con una aguja de platino las placas fueron incubadas
a 30º C durante 7 días. La utilización del citrato se caracterizó por una
reacción alcalina que cambió el color del medio de verde a azul fuerte.
El agar citrato de Simmons posee fosfato amónico como única fuente de
nitrógeno y citrato sódico como única fuente de carbono. Por consiguiente, los
microorganismos que utilizan el citrato como fuente de carbono pueden
también utilizar sales inorgánicas de amonio como única fuente de nitrógeno.
El metabolismo de estas sales hace que el medio se vuelva alcalino y se
produzca el viraje del indicador (azul de bromotimol) de verde a azul.
- Crecimiento en agar KF: Este medio contiene además de azida y TTC
(2,3,5 cloruro de trifenil tetrazolio) lactosa y maltosa que son utilizadas por la
mayoría de los enterococos con formación de ácido que se pone de manifiesto
por el viraje a amarillo del indicador púrpura de bromocresol. Los enterococos
reducen el TTC presente en el medio dando lugar a colonias de color rojo.
Enterococcus faecalis y sus variedades dan colonias rojas con buen
_____________________________________________________Material y Métodos
86
crecimiento y casi siempre con halo amarillo . E. faecium, da colonias rosas
por su menor facilidad para reducir el TTC.
Las cepas se incubaron en este medio a 37º C durante 48 horas y se
apuntó la presencia o no de crecimiento y en caso afirmativo el color, tipo de
colonias y la presencia o no de halo amarillo.
-Fermentación de azúcares: Se empleó el medio de fermentación MRS
(De Man y col., 1960), con la composición (en g/L) siguiente:
- Peptona 10,0 g
- Polvo “Lab-Lemco” 8,0 g
- Extracto de levadura 4,0 g
- Glucosa 20,0 g
- Tween 80 1 mL
- Fosfato dipotásico 2,0 mL
- Acetato sódico 3 hidrato 5,0 g
- Citrato triamónico 2,0 g
- Sulfato de magnesio 7 hidrato 0,2 g
- Sulfato de manganeso (II) 4 hidrato 0,05 g
- Agar 10,0 g
Para Lactococcus y Leuconostoc se ajustó el pH a 7,0 y para
Lactobacillus a 6,0 – 6,5 (Sharpe, 1962), Como indicador se utilizó el púrpura
de bromocresol al 0,004%.
Se ensayaron los siguientes azúcares:
Para lactococos: arabinosa, inulina, xilosa, glicerol, sucrosa, sorbitol,
trealosa, ramnosa, manitol, ribosa, salicina, maltosa y rafinosa.
_____________________________________________________Material y Métodos
87
Para leuconostocs: arabinosa, celobiosa, fructosa, glucosa, lactosa,
maltosa, melibiosa, sacarosa, salicina y trealosa.
Para los lactobacilos se probaron distintos azúcares para el grupo de los
homofermentadores y para los heterofermentadores. Para los
homofermentadores se ensayaron: arabinosa, lactosa, melibiosa, sucrosa,
xilosa, inulina, rafinosa, ramnosa, sorbitol y sorbosa. Para los
heterofermentadores: arabinosa, celobiosa, lactosa, melezitosa, melibiosa,
rafinosa, salicina, trealosa, xilosa y manosa (Kandler y Weiss, 1986).
Para los enterococos se utilizaron arabinosa, arbutina, melezitosa,
melibiosa, sorbitol, sorbosa, ramnosa, rafinosa, almidón y sacarosa.
Los azúcares se prepararon por separado en soluciones al 10% y se
esterilizaron por filtración, añadiéndose asépticamente al medio hasta obtener
una concentración final del 2%.
Las células microbianas de las cepas a ensayar se lavaron mediante
centrifugaciones y resuspensiones repetidas en una solución salina (8,5 g/L de
NaCl), partiendo del sedimento de un cultivo en caldo MRS. Posteriormente,
se resuspendieron en solución salina y se inocularon en placas de microtítulo,
en el medio de fermentación con cada uno de los azúcares. Seguidamente se
incubó la placa a 30º C y se realizaron lecturas a las 24, 48, 72 horas y a los 5
días. La utilización de los azúcares se manifestó en el viraje del medio de
fermentación desde el color violeta inicial hasta una tonalidad amarillenta. La
lectura que se tomó como más representativa a la hora de anotar el carácter
positivo o negativo en la fermentación de un azúcar determinado, fue la de 72
horas.
Para comprobar la fermentación de carbohidratos y como ayuda en la
identificación de las cepas se utilizó el sistema API 50CHL (bioMérieux, Maray
– L‟ Etoile, France).
_____________________________________________________Material y Métodos
88
Las cepas se agruparon por patrones bioquímicos de fermentación de
azúcares, así como por similitud en las características fisiológicas
comparándolos con patrones modelo y se identificaron siguiendo los criterios
de Garvie (1986), Kandler y Weiss (1986), Mundt (1986), Dellaglio y col. (1994),
Schleifer y Kilper-Bälz (1984), Devriese y col. (1985) y Orvin-Mundt (1986).
Pruebas efectuadas para adscribir a especie.
Lactococos (Mundt, 1986): Se comprobó el crecimiento a 45ºC, 40ºC y
10º C, la desaminación de la arginina, la producción de diacetilo, la prueba de
Voges-Proskauer, el crecimiento en presencia del 4% y 6,5% de sal, y la
fermentación de varios azúcares: arabinosa, xilosa, sucrosa, trealosa, manitol,
salicina, rafinosa, inulina, glicerol, sorbitol, ramnosa, ribosa y maltosa.
Leuconostocs (Garvie, 1986): Se comprobó el crecimiento a 37º C, en
presencia del 6,5% de sal, en presencia del 10% de etanol, la producción de
dextrano y la fermentación de los azúcares: arabinosa, celobiosa, fructosa,
glucosa, lactosa, maltosa, melibiosa, sacarosa, salicina y trealosa.
Lactobacilos homofermentativos: Se comprobó el crecimiento a 45ºC,
la fermentación de arabinosa, lactosa, melibiosa, sucrosa, xilosa, inulina,
rafinosa, ramnosa, sorbitol y sorbosa.
Lactobacilos heterofermentativos: Se comprobó el crecimiento a 15ºC y
45ºC, la desaminación de la arginina, la fermentación de los azúcares:
arabinosa, celobiosa, lactosa, melezitosa, melibiosa, rafinosa, salicina, trealosa,
xilosa y manosa.
Enterococos (Mundt, 1986): Se realizaron las pruebas de crecimiento en
presencia del 0,1% de azul de metileno, desaminación de L-arginina,
crecimiento en presencia del 0,04% de telurito potásico, crecimiento en agar
_____________________________________________________Material y Métodos
89
KF, crecimiento a 45ºC y 50ºC y fermentación de los azúcares: arabinosa,
melezitosa, melibiosa, sorbitol, sorbosa, ramnosa, rafinosa, almidón y sucrosa.
II.4.5. Caracterización genética de cepas de bacterias lácticas.
Aislamiento de ADN cromosómico (minipreparaciòn)
Para la extracción de ADN se siguió el procedimiento descrito por O'
Sullivan, D. J. y Klaenhammer, T. R. (1993) con modificaciones que se
describen a continuación:
-Se recogen volúmenes de muestra de 10 mL del cultivo bacteriano
correspondiente crecido en caldo MRS durante 18-24 horas a 30º C. Se
centrifuga a 2655 g durante 10 minutos a 4º C. A continuación se resuspende
el sedimento en 1 mL de buffer STE esteril. (5 mL EDTA 0,5M pH 8, 2,5 mL
Tris-HCl 1M pH8, sacarosa 10,3%). El contenido es transferido a un tubo
eppendorf y centrifugado 10 min. a 20.817 g. El sedimento fue resuspendido
en 300 μL de STE. Se le añade lisozima (concentracion final 30 mg/mL
lisozima, preparada en el mismo momento) y 5 μL de una solucion RNAsa de
concentración 150 ug/mL).
- La muestra anterior se incuba al menos 1 hora a 37º C.
-Se añaden 400 μL de solucion Kirby 2X. Solucion Kirby (2X): 2 g
sodium tri-isopropylnaphthelene sulphonate, 12 g salicilato (sodium 4-amino-
salicilato), 5 ml 2M Tris-HCl pH 8; 6 g fenol, 6 ng 8-hydroxyquinoline, 90 mL
agua destilada.
-Se mezcla 1 minuto con ayuda de un agitador Vortex y se añaden 200
μL fenol/cloroformo pH 8. Mezclar 30 segundos en Vortex. Se centrifuga 5
_____________________________________________________Material y Métodos
90
minutos a 2655 g. Se recoge la fase superior (aproximadamente 500 μL) y se
pasa a otro eppendorf.
-Se añaden 50 μL fenol/cloroformo pH 8. Mezclar 30 segundos en vortex
y se centrifuga 3 minutos.
-Se repite la fase de extraccion con cloroformo hasta que quede limpia
la interfase.
-La parte superior es transferida a otro tubo eppendorf.
- Se añade 1/10 del volumen de Acetato de sodio 3 M pH 6 y 1 volumen
de isopropanol. Mezcla por inversión y se centrifuga 10 minutos a 20.817 g y
4ºC.
-Se lava con etanol frio (mantener el etanol en congelador al menos 1
hora antes de su uso) y se centrifuga 10 minutos a 20.817 g. Descartar
sobrenadante. Lavar con etanol frio al 70% (realizar este paso con rapidez y
con un volumen aproximado de 1 mL).
- Se deja secar el tubo eppendorf al aire libre o con secado y se
resuspende el contenido en 50 μL de agua estèril.
Procedimiento de amplificación y secuenciacion de ADN que codifica
para el ARNr 16S.
Las reacción de amplificación mediante PCR se llevó a cabo con un
volumen de 50 μL, conteniendo 14 ng μLˉ¹ de ADN genómico, 200 μM de
cada dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 1 µM de cada primer (Pharmacia Biotech), y 1 U
de Taq polymerase (Promega). Todas las reacciones de amplificación fueron
llevadas a cabo en un “Hybaid PCR Sprint termal cycler" usando las siguientes
_____________________________________________________Material y Métodos
91
condiciones de ampliación: 35 ciclos de 94º C durante 2 minutos, 65º C durante
30 segundos, 72º C durante 4 minutos. El primer ciclo fue precedido por una
incubación durante 5 minutos a 95º C. Diez μL de los productos PCR fueron
sometidos a elecroforesis en gel de agarosa al 1% y posteriormente
visualizados con luz UV en un transiluminador después de teñir con bromuro de
etidio. Los oligonucleótidos usados como primers en este estudio fueron
obtenidos de Pharmacia Biotech: Forward primer 515 FPL: 5‟GCG GAT CCT
CTA GAC TGC AGT GCC AGC AGC CGC GGT AA 3‟ y reverse primer 13B: 5‟
CGG GAT CCC AGG CCCGGG AAC GTA TTC AC3‟ que originó un producto
de 904 pares de bases (pb), Forward primer 91E: 5' GGA ATT CAA AKG AAT
TGA CGG GGG C 3' y reverse primer 13B que originó un producto de 475 pb.
Los fragmentos PCR fueron purificados utilizando filtros Millipore (“Montage
PCR centrifugal filter devices”), y otro par de primers que finalmente resultaron
másadecuados: Forward primer 8: 5'AGTTTGATCCTGGCTCAG 3', y reverse
primer 806: 5' GGACTACCAGGGTATCTAAT 3', que produjo una secuencia de
834 pb.
Para secuenciar los fragmentos obtenidos, mediante secuenciacion
directa, se utilizó un secuenciador DNA PCR cuantitativo ABI PRISM 7000
(Applied Biosystems). Las secuencias nucleotídicas obtenidas se analizaron
mediante el uso del programa Chromas (version 2.23) de Techneleysium,
programa que abre los cromatogramas generados por el equipo de Applied
Biosystems y exporta las secuencias obtenidas en formato FASTA o EMBL.
Las secuencias fueron enviadas al Nacional Center for Biotechnology
Information (NCBI) para ser analizadas mediante comparación frente a la base
de datos de nucleótidos (BLAST database en formato FASTA
(http:/www.ebi.ac.uk/fasta/33/) y 16S ribosomol database
(http://rdd.cme.msu.edu/).
_____________________________________________________Material y Métodos
92
II.5. CARACTERIZACIÓN TECNOLÓGICA DE CEPAS DE
BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DEL QUESO SAN SIMÓN
DA COSTA
II.5.1. Actividad acidificante de las cepas de bacterias lácticas.
La actividad acidificante de las cepas fue medida según la norma FIL-
IDF 306 (1995). Estas cepas fueron revitalizadas en caldo MRS a 30º C
durante 24 horas. El cultivo microbiano fue inoculado en proporción de 1 mL
por cada 100 mL de leche desnatada en polvo estéril (reconstituida al 10%).
La acidez titulable y el pH fueron determinados tras 6, 12 y 24 horas de
incubación a 30º C.
II.5.2. Actividad proteolítica de las cepas de bacteria lácticas.
La actividad proteolítica de las cepas fue determinada por
espectrofotometría siguiendo el “Test de derivatización con O-phthaldialdehído
(OPA)” (Church y col., 1983).
Este test se basa en la reacción de los grupos α-amino liberados por la
hidrólisis de la caseína (después de un periodo de incubación de las cepas en
leche de 48 horas a 25ºC) con O-phthaldialdehído, en presencia de β-
mercaptoetanol, para formar un complejo que absorbe fuertemente a 340 nm.
Los resultados fueron calculados mediante una curva de calibración obtenida a
partir de diluciones de glicina en agua destilada, y fueron expresadas en “mM
GLy L-1 leche”.
_____________________________________________________Material y Métodos
93
II.5.3. Detección de la actividad enzimática por el sistema API-ZYM.
La actividad enzimática de las cepas fue evaluada usando el sistema
API-ZYM (BioMérieux). Las cepas de Leuconostoc y de Lactobacillus fueron
incubadas en caldo MRS y las de Lactococcus en caldo Elliker durante 16 h a
30ºC. Los cultivos fueron centrifugados a 7000 g durante 15 minutos a 4º C, y
el sedimento fue resuspendido en 2 mL de tampón fosfato (50mM, pH 7) hasta
alcanzar una densidad óptica entre 5 y 6 en la escala McFarland, e inoculados
en los microtubos de la tira de API-ZYM a un nivel de 65 μL por cada cúpula.
Las tiras de API-ZYM fueron incubadas a 37º C durante 4 h, y la actividad
enzimática fue valorada de 0 a 5 por comparación del color desarrollado a las 5
minutos, ayudándose del gráfico de color de reacción del API-ZYM. Las
actividades enzimáticas examinadas incluyeron; fosfatasa alcalina, esterasa
(C4), lipasa esterasa (C8), lipasa (C14), leucina arylamidasa, valina arylamidasa,
cistina arylamidasa, tripsina, а-quimotripsina, fosfatasa ácida, naftol-AS-BI-
fosfohidrolasa, α-galactosidasa, β-galactosidasa, β-glucuronidasa, α-
glucosidasa, β-glucosidasa, y N-acetil-β-glucosaminidasa.
II.6.- TRATAMIENTO ESTADÍSTICO
Para la comparación de los diferentes parámetros se realizó un análisis
de varianza (ANOVA) utilizando el test LSD para un intervalo de confianza del
95% (p<0,05) con el programa informático STATISTICA©.ffor Windows Release
5.1'' Statsoft, Inc., 1996 (Tulsa, OK, USA).
Se compararon los valores obtenidos entres los diferentes puntos de
muestreo a lo largo de la maduración y en los quesos artesanales e
industriales, respectivamente entre los dos grupos estudiados para el mismo
punto de muestreo (al final del periodo madurativo).e
Resu
lta
do
s y
D
isc
us
ión
___________________________________________________Resultados y Discusión
94
III.1.- EVOLUCIÓN DE LOS PRINCIPALES PARÁMETROS
QUÍMICOS Y FISICOQUÍMICOS DEL QUESO SAN SIMÓN DA
COSTA ELABORADO DE FORMA ARTESANAL A LO LARGO
DE LA MADURACIÓN.
En las tablas III y IV y en las figuras 8 y 9 se refleja la evolución de los
principales parámetros composicionales, en las muestras tomadas de la leche,
cuajada y de la porción profunda y superficial de 4 partidas de quesos
elaboradas por diferentes artesanos cualificados de la zona de producción,
empleando el procedimiento artesanal descrito en el apartado I.5.1.4.
Tabla III.- Evolución de los principales parámetros químicos y físico-químicos
en la leche, cuajada y porción profunda del queso San Simón da Costa a lo
largo de la elaboración y maduración (valores medios de los 4 lotes
desviación estándar)
ag de NaCl/100 g de H2O.
bAcidez titulable (g de ácido láctico/100 g de queso)
QUESO (Semanas de maduración)
Leche Cuajada 1 2 4 6
E.S.(%) 12,42 1,12 40,04 2,20 52,96 2,02 54,19 1,12 56,76 1,66 58,19 1,31
Humedad (%) 87,58 1,12 59,96 2,20 47,04 2,02 45,80 1,12 43,24 1,66 41,81 1,31
Lactosa 5,91 ± 0.25 2,00 ± 1.42 1,45 ± 0.38 N.D. N.D. N.D.
D- láctico N.D. 0,33 ± 0.41 0,90 ± 0,38 1,62 ± 0.38 1,41 ± 0,63 1.71 ± 0,50
L- láctico 1,72 ± 0,60 2,03 ± 0.10 1,91 ± 0.15 1,93 ± 0,32 1,89 ± 0,40 2.05 ± 0,40
NaCl (%E.S.) N.D. 1,35 0,52 1,26 0,49 1,12 0,21 1,06 0,22 1,22 0,30
S/Ha N.D. 0,91 0,29 1,42 0,49 1,33 0,26 1,38 0,21 1,69 0,41
pH 6,62 0,12 6,40 0,09 5,75 0,25 5,58 0,16 5,49 0,13 5,51 0,18
AT b
0,18 0,01c 0,63 0,16 1,34 0,41 1,75 0,42 2,06 0,30 2,14 0,49
aw N.D. 0,983 0,005 0,976 0,006 0,978 0,007 0,976 0,003 0,967 0,008
___________________________________________________Resultados y Discusión
95
Tabla IV.- Evolución de los principales parámetros químicos y físico-químicos
en la porción superficial del queso de San Simón Costa a lo largo de la
maduración (valores medios de los 4 lotes desviación estándar)
QUESO (semanas de maduración)
1 2 4 6
E.S.% 62,88 2,37 68,34 1,78 74,95 3,99 79,30 2,60
Humedad % 37,12 2,37 31,66 1,78 25,05 3,99 20,70 2,60
D- láctico 0,03 ± 0,04 0,20 ± 0,18 0,58 ± 0.38 0,89 ± 0.43
L- láctico 1,01 ± 0,17 1,06 ± 0,18 0.98 ± 0,19 0.76 ± 0,11
NaCl/%E.S 0,81 0,12 0,78 0,11 0,72 0,23 0,67 0,11
S/Ha 1,37 0,26 1,68 0,26 2,15 0,54 2,56 0,81
pH 5,78 0,24 5,65 0,19 5,59 0,21 5,50 0,14
ATb 1,16 0,22 1,33 0,36 1,25 0,29 1,47 0,38
aw 0,965 0,009 0,968 0,006 0,963 0,002 0,953 0,005
ag NaCl/100 g de H2O.
bAcidez titulable (g de ácido láctico/100 g de queso)
___________________________________________________Resultados y Discusión
96
Figura 8.- Evolución de los parametros químicos y físico-químicos de la parte
profunda del queso San Simón da Costa a lo largo de la maduración.
___________________________________________________Resultados y Discusión
97
Figura 9.- Evolución de los parametros químicos y físico-químicos de la parte
superficial del queso San Simón da Costa a lo largo de la maduración.
___________________________________________________Resultados y Discusión
98
El queso San Simón presenta una humedad en torno al 20 y al 40% en
la porción superficial y profunda, respectivamente. En la proción principal el
contenido en humedad permanece prácticamente constante a lo largo de la
maduración. La baja pérdida de humedad que experimenta el queso parece
estar relacionada con la tecnología de elaboración que incluye un proceso de
escaldado, cuya acción frente a la caseina origina la formación de una película
compacta que además de conferirle un aspecto liso y brillante, provoca el cierre
de los poros de la corteza evitando el desarrollo superficial de mohos y las
pérdidas de peso durante la maduración. Presenta niveles intermedios de
actividad del agua (valores de 0,9670,08). En general, estos valores
concuerdan con los hallados previamente para el queso San Simón da Costa
por Marcos y col., 1983, c y 1985 y por Nhuch (2000), y son comparables con
los obtenidos para otros quesos de vaca, como el de Tetilla (Marcos y col.,
1985), el Gouda (Marcos y col., 1981; Muir y col., 1995), o el Cheddar (Marcos
y col., 1981; Thakur y col., 1975) aunque este último en muchas ocasiones
supera el año de maduración. Los niveles alcanzados por el pH (5,5±0,18)
resultan superiores a los valores que presentan otros quesos de características
similares, ya que, en líneas generales, alcanzan valores que oscilan entre 4,56
y 5,40 (Prieto, 1999).
La acidez titulable fue superior en todos los casos en la parte profunda
de los quesos, con valores al final de la maduración de 2,14±0,49 g de ácido
láctico/100 g de queso y de 1,47±0.38 en la porción superficial.
El incremento de la acidez titulable que se produce al cabo de la primera
semana de maduración se debe fundamentalmente a la degradación de la
lactosa y a la formación de otros ácidos generados por la microbiota.
Posteriormente, en la parte profunda del queso sigue aumentando a lo largo del
proceso madurativo, mientras que en la parte superficial prácticamente se
mantiene constante, alcanzando valores más bajos.
___________________________________________________Resultados y Discusión
99
Los porcentajes de sal/humedad hallados tanto en el interior de los
quesos como en la porción superficial son bajos, alcanzando valores de 1,42±
0,49 y de 1,37±0,26 a la semana y de 1,69±0,41 y 2,56±0,81 al final del
periodo madurativo respectivamente, lo que indica que no van a provocar la
inhibición de las bacterias lácticas responsables de la maduración. Estas bajas
concentraciones de sal que presenta este queso parecen ser debidas al
sistema empleado de salazonado que provoca la pérdida de la mayor parte de
la sal añadida con el suero.
La lactosa con cifras iniciales bastante altas se degrada rápidamente
durante los primeros 15 días de maduración. El incremento en el contenido de
ácido D - láctico coincide con un ligero descenso del ácido L- láctico, lo que
podría ser debido a su conversión a través de la acción de los lactobacilos
(Thomas y Crow, 1983). Parte del L- lactato podría desaparecer también por
oxidación, aunque al final de la maduración las proporciones de ambos ácidos
permanecieron estables. La evolución de estos parámetros es en buena
medida similar a la hallada préviamente pra otros quesos elaborados de forma
artesanal, Nhuch (2000), lo que indica que se ha alcanzado un buen nivel de
homogeneidad en la fabricación tradicional de este queso.
___________________________________________________Resultados y Discusión
100
III.2.- EVOLUCIÓN DE LOS RECUENTOS MICROBIANOS A LO
LARGO DE LA ELABORACIÓN Y MADURACIÓN DEL QUESO
SAN SIMÓN DA COSTA ELABORADO DE MODO ARTESANAL
Los valores medios de los recuentos obtenidos por duplicado (±
desviación estandar) de los diferentes grupos microbianos (Log UFC/g o mL)
obtenidos durante la elaboración y maduración de 4 lotes de queso de San
Simón da Costa para las muestras procedentes de la porción profunda y
superficial, se reflejan en las tablas III y IV, respectivamente.
Tabla V.- Valores medios de los recuentos (Log UFC/g ± desviación
estándar) de los principales grupos microbianos a lo largo de la
elaboración y maduración en la porción profunda de 4 lotes de queso San
Simón da Costa elaborado de forma artesanal.
Medio de cultivo Queso (Semanas de maduración)
Leche Cuajada 1ª 2ª 4ª 6ª
PCA m 6,52±0,48 7,82±0,38 9,09±0,27 9,33±0,27 9,44±0.28 9,49±0.40
PCA p 6,35±0,58 7,35±0,42 8,68±0,38 8,87±0,44 8,91±0,35 8,59±0,58
M17 6,57±0,70 7,53±0,45 9,00±0,50 8,84±0,75 9,17±0,82 8,48±0,80
MSE 4,99±0,35 6,52±0,35 8,25±0,51 8,33±0,55 8,73±0,46 8,47±0,60
ROGOSA 3,86±0,32 4,70±0,35 7,74±0,55 8,18±0,54 9,28±0,49 9,08±0,47
KAA 3,67±0,56 5,64±0,46 7,60±0,50 7,11±0,79 7,32±0,62 7,38±0,59
VRBGA 3,35±0,46 3,99±0,61 7,52±0,54 7,04±0,60 5,88±0,92 5,23±1,01
VRBA 3,36±0,50 4,46±0,56 7,53±0,57 7,06±0,58 5,90±0,91 5,24±1,00
MSA 4,81±0,52 6,36±0,57 7,01±0,71 6,96±0,76 6,87±1,06 6,32±1,05
OGYEA 4,30±0,57 4,26±0,31 4,71±0,54 5,14±0,57 5,14±0,55 5,08±0,68
PCA m: Recuentos en Plate Count Agar. Aerobios Mesófilos Totales.
PCA p: Recuentos en Plate Count Agar. Psicrotrofos.
M17: Recuentos en Agar M17 (Therzagui y Sandine, 1975). Lactococos.
MSE: Recuentos en Agar MSE (Mayeux, Sandine y Elliker, 1962). Leuconostocs.
ROGOSA: Recuentos en Agar Rogosa (Rogosa, Mitchell y Wiseman 1951). Lactobacilos.
KAA: Recuentos en Agar KAA (Kanamycin - Aesculin - Azide - Agar - Base). Enterococos
VRBGA: Recuentos en VRBGA (Cristal Violeta-Rojo Neutro-Bilis - Glucosa-Agar). Enterobacterias.
VRBA: Recuentos en VRBA (Cristal Violeta -Rojo Neutro - Bilis - Agar). Coliformes.
MSA: Recuentos en Mannitol Salt Agar o Medio de Chapman. Micrococos.
OGYEA: Recuentos en Oxytetracycline Glucosa Yeast Extract Agar. Mohos y Levaduras.
___________________________________________________Resultados y Discusión
101
Tabla VI.- Recuentos medios (Log UFC/g ± desviación estándar) de
los principales grupos microbianos obtenidos durante la elaboración y
maduración en la porción superficial de 4 lotes de queso San Simón da
Costa elaborado de forma artesanal.
Medio de cultivo Queso (semanas de maduración)
1ª Semana 2ª Semana 4ª Semana 6ª Semana
PCA m 8,59±0,19 9,01±0,31 8,83±0,22 8,91±0,12
PCA p 8,23±0,24 8,53±0,40 8,45±0,33 8,38±0,36
M17 8,22±0,21 8,50±0,30 8,38±0,51 8,26±0,72
MSE 7,35±0,19 7,91±0,37 7,93±0,21 7,24±0,09
ROGOSA 7,19±0,58 8,28±0,75 8,86±0,50 8,45±0,38
KAA 7,15±0,30 6,83±0,33 6,65±0,38 6,76±0,29
VRBGA 6,74±0,50 6,50±0,43 4,86±0,75 3,57±0,70
VRBA 6,81±0,55 6,66±0,43 4,87±0,72 3,33±0,51
MSA 7,48±0,37 7,63±0,18 7,52±0,18 6,84±0,50
OGYEA 5,58±0,39 6,33±0,43 6,38±0,44 5,63±0,20
PCA m: Recuentos en Plate Count Agar. Aerobios Mesófilos Totales.
PCA p: Recuentos en Plate Count Agar. Psicrotrofos.
M17: Recuentos en Agar M17 (Therzagui y Sandine, 1975). Lactococos.
MSE: Recuentos en Agar MSE (Mayeux, Sandine y Elliker, 1962). Leuconostocs.
ROGOSA: Recuentos en Agar Rogosa (Rogosa, Mitchell y Wiseman 1951). Lactobacilos.
KAA: Recuentos en Agar KAA (Kanamycin - Aesculin - Azide - Agar - Base). Enterococos
VRBGA: Recuentos en VRBGA (Cristal Violeta-Rojo Neutro-Bilis - Glucosa-Agar). Enterobacterias.
VRBA: Recuentos en VRBA (Cristal Violeta-Rojo Neutro - Bilis - Agar). Coliformes.
MSA: Recuentos en Mannitol Salt Agar o Medio de Chapman. Micrococos.
OGYEA: Recuentos en Oxytetracycline Glucosa Yeast Extract Agar. Mohos y Levaduras.
___________________________________________________Resultados y Discusión
102
En las Figuras 11 y 12 se refleja la evolución que experimentan los
grupos microbianos a lo largo de la maduración, en las muestras de la porción
profunda y superficial de los quesos, respectivamente
Figura 10.- Evolución de los recuentos de los principales grupos microbianos
de las muestras tomadas en leche, cuajada y porción profunda de los quesos a
lo largo de la maduración.
En leche se obtuvieron recuentos elevados de aerobios mesófilos totales
(obtenidos en PCA tras un periodo de incubación de 48 h a 30ºC). Estos
valores (6,52 Log UFC/g), (Tabla V) podrían relacionarse con las condiciones
higiénicas durante la elaboración y maduración de los quesos, aunque fueron
similares a los señalados por otros autores para otras variedades, tales como
Montasio (Manzano y col., 1990), Cebreiro (Centeno y col., 1996), queso de
vaca de León (Rodríguez Medina y col., 1995) o Peñamellera (Estepar y col.,
1999), resultando ser ligeramente más bajos que los obtenidos para el queso
de Ulloa (Ordóñez y Burgos, 1977), Valle de Camonica (Garbelli y col., 1984) o
___________________________________________________Resultados y Discusión
103
Tetilla (Menéndez y col., 2001). Sin embargo, fueron más altos que los hallados
para otros quesos, como el de Burgos y Villalón (Chavarry y col., 1985), el
Manchego (García y col., 1987) o la Torta del Casar (Pouyet y col., 1993).
Figura 11.- Evolución de los recuentos de los principales grupos microbianos
de las muestras tomadas en la porción superficial de los quesos a lo largo de
la maduración.
En la cuajada se detectó un incremento de aproximadamente 1 unidad
logarítmica, debido probablemente a la retención física de los microorganismos
en el coágulo, dado que al tratarse de un queso de coagulación
predominantemente enzimática, con tiempos de coagulación muy cortos, el
desarrollo microbiano durante la coaguloación es escaso.
Los recuentos de mesófilos se mantuvieron prácticamente constantes
durante toda la maduración, con valores en torno a 108 UFC/g, en la porción
superficial y 109 UFC/g en la porción profunda. El hecho de que en la porción
___________________________________________________Resultados y Discusión
104
profunda sean superiores los recuentos, probablemente se debe a que la
microbiota láctica al ser microaerófila encuentra en la parte interna del queso
condiciones más favorables para su desarrollo. Estos recuentos fueron
similares a los obtenidos previamente para este tipo de queso por otros autores
(García Fontán y col., 2001; Garabal y col., 2008), así como a los obtenidos en
otros quesos elaborados con leche cruda. Sin embargo, resultaron ligeramente
inferiores a los obtenidos en el queso de Ulloa (Ordóñez y Burgos, 1977b) y en
el queso del Valle de Camonica (Garbelli y col., 1984), y en diferentes
variedades de queso como el Montasio (Manzano y col., 1990), Cebreiro
(Quinto y col., 1994; Centeno y col., 1996b), queso de vaca de León
(Rodríguez Medina y col., 1995) o el de los Pedroches (Sánchez y col., 1995).
El hecho de que los recuentos permanezcan constantes a lo largo de la
maduración puede deberse a que los valores de pH (en torno a 5,50 en las
muestras tanto de la porción profunda como de la superficial al cabo de 6
semanas de maduración) y de aw (0,967 en las muestras de profundidad y
0,953 en las de superficie) no fueron lo suficientemente bajos para provocar
una fuerte inhibición microbiana. Además, los valores de sal/humedad al final
de la maduración fueron bajos, (1,69% y 2,56% en las muestras de profundidad
y superficie, respectivamente).
Los recuentos de psicrotrofos (obtenidos en PCA tras 10 días de
incubación a 7º C) (Tabla V) fueron del orden de 0,5 y 1 unidad logarítmica
inferiores que los hallados para los mesófilos, permaneciendo también
constantes a lo largo de la maduración.
De los recuentos de bacterias lácticas obtenidos en agar M17 (medio
electivo para lactococos), agar MSE (medio electivo para leuconostocs) y agar
Rogosa (medio selectivo para lactobacilos), se deduce que estos grupos
constituyeron la población microbiana mayoritaria en el queso San Simón da
Costa, obteniéndose los recuentos más elevados a las 4 semanas de
___________________________________________________Resultados y Discusión
105
maduración con valores aproximadamente de 109 y 108 en las muestras de
porción profunda y superficial, respectivamente, que se mantienen estables
hasta el final de la maduración. Estos resultados fueron similares a los
detectados en otros quesos como el de Cebreiro (Centeno y col., 1996), el de
Tetilla (Menéndez y col., 2001) o el queso de Arzúa-Ulloa (Ordóñez y Burgos
1977; Centeno y col., 1994b), aunque resultaron bastante diferentes de los
obtenidos por Estepar y col. (1999) en el queso de Peñamellera, en el que los
lactococos (recuentos obtenidos en agar M17) constituyeron la población
microbiana predominante durante toda la maduración, tanto en las muestras de
profundidad como en las de superficie. En otros quesos, como el Kefalotyri, el
Feta o el Teleme (Litopoulou-Tzanetaki, 1990; Litopoulou-Tzanetaki y
Tzanetakis, 1992; Litopoulou-Tzanetaki y col., 1993) la población de lactococos
desciende en las primeras etapas de la maduración hasta su total desaparición.
Las cifras iniciales más bajas encontradas en los recuentos en agar MSE
y en agar Rogosa, electivo para leuconostocs y selectivo para lactobacilos,
respectivamente se podrían deber a que estos grupos al principio de la
maduración presentan una actividad metabólica inferior pero su capacidad de
adaptación a condiciones adversas (acidez, bajos valores de aw, elevadas
concentraciones de sal) va a contribuir a que se vayan incrementando en
etapas más avanzadas de la maduración haciéndose los recuentos elevados
de forma progresiva hasta alcanzar el final de la misma, presentando valores
de 8,47 y 9,08 (log UFC/g) en agar MSE y agar Rogosa, respectivamente.
Este patrón de actuación concuerda con el hallado para otros tipos de
quesos, como el queso de Arzúa Ulloa (Ordóñez y Burgos 1977b) y el queso de
vaca de León (Rodríguez Medina y col., 1995), y difiere del hallado para otros
quesos, como el Genestoso (Arenas y col., 2004).
___________________________________________________Resultados y Discusión
106
Los recuentos de enterococos, obtenidos en agar KAA (Kanamicina
Aesculina Azida) en las muestras de leche fueron de 3,67±0,56 log UFC/g Este
valor se encuentra en el rango de los obtenidos en leche de vaca en otros
estudios (Rodríguez Medina y col., 1994) y en algunas muestras de leche de
cabra (Tornadijo y col., 1995; Zárate y col., 1997), mientras que es ligeramente
inferior a los recuentos hallados en otras muestras de leche de vaca (Arenas y
col., 2004), de leche de cabra tomadas en época estival (Tornadijo y col., 1995)
o de leche de oveja (Sánchez y col., 1998).
La presencia de enterococos en los quesos depende del grado de
contaminación y de las condiciones físico-químicas (pH, aw, NaCl, etc.), si
bien hay que tener en cuenta que son microorganismos muy resistentes a las
condiciones adversas. Los recuentos medios más altos obtenidos en agar KAA
en las muestras de la profundidad y superficie de los quesos (Tablas V y VI)
corrrespondieron a la primera semana de la maduración (7,60 y 7,15 log
UFC/g, respectivamente), Durante el resto de la maduración los recuentos
experimentaron un ligero descenso para terminar con valores en torno a 7,38 y
6,76 (log UFC/g) en las muestras de profundidad y superficie, respectivamente.
El hecho de que se mantengan los recuentos más o menos constantes durante
todo el proceso madurativo puede guardar relación como se señaló
anteriormente con la capacidad que tiene este grupo microbiano para resistir
condiciones adversas (Suárez y col., 1983; Mundt, 1986; Garg y Mital, 1992),
como las que se van instaurando en los quesos mientras progresa la
maduración.
Los recuentos de enterococos en el queso de San Simón da Costa
fueron similares a los obtenidos en el queso Anthotyro (Kalogridou-Vassiliadou
y col., 1994), Monte Veronese (Maggi y Ballarini, 1994), Tenerife (Zárate y col.,
1997), Pichtogalo Chanion (Papageorgiou y col., 1998), Arzúa (Centeno y col.,
1994; 1995), Cebreiro (Centeno y col., 1996) o en algunos lotes del queso de
___________________________________________________Resultados y Discusión
107
Genestoso (Arenas y col., 2004) y ligeramente superiores a los detectados en
el queso de Arzúa elaborado con leche pasterizada (Centeno y col., 1995) lo
que indica la resistencia que en general muestran las distintas especies de
enterococos a las temperaturas de pasterización. También resultaron más
elevados que los detectados en el queso de vaca de León (Rodríguez Medina y
col., 1995), y el Peñamellera (Estepar y col., 1999; Arenas y col., 2004). Por el
contrario, fueron ligeramente inferiores a los obtenidos en el queso de Ulloa
(Ordóñez y Burgos, 1977), queso tipo Palmita (Ferrer Ocando y col., 1993),
ciertos quesos blandos y semiduros (Tarelli y col., 1994), queso de Los
Pedroches elaborado con leche cruda (Sánchez y col., 1995) o ciertos quesos
de oveja como los estudiados por Sánchez y col. (1998).
Los recuentos de enterobacteriáceas se efectuaron en VRBGA y los de
coliformes en VRBA resultando prácticamente idénticos en ambos medios, con
valores máximos obtenidos en la primera semana de la maduración, en torno a
7,5 logUFC/g en la porción profunda y del orden de una unidad logarítmica más
baja en la porción superficial. Estos resultados son similares a los obtenidos
por Ordóñez y Burgos (1977) en el queso de Arzúa-Ulloa y por Quinto y col.
(1994) en el queso de Cebreiro. En cambio, fueron superiores a los obtenidos
por Rodríguez Medina y col. (1995) en el queso de vaca de León, por Tornadijo
y col., (1993) en el queso de Armada y por Arenas y col. (2004) en el queso de
Genestoso en el que este grupo bacteriano desaparece por completo al final de
la maduración. Buffa y col. (2001) relacionaron la rápida desaparición de las
Enterobacteriáceas con condiciones de crecimiento desfavorables para estos
microorganismos durante la maduración de los quesos.
Es importante destacar que a medida que va progresando el tiempo de
maduración van disminuyendo los recuentos de enterobacteriáceas, de tal
forma que al final del periodo estudiado disminuyeron del orden de 2 unidades
logarítmicas en la porción profunda y de 3 en la superficial. De hecho, diversos
___________________________________________________Resultados y Discusión
108
factores (acidez, descenso de la aw o la concentración de NaCl) ejercen un
efecto adverso sobre las condiciones de crecimiento y supervivencia de esta
población, pero en este caso, este descenso no parece ser debido a los
cambios en estos parámetros, dado que no resultan tan intensos en las últimas
etapas de la maduración. No obstante, el descenso más acusado que se
produjo en la porción superficial podría estar relacioando con el hecho de que
en la superficie de los quesos las condiciones son más desfavorables,
pudiendo ser capaces de restringir el crecimiento de estos microorganismos.
La evolución seguida por las micrococáceas, determinada a través de
los recuentos en agar M.S.A. fue similar en la porción profunda (tabla V) y en la
porción superficila (tabla VI). Los recuentos más elevados fueron obtenidos
entre la primera y segunda semana de la maduración, con valores del orden de
106 a 107 UFC/g. Estos resultados concuerdan con los obtenidos para otras
variedades de quesos (Núñez, 1978; Poullet y col., 1991; González de Llano y
col., 1992). Los recuentos experimentaron un ligero descenso a lo largo de la
maduración en las muestras de profundidad, mientras que en las de superficie
se mantuvieron prácticamente constantes hasta la cuarta semana de
maduración. Los recuentos superficiales fueron aproximadamente una unidad
logarítmica superiores a los de profundidad, explicable dado que el género
Micrococcus es aerobio estricto y además el carácter halotolerante de estos
microorganismos va a favorecer su crecimiento en superficie, aunque en este
caso no existieran grandes diferencias entre los niveles de S/H hallados en la
proción superficial y profunda de los quesos a lo largo de la maduración. Este
mismo comportamiento ha sido observado por Menéndez y col. (2001) en los
recuentos efectuados en MSA para el queso de Tetilla. Por otra parte, también
podrían influir las diferencias en el pH entre ambas zonas del queso, al tratarse
este grupo microbiano de microorganismos sensibles a la acidez, aunque
tampoco las diferencias existentes entre el pH de ambas porciones de los
quesos fueron muy acusadas.
___________________________________________________Resultados y Discusión
109
Los recuentos de mohos y levaduras, efectuados en OGYEA (Tablas V
y VI) fueron del orden de 104 UFC/g en leche y cuajada incrementándose hasta
105 UFC/g, durante la maduración, en la porción profunda y hasta 106
UFC/g,
en la porción superficial estos recuentos más elevados son explicables
considerando la preferencia de estos grupos por las condiciones aeróbicas.
Los recuentos de mohos y levaduras en el queso de San Simón fueron
ligeramente más bajos que los obtenidos en el queso de Cebreiro (Quinto y
col., 1994), queso de vaca de León (Rodríguez Medina y col., 1995),
Peñamellera (Estepar y col., 1999) o queso de Genestoso (Arenas y col.,
2004). Aunque la evolución sufrida por el pH, aw y el cociente sal / humedad
debería favorecer el crecimiento de la microbiota fúngica durante el transcurso
de la maduración de los quesos, los valores más bajos que presenta el queso
San Simón da Costa pueden ser explicados debido al proceso de escaldado
que se emplea en su elaboración, que va a inhibir o al menos disminuir su
capacidad de desarrollo y crecimiento.
III.3.- AISLAMIENTO DE CEPAS DE BACTERIAS LÁCTICAS EN
agar M17, MSE y ROGOSA
A partir de muestras de leche, cuajada y de la porción profunda de los
quesos fueron aisladas 720 cepas utilizando tres medios de cultivo (agar M17,
agar MSE y agar Rogosa). En cada medio fueron aisladas 240 cepas y
posteriormente sometidas a pruebas de identificación que permitiesen su
adscripción a nivel de género y de especie.
Procedentes de las muestras de la porción superficial fueron aisladas
240 cepas en los tres medios de cultivo (en cada medio se aislaron 80 cepas)
que igualmente fueron sometidas a las pruebas de identificación.
___________________________________________________Resultados y Discusión
110
III.4.- IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS AISLADAS EN AGAR
M17, AGAR MSE y AGAR ROGOSA.
En total fueron identificadas 141 cepas de bacterias lácticas en M17, 167
en agar MSE y 187 en agar Rogosa.
- Cepas adscritas al género Lactococcus
Al género Lactococcus fueron adscritas 46 cepas, de las cuales 12
fueron aisladas en agar M17, 20 en agar MSE y 14 en agar ROGOSA. En
nuestro estudio el agar M17 mostró una escasa selectividad para el aislamiento
de lactococcus, sólo el 3,75% de las cepas aisladas en M17 se adscribieron a
este género.
Con respecto a la adscripción a especie, 13 se incluyeron en la especie
Lactococcus lactis subsp. lactis, 30 en L. lactis subsp. cremoris y 2 en L. lactis
subps. raffinolactis, 1 cepa no se pudo identificar a nivel de especie.
L. lactis subsp. lactis representó aproximadamente el 28% del total de
lactococos identificados, L. lactis subsp. cremoris el 65% y L. lactis subsp.
raffinolactis el 4 %.
Las características bioquímicas de las cepas identificadas como
lactococos se recogen en la tabla VII.
En la mayoría de los quesos artesanales españoles como Cabrales
(Núñez y Medina, 1979), Roncal (Ordóñez y col., 1980), Mahón (Suárez y col.,
1983), queso de cabra estudiado por Fontecha y col. (1990), Gamonedo
(González de Llano y col., 1992), Afuega‟l Pitu (Cuesta y col., 1996), Arzúa
(Centeno y col., 1996), Armada (Tornadijo y col., 1995), Peñamellera (Estepar y
col., 1999) o Genestoso (González y col., 2006), la especie de Lactococcus
dominante fue Lactococcus lactis subsp. lactis, mientras que L. lactis subsp.
cremoris fue aisladas en escasas ocasiones.
___________________________________________________Resultados y Discusión
111
Tabla VII.- Características bioquímicas de las cepas de lactococos1
aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da
Costa.
Características L. lactis ssp.
lactis L. lactis ssp
cremoris L. lactis ssp raffinolactis
Nº de cepas 13 30 2
Crec. a 45ºC 0 0 0
Crec. a 40ºC 13 28 2
Crec. a 10º C 13 29 2
Desaminación de Arginina
13 0 1
Prueba V.P. 6 26 0
Crec. 4% NaCl 13 29 2
Crec. 6,5% NaCl 0 0 0
Fermentación:
Arabinosa 5 0 1 -/+
Xilosa 4 y 1 +/- 7 -/+ 1 -/+
Sucrosa 12 2 -/+ 2
Trealosa 13 30 2
Manitol 12 y 1+/- 30 2
Salicina 13 30 2
Rafinosa 0 6 y 5 -/+ 2
Inulina 0 1 y 1-/+ 0
Glicerol 7 12 y 4 -/+ 1 y 1 -/+
Sorbitol 4 23 2
Ramnosa 5 y 4 +/- 16 y 6 +/- 2
Ribosa 13 27 1 y 1 +/-
Maltosa 13 30 2
1 Una cepa no pudo ser identificada a nivel de especie.
___________________________________________________Resultados y Discusión
112
- Cepas adscritas al género Leuconostoc
Como leuconostocs se identificaron un total de 76 cepas, 48 aisladas en
MSE, 17 en M17 y 11 en ROGOSA.
De estas 76 cepas, 42 fueron identificadas como Leuconostoc
paramesenteroides, 13 como Ln. lactis, 5 como Ln. mesenteroides subsp.
mesenteroides, 3 como Ln. cremoris, 1 como Ln. mesenteroides subsp.
dextranicum y 12 cepas no pudieron ser adscritas a ninguna especie.
Respecto al total de leuconostoc aislados, Ln. paramesenteroides
representó aproximadamente el 55%, Ln. lactis el 17%, L. mesenteroides
subsp. mesenteroides el 7%, Ln. cremoris el 4% y Ln. mesenteroides subsp.
dextranicum representó el 1%.
El agar MSE se comportó con escasa selectividad en el aislamiento de
leuconostoc (el 15% de los aislamientos realizados en MSE pertenecieron a
este género) a pesar de que este medio lleva en su composición un 10% de
sacarosa y un 0,0075% de azida sódica; si bien hay que tener en cuenta que el
63% de las cepas de este género fueron aisladas en este medio.
También hemos podido comprobar la dificultad que entraña la
adscripción fiable a especie de los microorganismos de este género cuando se
utilizan únicamente caracteres fenotípicos.
La tabla VIII muestra las características bioquímicas de las cepas
identificadas como leuconostoc.
___________________________________________________Resultados y Discusión
113
Tabla VIII.- Características bioquímicas de las cepas de Leuconostoc1
aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da
Costa.
Características
Ln. mesenteroides
ssp. mesenteroides
Ln. mesenteroides
ssp. dextranicum
Ln. paramesenteroides
Ln. lactis
Ln. cremoris
Nº de cepas 5 1 41 13 3
Crec. a 10ºC 5 1 41 13 0
Crec. a 37ºC 4 1 41 13 0
Crec. 4% NaCl 5 1 41 11 0
Crec. 6,5% NaCl
5 1 39 0 0
Prod. dextrano 5 1 0 0 0
Fermentación de:
Arabinosa 5 0 11 0 0
Celobiosa 3 y 1 +/- 1 22 y 12 +/- 3 2
Fructosa 5 1 41 13 2
Glucosa 5 1 41 13 3
Lactosa 5 1 41 13 3
Maltosa 5 1 41 9 3
Melibiosa 4 y 1 +/- 1 27 7 1
Sacarosa 5 1 41 13 0
Salicina 1 y 1 +/- 1 22 y 9 +/- 3 y 3 +/-
0
Trealosa 3 y 2 +/- 1 41 3 3
1 Trece cepas no pudieron ser adscritas con fiabilidad a nivel de especie
___________________________________________________Resultados y Discusión
114
- Cepas adscritas al género Lactobacillus
En agar Rogosa se aislaron 187 cepas de bacterias lácticas, de las
cuales 137 correspondieron a lactobacilos, 14 a lactococos, 11 a leuconostoc y
25 a enterococos. Por consiguiente, el medio agar ROGOSA mostró una
selectividad bastante elevada para el aislamiento de lactobacilos. De hecho,
fueron aislados en Rogosa el 59% de los lactobacilos.
De las 233 cepas de lactobacilos aisladas en los tres medios de cultivo,
137 lo fueron en ROGOSA (89 homofermentadoras y 48 heterofermentadoras),
71 en M17 (32 homofermentadoras y 39 heterofermentadoras) y 25 en MSE
(20 homofermentadoras y 5 heterofermentadoras). Entre las cepas aisladas no
se encontró ningún lactobacilo perteneciente al grupo Thermobacterium.
Los lactobacilos homofermentativos y heterofermentativos constituyen
parte de las bacterias lácticas non starter (NSLAB) que contribuyen al
desarrollo del flavor final de los quesos madurados. De hecho, la intensidad y
calidad del aroma de algunos quesos de larga maduración se puede ver
incrementada con la adición de cepas de lactobacilos junto con el cultivo
iniciador.
Aunque predominaron los lactobacilos homofermentativos (141 cepas),
se identificaron también lactobacilos heterofermentativos en elevado número
(92 cepas). López y Mayo (1997) detectaron también un elevado número de
lactobacilos heterofermentativos en los estudios realizados en varios quesos
artesanales de Asturias.
En el queso San Simón las especies encontradas en el grupo de los
lactobacilos homofermentadores fueron: Lactobacillus casei subsp. casei (81
cepas), L. casei subsp. rhamnosus (33 cepas), Lactobacillus plantarum (24
cepas) y L. casei subsp. tolerans (3 cepas) (Tabla IX).
___________________________________________________Resultados y Discusión
115
Las especies de lactobacilos más comúnmente encontradas en los
quesos madurados son por lo general, Lb. plantarum, Lb. casei subsp. casei y
Lb. rhamnosus. Como se indica más abajo estas especies fueron detectadas
en el queso de San Simón en una proporción de un, 10%, 35% y 13%,
respectivamente, con relación al total de lactobacilos aislados.
La adición de cepas concretas de Lb. casei y Lb. plantarum como co-
cultivos en la elaboración de quesos contribuye al desarrollo del aroma de los
quesos. Resulta interesante, por tanto, la selección de cepas de lactobacilos
con aptitud proteolítica que puedan ser ensayados para mejorar la intensidad y
calidad del aroma de los quesos.
En el grupo de los lactobacilos heterofermentativos 44 cepas fueron
adscritas a la especie Lb. buchneri, 38 a la especie Lb. bifermentans y 10 a Lb.
fermentum. Las características bioquímicas se muestran en la tabla X.
Por lo general, los lactobacilos heterofermentativos como Lb. brevis y Lb.
fermentum suelen ser menos frecuentes en los quesos madurados y de hecho
no suelen incluirse como co-cultivos en los ensayos que se realizan con cepas
non-starter ya que poseen una capacidad potencial de producir defectos (Crow
y col., 2001). En nuestro estudio Lb. fementum fue aislado en una proporción
de un 4% respecto al total de lactobacilos.
En relación con el total de cepas de lactobacilos, Lb. casei subsp. casei
representó aproximadamente el 35%, Lb. casei subsp. rhamnosus el 13%, Lb.
plantarum el 10% y Lb. casei subsp. tolerans el 1%. Lactobacillus bifermentans
representó el 16 % de los lactobacilos totales, Lb. fermentum el 4% y Lb.
buchneri el 19%.
Cabe señalar que 7 cepas identificadas como Lb. casei subsp. casei
fueron finalmete adscritas, por técnicas genéticas, a la especie Lb. paracasei.
___________________________________________________Resultados y Discusión
116
Tabla IX.- Características bioquímicas de las cepas de lactobacilos
homofermentadores aisladas durante la elaboración y maduración del
queso San Simón da Costa.
Características Lb.
plantarum Lb. casei ssp
casei Lb. casei ssp rhamnosus
Lb. casei ssp tolerans
Nº de cepas 24 81 33 3
Crec. a 15ºC 24 81 33 3
Crec. a 45ºC 11 57 31 1
Desaminacion de Arginina
0 0 0 0
Fermentación:
Arabinosa 3 y 3 +/- 2 y 4 -/+ 0 0
Lactosa 24 77 32 y 1 -/+ 3
Melibiosa 24 0 0 0
Sucrosa 24 81 32 0
Xilosa 5 y +/- 0 0 1
Inulina 4 7 0 0
Rafinosa 8 y 8 +/- 3 15 y 6 +/- 1
Ramnosa 10 y 5 +/- 0 33 1
Sorbitol 23 y 1 +/- 62 y 10 +/- 29 y 1 +/- 2
Sorbosa 4 y 2 +/- 0 0 0
___________________________________________________Resultados y Discusión
117
Tabla X.- Características bioquímicas de las cepas de lactobacilos
heterofermentadores aisladas durante la elaboración y maduración del
queso San Simón da Costa.
Características Lb. fermentum Lb. bifermentas Lb. buchneri
Nº de cepas 10 38 44
Crec. a 15ºC 0 38 37
Crec. a 45ºC 10 0 23
Desaminación de Arginina
10 0 44
Fermentación:
Arabinosa 0 2 0
Celobiosa 10 35 35 y 8 +/-
Melecitosa 0 0 43 y 1 +/-
Melibiosa 5 3 y 3 -/+ 4 y 3 -/+
Rafinosa 5 0 4 y 1 -/+
Salicina 0 36 0
Trealosa 19 0 43 y 1 +/-
Xilosa 0 0 6
Manosa 10 38 44
___________________________________________________Resultados y Discusión
118
- Cepas adscritas al género Enterococcus
En los tres medios de cultivo (agar M17, agar MSE y agar Rogosa)
también se aislaron cepas de Enterococcus.
En agar M17 se aislaron 41 cepas de enterococos, en agar MSE 74
cepas y en agar Rogosa 25 cepas, es decir un total de 140 cepas, que viene a
sugerir la elevada proporción en que este grupo microbiano está presente en el
queso de San Simón. El elevado recuento de enterococos no es sorprendente
teniendo en cuenta la elaboración artesanal de los quesos, su ubicuidad, su
actividad proteolítica y la capacidad de fermentar la lactosa (Estepar y col.,
1999).
La mayoría de las cepas de enterococos aisladas en los tres medios de
cultivo fueron identificadas como Enterococcus faecalis (98 cepas). Si tenemos
en cuenta los aislamientos efectuados en agar KAA durante la elaboración y
maduración del queso de San Simón (García y col., 2002), una proporción de
un 63 a 79% de las cepas aisladas en leche, cuajada y las muestras de la
porción profunda de los quesos, así como el 90% de los aislamientos
efectuados a partir de las muestras de superficie fueron adscritas al género
Enterococcus, siendo E. faecalis la especie dominante. E. faecalis fue también
la especie dominante en una gran variedad de quesos elaborados con leche de
diferentes especies y con características muy distintas: Roquefort (Devoyod,
1969); Manchego (Ordóñez y col., 1978); Majorero (Fontecha y col., 1990);
Ibores (Mas y González Crespo, 1992); queso tipo Palmita (Ferrer Ocando y
col., 1993); Saint-Paulin (Ryser y col., 1994); Armada (Tornadijo y col., 1995);
Arzúa (Centeno y col., 1995); El-Klila (Boubekri y Ohta, 1996); queso de
Tenerife (Zárate y col., 1997); Roncal e Idiazábal (Arizcun y col., 1997);
Cebreiro (Menéndez y col., 1998) o el queso Serra da Estrela (Tavaria y
Malcata, 1998).
___________________________________________________Resultados y Discusión
119
Veintinueve cepas que posiblemente pertenezcan a la especie E.
faecalis o a la especie E. faecium, fueron incluidas en un grupo intermedio que
denominamos Inter faecalis-faecium por presentar características comunes a
ambas especies. Estos problemas de identificación de las cepas de
enterococos ya fueron también considerados anteriormente por otros autores
(Arizcun y col., 1997). Por último, trece cepas no pudieron ser adscritas a
ninguna especie.
Las características bioquímicas de las cepas de enterococos se
muestran en la tabla XI
___________________________________________________Resultados y Discusión
120
Tabla XI.- Características bioquímicas de las cepas de enterococos
aisladas durante la elaboración y maduración del queso San Simón da
Costa.
Características E. faecalis
faecalis E. Inter. faecalis
faecium Enterococcus
spp.
Nº de cepas 98 29 13
Crec. a 40ºC 98 29 13
Crec. a 45ºC 98 29 13
Crec. 4,5% NaCl 98 29 13
Crec. 6,5% NaCl 98 29 13
Crec. en agar KF 98 9 13
Desaminación de arginina
98 15 13
Fermentación:
L-Arabinosa 0 9 13
Arbutina 98 29 13
Melezitosa 65 17 0
Melibiosa 0 6 4
Sorbitol 98 22 13
Sorbosa 7 6 0
Ramnosa 75 15 13
Rafinosa 8 9 13
Almidón 65 14 13
Sacarosa 98 27 13
Manitol 98 9 13
D-Xilosa 8 19 10
Glicerol 41 29 13
Inulina 0 0 0
Salicina 98 29 13
Trealosa 40 29 13
Ribosa 98 29 13
Maltosa 98 29 13
___________________________________________________Resultados y Discusión
121
III.5. EVOLUCIÓN DE LAS ESPECIES DE BACTERIAS
LÁCTICAS DURANTE LA ELABORACIÓN Y MADURACIÓN DEL
QUESO DE SAN SIMÓN DA COSTA
Las tablas XII, XIII y XIV recogen respectivamente la identidad y la
distribución por puntos de muestreo de los aislamientos efectuados en los
medios agar M17, agar MSE y agar ROGOSA.
En agar M17 la mayoría de las cepas de bacterias lácticas aisladas
fueron identificadas como lactobacilos (71 cepas) (22,19%) (Tabla XII). A pesar
de tratarse de un medio moderadamente selectivo para el aislamiento de
lactococos, en nuestro estudio sólo se aislaron 12 cepas de lactococos (3,75%
de las cepas aisladas en este medio).
En agar MSE (Tabla XIII) se aislaron 167 cepas de bacterias lácticas, de
las cuales 20 (6,25%) fueron identificadas como lactococos, 48 cepas (15%)
fueron leuconostocs, 25 (7,81%) lactobacilos y 74 (23,12%) enterococos.
Enterococos y leuconostocs fueron también los microorganismos más
frecuentemente aislados en agar MSE a partir de los estudios efectuados en
queso Tetilla (Menéndez y col., 2001) y en queso de Armada (Tornadijo y col.,
1995). En el queso de Genestoso el 35% de las cepas aisladas en MSE fueron
adscritas al género Lactococcus, el 26,43% al género Leuconostoc, el 22,86%
al género Lactobacillus y el 22,86% al género Enterococcus (González y col.,
2006).
De las 187 cepas de bacterias lácticas aisladas en agar Rogosa (Tabla
XIV), 14 (4,37%) correspondieron a lactococos, 11 (3,44%) a leuconostocs, 25
(7,81%) a enterococos y 137 (42,81%) a lactobacilos. Este medio muestra
elevada selectividad para el aislamiento de lactobacilos.
___________________________________________________Resultados y Discusión
122
Como resultado del aislamiento de cepas en agar M17, agar MSE y agar
Rogosa se encontró un predominio de cepas del género Lactobacillus (233
cepas), así como una baja proporción de lactococos (46 cepas). La baja
proporción de lactococos fue también descrita en el queso de Tetilla por
Menéndez y col. (2001) pero por el contrario la presencia de lactobacilos en el
queso de San Simón fue notable respecto a los resultados obtenidos en otros
quesos similares por, Litopoulou-Tzanetaki y Tzanetakis (1992), Centeno y col.
(1996) y Menéndez y col. (2001).
___________________________________________________Resultados y Discusión
123
Tabla XII.- Distribución de las cepas de bacterias lácticas aisladas en agar M17 durante la fabricación y maduración del queso San Simón da Costa.
Especies
Leche Cuajada
Semanas de maduración
1 2 4 6
Profundidad Superficie Profundidad Superficie Profundidad Superficie Profundidad Superficie
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Lactococcus lactis ssp. lactis
0 - 1 2,5 0 - 0 - 1 2,5 3 15 - 0 - 1 2,5 0 -
L. lactis ssp. cremoris 0 - 1 2,5 1 2,5 0 - 0 - 0 - 1 2,5 1 5 2 5 0 -
Lactobacillus plantarum 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 1 5 0 - 2 10
Lb. casei ssp. casei 0 - 0 - 0 - 9 45 0 - 13 65 0 - 2 10 0 - 0 -
Lb. casei ssp. rhamnosus 1 2,5 0 - 0 - 0 - 2 5 1 5 0 - 0 - 1 2,5 0 -
Lb. casei ssp. tolerans 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 -
Lb. fermentum 0 - 1 2,5 3 7,5 0 - 1 2,5 0 - 1 2,5 0 - 4 10 0 -
Lb. bifermentans 0 - 0 - 0 - 1 5 1 2,5 1 5 1 2,5 3 15 1 2,5 5 25
Lb. buchneri 1 2,5 1 2,5 0 - 3 15 0 - 0 - 1 2,5 4 20 6 15 0 -
Leuconostoc paramesenteroides
0 - 0 - 0 - 2 10 0 - - 1 2,5 2 10 1 2,5 3 15
Ln. cremoris 0 - 0 - 0 - 1 5 0 - - 0 - 0 - 0 - 0 -
Ln. lactis 0 - 0 - 2 5 1 5 0 - 0 - 0 - 1 5 0 - 2 10
Leuconostoc sin identificar
0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 1 5
Enterococcus faecalis faecalis
0 - 5 12,5 2 5 0 - 9 22,5 0 - 6 15 1 5 11 27,5 5 25
Ent. inter faecalis-faecium
0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 2 10 0 - 0 - 0 - 0 -
Cepas identificadas 2 5 9 22,5 8 20 17 85 14 35 20 100 11 27,5 15 75 27 67,5 18 90
Cepas aisladas 40 100 40 100 40 100 20 100 40 100 20 100 40 100 20 100 40 100 20 100
___________________________________________________Resultados y Discusión
124
Tabla XIII.- Distribución de las cepas de bacterias lácticas aisladas en agar MSE durante la fabricación y maduración del
queso San Simón da Costa.
Especies
Leche Cuajada
Semanas de maduración
1 2 4 6
Profundidad Superficie Profundidad Superficie Profundidad Superficie Profundidad Superficie
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Nº
cepas (%)
Lactococcus lactis ssp. lactis
0 - 0 - 0 - 0 - 2 5 0 - 1 2,5 0 - 0 - 0 -
L. lactis ssp. cremoris 1 2,5 0 - 4 10 0 - 4 10 0 - 0 - 2 10 3 7,5 1 5
L. lactis ssp. raffinolactis 0 - 1 2,5 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 1 2,5 0 -
Lactobacillus plantarum 1 2,5 0 - 0 - 0 1 2,5 4 20 0 - 0 - 0 - 2 10
Lb. casei ssp. casei 1 2,5 0 - 0 - 3 15 0 - 1 5 1 2,5 3 15 2 5 0 -
Lb. casei ssp. tolerans 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 1 5 0 - 0 -
Lb. buchneri 1 2,5 1 2,5 1 2,5 0 - 1 2,5 0 - 0 - 1 5 0 - 0 -
Leuconostoc mesenteroides
ssp. mesenteroides 0 - 1 2,5 2 5 0 - 1 2,5 0 - 1 2,5 0 - 0 - 0 -
Ln. mesenteroides ssp. dextranicum
0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 1 2,5 0 - 0 - 0 -
Ln. paramesenteroides 0 - 0 - 4 10 2 10 1 2,5 1 5 10 25 2 10 3 7,5 2 10
Ln. cremoris 0 - 0 - 1 2,5 0 - 0 - 0 - 0 0 - 0 - 0 -
Ln. lactis 0 - 0 - 0 - 0 - 5 12,5 0 - 2 5 0 - 0 - 0 -
Leuconostoc sin identificar
1 2,5 0 - 1 2,5 0 - 2 5 1 5 1 2,5 0 - 2 5 1 5
Enterococcus faecalis faecalis
4 10 2 5 11 27,5 0 - 8 20 1 5 8 20 1 5 9 20,5 0 -
Ent. inter faecalis-faecium
4 10 5 12,5 1 2,5 0 - 0 - 1 5 2 5 0 - 2 5 2 10
Enterococcus spp. 1 2,5 2 5 2 5 0 - 1 2,5 0 - 2 5 0 - 5 12,5 0 -
Cepas identificadas 14 35 12 30 27 67,5 5 25 26 65 9 45 29 72,5 10 50 27 67,5 8
Cepas aisladas 40 100 40 100 40 100 20 100 40 100 20 100 40 100 20 100 40 100 20 100
___________________________________________________Resultados y Discusión
125
Tabla XIV.- Distribución de las cepas de bacterias lácticas aisladas en agar Rogosa durante la fabricación y maduración del
queso San Simón da Costa.
Especies Leche Cuajada
Semanas de maduración
1 2 4 6
Profundidad Superficie Profundidad Superficie Profundidad Superficie Profundidad Superficie Nº
cepas (%) Nº cepas (%) Nº
cepas (%) Nº cepas (%) Nº
cepas (%) Nº cepas (%) Nº
cepas (%) Nº cepas (%) Nº
cepas (%) Nº cepas (%)
Lactococcus lactis ssp. lactis 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 2 5 0 - 2 5 0 -
L. lactis ssp. cremoris 0 - 1 2,5 0 - 1 5 0 - 0 - 3 7,5 1 5 1 2,5 2 10
L. lactis ssp. raffinolactis 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 -
Lactococcus sin identificar 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 1 5 0 - 0 -
Lactobacillus plantarum 1 2,5 0 - 0 - 0 - 2 5 0 - 1 2,5 1 5 8 20 0 -
Lb. casei ssp. casei 5 12,5 5 12,5 11 27,5 0 - 7 17,5 1 5 7 17,5 0 - 9 22,5 1 5
Lb. casei ssp. rhamnosus 4 10 6 15 5 12,5 0 - 6 15 0 - 5 12,5 0 - 1 2,5 1 5
Lb. casei ssp. tolerans 0 - 0 - 2 5 0 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 -
Lb. bifermentans 5 12,5 2 5 1 2,5 1 5 2 5 0 - 6 15 0 - 5 12,5 3 15
Lb. buchneri 7 17,5 3 7,5 5 12,5 0 - 2 5 0 - 0 - 0 - 5 12,5 1 5
Leuconostoc paramesenteroides 0 - 0 - 0 - 0 - 1 2,5 0 - 3 7,5 0 - 2 5 1 5
Ln. cremoris 0 - 0 - 1 2,5 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 -
Leuconostoc sin identificar 2 5 1 2,5 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 - 0 -
Enterococcus faecalis faecalis 2 5 3 7,5 1 2,5 0 - 2 5 0 - 6 15 0 - 1 2,5 0 -
Ent. inter faecalis-faecium 0 - 0 - 2 5 0 - 2 5 0 - 4 10 0 - 2 5 0 -
Cepas identificadas 26 65 21 52,5 28 70 2 10 24 60 1 5 37 92,5 2 10 36 90 9 45
Cepas aisladas 40 100 40 100 40 100 20 10
0 40 100 20 10
0 40 100 20 10
0 40 100 20 100
___________________________________________________Resultados y Discusión
126
III.6.- CONFIRMACIÓN POR TÉCNICAS GENÉTICAS DE LA
IDENTIFICACIÓN DE LAS CEPAS SOMETIDAS A ENSAYO DE
SU APTITUD TECNOLÓGICA
Entre las bacterias lácticas aisladas del queso San Simón da Costa
artesanal e identificadas a nivel de especie siguiendo la metodología clásica se
seleccionaron 20 cepas pertenecientes a diferentes lotes y distintos puntos de
muestreo, representativas de la mayoría de los patrones bioquímicos hallados.
La identificación de estas cepas se comprobó mediante el uso de técnicas
genéticas.
Se pueden emplear diferentes técnicas genotípicas para identificar las
bacterias lácticas a nivel de especie o para diferenciar cepas de una misma
especie. En nuestro caso se utilizó la técnica de amplificación en cadena de la
polimerasa (PCR) del ADN que codifica para el ARN ribosomal 16S, seguido de
secuenciación y comparación de las secuencias obtenidas frente a las
depositadas en bases de datos.
En las figuras 13 y 14 se muestran, a modo de ejemplo, las fotos de la
electroforesis de los productos PCR de cepas de bacterias lácticas aisladas del
queso de San Simón da Costa, entre las que se incluyen algunas
seleccionadas para ensayar la aptitud tecnológica. De este modo, en las 20
cepas que fueron estudiadas desde una perspectiva tecnológica se llevó a
cabo previamente la confirmación de su identificación empleando técnicas
moleculares. En todos los casos se obtuvo una banda única de ADN, de 834
pb, resultado de la amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN
que codifica para el ARN ribosomal 16S. La banda correspondiente fue
secuenciada y comparada con las secuencias depositadas en bases de datos.
___________________________________________________Resultados y Discusión
127
En algunas cepas se pudo confirmar la identificación realizada por métodos
clásicos, mientras que en algún otro caso fue necesario modificar la adscripción
a especie. La identificación de las cepas empleando la metodología clásica y
las técnicas moleculares coincidió en un 100% para las cepas de Lactococcus
lactis subsp. lactis, Lactobacillus casei subsp. casei, Lb. casei subsp.
rhamnosus y Leuconostoc mesenteroides. Con respecto a las cepas adscritas
a la especie Lactobacillus paracasei la adscripción coincidió en un 100% a nivel
de género, aunque previamente habian sido adscritas a la especie Lb. casei.
Por último, señalar que con respecto a Enterococcus faecalis la adscripción
coincidió en un 67%,
___________________________________________________Resultados y Discusión
128
Figura 12.- Electroforesis de los productos PCR obtenidos con los primers 8 y 806.
C: Control. ADN de fago Lambda digerido con HindIII. Orden del 1-10: Cepas lácticas
aisladas del queso de San Simón artesanal: Lactobacillus plantarum (SS 1239),
Lactococcus lactis subsp. lactis (SS 13), Enterococcus faecalis (SS 26), Lactococcus lactis
subsp. lactis (SS 193), Lactococcus lactis subsp. lactis (SS 194), Leuconostoc
mesenteroides (SS 1437), Cepa identificar a género (SS 1439), Lactococcus lactis subsp.
lactis (SS 2379), Enterococcus sulphureus (SS 163), Leuconostoc pseudomesenteroides
(SS 2068).
Figura 13.- Electroforesis de los productos PCR obtenidos con el primer 8-806.
C: Control. ADN de fago Lambda digerido con HindIII. Orden del 1-8: Lactobacillus casei
(SS 1615), Control negativo sin ADN, Lactobacillus plantarum (SS 1594), Lactobacillus
casei (SS 263), Enterococcus raffinosus (SS 1293), Lactobacillus casei (SS 1614),
Lactococcus lactis subsp. lactis (SS 2363), Enterococcus spp. (SS 164).
23130
9416
6557
4361
2322 2027
564
125
23130
9416
6557
4361
2322
2027
564
125
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pb
pb
C 1 2 3 4 5 6 7 8
___________________________________________________Resultados y Discusión
129
III.7.- ESTUDIO DE LA APTITUD TECNOLÓGICA DE BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DEL QUESO SAN SIMÓN DA COSTA.
La industria quesera debe ofrecer a los consumidores productos de
calidad, desarrollando procedimientos de elaboración encaminados a que los
quesos alcancen las propiedades organolépticas adecuadas en un tiempo de
maduración razonable. Para conseguir este objetivo se puede hacer uso de
cultivos iniciadores, constituidos por ciertas especies microbianas que posean
unas características concretas de interés tecnológico, y de otras cepas
específicas que se pueden añadir como "cultivos adjuntos" con el fin de mejorar
la calidad global de los quesos. En este sentido, los quesos artesanales
constituyen un importante almacén de diversidad microbiana fenotípica y
genotípica que puede llegar a tener importantes aplicaciones biotecnológicas
(Wouter y col., 2002; Topisirovic y col., 2006; Van Hylckama Vlieg y col., 2006).
De hecho, existe un interés creciente en el conocimiento de la microbiota de los
quesos fabricados con leche cruda debido a la necesidad de encontrar nuevas
bacterias lácticas que complementen o puedan llegar a remplazar las cepas
que se están utilizando a nivel industrial (Alegría y col., 2009).
En los ensayos de la aptitud tecnológica de las bacterias lácticas
aisladas e identificadas del queso San Simón da Costa elaborado de forma
artesanal se determinó la capacidad acidificante y proteolítica y la actividad
enzimática por la técnica rápida del API ZYM.
La identificación de las 20 cepas seleccionadas para el estudio de su
aptitud tecnológica fue confirmada por técnicas moleculares según la
metodología descrita en el apartado II.4.5., siendo adscritas a las especies:
Lactococcus lactis subsp. lactis (3 cepas), Lactobacillus casei subsp. casei (3
___________________________________________________Resultados y Discusión
130
cepas), Lactobacillus paracasei (7 cepas), Lactobacillus casei subsp.
rhamnosus (1 cepa), Leuconostoc mesenteroides (3 cepas) y Enterococcus
faecalis (3 cepas).
III.7.1. Actividad acidificante
La acidificación inicial de la leche es un aspecto de crucial importancia
en la elaboración de quesos ya que contribuye a la coagulación y
posteriormente a la sinéresis de la cuajada, a la expulsión del suero, a la
solubilización del calcio micelar y previene o reduce el crecimiento de
microbiota indeseable. Una de las propiedades más importantes de las
bacterias lácticas que se utilizan como starters en la elaboración del queso es
la capacidad acidificante inicial de la leche (Cogan y col., 1997). De hecho,
para que una cepa láctica sea considerada como una buena candidata para
que pueda ser incluida en un starter debe producir suficiente ácido como para
reducir el pH de la leche a valores inferiores a 5,3 al cabo de 6 h de incubación
a 30ºC (Beresford y col. (2001). Algunos autores (Martínez Moreno, 1976;
Núñez y Medina, 1979; Timmons y col., 1988; Requena y col., 1991; Mas y
González-Crespo, 1992) coinciden en que las diferencias entre cepas rápidas y
lentas en lo que a actividad acidificante se refiere está en función de que la
acidez titulable de la leche a las 6 h de incubación se incremente al menos
hasta unos 30ºD. No obstante, las cepas con escasa capacidad acidificante
pueden ser empleadas como cultivos adjuntos en función de sus propiedades
tecnológicas (Sarantinopoulos y col., 2001; Ayad y col., 2004).
La capacidad acidificante de las 20 cepas de bacterias lácticas
ensayadas se determinó después de 6, 12 y 24 h de incubación a 30ºC. Los
resultados obtenidos se muestran en la tabla XV.
___________________________________________________Resultados y Discusión
131
Tabla XV.- Actividad acidificante de bacterias lácticas aisladas del queso
de San Simón da Costa.
Tiempo de incubación (h)
Cepa 6 h 12 h 24 h
pH Acidez titulable *
pH Acidez titulable *
pH Acidez titulable *
Lactococcus lactis subsp. lactis
SS 193 6,20 0,32 5,6 0,44 4,84 0,64
SS 194 5,64 0,26 5,25 0,40 4,71 0,58
SS 287 5,70 0,32 5,25 0,38 5,03 0,52
Lactobacillus casei subsp. casei
SS 1614 6,23 0,31 5,63 0,41 5,06 0,59
SS 1615 6,16 0,24 5,59 0,29 4,52 0,85
SS 263 6,29 0,31 5,99 0,42 4,86 0,67
Lactobacillus paracasei
SS 1644 6,08 0,26 5,29 0,39 4,9 0,74
SS 1661 6,08 0,29 5,77 0,30 5,15 0,51
SS 1695 6,21 0,20 5,66 0,28 5,07 0,55
SS 1689 6,15 0,27 5,89 0,29 5,78 0,39
SS 1770 6,12 0,21 5,66 0,40 4,5 0,75
SS 1778 6,11 0,19 5,64 0,35 4,34 0,84
SS 1785 6.10 0,30 5,72 0,30 4,32 0,85
Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
SS 1684 5,83 0,24 5,38 0,30 5,26 0,39
Leuconostoc mesenteroides
SS 1435 5,70 0,30 5,51 0,33 5,18 0,43
SS 1437 6,13 0,31 5,56 0,40 5,39 0,46
SS 1464 6,12 0,28 5,83 0,33 5,62 0,40
Enterococcus faecalis
SS 1378 5,88 0,33 5,02 0,48 4,55 0,80
SS 191 6,08 0,27 5,4 0,56 4,77 0,85
SS 1449 6,18 0,25 5,68 0,30 5,44 0,40
* Expresada en g de ácido láctico/100 mL de leche.
___________________________________________________Resultados y Discusión
132
De todas las cepas ensayadas solo 5 de ellas (2 de Lactococcus lactis, 1
de Lactobacillus casei subsp rhamnosus, 1 de Leuconostoc mesenteroides y
otra de Enterococcus faecalis) fueron capaces de reducir el pH de la leche a
valores inferiores a 6,0 tras 6 h de incubación a 30ºC y 8 cepas desarrollaron
una acidez titulable en la leche igual o superior a 30ºD, (2 Lactococcus lactis
subsp. lactis 2 Lactobacillus casei subsp. casei, 1 Lactobacillus paracasei 2
Leuconostoc mesenteroides y 1 de Enterococcus faecalis). Por todo ello, en
general, se pueden considerar cepas ligeramente acidificantes.
Estos resultados están en concordancia con los previamente obtenidos
por Garabal y col. (2008) al caracterizar cepas de lactococos aislados de
diversos quesos tradicionales gallegos y por Asteri y col. (2009) al estudiar la
capacidad acidificante de cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos
tradicionales griegos. Los lactococos aislados del queso Beyaz, un queso de
origen turco, fueron también caracterizados por Durlu-Ozkaya y col. (2001)
como cepas de lenta capacidad acidificante. En cambio, la capacidad de
producir ácido láctico fue superior en las cepas de lactococos aisladas del
queso de Armada (Herreros y col., 2003), del queso de Arzúa Ulloa (Menéndez
y col., 1998) y de otros quesos artesanales (Requena y col., 1991; Mannu y
col., 2000; Alonso Calleja y col., 2002; Madera y col., 2003; Pérez y col., 2003;
Badis y col., 2004).
Ayad y col. (2004) coinciden en que la actividad acidificante de la
mayoría de las cepas de lactococos aisladas de productos lácteos tradicionales
es generalmente baja. No obstante, algunas cepas con baja capacidad de
acidificación pueden emplearse en cultivos mixtos siempre a que presenten
otras propiedades de interés tecnológico (Sarantinopoulos y col., 2001).
___________________________________________________Resultados y Discusión
133
A las 12 horas de incubación la acidez desarrollada por las cepas de
Lactococccus lactis subsp. lactis se incrementó hasta valores en torno a 0,40 g
de ácido láctico /100 mL, aumentando posteriormente a las 24 horas de
incubación, aunque los valores alcanzados no superaron en ningún caso 0,65 g
de ácido láctico / 100 mL.
Resultados similares fueron hallados para Lactobacilus casei subsp
casei y Lactobacillus paracasei, aunque alguna cepa de forma aislada mostró
una mayor capacidad acidificante que coincidió con un mayor descenso del pH.
Así la cepa de L. casei subsp. casei (SS 1615) y las cepas de Lactobacillus
paracasei (SS 1778 y SS 1785) acidificaron hasta valores de pH de 4,5 e
inferiores, llegando a producir en torno a 0,85 g de ácido láctico/100 mL de
leche.
Las cepas de Leuconostoc mesenteroides mostraron una acidez similar
a la de Lactococcus lactis subsp. lactis tras 6 h de incubación. En cambio, a las
12 y 24 h la acidez producida por los leuconostocs fue inferior a la de los
lactococos. Otros autores detectaron también una baja actividad acidificante
para las cepas de leuconostocs aisladas de diversos quesos artesanales (y
(Herreros y col., 2003; Pérez y col., 2003; Ayad y col., 2004; Badis y col., 2004;
Ballesteros y col., 2006; Asteri y col., 2009 y Nieto-Arribas y col., 2009
Los enterococos aislados del queso San Simón da Costa presentaron
también grandes variaciones, aunque de las 3 cepas estudiadas dos de ellas
(SS 1378 y SS 191) mostraron una capacidad acidificante relativamente alta,
comparable con la de las cepas de L. paracasei y L. casei subsp casei,
anteriormente citadas.
En general, podemos señalar que la capacidad acidificante de las cepas
de la especie Lactococcus lactis subsp lactis es similar a la de Lactobacillus
casei subsp rhamnosus y Leuconostoc mesenteroides y a la mayor parte de
___________________________________________________Resultados y Discusión
134
Lactobacillus casei subsp casei, Lactobacillus paracasei, aunque se pueden
observar grandes variaciones en la producción de acidez entre cepas de dichas
especies, sobre todo a medida que progresa el tiempo de incubación,
encontrando valores que oscilaron entre los 0,39 y 0,85 g de ácido láctico / 100
mL en función de la cepa. Diversos autores coinciden en que la capacidad
acidificante es una característica dependiente de la cepa (Centeno y col., 1996;
Gaya y col., 1999; Pérez y col., 2003). En el caso de los enterococos, es sabido
que pueden estimular la producción de ácido por los lactococos ya que los
péptidos y aminoácidos liberados pueden actuar como sustratos de crecimiento
para el resto de las bacterias lácticas (Devoyod y Desmazeaud, 1970). La
capacidad de hidrólisis de la caseína de la leche por las cepas de Enterococcus
faecalis les permite incrementar su población rápidamente a expensas de los
péptidos liberados (Mayo y col., 1990; Centeno y col., 1996), siendo capaz,
incluso en las primeras horas de cultivo de producir más ácido que muchas
especies de lactococos (Schmidt y Lenoir, 1972; Muchetti y col., 1982). Sin
embargo, otros autores han encontrado que los enterococos presentan una
ligera capacidad acidificante (Sarantinopoulos y col., 2001; Durlu-Ozkaya y
col., 2001; Ayad y col., 2004) y de hecho, se ha descrito que Enterococcus
faecium y E. faecalis degradan la lactosa en la leche más lentamente que
Lactobacillus paracasei, que es en sí un microorganismo de acidificación lenta
(Freitas y col., 1999). No obstante, la acidificación final producida por algunas
cepas de lactobacilos (5 de las 11 ensayadas) y de enterococos fue superior a
la de los lactococos y leuconostocs alcanzando valores en torno a 0,75-0,85 g
de ácido láctico /100 mL leche a las 24 h de incubación. Este mismo
comportamiento ha sido descrito por Herreros y col. (2003), para el queso de
Armada. Asimismo, Durlu-Ozkaya y col. (2001) al estudiar un queso de origen
turco no observaron cambios importantes en el pH de la leche inoculada con
___________________________________________________Resultados y Discusión
135
cepas de lactobacilos tras 6 h de incubación a 30ºC, aunque después de 24 h
también encontraron un descenso del pH superior a una unidad.
Teniendo en cuenta la opinión de algunos autores que sugieren que
aquellas cepas cuya capacidad acidificante proporciona una acidez superior a
0,25 g de ácido láctico /100 mL después de 6 horas de incubación, podrían ser
usadas como cultivos estarters en la fabricación de queso (Núñez y col., 1981 y
Requena y col., 1991), se puede concluir que con muy pocas excepciones
(solo 3 cepas de las 20 ensayadas) las cepas aisladas del queso San Simón
da Costa resultarían adecuadas para ser utilizadas en la fabricación a nivel
industrial. Considerando que el pH del queso San Simón da Costa artesanal se
encuentra en valores de 5,50 y que presenta una AT del orden de 0,70 g/100
mL se podrían incluir como co-cultivos aquellas cepas que desarrollaron una
acidez final elevada, como la cepa de L. casei subsp. casei, (SS 1615) las
cepas de L. paracasei (SS 1778 y SS 1785) y las cepas de Enterococcus
faecalis (SS 1378 y SS 191).
___________________________________________________Resultados y Discusión
136
III.7.2. Actividad proteolítica
Las enzimas proteolíticas de las bacterias lácticas juegan un papel
importante en la degradación de la caseína y de los péptidos, libera
aminoácidos. La actividad proteolítica es esencial para el desarrollo de la
microbiota y para conseguir mejorar el aroma y la textura en los quesos y otros
productos lácteos fermentados (Fox, 1989; Axelson, 1998; Christensen y col.,
1999; Martínez Cuesta y col., 2001). Por consiguiente, las cepas que tengan
una mayor implicación en la degradación proteica durante la maduración
pueden encontrar aplicación en la elaboración del queso y otros productos
lácteos fermentados. De hecho, la calidad elevada de estos productos depende
directamente del starter y más concretamente de su sistema proteolítico, ya
que las peptidasas y los aminoácidos formados ejercen un fuerte impacto sobre
el aroma o bien sirven como precursores del mismo (De Angelis y col., 2001;
Law, 2001). Además, el empleo de cepas seleccionadas con elevada actividad
proteolítica y/o lipolítica puede llegar a acortar el tiempo de maduración,
permitiendo un sustancial ahorro a la Industria quesera. Por otra parte, el
sistema proteolítico de las bacterias lácticas puede también contribuir a la
liberación de péptidos bioactivos a partir de la leche, con efecto positivo sobre
la salud (Wouters y col., 2002; Phelan y col., 2009).
En la Tabla XVI se muestran los resultados obtenidos en la
determinación de la actividad proteolítica de las 20 cepas seleccionadas como
valores medios de tres determinaciones ± desviación estándar.
___________________________________________________Resultados y Discusión
137
Tabla XVI. Actividad proteolítica de 20 cepas de bacterias lácticas
aisladas del queso de San Simón da Costa a
Cepa Actividad proteolítica (a las 24 h)
mM Gly L-1 *
Lactococcus lactis subsp. lactis
SS 193 0,135 ± 0,010
SS 194 0,804 ± 0,060
SS 287 0,398 ± 0,020
Lactobacillus casei subsp. casei
SS 1614 0,505 ± 0,018
SS 1615 0,182 ± 0,012
SS 263 0,051 ± 0,010
Lactobacillus paracasei
SS 1644 0,135 ± 0,008
SS 1661 0,060 ±,0,006
SS 1695 0,637 ± 0,040
SS 1689 1,605 ± 0,005
SS 1770 0,470 ± 0,006
SS 1778 0,290 ± 0,003
SS 1785 0,398 ± 0,002
Lactobacillus casei subsp. rhamnosus
SS 1684 0,111 ± 0,001
Leuconostoc mesenteroides
SS 1435 0,099 ± 0,001
SS 1437 0,195 ± 0,003
SS 1464 0,132 ± 0,005
Enterococcus faecalis
SS 1378 1,832 ± 0,006
SS 191 0,374 ± 0,001
SS 1449 1,320 ± 0,002
a
Valores medios de tres determinaciones ± desviación estandar. * Actividad proteolítica medida usando el o-phthaldialdehyde (OPA) y expresada como mM de glicina / L de leche.
___________________________________________________Resultados y Discusión
138
Los leuconostocs presentaron la actividad proteolítica más baja, con
valores que no sobrepasaron 0,2 mM Gly L-1. Los sistemas proteolíticos de los
leuconostocs no han sido muy estudiados, aunque estos microorganismos se
incluyen como iniciadores en los quesos suizos y en los azules. Los
leuconostocs son heterofermentativos y su principal función en los quesos es
producir CO2 para la formación de los ojos en los quesos suizos y la textura
abierta en los azules. Su sistema proteolítico presumiblemente actúa, pero
estos quesos poseen otras enzimas más efectivas, por ejemplo en quesos de
pasta azul es predominante el P. roqueforti. Algunos autores (Ezzat y col.,
1993) han estudiado las proteasas de la pared celular de Leuconostoc
mesenteroides encontrando también una actividad peptidasa.
Las cepas de Lactococcus también mostraron, por lo general, baja
actividad proteolítica, con valores inferiores a 0,5 mM Gly L-1, únicamente la
cepa SS 194 de Lactococcus lactis presentó valores de 0,80 mM Gly L-1. Estos
valores fueron inferiores a los detectados por diversos autores en cepas de
lactococos aisladas de quesos tradicionales con distintos orígenes (Centeno y
col., 1996; Herreros y col., 2003; Garabal y col., 2008 y González y col., 2010)
pero similares a los detectados por Mayo y col. (1990) en las cepas de
lactococos aisladas del queso Cabrales.
Los valores de actividad proteolítica detectados para Lactobacillus
difirieron considerablemente entre cepas. Una cepa de Lb. casei subsp casei
(SS 263) y una de Lb. paracasei (SS 1661) mostraron actividad proteolítica
inferior a 0,1 mM Gly L-1; 6 cepas presentaron una actividad comprendida entre
0,1 y 0,5 mM Gly L-1, una cepa de Lactobacillus casei subsp. casei (SS 1615) y
cuatro de Lb. paracasei (SS 1644, SS 1770, SS 1778 Y 1785 y SS 1689) y una
cepa de Lb. casei. subsp. rhamnossus (SS 1684). Dos cepas mostraron valores
___________________________________________________Resultados y Discusión
139
de actividad proteolítica en torno a 0,5 mM Gly L-1 , una de Lb. casei subsp.
casei (SS 1614) y una de Lb. paracasei (SS 1695). Solamente una de ellas la
SS1689 de Lb. paracasei originó valores más altos (1,6 mM Gly L-1).
En líneas generales los valores de actividad proteolítica hallados para
las cepas de Lb. casei fueron similares a los obtenidos por Herreros y col.
(2003) y Garabal y col. (2008) para el queso Genestoso y otros quesos
gallegos, respectivamente. Pérez y col. (2003) para el queso de Tenerife
también detectaron una baja actividad proteolítica entre la mayoría de las
cepas de bacterias lácticas aisladas, siendo los lactococos los que presentaron
la mayor actividad proteolítica en la leche, al igual que refieren Requena y col.
(1991) y Centeno y col. (1996) respecto a los lactococos aislados del queso
Majorero y del queso Arzúa, respectivamente. En cambio, se detectaron
mayores valores de actividad proteolítica entre algunas cepas de lactobacilos
aisladas del queso de Arzúa (Centeno y col., 1996) y de quesos tradicionales
de Argelia (Badis y col., 2004). Otros estudios adjudican también mayor
actividad proteolítica para la mayoría de los lactobacilos en comparación con
los lactococos y los enterococos (Ayad y col., 2004).
Los lactococos son usualmente microbiota dominante durante las
primeras semanas de la maduración de los quesos. Sin embargo, la población
láctica no-starter perteneciente al género Lactobacillus ve incrementada su
densidad durante las últimas etapas de la maduración, contribuyendo así a la
proteolisis y al desarrollo del aroma (Peterson y Marshall, 1990).
La actividad proteolítica de los lactococos se debe fundamentalmente a
sus exopeptidasas (Visser, 1993; Tan y col., 1993), que pueden ser muy
activas debido posiblemente a que su localización es extracelular, si bien
varían mucho entre especies y cepas. También se ha descrito que estos
___________________________________________________Resultados y Discusión
140
microorganismos poseen proteasas intracelulares (Law y Kolstad, 1983;
Ichishima y col., 1986; Muset y col., 1989; Chapot-Chartier y col., 1994) pero su
acción parece estar más restringida, debido a que es necesaria la autolisis para
la liberación de las enzimas. Se sabe que poseen al menos 2 endopeptidasas,
que pueden hidrolizar los péptidos liberados de las caseínas que contengan
hasta 34 residuos, y 3 aminopetidasas (una aminopeptidasa, PepN, una
glutamil/aspartil-aminopeptidasa, PepA, y una tiol aminopeptidasa, PepC),
además de una peptidilaminopeptidasa, PepX. Poseen también una
tripeptidasa y 3 dipeptidasas, una general, y 2 especificas para la prolina
(prolinasa, ProX y prolidasa, Xpro) por lo que los lactococos pueden
metabolizar péptidos ricos en prolina. Sorprendentemente, no poseen ninguna
carboxipeptidasa. Los lactobacilos también poseen un variado equipo
enzimático, que en el caso de las especies mesófilas está principalmente
constituido por exopeptidasas, mientras que las termófilas poseen además
endopeptidasas plasmáticas muy importantes (El-Soda y col., 1978; Turner y
col., 1983). Se puede afirmar que, por lo general, los lactobacilos son más
proteolíticos que los lactococos (Castberg y Morris, 1976) y de ellos, las
especies termófilas más que las mesófilas (Bartels y col., 1987).
En el caso de Enterococcus, dos de las tres cepas SS 1378 y SS 1449
respectivamente liberaron grupos amino en elevadas concentraciones de 1,8 y
1,3 mM Gly L-1.
Durlu-Ozkaya y col. (1991) detectaron la mayor actividad proteolítica
entre cepas de Enterococcus y de Lactococcus, siendo los lactobacilos, en
general, los que exhibieron la actividad más baja.
Los enterococos juegan un papel importante en la maduración y
desarrollo del aroma de los quesos, debido a su actividad proteolítica y
esterolítica, así como a la producción de diacetilo y otros compuestos volátiles
___________________________________________________Resultados y Discusión
141
(Jensen y col., 1975 a, b; Ordóñez y col., 1978; Trovatelli y Schliesser, 1987;
Centeno y col., 1996, 1999; Casalta y Zennaro, 1997; Franz y col., 1999, 2003;
Sarantinopoulos y col., 2001 a, b). En general, las cepas de E. faecalis subsp.
liquefaciens son altamente proteolíticas, ya que poseen sistemas proteolíticos
extracelulares y endocelulares que participan en la degradación de las s1 y -
caseínas, liberando péptidos y polipéptidos.
Sin embargo, la excesiva actividad proteolítica de algunas especies,
principalmente dirigida sobre la s1-caseína y la -caseína, llega a ocasionar en
los quesos defectos de textura y sabores amargos debido a la intensa
liberación de péptidos y polipéptidos, pudiendo incluso tener lugar a
temperaturas de refrigeración. No es infrecuente que se planteen estos
problemas ya que la especie más frecuentemente aislada en los quesos es
Enterococcus faecalis y sus variedades y, concretamente cepas de E. faecalis
var. liquefaciens que poseen un gran potencial enzimático, pudiendo provocar
una intensa proteolisis con la consiguiente liberación de compuestos amargos.
De hecho, la proteolisis que sufren ciertos quesos elaborados con leche cruda
se atribuye a la presencia de cepas de esta variedad que producen proteinasas
con actividad hidrolítica sobre las caseínas y otras proteínas de la leche. No
obstante, también se pueden producir defectos de textura y de sabor debido a
cepas de la especie E. faecium. Por ello, para una correcta selección de las
cepas, deberían ser evaluadas completamente todas sus características.
Algunos autores han observado una relación entre la actividad
proteolítica evaluada mediante el test OPA y la actividad acidificante de
algunas bacterias lácticas, como los lactococos (Mayo y col., 1990; Requena y
col., 1991; Centeno, 1993), aunque en otros casos no pudo comprobarse
ninguna relación (Durlu-Ozkaya y col 1991). Nuestros resultados pusieron de
manifiesto que ambas propiedades son características de cada cepa.
___________________________________________________Resultados y Discusión
142
III.7.3. Actividad enzimática de las bacterias lácticas aisladas del
queso San Simón da Costa.
Las actividades enzimáticas de las 20 cepas seleccionadas (3
Lactococcus lactis, 3 Lactobacillus casei subsp. casei, 7 Lactobacillus
paracasei, 1 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, 3 Leuconostoc
paramesenteroides y 3 Enterococcus faecalis) aisladas del queso San Simón
da Costa elaborado de forma artesanal, evaluadas mediante el sistema API-
ZYM se muestran en la Tabla XVII.
No se detectó actividad fosfatasa alcalina en ninguna de las cepas
ensayadas, lo que parece ser común en el caso de las bacterias lácticas
(Tzanetakis, N. y Litopoulou-Tzanetaki, 1989; Karakus 1995).
La baja o nula actividad lipasa es frecuente entre varias cepas de
bacterias lácticas (Requena y col., 1991; Menéndez y col., 2001; Herreros y
col., 2003).
Ninguno de los microorganismos mostró actividades para las siguientes
enzimas: tripsina, β glucuronidasa, N-acetil-β-glucosaminidasa, α-mannosidasa
y α-fucosidasa. Resultdos similares han sido descritos en el caso de cepas de
Lactococcus lactis aislados del queso Arzúa-Ulloa por Menéndez y col. (1998).
La actividad lipasa sólo fue detectada en la cepa SS 1778 de
Lactobacillus paracasei, alcanzando valores inferiores a 5 nmol de sustrato
hidrolizado.
___________________________________________________Resultados y Discusión
143
Tabla XVII.- Actividad enzimática1 (valores aproximados), detectados por medio del sistema API-ZYM, de células enteras
de 20 cepas de bacterias lácticas aisladas del queso San Simón da Costa
Cepas Enzimas ensayadas2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Lactococus lactis subsp lactis
SS 193 - 5-10 10 - 20 - 5 - 5 10 5 - - - - - - - -
SS 194 - 5 10 - 40 5 5 - 5 10 5 - - - - - - - -
SS 287 - <5 <5 - 30 - - - - 40 5 - - - - - - - -
Lactobacillus casei subsp. casei
SS 1614 - 5-10 10 - 40 10-20 - - <5 5 10 - - - 20 - - - -
SS 1615 - 10-20 20 - 40 40 20 - - 5 20 - - - 20 - - - -
SS 263 - 20 30 - 40 40 - - - 10 20 - 10 - 40 - - - -
Lactobacillus paracasei
SS 1644 - 10 10 - >40 >40 5 - 5 20 40 - 20 - >40 5 - - -
SS 1661 - 20 20 - ≥40 ≥40 5 - 5 20 30 - 30 - ≥40 5 - - -
SS 1695 - 10 10 - >40 >40 5 - 5 20 30 - 20 - 30 - - -
SS 1689 - 10-20 10 - 5 - - - - 5 5 - - - - - - - -
SS 1770 - 10-20 10-20 - 40 20 10 - 5 10 20 - <5 - 10 - - - -
SS 1778 - 20 10 <5 40 40 5 - - 5-10 20 - <5 - 30-40 - - - -
SS1785 - 10-20 10 - 40 40 - - - 5 20 - - - 40 - - - -
Lb. casei subsp. rhamnosus SS 1684 - 10 10 - 30 - - - - 20 30-40 - 10-20 - 40 - - - -
Leuconostoc mesenteroides
SS 1435 - 10-20 5-10 - 5 - - - - 5-10 20 10 10-
20
- 40 - - - -
SS 1437 - 10 10 - 20 - - - - 5 10 - - - - - - - -
SS 1464 - - - 5 - - - - 20 - 20 5 - 30-40 - - - -
Enteroccocus faecalis
SS 1378 - 20 20 - 30 - 5 - - 5 - - 5 - - - - - -
SS 191 <5 20 5 - 30 5 10 - 20 20 5 - 5 - 5 - - - -
SS 1449 - 20 10 - - - 0-5 - 5 5 5 - - - - <5 - - -
1Actividad enzimática (valores aproximados) expresada como nmol de sustrato hidrolizado. 2Enzimas ensayadas: 1.- Fosfatasa alcalina. 2.-Esterasa (C4). 3.- Esterasa lipasa (C8). 4.- Lipasa (C14). 5.- Leucina arilamidasa. 6.-
Valina arilamidasa. 7.- Cistina arilamidasa 8.- Tripsina. 9.- -Quimotripsina. 10.- Fosfatasa ácida. 11.- Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa. 12.-
-galactosidasa. 13.- -galactosidasa. 14.- -glucuronidasa. 15.- -glucosidasa. 16.- -glucosidasa. 17.- N-acetil--glucosaminidasa, 18 .- α-mannosidasa, 19.- α-fucosidasa.
___________________________________________________Resultados y Discusión
144
Las actividades esterasa y esterasa lipasa resultaron diferentes en
función de los grupos y cepas ensayados siendo en líneas generales los
Lactococcus los que presentaron los valores más bajos y en el caso de la
actividad esterasa Enterococcus faecalis los valores más altos.
Las variaciones encontradas entre las actividades que presentan las
diferentes cepas podrían explicar los diferentes resultados obtenidos en los
estudios previos sobre las esterasas de bacterias lácticas y apoyan la
necesidad de realizar una selección adecuada de los cultivos iniciadores o
cultivos adjuntos para su uso en la elaboración de quesos o para acelerar la
maduración (Katz y col., 2003).
La actividad esterasa lipasa más elevada (alrededor de 20 nmol de
sustrato hidrolizado) fue observada para dos de las cepas de Lb. casei subsp
casei (SS 1615 y SS 263), dos de Lb. paracasei (SS 1661 y SS 1770) y una de
Enterococcus faecalis (SS 1378).
El hecho de que los lactobacilos presenten actividades esterasas más
elevadas que los lactococos ha sido descrito previamente por Gobbetti y col.,
(1996) para el queso Crescenza y por Herrero y col. (2003) para el queso
Armada.
Las esterasas forman parte del grupo de las hidrolasas (carboxil éster
hidrolasas) llevando a cabo la hidrolisis preferentemente sobre los ésteres que
contienen ácidos grasos C4 - C6 (El Soda y Ezzat, 1993; Collins y col., 2003),
por lo que estas actividades son interesantes en el starter láctico por su papel
determinante del aroma.
En conclusión, las cepas aisladas del queso San Simón da Costa, a
excepción de las de Lactococcus lactis y una cepa de Leuconostoc
mesenteroides presentaron una actividad lipolítica que podría considerarse
___________________________________________________Resultados y Discusión
145
adecuada, aunque también hay que considerar que bajos niveles de actividad
lipolítica en las cepas del cultivo iniciador pueden tener importancia en el
desarrollo del aroma en los quesos, debido al bajo umbral de detección de los
compuestos que se derivan de la acción lipolítica y al largo proceso madurativo
que experimentan algunos. La actividad esterasa de las bacterias lácticas es
fundamentalmente intracelular como han señalado varios autores (El Soda y
col., 1986; Khalid y Marth, 1990; Lee y Lee, 1990; Oliszewski y col., 2007),
aunque en otros casos se ha señalado que en las cepas de lactobacilos y
lactococos puede haber esterasas ligadas a la pared celular (Ezzat y col., 1993;
Crow y col., 1994) que llegan a actuar tras la lisis celular.
La actividad fosfatasa ácida, enzima necesaria para la hidrolisis de
fosfopeptidos (Fox y McSweeney 1996), alcanzó valores muy variables que
oscilaron entre 5 y 20 nmol de sustrato hidrolizado, aunque una de las cepas,
la SS 287 de Lactococcus lactis llegó a alcanzar valores de 40 nmol.
Estos resultados concuerdan con los previamente descritos en cepas de
bacterias lácticas que participan en la maduración de otros quesos, como el de
Armada, (Herreros, 2003), el de Tetilla (Menéndez y col., 2001) o en quesos de
cabra (Tzanetaki y Litopoulou - Tazanetaki, 1989). Una elevada actividad
fosfatasa exhibida por cepas de bacterias lácticas puede tener relevancia en su
aplicación para la degradación de los fitatos (Palacios y col., 2008).
La actividad leucina aminopeptidásica fue detectada en todas las cepas,
comprobándose una importante actividad (del orden de 40 nmoles de sustrato
hidrolizado) en la mayoría de las cepas de Lactobacillus casei, nivel
comparable al obtenido por Requena y col. (1991) y Karakus (1995). Para
estas cepas se observó adicionalmente una elevada actividad valina
aminopeptidásica, que no fue detectada en el resto de las cepas ensayadas.
___________________________________________________Resultados y Discusión
146
La presencia de fuerte actividad leucina aminopeptidásica detectada en
la mayoría de las cepas de bacterias lácticas aisladas del queso San Simón da
Costa es deseable para su utilización como starters, con el fin de producir el
típico aroma de los productos lácteos en cuya transformación/maduración
intervienen (Dewan y Tamang, 2007).
De hecho las peptidasas microbianas pueden también disminuir el
amargor al hidrolizar péptidos amargos formados en los quesos (Tan y col.,
1993; Sasaki y col., 1995; Cuesta y col., 2001)
En las cepas de Lactococcus y Leuconostoc no se detectó actividad
cistina-arilamidasa siendo muy baja en los otros casos y solo alcanzó cierta
relevancia (20 nmoles de sustrato hidrolizado para la cepa de Lactobacillus
casei subsp. casei (SS 1615). Dako y col. (1995) Herreros y col. (2003)
también detectaron una mayor actividad aminopeptidasica en las cepas de
Lactobacillus casei subsp. casei con respecto a los lactococos y principalmente
dirigida frente a los sustratos Lys y Leu.
La mayor actividad aminopeptidásica detectada por Pérez y col. (2003)
entre los aislamientos de bacterias lácticas procedentes del queso de Tenerife
correspondió también a los lactobacilos. Por su parte, Asteri y col. (2009)
detectaron la mayor actividad peptidolítica entre cepas de lactobacilos
termófilos y cocos termófilos.
Actividades valina-aminopeptidásicas nulas o muy bajas y cistino-
aminopeptidasa débiles han sido también detectadas mediante el uso del
sistema API - ZYM para otras cepas de Lactococcus aisladas de productos
lácteos (Tznanetakis y Litopoulou-Tzanetaki 1989; Requena y col., 1991; Fox y
Mc Sweeney, 1996).
___________________________________________________Resultados y Discusión
147
En las bacterias lácticas se han podido identificar varias peptidasas con
diferentes especificidades, aunque la mayor actividad aminopeptidasa en
muchas cepas de NSLAB se dirige hacia sustratos conteniendo un aminoácido
básico (Lys o Arg) (Williams y Banks, 1997), siendo frecuente detectar muy
baja o ninguna actividad aminopeptidasa hacia los sustratos conteniendo
aminoácidos hidrofóbicos (Gly-pNA, Ala-pNA, Leu-pNA y Pro-pNA) (Williams et
al., 1998; Macedo y col., 2000; Herreros y col., 2003) siendo más activas frente
a Lys-pNA que hacia el resto de sustratos con características hidrofóbicas
(Ztaliou y col., 1996). Todas las peptidasas identificadas fueron intracelulares y
se liberaron en los productos lácteos fermentados después de la lisis celular
(Law y Haandrikman, 1997; Axelson, 1998). Los aminoácidos producidos
contribuyen de forma directa o indirecta al aroma básico del queso ya que son
a su vez precursores en otras reacciones catabólicas con producción de
compuestos volátiles responsables del aroma (Fox y Wallace, 1997).
Por lo que respecta a la actividad enzimática sobre los hidratos de
carbono, la mayoría de las cepas de los géneros Lactobacillus y Leuconostoc
mostraron una elevada actividad α-glucosidasa (30 a 40 nmol sustrato
hidrolizado), mientras que dicha actividad no fue detectada en cepas de
Lactococcus lactis, y resultó mínima en Enterococcus faecalis.
La actividad β-galactosidása se detectó en las cepas de lactobacilos, lo
que era de esperar, sobre todo si tenemos en cuenta que la β-galactosidasa es
el principal enzima del que disponen los lactobacilos homofermentativos para la
transformación de la lactosa en ácido láctico. Lactobacillus casei y L. plantarum
pueden fermentar la lactosa gracias a su actividad β-galactosidasa pero
algunas cepas también muestran una actividad β-fosfo-galactosidasa (Herrero
col., 1996). En nuestro caso, sólo dos cepas de Lactobacillus paracasei
mostraron una baja actividad del orden de 5 nmoles, y fue nula en 4 de ellas.
___________________________________________________Resultados y Discusión
148
Dewan y Tamang (2007) detectaron una elevada actividad β-
galactosidasa entre las cepas de bacterias lácticas aisladas de diversos
productos lácteos fermentados, lo que posibilita que los productos lácteos
elaborados con dichas cepas puedan ser susceptibles de consumo por
personas intolerantes a la lactosa (Mathara y col., 2004).
___________________________________________________Resultados y Discusión
149
III.8.- CRITERIOS DE SELECIÓN DE LAS CEPAS DE
BACTERIAS LÁCTICAS AISLADAS DEL QUESO SAN SIMÓN
DA COSTA.
Los resultados obtenidos, al considerar de forma global la aptitud
tecnológica de las 20 cepas estudiadas, teniendo en cuenta los niveles
alcanzados por las actividades acidificante, proteolítica, lipolítica y
aminopeptidásica, se muestran en la Tabla XVIII. La intensidad relativa de las
actividades enzimáticas alta, media y baja fue asignada considerando los
valores máximo y mínimo entre los que fluctuaba cada actividad ensayada.
En relación a la capacidad acidificante, se asignaron valores altos a
aquellas cepas que redujeron el pH a valores inferiores a 6,0 a las 6 h de
incubación y que al cabo de 24 h produjeron un descenso del pH a valores
inferiores a 5,0 e incrementaron la acidez titulable de la leche por encima de
0,50 g ácido láctico / 100 mL leche. Se asignó una capacidad acidificante
media cuando cumplían uno de los dos criterios. En general, todas las cepas
presentaron valores medios-bajos, excepto dos cepas de Lactococcus lactis
(SS 194 y SS 287) y una de Enterococcus faecalis (SS 1378)
La actividad proteoítica se consideró alta en aquellas cepas que
originaron cantidades superiores a 0,6 mM de glicina/L de leche, media cuando
oscilaba entre 0,4 y 0,6 mM y baja cuando era inferior a 0,4 mM de glicina/L de
leche. La mayoría de las cepas presentaron una actividad proteolítica media-
baja, excepto en una cepa de Lactococcus lactis (SS 194), dos de
Lactobacillus paracasei (SS 1695 y SS 1689) y dos de Enterococcus faecalis
(SS 1378 y SS 1449).
___________________________________________________Resultados y Discusión
150
Respecto a la actividad lipolítica se consideraron las actividades
esterasa y esterasa lipasa (C8). Se consideró alta con un valor de 20 nmol de
sustrato hidrolizado en una de estas actividades y al menos 10 nmoles de
sustrato en la otra y media si ambas actividades alcanzaban los 10 nmol de
sustrato hidrolizado o una de ellas lo superaba. En este caso, diez de las cepas
estudiadas que fundamentalmente pertenecieron a Lactobacillus casei subsp.
casei, Lactobacillus paracasei y Enterococcus faecalis, presentaron valores
altos, siete valores medios y dos de ellos, los Lactococcus lactis (SS 194 y SS
287), valores bajos no mostrando actividad alguna Leuconostoc mesenteroides
(SS 1464).
La actividad aminopéptidasa se consideró alta cuando se detectó
actividad leucina, valina y cistina arilamidasa y media cuando solo se detectó
para dos de ellas.
En líneas generales, las cepas de Lactobacillus presentaron actividad
aminopeptidása más alta, siendo prácticamente inexistente en el caso de los
Leuconostocs, y dependiente de la cepa en Lactococcus lactis y Enterococcus
faecalis.
En resumen algunas de las cepas autóctonas de bacterias lácticas
ensayadas en este estudio pueden jugar un papel importante en la elaboración
y maduración del queso San Simón da Costa, contribuyendo a la acidificación
de la leche y de la cuajada y a la formación de aromas y sabores como
consecuencia de su actividad proteolítica y/o lipolítica.
Si consideramos los niveles relativos de aptitud tecnológica de las cepas
de bacterias lácticas aisladas del queso San Simón da Costa (Tabla XVIII), se
podrían seleccionar para diseñar un cultivo iniciador destinado a la elaboración
de este queso con leche pasterizada las siguientes cepas: Lactococcus lactis
___________________________________________________Resultados y Discusión
151
subsp. lactis (SS 194) y Enterococcus faecalis (SS 1378). Como co-cultivos se
podrían incluir algunas de las siguientes: Lactobacillus casei subsp. casei (SS
1615) y Lactobacillus paracasei (SS 1695, SS 1770 y SS 1778).
No obstante y previamente a su utilización es preciso completar otros
estudios relativos a la ausencia de patogenicidad de las cepas, en especial en
referencia a E. faecalis, así como la resistencia a antibióticos de las cepas
seleccionadas o la capacidad de producir aminas biógenas.
Los estudios de compatibilidad entre cepas y de resitencia a los
principales fagos que comprometen los cultivos lácticos continuarán y
completarán esta línea de investigación.
___________________________________________________Resultados y Discusión
152
Tabla XVIII. Niveles relativos de la aptitud tecnológica (actividades acidificante,
proteolítica, lipolítica y aminopeptidasa) de las bacterias lácticas aisladas del
queso de San Simón da Costa.
Cepa
Actividad 1
acidificante Actividad
2
proteolítica
Actividad enzimática
Lipolítica 3 Amino-peptidása
4
Lactococcus lactis subsp. lactis
SS 193 Media Baja Media
B
B
M
A
A
M
A
M
A
Media
AM
MB
AM
MA
-A
AA
MA
AA
SS 194 Alta Alta Baja Alta
SS 287 Alta Media Baja Baja
SS 1614 Baja Media Media Media
Lactobacillus casei subsp. casei
SS 1615 Media Baja Alta Alta
SS 263 Media Baja Alta Media
SS 1644 Media Baja Media Alta
SS 1661 Baja Baja Alta Alta
Lactobacillus paracasei
SS 1695 Baja Alta Media Alta
SS 1689 Baja Alta Alta -
SS 1770 Media Media Alta Alta
SS 1778 Media Baja Alta Alta
SS 1785 Media Media Alta Media
Lactobacillus casei
subsp. rhamnosus SS 1684 Baja Baja Media Baja
Leuconostoc
mesenteroide
SS 1435 Baja Baja Alta -
SS 1437 Baja Baja Media Baja
SS 1464 Baja Baja - -
Enterococcus
faecalis
SS 1378 Alta Alta Alta Media
SS 191 Media Media Media Alta
SS 1449 Baja Alta Alta -
1. Alta: valores de pH < 6,0 a las 6 h, de 5,0 a las 24 h. y AT > 0,5 de ácido láctico/100 g de queso. Media: Si cumplen dos de estos criterios. 2. Alta: > 0,6 mM Gly L
-1. Media: 0.4-0.6 mM Gly L
-1. Baja: < 0.4 mM Gly L
-1
3. Actividades esterasa y estarasa lipasa. Alta: > 20 nmol de sustrato hidrolizado en una de ellas o > 10 en ambas. Media: 10-20 nmol de sustrato hidrolizado en una de ellas. 4. Actividades leucina, valina y cistina- arilamidasa: Alta: en las 3 enzimas. Media: Actividad en 2.
Co
nclu
sio
ne
s
Conclusiones
153
CONCLUSIONES:
1.- Los recuentos obtenidos en todos los medios fueron por lo general 1
unidad logarítmica superiores en las muestras de la porción profunda, a
excepción de los correspondientes a la microbiota halotolerante, y a los mohos
y levaduras.
Los recuentos máximos, tanto en la porción superficial como en la
profunda se alcanzaron a la semana de maduración, excepto los obtenidos en
los medios agar MSE, agar Rogosa y agar OGYEA, que se observaron a las 4
semanas, lo que está en concordancia con la evolución experimentada por los
parámetros físico-químicos.
2.- Las bacterias lácticas constituyeron el grupo microbiano mayoritario
durante la elaboración y maduración del queso San Simón da Costa,
perteneciendo las especies dominantes a los géneros Lactococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc y Enterococcus.
3.- Como resultado de la identificación de las 495 cepas aisladas de la
porción profunda y superficial de los quesos se encontró un predominio del
género Lactobacillus que representó al término de la maduración un 78% de las
cepas identificadas aisladas en agar Rogosa, en torno al 40% en agar M17 y
alrededor del 10% en agar MSE, siendo la especie dominante Lb. casei subsp.
casei, que supuso un 35%.
Conclusiones
154
Al género Enterococcus pertenecieron un 51% de las cepas identificadas
aisladas en agar MSE, un 36% de las procedente de agar M17, y un 13% de
las de Agar Rogosa, siendo adscritas, en torno al 80% a Enterococcus faecalis.
El mayor porcentaje de Leuconostoc (en torno al 50%) fue obtenido a
partir de los aislamientos efectuados en agar MSE, siendo Leuconostoc
mesenteroides la especie mayoritariamente aislada, representando
aproximadamente el 55%.
El porcentaje de cepas adscritas al género Lactococcus fue bajo, el 12%
de las identificadas aisladas en Agar MSE, el 8,5% en Agar M17 y el 7,5% en
Agar Rogosa, siendo la especie predominante Lactococcus lactis subsp.
cremoris, con un porcentaje del 67%.
4.- La identificación de las cepas empleando la metodología clásica y las
técnicas moleculares coincidió en un 100% para las cepas de Lactococcus
lactis subsp. lactis, Lactobacillus casei subsp. casei, Lb. casei subsp.
rhamnosus y Leuconostoc mesenteroides. Con respecto a las cepas adscritas
a la especie Lactobacillus paracasei, aunque la adscripción coincidió en un
100% a nivel de género, previamente habían sido adscritas a la especie Lb.
casei. Finalmente para Enterococcus faecalis la adscripción coincidió en un
67%.
5.- Aunque prácticamente todas las cepas estudiadas (17 de 20) dieron
lugar a la producción de una cantidad de ácido láctico superior o igual a 0,24
g/100 mL de leche, sólo cinco cepas, dos de Lactococcus lactis subsp. lactis,
una de Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, una de Leuconostoc
Conclusiones
155
mesenteroides y otra de Enterococcus faecalis produjeron un descenso del pH
a valores inferiores a 6,0 al cabo de 6 horas.
6.- Las cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis (SS 194), Lactobacillus
paracasei (SS 1695 y SS 1689) y Enterococcus faecalis (SS 1378 y SS 1449)
exhibieron la capacidad proteolítica más elevada.
La actividad lipolítica más elevada, evaluada mediante la técnica API -
ZYM, se observó en las cepas de Lactobacillus y Enterococcus.
7.- Considerando de forma global la aptitud tecnológica de las cepas
ensayadas, podemos llegar a proponer un cultivo iniciador para la elaboración
del queso San Simón da Costa a partir de leche pasterizada que debería incluir
las cepas de Lactococcus lactis subps lactis (SS 194), de Enterococcus faecalis
(SS 1378). Como cultivos adjuntos podrían ser adecuadas las cepas de
Lactobacillus casei subsp casei (SS 1615) o alguna de Lactobacillus paracasei
(SS 1695, SS 1770, SS 1778).
Bib
lio
gra
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