practicas de microbilogia para el estudio de microorganismos
DESCRIPTION
aislamiento de colonias por diferentes métodos para una buena observación de las características tanto morfológicas como microscopias.TRANSCRIPT
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
55
PRACTICA Nº 4
I. COMPORTAMIENTO CULTURAL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
II. INTRODUCCION
Los estudios de microorganismos en el laboratorio se realizan con cultivos puros, es
decir con una sola especie de microorganismos el cual es inoculado en medios
sólidos y líquidos estériles que aseguren la pureza del cultivo.
Las muestras desde las cuales se les quiere aislar los microorganismos son complejas
presentan una gran variedad, es de aquí donde se toma una alícuota o inóculo y se
transfiere a un medio estéril que generalmente es un medio líquido siempre bajo
condiciones asépticas.
Para obtener cultivos puros de microorganismos se requiere de pasajes sucesivos de
medios líquidos a sólidos o viceversa hasta lograr UFC los suficientemente aisladas
que permitan su pureza.
La pureza de estos cultivos permite estudiar sus características que presentan en los
diferentes medios en los cuales se les cultiva, que pueden ser sólidos o líquidos.
Siguiendo el orden de los estudios microbianos in vitro de morfología celular y de colonias
como caracteres de especies o grupos bacterianos, el alumno observará en esta práctica
las características culturales de 4 cepas con comportamiento característico diferencial en
caldo nutricio, agar en plano inclinado y agar en columna. Cada carácter varía según las
necesidades metabólicas y de multiplicación de las especies o grupos bacterianos y en
parte ayuda a la identificación.
OBJETIVO
- Estudiar el comportamiento de los microorganismos aislados previamente en
medios de cultivo y comprobar la pureza de los mismos.
III. MATERIALES
1.- Cepas puras de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus, Pseudomonas,
Saccharomyces, Aspergillus y Penicillium codificadas de 24 a 48 horas de incubación.
2.- Tubos de ensayo con caldo nutritivo.
3.- Placas con agar nutritivo y agar sabouraud.
4.- Placas con agar papa dextrosa.
5.- Tubos con agar nutritivo semisólido en columna.
6.- Asa de siembra, gradilla, plumón.
7.- Batería Gram: cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, fucsina fenicada de Ziehl. Láminas
portaobjetos, cubreobjetos limpias, papel lente.
8.- Microscopio, aceite de inmersión y alcohol 70º.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
56
IV. PROCEDIMIENTO:
1. Replicación de líquido a líquido
1. Tomar el cultivo de bacterias con la mano izquierda y destapar con el dedo meñique de
la mano derecha a la altura del mechero.
2. Con el asa de Kohle previamente flameada al fuego extraer una alícuota del
inóculo.
3. Tapar el tubo y colocarlo en la gradilla
4. Depositar el inóculo en el nuevo tubo de caldo nutritivo agitando, flamear la boca
del tubo al mechero y taponar.
5. Esterilizar el asa al mechero
6. Rotular e incubar a 28 – 30º.
2. Replicación de líquido a sólido
1. Repetir los pasos (1), (2) y (3) de la técnica anterior.
2. Tomar con la mano izquierda la placa con agar, destapar la placa a la altura del
mechero, introducir el asa y realizar estrías en zigzag con el inóculo en la superficie del
medio.
3. Cerrar la placa y flamear el asa de siembra.
4. Rotular e incubar a 28 – 30º.
V. CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS
1. COMPORTAMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO:
Mediante el siguiente cuadro se sintetizarán los caracteres de comportamiento macroscópico en un medio líquido.
CUADRO I
CANTIDAD DE TURBIEDAD DESARROLLO EN OLOR DESARROLLO SUPERFICIE
Abundante Homogénea - Formación de película, ninguno De naturaleza: Gomosa, lisa, Corrugada, escamosa Membranosa, Costrosa Moderado En grumos finos - Sin película: desarrollo Fecaloide, en anillo Escaso En grumos gruesos Aromático Nulo Algodonoso Parecido a.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
57
2. COMPORTAMIENTO EN MEDIO SÓLIDO:
La lectura se hará en base a un desarrollo masivo en capa sobre la superficie del medio. Los
caracteres diferenciales son idénticos a los de las colonias.
CUADRO II
CANTIDAD DE FORMA TEXTURA DE CONSISTENCIA
DESARROLLO SUPERFICIE
Abundante Filiforme Lisa Cremosa
Moderado Difusa o Confluente Granular Butirosa
Escaso Arborescente Escamosa Viscosa o vidriosa
Nulo Rizoide Membranosa Gomosa o mucosa
Perlada Papulosa Membranosa
Toruloide Corrugada Algodonosa
Costrosa
Verrucosa
Lacerada
BRILLO TRANSPARENCIA CROMOGENESIS ASPECTO DEL MEDIO OLOR
Vivo Opaca Amarillo limón Inalterado Ninguno
Apagado Opalescente Amarillo oro Grisáceo Fecaloide
Opaco Transparente Amarillo pálido Negruzco Sui generis
Anaranjado Enrojecido Aromático
Azulado Verdoso
Verde amarillento Fluorescente
Verde azulado Lechosa
Rojizo Opalescente
Anotar y realizar la discusión de los resultados obtenidos.
3. COMPORTAMIENTO EN MEDIO SEMISÓLIDO (B. EN COLUMNA)
El crecimiento semisólido se define a lo largo del trazo de siembra por puntura y también
de acuerdo al tipo de multiplicación celular en la profundidad del medio. Permite además la
lectura de la MOTILIDAD MACROSCOPICA de la bacteria a las 24 ó 48 horas. De
incubación.
1. Repetir los pasos (1), (2) y (3) de la técnica N°1.
2. Tomar con la mano izquierda el tubo con agar semisólido, destapar el tubo con el
dedo meñique de la mano derecha a la altura del mechero, e inocular en el agar la
muestra introduciendo el asa (usando alambre de micrón en punta) hasta la zona
media del tubo.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
58
3. Flamear la boca del tubo, flamear el asa y colocar el tubo en la gradilla.
4. Rotular e incubar a 28 – 30º por 48 horas.
CUADRO III
DESARROLLO EN PUNTURA ASPECTO DEL MEDIO MOTILIDAD
Filiforme Inalterado Crecimiento difuso
Parcial o total del
Microorganismo por
Toda la columna de
Agar: BACTERIA MOVIL
Granular Grisáceo Crecimiento
Circunscrito al trazo
De siembra: BACTERIA
NO MOVIL
Perlado Negruzco
Claviforme Enrojecido
Rizoide Verduzco
En pino invertido Lechoso
Arborescente Fluorescente
Velloso Opalescente
VI. COLORACIÓN GRAM DE LAS CEPAS
Hacer tinción de cada cepa, sea de caldo o de agar.
Hacer esquemas de las observaciones.
VII. PRESENTACIÓN DE INFORME
Con los resultados obtenidos de la caracterización morfológica de las colonias, movilidad
bacteriana, respiración celular, tinción gram y morfología celular además del uso de
bibliografía adecuada e identificar el nombre correspondiente (género y especie o solo
género) de cada una de las cepas estudiadas de las cepas puras Bacillus, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Sacharomyces presentadas en la práctica. Presentar su discusión de
resultado.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
59
VIII. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la razón de utilizar cultivos puros para el estudio morfológico?
2. ¿La morfología de los microorganismos varia con el medio de cultivo. Por qué?
3. ¿Cuál es el fundamento de la cromogénesis?
4. ¿Cuál es el fundamento de la fluorescencia en los microorganismos?
Tabla I
Comportamiento Cultural de Bacterias en Medio Sólido
M.O.
Características
Escherichia
coli
Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
sp
Salmonella
sp
Bacillus sp
Cantidad de
desarrollo
Abundante Abundante Abundante Moderado Abundante
Forma Difusa Difusa Difusa Filiforme Filiforme
Textura Lisa Lisa Lisa Lisa Corrugada
Consistencia Cremosa Gomosa Cremosa Cremosa Cremosa
Brillo Mate Brillante Opaca Mate Brillante
Adherencia Moderada Moderada Moderada Debil Moderada
Cromogénesis Ausente Amarillo
dorado
Azul verdoso Ausente Ausente
Aspecto del medio Opalescente Opalescente Fluorescente Opalescente Opalescente
Olor Fecaloide Sui generis Fruta podrida Fecaloide Descompuesto
Coloración gram (-) (+) (-) (-) (+)
Comportamiento Cultural de Bacterias en Medio Líquido
M.O.
Características
Escherichia
coli
Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
sp
Salmonella
sp
Bacillus sp
Cantidad de
desarrollo
Abundante Homogénea Abundante Moderado Abundante
Turbidez Homogénea Homogénea Homogénea Homogénea Homgénea
Desarrollo
superficie
Sin película Sin película Anillo verde Sin película Sin película
Olor Fecaloide Sui generis Fruta podrida Fecaloide Descompuesto
Sedimento Moderado Moderado Abundante Escaso Ausente
Naturaleza
sedimento
Mucoide Mucoide Grumoso Granular Ausente
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
60
Comportamiento Cultural de Bacterias en medio semi sólido
M.O.
Características
Escherichia coli Staphylococcus
aureus
Pseudomonas
sp
Salmonella
sp
Bacillus sp
Aspecto del medio Opalescente Opalescente Fluorescente Opalescente Opalescente
Motilidad (+) (-) (+) (+) (+)
Comportamiento Cultural de Hongos en medio sólido
M.O.
Características
Saccharomyces
cerevisiae
Candida sp Aspergillus sp Penicillium sp
Cantidad de
desarrollo
Abundante Abundante Moderado Moderado
Forma Perlada Perlada Arborescente Arborescente
Textura Lisa Lisa Corrugadas Corrugada
Consistencia Mucosa Cremosa Algodonosa Algodonosa
Brillo Brillante Brillante Opaca Opaca
Adherencia Débilmente Débilmente Fuerte Fuerte
Cromogénesis Ausente Ausente Azul verdoso Azul negruzca
Aspecto del medio Opalescente Opalescente Opalescente Opalescente
Olor Frutas Frutas Sui generis Sui generis
Comportamiento Cultural de Hongos en Medio Líquido
M.O.
Características
Saccharomyces
cerevisiae
Candida sp Aspergillus sp Penicillium sp
Cantidad de
desarrollo
Abundante Abundante Escaso Escaso
Turbidez Homogénea Homogénea Escaso Escaso
Desarrollo superficie Sin película Sin película Costrosa Costrosa
Olor Frutas Frutas Sui generis Sui generis
Sedimento Moderado Moderado Nulo Nulo
Naturaleza
sedimento
Mucoide Mucoide Nulo Nulo
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
61
Comportamiento Cultural de Hongos en medio semi sólido
M.O.
Características
Saccharomyces
cerevisiae
Candida sp Aspergillus sp Penicillium
sp
Aspecto del medio Opalescente Opalescente Opalescente Opalescente
Motilidad (-) (-) (-) (-)
II. DETERMINACION DEL NUMERO DE MICROORGANISMOS
I. INTRODUCCION
En muchas fases de la microbiología se hace necesario cuantificar el número de
microorganismos que se encuentran en un cultivo o determinar su número en alimentos,
aguas y otros productos.
Los métodos que miden el número de células son importantes para contar el número de
organismos unicelulares como bacterias y levaduras. En la determinación de la masa de
células pueden emplearse para todo tipo de microorganismo.
Existen métodos directos e indirectos:
A) Métodos Directos
1.- Determinación del número de microorganismos
- Recuento microscópico directo
- Recuento en placas
- Número más probable
- Conteo electrónico
- Electrodos de Pt, inmersos en un electrolito. Tamaño de partícula 1- 3 um
1. Contador coulter
2.- Determinación de la masa celular
- Peso seco
- Turbidimetría
- Volumen empacado
B) Estimación indirecta de masa celular
- Cuando el cultivo contiene sólidos no celulares
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
62
Básicamente son valoraciones químicas de los componentes celulares como por ejemplo
nitrógeno, CO2, proteínas, ADN, lípidos, carbohidratos.
Todos los métodos poseen ventajas y desventajas, se hace necesaria la combinación de
varios métodos para tener valores que muestren el número original de microorganismos.
OBJETIVO
• Adiestrar al alumno en los métodos usados en la determinación del número de
microorganismos.
• La cuantificación permitirá determinar la cinética en el caso de los Bioprocesos o el
grado de contaminación de un producto determinado.
II. MATERIALES
• 1 muestra de alimento de expendio público no cocinado (hamburguesa de carne y/o
pollo no cocinada, salsa de ají, cremas, etc.)
• Frascos con 90 ml con agua destilada estéril.
• Placas Petri.
• Tubos con 9 ml de solución salina estéril de 0.85%
• Tubos con 9 ml de caldo lactosa
• Pipetas de 1 y 10 ml
• Tubos con 1 ml de agua destilada estéril
• Gradillas
• Plumón indeleble.
• Mechero
• Encendedor
III. PROCEDIMIENTO
1. Tomar 1 ml ó 1 gr de la muestra problema según sea líquida o sólida y transferir a un
tubo de ensayo con 9 ml de agua destilada estéril, ésta constituirá la dilución 10-1.
2. Realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3, 10-4 en los tubos de agua destilada estéril.
3. Proceder al aislamiento por los métodos descritos abajo.
A) RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE PLACAS:
1. Tomar 1 ml de la dilución de la muestra en condiciones estériles.
2. Destapar con la mano izquierda la placa Petri lo necesario y depositar el inóculo.
3. Colocar la cubierta de la placa Petri.
4. Incorporar 10 a 15 ml del agar respectivo mantenidos a 45° C tapar y describir
movimientos rotatorios a fin de distribuir homogéneamente el inóculo.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Microbiología General y Aplicada
63
5. Rotular e incubar a 28° C.
6. Contar el número de colonias que aparecen al final de la incubación.
7. Realizar los cálculos pertinentes.
UFC/gr o ml = (N° de colonias contadas x FDD) / (volumen de siembra)
FDD: Factor decimal de dilución = 1 / Dilución realizada
8. Realizar la discusión de los resultados obtenidos.
B) RECUENTO DE MICROORGANISMOS COLIFORMES POR EL METODO DEL NUMERO
MAS PROBABLE ( NMP)
1. Tomar 1 ml de la muestra problema y transferir a un tubo con 9 ml de agua destilada
estéril, ésta constituirá la dilución 10-1.
2. Realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3 en los tubos de agua destilada estéril.
3. Tomar 3 tubos con caldo lactosa e inocular 1 ml de la dilución seleccionada a cada
uno, repetir el procedimiento con las otras diluciones tomando siempre 3 tubos para
cada dilución, empezando siempre con la menor dilución.
4. Rotular los datos en los tubos e incubar a 28° C por 48 horas.
5. Verificar este resultado en la tabla II para determinar el número más probable.
IV. PRESENTACIÓN DEL INFORME
Realizar la discusión de los resultados de acuerdo a la procedencia de la muestra problema.
V. CUESTIONARIO
1.- ¿Puede Ud. Medir el crecimiento de hongos por turbidimetría?
2.- ¿En qué casos se emplea la Escala de Mac Farland?
2.- ¿Cuál es la desventaja que presentan los contadores electrónicos?
3.- ¿Cuál es el inconveniente que presenta el recuento directo al microscopio?
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
64
TABLA II
Tabla 1. Índice del NMP para varias combinaciones de resultados positivos y negativos para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con alícuotas de 0.1; 0.01 y 0.001g.
Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag. 5
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
65
PRACTICA Nº 5
ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
Es bien conocido que las actividades vitales de los organismos están condicionadas por su
ambiente. Modificando fundamentalmente estos factores, el organismo bien se adapta a las
nuevas condiciones o en todo caso muere; en esto está implicado la magnitud y el tipo de
cambio operado. Este es el aspecto en el que los microorganismos difieren de las células de
plantas superiores y animales.
El conocimiento de los factores físicos que controlan la supervivencia y multiplicación de los
microorganismos nos sirven como instrumento de control de la actividad bacteriana para
ser esta incrementada, disminuida o destruida completamente.
El tipo de muerte bacteriana por agentes físicos está relacionado al número de bacterias
sobrevivientes, lo que significa que el proceso de desinfección no es repentino sino gradual,
en el que el número de microorganismos muertos por unidad de tiempo es mayor al
principio y mucho menor cuando la acción continúa.
I. EFECTO DE LA TEMPERATURA
Las bacterias son capaces de una capacidad de sobrevivencia amplia con límites de
temperatura variable, su rango de crecer y ejercer sus actividades está entre los 0 y 90°C.
CONDICIONES QUE VARIAN LA MUERTE TÉRMICA:
1. Contenido DE AGUA DEL MEDIO: La muerte bacteriana se genera por coagulación de
las proteínas del protoplasma. Cuanto mayor es el porcentaje de agua en el medio,
menor será la temperatura requerida para matar la bacteria.
2. Contenido de agua de los organismos: A menor cantidad de agua, los
microorganismos se secan y se produce mayor resistencia a la temperatura.
3. Concentración de hidrogeniones: Lo microorganismos mueren fácilmente en
condiciones ácidas o alcalinas, requiriéndose temperaturas menores que en medios
neutros.
4. Composición del medio: Los medios que contienen alta concentración de proteínas
incrementan la temperatura requerida para destruir bacterias, ya que las proteínas
forman una película alrededor de los microorganismos como medio de protección
indirecta ante situaciones desfavorables.
5. Edad de las células: Las células viejas son más resistentes que las células jóvenes a
las condiciones adversas.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
66
Objetivo:
- Determinar la temperatura de muerte térmica de los microorganismos estudiados
tratados a 40° C y 65° C durante diferentes intervalos de tiempo.
- Determinar el número de microorganismos supervivientes resistentes al tratamiento
térmico.
Materiales:
Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Procedimiento:
1. Dos cultivos de 24 horas de edad de E. coli y S. aureus crecidos en Caldo Nutritivo se
someterán a 40° C y 65° C.
2. Cada 0, 40, 80 y 100 minutos se cogerá 1 ml de cada uno los tubos que contienen las
cepas microbianas en ambas temperaturas y se sembrará por el método de difusión en el
medio de cultivo Agar Nutritivo. Realizar diluciones seriadas.
3. Rotular correctamente las placas Petri indicando el tratamiento y la cepa microbiana.
4. Incubar a 28° C por 48 horas en posición invertida.
5. Realizar el recuento de microorganismos en cada uno de los tratamientos.
6. Resultados: Anotar los resultados en el siguiente cuadro:
Temperatura Tiempo (min) Crecimiento microbiano (UFC/ml)
Escherichia coli Staphylococcus aureus
40° C
0
40
80
100
65° C
0
40
80
100
7. Con los resultados obtenidos elaborar la curva de supervivencia de microorganismos en
papel milimetrado comparando el tiempo de exposición (eje X) y las UFC/ml (eje Y) para
cada una de las temperaturas evaluadas por microorganismos evaluado.
8. Con los resultados obtenidos halle el Tiempo de Reducción decimal o valor D en ambas
temperaturas utilizando la siguiente fórmula:
Donde:
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
67
Dt: Tiempo en minutos para reducir el 90% el número de microorganismos de una
población a una temperatura dada.
x: Minutos a una determinada temperatura
No: n° de células al inicio del tratamiento térmico
Nx: n° de células supervivientes después de un tratamiento
9. Interpretación y Discusión de resultados. A partir de las curvas graficadas indique los
resultados obtenidos para cada una de las variables estudiadas y explique los resultados
obtenidos utilizando bibliografía adecuada (artículos científicos, libros).
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
68
II. ACCIÓN DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
Este factor viene a ser la presión desbalanceada que da lugar a los fenómenos de difusión y
ósmosis, en una solución donde hay diferencia de concentraciones.
Si un organismo está inmerso en una solución que tenga alta presión osmótica, el agua
saldrá de la célula hasta que establezca un equilibrio entre el interior y exterior celular lo
que ocasionará que la membrana citoplasmática y el protoplasma se contraigan hacia el
centro de la célula; es entonces que la célula ha entrado en el proceso de crenación.
Lo contrario ocurre cuando una célula está en un medio con baja presión osmótica, el agua
ingresará a la célula hasta establecer equilibrio en el exterior celular, y si la diferencia de
presión es grande la membrana tenderá a explotar y se dirá que la célula ha entrado en
estado de plasmólisis.
Objetivo:
- Determinar la concentración de NaCl que afecta el crecimiento microbiano.
Material
- Cepa de Escherichia coli de 24 horas de edad crecida en caldo nutritivo
- 4 Placas con concentraciones crecientes de NaCl al 5%, 10%, 20% y 40% en medio
base Agar Nutritivo.
- 1 placa con Agar Nutritivo.
- Asa de siembra
- Encendedor
Procedimiento
1. En las placas con diferentes concentraciones de NaCl, sembrar la cepa de E. coli por
el método del estriado.
2. Repetir el paso anterior utilizando una placa con Agar Nutritivo que contiene
concentración normal de NaCl.
3. Rotular las placas Petri con la cepa microbiana utilizada.
4. Incubar a 28°C por 48Hrs.
5. Comparar el crecimiento microbiano entre las placas que contienen las diferentes
concentraciones de NaCl y la placa con Agar Nutritivo que contiene concentración
normal de NaCl.
6. Interpretación y Discusión de resultados.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
69
ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
I. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE IONES HIDRÓGENO (pH) EN LOS
MICROORGANISMOS.
El efecto de distintas concentraciones de iones hidrógeno es considerado con respecto a su
capacidad para suprimir el crecimiento microbiano. Los microorganismos se inocularán en
un medio que es capaz de mantener el crecimiento siempre y cuando el pH sea tolerable. La
única diferencia entre las distintas probetas de medio de cultivo radica en el pH de los
caldos en cuestión. Se observará el crecimiento y se tendrá conclusiones. Para que estos
resultados sean válidos es preciso la observación de todas las probetas en un mismo
tiempo.
Objetivo:
- Determinar el efecto del pH en el crecimiento y desarrollo microbiano.
Materiales
- Cultivos de 24 horas de edad de Escherichia coli.
- Tubos con caldo nutritivo estéril previamente ajustados con HCl 1.0N y NaOH 1.0N a
valores de pH de 3.0, 5.0, 7.0, 9.0 y 11.0 (1 de cada una)
Procedimiento.
1. Inocule con una azada el cultivo de E. coli en cada uno de los tubos de caldo nutritivo con
distintos valores de pH.
2. Incube a 28° C y anote sus observaciones en términos de la cantidad de crecimiento al
segundo y cuarto día. Emplee la siguiente escala:
+ = Poco crecimiento
++ = Regular Crecimiento
+++ = Crecimiento moderado
++++ = Abundante crecimiento
3. Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:
TABLA DE RESULTADOS
pH 3.0 pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 pH 11.0
E. coli
4. Interpretación y Discusión de resultados.
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
70
II. ACCIÓN DE LOS DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS.
Objetivo
- Observar y comparar el efecto de los desinfectantes y antisépticos en el desarrollo
microbiano.
Materiales
- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
- Medio de cultivo: Agar nutritivo
- Desinfectantes: Lejía al 10%, cresol al 5%, Pinesol.
- Antisépticos: Alcohol al 70%, agua oxigenada, merthiolate, jabón medicado (Protex)
- Discos de papel filtro, pinzas.
- Plumón indeleble.
Procedimiento
Agentes desinfectantes
1. Dividir la placa de Agar Nutritivo en 3 mitades utilizando plumón indeleble.
2. A partir de un cultivo de 24 horas de edad de la cepa de E. coli coger con un asa de kohle
el inóculo necesario y sembrarlo sobre la superficie de cada parte de la placa de Agar
Nutritivo.
3. Utilizando una pinza estéril colocar un disco de papel filtro de 1.5 cm de diámetro
embebido en la solución del desinfectante.
4. Realizar el mismo procedimiento para la cepa microbiana de S. aureus
5. Incubar las placas a 28°C por 48 horas en posición invertida.
Agentes Antisépticos
1. Dividir la placa de Agar Nutritivo en 4 mitades.
2. Realizar el mismo procedimiento descrito para los agentes desinfectantes y probar las
cepas de E. coli y S. aureus.
3. Incube a 28° C por 48 horas y anote sus observaciones en términos de la cantidad de
crecimiento. Emplee la siguiente escala:
+ = Poco crecimiento
++ = Regular Crecimiento
+++ = Crecimiento moderado
++++ = Abundante crecimiento
4. Resultados: Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
71
5. Interpretación y Discusión de resultados.
Antiséptico E. coli S.aureus
Alcohol al 70%
H2O2
Merthiolate
Jabón Protex
Desinfectante E. coli S.aureus
Lejía
Cresol
Pinesol
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
72
PRUEBAS DE DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA
El metabolismo es el conjunto de reacciones que ocurren en los seres vivos, que incluye
procesos de obtención de energía, tales como, descomposición de moléculas orgánicas en
los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos.
Asimismo, se encuentran las de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales
(anabolismo).
Todas las reacciones metabólicas son catalizadas por enzimas que en su mayoría son
intracelulares aunque hay también extracelulares, sobre todo hidrolíticas, que son liberadas
por la célula para catalizar reacciones fuera de esta.
Es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos por su
inoculación en medios de cultivo con diversos sustratos que puedan ser utilizados como
fuentes de energía, carbono, donadores de electrones, así como de otros nutrientes
esenciales necesarios para su crecimiento.
Existen numerosas pruebas bioquímicas con medios de cultivo adicionados de indicadores
de pH para detectar la producción de ácido o álcali, con inhibidores selectivos como bilis,
cianuro o con colorantes, sulfuros, etc. que facilitan la determinación de diferentes
actividades metabólicas. La actividad que se evalúa con mayor frecuencia es: capacidad
para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, etc.).
El desarrollo de pruebas bioquímicas es importante para la identificación de especies
bacterianas que proliferan en el área de alimentos, clínica y ambiental capaces de crecer
utilizando diferentes sustratos y por lo tanto su potencial deterioro.
Objetivo
- Caracterizar a los microorganismos en función de su capacidad fermentativa de
diferentes carbohidratos.
Materiales
- Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
- Caldo Base Rojo de Fenol
- Carbohidratos: Glucosa, Sacarosa y Lactosa
- Pipetas estériles
- Plumón indeleble.
Procedimiento
1. Inocular 0.5 ml de cada cepa en una serie de tubos de caldo rojo fenol con glucosa,
lactosa, y sacarosa.
2. Incubar los tubos a 28°C durante 48 horas.
3. Resultados: Determinar si hay crecimiento y cambios en el color del indicador Criterios de evaluación: Producción de ácido Prueba positiva (+): color amarillo Prueba negativa (-): color rojo
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
73
4. Interpretación de resultados y Discusión.
CUESTIONARIO 1. De los microorganismos estudiados ¿qué estructuras bacterianas le confieren resistencia
térmica? ¿Por qué?
2. ¿Cuál es el rango de temperatura en el cuál los microorganismos crecen y se multiplican
rápidamente y en función de esto cuál sería la temperatura recomendada para la
conservación de los alimentos? ¿Por qué?
3. ¿Qué cuidados debemos practicar frente a la cantidad de agua extra o intra celular en
posibles productos frescos a temperatura ambiente?
4. ¿Qué ejemplos de aplicación están basados en la fisiología de la presión osmótica?
5. ¿Cuál es la razón de usar alcohol de 70°? 6. En un proceso productivo de derivados de frutas, ¿Cuál sería el agente contaminante
principal? ¿Cuál sería su agente químico de control? ¿Qué función cumpliría este agente?
Proponga un ejemplo.
7. Explique el efecto de los desinfectantes y antisépticos en el desarrollo microbiano.
8. De acuerdo a la capacidad fermentativa de los carbohidratos por las bacterias estudiadas
indique los alimentos que pueden ser potencialmente deteriorados por esta actividad
metabólica. ¿Por qué?
Defina:
Desinfectante Antiséptico Bactericida Bacteriostático Plasmólisis
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
74
PRACTICA Nº 6
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MOHOS POST COSECHA, CARACTERÍSTICAS DE LOS PRINCIPALES GRUPOS DE HONGOS
La mayoría de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su energía por
respiración o fermentación de materiales orgánicos solubles presentes en estos ambientes.
El aire no es un medio en el que pueden desarrollarse los microorganismos pero es el
portador de aerosoles biológicos como polvo, gotitas de agua y otros, que pueden estar
cargados de los diversos grupos de microorganismos.
De las capas de aire se han encontrado esporas de hongos que proceden principalmente del
suelo, de la vegetación y del mar. Algunos de los géneros más comúnmente aislados del aire
son Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor y Cladosporium entre otros.
Todos los hongos se reproducen por esporulación. Cuando la espora se encuentra en un
medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o más tubos germinativos
que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y largos que se denominan
HIFAS, las cuales pueden ramificarse después. En algunas especies se forman septas a lo
largo de la hifa, quedando entonces dividida en pequeños compartimentos como una caña
de bambú llamándose entonces HIFA SEPTADA, otras veces no hay septación y el
protoplasma fluye continuamente a lo largo de la hifa, describiéndose entonces como HIFA
NO SEPTADA ó CENOCITICA. En la mayoría de los hongos las hifas son septadas. A medida
que las hifas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso o filamentoso de
hifas entrelazadas llamado MICELIO. El conjunto de micelio se conoce como TALO. En
algunas formas superiores las hifas se unen formando cuerpos fructíferos grandes y de
estructura compleja como es el caso de las setas. La parte del micelio que penetra en el
substrato y absorbe substancias nutritivas se llama MICELIO VEGETATIVO, la parte que se
proyecta sobre la superficie del substrato origina el MICELIO AEREO, que a su vez da origen
a esporas asexuales llamadas CONIDIAS, cuya misión es la de dispersar el hongo a nuevos
hábitats.
Algunos hongos también producen esporas sexuales formadas como resultado de la
reproducción sexual. Las que están encerradas en una especie de saco (Asca) se llaman
ASCOSPORAS y las que se forman en el extremo de un basidio se denominan
BASIDIOSPORAS. Las propiedades de las esporas sexuales son un criterio importante en la
clasificación e identificación de los hongos.
Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prácticamente hay tres grupos
importantes: Los mohos, las levaduras y las setas. Los mohos son hongos filamentosos que
están ampliamente distribuidos en la naturaleza y son habituales en pan viejo, queso, frutas
o cualquier tipo de alimento. Presentan una gran variedad de formas y tamaños. Las
levaduras son hongos unicelulares y la mayoría son Ascomicetos. Normalmente tienen
forma oval o cilíndrica y su principal forma de reproducción es la gemación, se desarrollan
bien en hábitats con abundante azúcar tales como frutas, flores, e incluso la corteza de los
árboles. Las levaduras tienen gran importancia biotecnológica en la industria cervecera y de
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
75
la panificación y en la producción de proteína de origen unicelular (Biomasa). El principal
agente de la fermentación alcohólica es Sacharomyces cerevisiae. Las setas son hongos
filamentosos pertenecientes a los Basidiomycetes que forman cuerpos fructíferos
denominados “setas” y que producen basidiosporas como esporas sexuales. Una actividad
ecológica muy importante de los Basidiomycetes, es la descomposición de la madera, papel,
ropa y otros derivados de productos naturales. Estos Basidiomycetes, por tanto, son
capaces de producir Celulasas con actividades degradantes de lignina que utilizarán como
fuente de carbono y energía. Debido a que muchas setas como Pleurotus ostreatus, son
comestibles, su producción en gran escala es una actividad económicamente importante,
aunque las hay también venenosas como Amanita virosa y Amanita phalloides.
Cada hongo tiene ciertas características macro (morfología colonial, pigmentación) y
microscópicas (tipos de hifas, de conidias, etc.) que permiten clasificarlo.
Característica macro y microscópicas de los principales géneros de hongos ambientales
1. Aspergillus
Características Macroscópicas: El color es la principal característica macroscópica para la
identificación de los grupos de aspergilos. Poseen distintos tonos de verde, pardo, amarillo,
blanco, gris y negro.
Características Microscópicas: Presenta un conidióforo erecto septado en cuya parte apical se
encuentran las cabezuelas conidiales que presentan bajo el microscopio cuatro formas
básicas: globosa, radiada, columnar o claviforme. Los conidios constituyen cadenas
alrededor de la cabezuela y que se originan a partir de las fiálides.
Cabezuela globosa
Cabezuela hemisférica
Fiálides
Cadena de conidias
Cabezuela claviforme Hifa septada
Fig. 1. Género Aspergillus
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
76
2. Penicillium
Características Macroscópicas: Las colonias del género Penicillium son circulares si no hay impedimento alguno para su crecimiento. Éste es generalmente blanco, pero en algunas especies es amarillo, anaranjado, púrpura o pardo claro. La superficie de la colonia madura, o sea con sus conidios formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con pequeños haces (fascículos) de conidióforos. Características Microscópicas: Este género se caracteriza por formar conidias en una
estructura ramificada semejante a un pincel. Los filamentos o hifas alcanzan un diámetro
entre dos o tres micrómetros y tienen septos. Presenta conidióforo erecto en cuya parte
aplica se encuentras las fiálides distribuidas en varias ramificaciones. Los conidios son
esféricos o elipsoidales, unicelulares, hialinos que en masa se ven de color verde, verde
azulado, verde aceituna o gris. La pared de los conidios es lisa o rugosa según las especies.
Conidióforo
Fiálides muy ramificadas o sin ramificación
Cadena de conidias
Fig. 2. Género Penicillium
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
77
3. Rhizopus
Características macroscópicas: Colonias algodonosas laxas, que cubre completamente la
caja de Petri y logra empujar la tapa hacia arriba. Inicia de color blanco y se torna gris con
puntos negros que corresponden a los esporangios.
Características microscópicas: Hifas gruesas y aseptadas, abundantes rizoides prominentes
de color café, de los que salen esporangióforos largos, no ramificados, de color café, cada
uno con un esporangio café con esporangiosporas espiculadas. Dependiendo de la especie
puede poseer estolones o puentes de comunicación entre los rizoides.
4. Mucor
Características macroscópicas: Colonias algodonosas laxas, que cubre completamente la
caja de Petri y logra empujar la tapa hacia arriba. Presenta colonias Amarillo marrón pálido.
Características microscópicas: Presenta esporangióforos largos sin ramificar o cortos
ramificados que en ocasiones se curvan hacia abajo. Los esporangios son de color marrón
pálido. Las esporangiosporas son de de forma elipsoidales y de pared lisa. Se distingue de
Rhizopus por la ausencia de rizoides.
Esporangiosporas
Esporangióforo
Estolón
Esporangio
Esporangiosporas
Esporangióforo
Estolón
Rizoides
Esporangio
Esporangiosporas
Fig. 3. Género Rhizopus
Fig. 4. Género Mucor
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
78
Objetivo:
- Aislar e identificar los principales hongos ambientales causantes del deterioro de los
alimentos de acuerdo a sus características macro y microscópicas.
Materiales y sustancias
- Placas Petri conteniendo medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD).
- Asa de Kohle
- Alambre de nicrón en punta
- Láminas portaobjetos
- Papel lente
- Alcohol 70°
- Agua destilada estéril.
- Colorante Azul algodón de Lacto-fenol
- Cinta scotch
- Mechero Bunsen
- Encendedor
- Microscopio
- Plumón marcador
- Diversos tipos de alimentos con visible desarrollo fúngico en la superficie: frutos,
cereales, granos, hortalizas, pan, etc.
Procedimiento
I. Observación directa de las estructuras vegetativas y reproductivas asexuales de los
hongos
1. A partir de las muestras de alimentos con desarrollo fúngico sobre su superficie colocar
la parte adherente de un trozo de cinta scotch y presionar con cuidado para favorecer la
adhesión de las estructuras.
2. Colocar una gota del colorante azul de algodón de lacto-fenol sobre una lámina
portaobjeto.
3. Colocar sobre la gota del colorante el trozo de cinta scotch adhiriendo con cuidado las
estructuras fúngicas previamente tomadas del alimento deteriorado.
4. Examinar al microscopio con objetivo de menor aumento para buscar estructuras
reproductivas representativas y posteriormente cambiar a un objetivo de mayor
aumento para observar con mejor detalle las características de las estructuras
seleccionadas procurando que éstas presenten la arquitectura completa del hongo para
facilitar su identificación.
5. Reconocer la morfología que conforman parte del talo vegetativo: tipo de hifa septada o
cenocítica, estolón, rizoide, etc. y, del talo reproductivo asexuales: esporangióforo,
conidióforo, fiálides, esporangio, esporas, vesícula o cabezuela, etc.
6. Realizar la Identificación preliminar del género del hongo
7. Dibujar las observaciones realizadas
UNMSM – FQIQ – Dpto. Quím. Orgánica Guía de Prácticas de Biología General
79
II. Aislamiento en medio de cultivo de hongos a partir de los alimentos deteriorados
1. Seleccionar en el alimento deteriorado una zona con el desarrollo de un solo tipo de
hongo: pigmentación, tipo de crecimiento del micelio (algodonoso, velloso, pulverulento,
etc.), etc.
2. Coger un pequeño trozo del micelio seleccionado con la ayuda del asa de kohle y
depositarlo en el centro de una placa Petri conteniendo APD. Realizar este proceso a la
altura del mechero bajo condiciones estrictas de esterilidad.
3. Rotular la placa Petri indicando el tipo de alimento utilizado.
4. Incubar por 7 días a temperatura ambiente.
5. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores por muestra
de alimento utilizado.
6. Anotar las características de las colonias: Forma, aspecto del micelio (algodonoso,
velloso, pulverulento u otro), pigmentación, elevación, consistencia, etc.
7. Realizar la relación con las estructuras reproductivas asexuales observadas al
microscopio para la identificación del género del hongo observado.
8. Dibujar las observaciones realizadas.
9. Indicar el género del hongo observado.
Recomendaciones
Antes y después del trabajo en el microscopio limpie los lentes de los objetivos y oculares
utilizando papel lente y alcohol de 70°.
Cuestionario
1. Explicar cuál es el mecanismo de acción de los géneros Aspergillus, Penicillium y Rhizopus
para causar el deterioro de los alimentos y mencionar ejemplos de alimentos que son
comúnmente atacados por estos hongos.
2. Dibujar las estructuras vegetativas y reproductivas asexuales y/o sexuales de 3 hongos de
diferente género de importancia agroindustrial, diferentes a lo visto en la práctica.
3. Describir otra técnica de aislamiento de hongos.
4. Mencionar la importancia de los hongos en Microbiología Agroindustrial.
5. ¿A qué se denomina micosis? Mencione dos de las más importantes y haga hincapié en la prevención y el tratamiento.